本發(fā)明涉及一種不對稱二硫醚類化合物在抗SARS冠狀病毒感染中的應(yīng)用，屬于藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：SARS，即傳染性非典型肺炎(俗稱“非典”)，全稱為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome)，是一種因感染SARS相關(guān)冠狀病毒而導(dǎo)致的呼吸道傳染病。臨床主要癥狀表現(xiàn)為：發(fā)熱、身體不適、寒戰(zhàn)、頭痛、干咳和呼吸困難，同時伴有血氧量減少以及淋巴細胞和血小板減少等，通常需要用插管法和機械幫助呼吸。SARS冠狀病毒傳染性極強，病情進展快速。自2002年11月在我國廣東首次發(fā)現(xiàn)病例以來，已經(jīng)有許多國家和地區(qū)的人們受到這種病毒的威脅，據(jù)統(tǒng)計，全球共發(fā)現(xiàn)感染SARS病毒病例8000余起，死亡人數(shù)約800左右。該病可通過人與人的密切接觸和短距離接觸傳染性飛沫感染，而且起病急、傳播快、致死率高，因此找出非典型肺炎的致病病原體，是開展有針對性的診斷、預(yù)防與治療的基礎(chǔ)。經(jīng)過全世界科學(xué)家的共同努力，探明這種疾病由一種變異的冠狀病毒所致，后將這種變異的冠狀病毒命名為“SARS病毒”。冠狀病毒在目前已知的正鏈RNA病毒中基因組是最大的。冠狀病毒的宿主比較廣泛，包含鳥類，哺乳動物以及人類。大多數(shù)的冠狀病毒都具有感染對象的種屬特異性，即它們只感染一種動物或是跟這種動物關(guān)系密切的其他少數(shù)幾種動物，進而引發(fā)一系列的疾病。根據(jù)它們的宿主、血清型基因序列、血清型關(guān)系，將其分為4個屬，α冠狀病毒(Alphacoronavirus)，β冠狀病毒(Betacoronavirus)，γ病毒(Gammacoronavirus)，δ冠狀病毒(Deltacoronavirus)。Alphacoronavirus主要包含豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、人類冠狀病毒(HCoV-NL63)、人類呼吸道冠狀病毒(HCoV-229E)等；β病毒屬主要包含人類呼吸道冠狀病毒(HCoV-OC43)、牛冠狀病毒(BCoV)、馬冠狀病毒(ECoV)、鳥嘴海雀病毒(PUCoV)、鼠肝炎病毒(MHV)、人類冠狀病毒(HCoV-HKU1)、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)、MERS冠狀病毒(MERS-CoV)等；γ病毒屬主要包含，鴿子冠狀病毒(PICoV)、土耳其冠狀病毒(TCoV)、傳染性支氣管炎病毒(AIBV)等。SARS-CoV基因組大小為29.7kb，其中轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因21kb，其中兩個有重疊部分的開放閱讀框ORF1a與ORF1b分別編碼多聚蛋白pp1a(486kDa)與pp1ab(790kDa)，pp1a與pp1ab被木瓜樣蛋白酶以及SARS冠狀病毒主蛋白酶加工產(chǎn)生具有功能的結(jié)構(gòu)單元，使病毒完成正常的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制功能。其中主蛋白酶在多聚蛋白pp1a與pp1ab上有十一個酶切位點，負責(zé)nsp4-nsp16之間的切割，也包含對RNA聚合酶以及解旋酶(HEL)的加工，因此對病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制十分重要。由于主蛋白酶在病毒生活史中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如果能夠有效地抑制SARS冠狀病毒蛋白酶的水解作用，那么將較好地抵御SARS冠狀病毒對人體的侵染。因此冠狀病毒的主蛋白酶作為設(shè)計抗病毒藥物的理想靶點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種不對稱芳香二硫醚類化合物在抗SARS冠狀病毒感染中的應(yīng)用，所述不對稱芳香二硫醚類化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶具有較強的抑制活性。本發(fā)明提供的第一種應(yīng)用為所述不對稱芳香二硫醚類化合物在制備預(yù)防和/或治療SARS冠狀病毒感染的抗病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的第二種應(yīng)用為所述不對稱芳香二硫醚類化合物在制備SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用?；钚猿煞譃樗霾粚ΨQ芳香二硫醚類化合物的預(yù)防和/或治療SARS冠狀病毒感染的抗病毒藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述抗病毒藥物還包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、增效劑；該藥物可以制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑的形式使用；其給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射。所述不對稱芳香二硫醚類化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示，式I中，X表示NH或S；R1表示苯環(huán)上的單取代基或多取代基，R1獨立地選自-NO2、C1-C3烷基、R’OCO-和鹵素，其中，R’表示C1-C3烷基；R2表示H、C1-C3烷基或R”O(jiān)CO-，其中R”表示C1-C3烷基；R3表示H或R”’CONH-，其中R”’表示C1-C3烷基。具體地，式I中，R1表示苯環(huán)上的單取代基，R1選自-NO2、C2H5OCO-、CH3OCO-、甲基、氟、氯和溴；R2表示H、甲基或CH3OCO-；R3表示H或CH3CONH-。更具體地，所述不對稱芳香二硫醚類化合物為下述式1-式12所示化合物中任一種，本發(fā)明所涉及的含五元雜環(huán)的不對稱二硫醚類化合物可按照文獻(王建國等，中國發(fā)明專利ZL201210055728.5；王建國等，中國發(fā)明專利ZL201210084848.8)公開的方法制備。本發(fā)明所涉及的不對稱芳香二硫醚類化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制效果十分明顯，其對SARS冠狀病毒主蛋白酶的IC50小于6μM，表明這類化合物能夠有效的抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性。通過對所述不對稱二硫醚類化合物進行針對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性測定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所涉及的化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶都有很好的抑制活性，這說明這類化合物能夠有效的抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性，因此這一類化合物有望作為抑制SARS冠狀病毒的潛在藥物。附圖說明圖1為式1所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖2為式2所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖3為式3所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖4為式4所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖5為式5所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖6為式6所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖7為式7所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖8為式8所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖9為式9所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖10為式10所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖11為式11所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。圖12為式12所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制曲線。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例用于合成含五元雜環(huán)的不對稱二硫醚類化合物所使用的化學(xué)原料及試劑2-巰基-4-甲氧羰基咪唑、2-巰基-5-乙酰氨基噻唑、2-巰基噻唑、2-巰基-4-甲基噻唑、鄰硝基苯次磺酰氯、鄰乙氧羰基苯次磺酰氯、鄰甲氧羰基苯次磺酰氯、對氯苯次磺酰氯、對氟苯次磺酰氯、對甲基苯次磺酰氯、對溴苯次磺酰氯購自AlfaAesar(天津)化學(xué)品公司、上海晶純試劑有限公司或美國Aurora化學(xué)品公司，其余常規(guī)化學(xué)原料均為天津本地市售。SARS冠狀病毒主蛋白酶本小組表達純化，熒光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(純度大于98％)，購自上海吉爾生化有限公司。酶抑制活性測定的用到的化學(xué)試劑及生化試劑二甲基亞砜(DMSO)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)均為天津市售。測試酶活性采用的熒光酶標(biāo)儀(SpectramaxGEMINIxps)，產(chǎn)自MolecularDevices公司。實施例1：不對稱二硫醚類化合物的制備反應(yīng)方程式如上所示。將0.9g(5mmol)2-巰基-4-甲氧羰基咪唑、加入到0.95g(5mmol)的鄰硝基苯次磺酰氯的乙醚溶液當(dāng)中，室溫反應(yīng)3個小時，過濾，無水乙醚洗滌，即得目標(biāo)化合物，粗品過柱，得1.37g目標(biāo)化合物(式1，黃色固體，產(chǎn)率88％)。按照同樣的過程和方法制備式2-12所示化合物。式1-12所示化合物的物化表征數(shù)據(jù)見表1，1HNMR、13CNMR、高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2。表1不對稱芳香二硫醚類化合物的物化參數(shù)表2不對稱芳香二硫醚類化合物的1HNMR、13CNMR、高分辨質(zhì)譜實施例2、式1-12所示不對稱芳香二硫醚類化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性的測定本發(fā)明采用的SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達、純化等方法步驟參考文獻方法(Rao,Z.H.etal.,PNAS,2003,100,13190-13195)，篩選方法是饒子和等在CN101418334A中公開的篩選方法。SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性測定是使用熒光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2來完成的。該熒光底物的氨基酸序列來源于SARS冠狀病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。用于熒光強度測定的儀器為FluoraskanAscent熒光儀(Thermo)，激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為320nm和405nm。用于酶反應(yīng)的緩沖體系是50mMTris-HCl(pH7.3)，1mMEDTA(不含DTT)，用緩沖液配置冠狀病毒主蛋白酶(總濃度1μM)，加入備選樣品DMSO溶解物(終濃度為10μM)，303k放置10min，迅速加入熒光底物MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2，底物濃度為20μM。每5s記錄一次熒光讀數(shù)，共測定200個點。1200rpm震蕩5s，檢測熒光值。不加備選樣品，其余實驗條件均相同。以時間為X軸，熒光值為Y軸可得酶活動力學(xué)曲線。通過酶標(biāo)儀記錄的酶反應(yīng)的相關(guān)參數(shù)，根據(jù)熒光強度以及反應(yīng)時間，采用GraphPadPrism5軟件分析前10s的酶促反應(yīng)的速率。設(shè)定V0為不加抑制劑的酶促反應(yīng)的初速度，Vi為加抑制劑的酶促反應(yīng)的初速度。根據(jù)酶促反應(yīng)速率，計算出每個化合物的剩余活性Ra(ResidualActivity，Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(InhibitionRate，Ir)(1-Vi/V0)。對于剩余活性<20％的化合物進行復(fù)篩，排除假陽性的可能。對于剩余活性低于15％的化合物，設(shè)計熒光淬滅實驗。綜合考慮化合物的剩余活性百分率和熒光淬滅率就可以判斷化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制作用。因為該體系主要是通過熒光強度來篩選的，所以，當(dāng)有熒光的化合物或者是與MCA類似的化合物都會對體系產(chǎn)生干擾。另外，很多Dnp類似的結(jié)構(gòu)會淬滅體系的熒光而造成假陽性，為了排除假陽性結(jié)果，本發(fā)明采用先將主蛋白酶與熒光底物反應(yīng)一段時間，讓體系熒光達到最大值Q1，再在體系中加入與實驗組等量的化合物，并檢測體系的熒光值大小為Q2。將兩者的熒光值按照公式計算得出熒光淬滅率Qr(Qr＝(Q1-Q2)/Q2*100％)。當(dāng)熒光淬滅率高于20％為假陽性結(jié)果需排除，當(dāng)熒光淬滅率低于20％為陽性結(jié)果，進行下一步研究。每個化合物用95％的DMSO配置成一定濃度，按照一定的梯度稀釋，配置成不同濃度。用上述檢測方法測定SARS冠狀病毒主蛋白酶不同濃度下化合物的剩余活性。以抑制劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的剩余活性值為縱坐標(biāo)，制作曲線，分別如圖1-圖12所示，用GraphPadPrism5軟件，計算出該抑制劑的IC50值。表3列舉了式1-12所示化合物抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性數(shù)據(jù)。IC50計算的公式為Y＝最低點+(最高點-最低點)/{1+10^[(logIC50-X)*希爾斜率]}其中Y代表剩余活性分?jǐn)?shù)，X代表化合物濃度的常用對數(shù)，希爾斜率表示初始速率，^指的是冪算法。表3式1-12所示不對稱芳香二硫醚類化合物抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的IC50值編號IC50(μM)編號IC50(μM)12.07572.02925.95481.25033.95792.21144.126103.32152.565112.55561.947122.452由表3中的數(shù)據(jù)可以看出，式1-12所示化合物對SARS冠狀病毒主蛋白酶具有很好的抑制作用。當(dāng)前第1頁1 2 3