本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與病毒學(xué)領(lǐng)域，涉及咪唑菌酮在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

家蠶血液型膿病是養(yǎng)蠶業(yè)三大病毒病中危害最為嚴(yán)重的一種病害，其傳染性極強(qiáng)，近年來養(yǎng)蠶生產(chǎn)中較為普遍發(fā)生，并不時(shí)發(fā)生部分農(nóng)戶或一定養(yǎng)蠶區(qū)域內(nèi)絕產(chǎn)的情況。家蠶血液型膿病的病原是家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)，該病毒屬桿狀病毒科、核型多角體病毒屬，是一種具有囊膜、雙鏈DNA病毒，它在病毒復(fù)制過程中會(huì)形成兩種病毒粒子，即包涵體來源病毒粒子與芽生病毒粒子，前者隨著食物進(jìn)入家蠶中腸感染部分中腸細(xì)胞，被感染中腸細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量芽生病毒粒子，新生的芽生病毒粒子進(jìn)而感染其它組織導(dǎo)致細(xì)胞裂解，蟲體最終死亡。病蠶、蛹、蛾的尸體、膿汁及被之污染的蠶糞、蠶具、蠶繭，帶有大量的病毒，具有強(qiáng)烈的傳染性，是血液型膿病的主要的傳染源。

目前對(duì)于家蠶血液型膿病的治療尚無特效藥物，生產(chǎn)上主要是通過加強(qiáng)養(yǎng)蠶期嚴(yán)格的消毒來杜絕BmNPV的感染，消毒劑主要成分有氯制劑和甲醛試劑等。但是家蠶血液型膿病的潛伏期短，發(fā)病快，感染時(shí)肉眼難以察覺，當(dāng)肉眼發(fā)現(xiàn)時(shí)，則常處于發(fā)病晚期或是暴發(fā)期，一旦病毒感染了蠶體，發(fā)生疾病，則很難進(jìn)行有效治療進(jìn)而挽回?fù)p失，開發(fā)治療家蠶血液型膿病的藥物是蠶農(nóng)或部分技術(shù)人員非常迫切的期望。

已有試驗(yàn)研究證明B-丙內(nèi)酯、，萘啶酮酸等化學(xué)物品對(duì)家蠶BmNPV感染后的發(fā)病具有一定的抑制效果，但其作用還是主要體現(xiàn)在預(yù)防而不是治療。咪唑菌酮是咪唑啉酮類殺菌劑，屬于線粒體呼吸抑制劑，對(duì)卵菌綱真菌引起的霜霉病有良好的保護(hù)和治療活性。發(fā)明人在篩選家蠶血液型膿病治療化合物的過程中發(fā)現(xiàn)咪唑菌酮對(duì)BmNPV有明顯的抑制效果，目前咪唑菌酮應(yīng)用于病毒及BmNPV防治方面尚無專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種咪唑菌酮在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，另一目的是提供使用咪唑菌酮用于防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞的合適濃度。

技術(shù)方案：咪唑菌酮在制備防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

咪唑菌酮的有效濃度為1μg/mL。

防治BmNPV感染家蠶細(xì)胞藥物，有效成分為溶解于DMSO中的咪唑菌酮，濃度為1μg/mL。

具體防治方法為：

1.咪唑菌酮對(duì)攜帶eGFP報(bào)告基因的BmNPV感染的防治

(1)用DMSO溶解咪唑菌酮，配制濃度為10mg/mL的儲(chǔ)存液。

(2)分別在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種約10⁵個(gè)/皿的家蠶細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用配制好的咪唑菌酮儲(chǔ)存液加入細(xì)胞中，使終濃度分別為0.01-1μg/mL，孵育10-120min，孵育細(xì)胞溫度為20-29℃，以等體積DMSO孵育液作為對(duì)照。孵育后，用MOI＝10攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV病毒感染細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并對(duì)病毒滴度進(jìn)行測定。

(3)分別在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種約10⁵個(gè)/皿的家蠶細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用MOI＝10攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV病毒感染細(xì)胞，在感染后的6、12、24小時(shí)后加入1μg/mL咪唑菌酮，72小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并對(duì)病毒滴度進(jìn)行測定。

有益效果：本發(fā)明提供一種以咪唑菌酮為主要有效成分，制備防治家蠶血液型膿病的藥物。當(dāng)咪唑菌酮使用終濃度在1μg/mL以上時(shí)能夠完全抑制BmNPV的復(fù)制，并且在BmNPV完成對(duì)細(xì)胞的侵染后能夠繼續(xù)抑制BmNPV的復(fù)制，具有治療效果。本發(fā)明可用于防治家蠶血液型膿病的藥物研發(fā)及生產(chǎn)，具有應(yīng)用推廣價(jià)值。

附圖說明

圖1、攜帶綠色熒光蛋白基因的BmNPV重組病毒BmBac-egfp示意圖。

圖2、利用不同濃度咪唑菌酮處理細(xì)胞后病毒感染細(xì)胞熒光圖。

圖3、利用不同濃度咪唑菌酮處理細(xì)胞后病毒滴度。

圖4、感染后不同時(shí)間點(diǎn)加入咪唑菌酮處理細(xì)胞熒光圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV的構(gòu)建

將egfp片段克隆至pFastBac1(Invitrogen)的BamHI(Takara)和XhoI(Takara)位點(diǎn)，構(gòu)建供體質(zhì)粒pFastBac-egfp，通過轉(zhuǎn)座獲得BmBac-egfp(圖1)，將BmBac-egfp DNA轉(zhuǎn)染BmN(家蠶卵巢細(xì)胞)細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光表達(dá)。將其細(xì)胞上清用于感染BmN細(xì)胞，感染72小時(shí)后收獲病毒，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度，病毒4℃冰箱避光保存。

2.細(xì)胞的接種及咪唑菌酮的儲(chǔ)存液配制

(1)分別在35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)中各接種約10⁵BmN細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。

(2)27℃培養(yǎng)約12h-24h，待細(xì)胞貼壁后，用于以下實(shí)驗(yàn)。

(3)咪唑菌酮的儲(chǔ)存液配制

用DMSO配制濃度為10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液。

3.當(dāng)咪唑菌酮的終濃度為0μg/mL，即對(duì)照組細(xì)胞，攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV對(duì)細(xì)胞感染效率

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入2μL DMSO與2mL 10％FBS的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)30min，加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2(DMSO)。

(3)取10μL細(xì)胞培養(yǎng)液，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

結(jié)果顯示0μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染的細(xì)胞產(chǎn)生大量熒光，病毒滴度Log₁₀(TCID50)為9.87(見圖3(DMSO))。

實(shí)施例2

咪唑菌酮的終濃度為1μg/mL時(shí)，對(duì)攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入2μL 10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液與2mL 10％FBS的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)30min，隨后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2(T1)。

(3)取10μL細(xì)胞培養(yǎng)液，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

結(jié)果顯示1μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染的細(xì)胞沒有熒光產(chǎn)生，達(dá)到了完 全抑制，病毒滴度為0(圖3 T1)。

實(shí)施例3

咪唑菌酮的終濃度為0.25μg/mL時(shí)，對(duì)攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入0.5μL 10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液與2mL 10％FBS的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)30min，隨后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2(T0.25)。

(3)取10μL細(xì)胞培養(yǎng)液，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

結(jié)果顯示0.25μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染細(xì)胞的熒光與對(duì)照相比明顯減少，病毒滴度Log₁₀(TCID50)為8(圖3T0.25)。

實(shí)施例4

咪唑菌酮的終濃度為0.1μg/mL時(shí)，對(duì)攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入0.2μL 10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液與2mL 10％FBS的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)30min，隨后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2(T0.1)。

(3)取10μL細(xì)胞培養(yǎng)液，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

結(jié)果顯示0.1μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染細(xì)胞的熒光與對(duì)照相比明顯減少，但比0.25μg/mL咪唑菌酮處理的細(xì)胞多，病毒滴度Log₁₀(TCID50)為9.13(圖3T0.1)。

實(shí)施例5

咪唑菌酮的終濃度為0.01μg/mL時(shí)，對(duì)攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，分別加入0.02μL 10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液與2mL 10％FBS的TC100培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)30min，隨后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒。

(2)72h后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖2(T0.01)。

(3)取10μL細(xì)胞培養(yǎng)液，用終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。

結(jié)果顯示0.1μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染細(xì)胞的熒光與對(duì)照相比差異不明 顯，病毒滴度Log₁₀(TCID50)為9.65(圖3T0.01)，表明該濃度下咪唑菌酮對(duì)BmNPV沒有防治效果。

實(shí)施例6

咪唑菌酮的終濃度為1μg/mL時(shí)，感染后加入咪唑菌酮對(duì)攜帶egfp報(bào)告基因的BmNPV感染的防治：

(1)取各接種好10⁵細(xì)胞的3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)細(xì)胞皿中合2mL的10％FBS的TC100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。移去舊的培養(yǎng)基，隨后加入MOI＝10的BmBac-egfp病毒；此時(shí)設(shè)置時(shí)間為感染后0小時(shí)，6、12、24小時(shí)后加入2μL 10mg/mL的咪唑菌酮儲(chǔ)存液，27℃培養(yǎng)。

(2)72小時(shí)后，將3個(gè)皿放置于熒光倒置顯微鏡，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況見圖4。

結(jié)果顯示BmNPV完成對(duì)細(xì)胞的感染后加入1μg/mL咪唑菌酮處理細(xì)胞，對(duì)BmNPV也有完全的抑制效果，表示1μg/mL咪唑菌酮可以對(duì)BmNPV感染細(xì)胞進(jìn)行病毒清除和治療。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上所述的實(shí)施例和實(shí)施方式所述的咪唑菌酮濃度和處理時(shí)間僅用于說明性目的而非限制，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在細(xì)胞狀態(tài)或者細(xì)胞培養(yǎng)基理化性質(zhì)比如酸堿度等等微小的差異，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍，并被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍之內(nèi)。