本發(fā)明屬于人體植入醫(yī)療器械技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用合成的多元聚合物制備人工角膜的方法。

背景技術(shù)：

人角膜基質(zhì)層占角膜厚度的90％，主要由角膜基質(zhì)細(xì)胞和膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分規(guī)則排列而成，透明且具有一定的曲率半徑，有利于光線通過(guò)和折曲，在維持整個(gè)角膜的透明度和曲光率等方面具有至關(guān)重要的作用。絕大多數(shù)角膜基質(zhì)病盲患者均可以通過(guò)角膜移植手術(shù)來(lái)治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜的高度匱乏致使絕大部分患者得不到供體角膜而無(wú)法復(fù)明，導(dǎo)致許多眼角膜疾病患者長(zhǎng)期處于等待供體捐獻(xiàn)與失明的痛苦中。因此開(kāi)發(fā)一種來(lái)源方便，可替代供體捐獻(xiàn)角膜的人工眼角膜就變得格外重要和迫切。

人造角膜支架材料主要由合成生物材料和與ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）相關(guān)的生物材料組成。合成生物材料的優(yōu)點(diǎn)是可以提供優(yōu)異的生物力學(xué)性能，無(wú)限量供應(yīng)，透光度高以及可塑性強(qiáng)的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是親水性差，缺乏生物活性，并且可能誘發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)等問(wèn)題。合成生物材料中加入ECM成分，能夠?yàn)榉N子細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)有助于細(xì)胞黏附、增殖或分化的天然微環(huán)境。

3D打印技術(shù)是一項(xiàng)基于噴射型的快速成型技術(shù)，可以很容易控制局部材料組成、微觀結(jié)構(gòu)以及表面特性，可以應(yīng)用到組織工程角膜的制備中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種多元聚合物人工角膜的制備方法，得到一種力學(xué)性能優(yōu)異，生物相容性良好的人工角膜。

為實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案為：一種多元聚合物人工角膜的制備方法，步驟包括：

1）合成多元共聚材料：取多種單體原料混合，加入催化劑，抽真空，充氮?dú)?，在密閉的容器中進(jìn)行反應(yīng)，制備多元共聚物；

2）制備角膜三維支架：使用3D生物打印機(jī)，將上述多元共聚物為原料置于打印機(jī)的料筒中，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的模型，打印出角膜形狀的三維立體支架；

3）利用ECM對(duì)三維支架進(jìn)行功能修飾：取脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉溶于蒸餾水中，制備成納米顆?；鞈乙?，使用直接涂覆的方式將混懸液中的細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻覆蓋到角膜三維支架表面；

4）殘余角膜微組織化方法的構(gòu)建：取患者角膜進(jìn)行微組織化處理，制備成均勻的細(xì)微顆粒，離心收集沉淀，在沉淀中加入生物蛋白膠，在無(wú)菌條件下，將其注入到被修飾支架材料中，制得人工角膜。

為了控制多元共聚物的分子量，所述步驟1）中反應(yīng)溫度為130-160℃，反應(yīng)時(shí)間為10-24h。

為了滿足人工角膜的力學(xué)強(qiáng)度，所述步驟1）中多元共聚物的分子量為3000-50000。

為了滿足人工角膜光學(xué)性能、力學(xué)強(qiáng)度和降解性能的需求，所述步驟1）中單體選自ε-己內(nèi)酯、丙交酯、三亞甲基碳酸酯或乙二醇中的幾種組合，使用時(shí)的質(zhì)量比為，ε-己內(nèi)酯：丙交酯：三亞甲基碳酸酯：乙二醇=5-90:5-90:3-50:5-30。

為了加速多元聚合反應(yīng)，所述步驟1）中催化劑為辛酸亞錫、有機(jī)胍、金屬鋅、三丁基氯化錫、乙酰丙酮鐵、乳酸鋅、納米氧化鋅、牛磺酸、乙醇鐵、正丙醇鐵或正丁醇鐵；催化劑的質(zhì)量為原料質(zhì)量的0.1%-1%。

進(jìn)一步的，所述步驟2）中打印頭直徑為200μm，擠出速度為0.022-0.033mm/s，打印溫度為120℃-180℃，打印速度為6mm/s，打印層厚為0.01-0.1mm。

為了提高三維支架的生物相容性，保證細(xì)胞能夠在支架上存活，所述步驟2）中打印得到的角膜三維支架的孔隙率為90%，孔隙直徑為200-500μm。

進(jìn)一步的，所述步驟3）中脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉的制備方法為：將新鮮動(dòng)物眼角膜放于生理鹽水中洗凈瀝干后切成小塊，使用雙氧水浸泡；再使用蒸餾水和三蒸水清洗干凈，細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性后，將小塊角膜使用超微濕法粉碎，離心分離，收集沉淀，冷凍干燥制備成脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)納米級(jí)干粉，在4℃下保存。

為了提高離心效果，降低脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)顆粒的粒徑，所述離心是在4℃條件下分三次離心，離心時(shí)間分別為10-20min，離心速度分別為1000rmp-8000rmp，且三次離心的速率是遞增的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明首先制備一種具有優(yōu)異力學(xué)性能的多元聚合物材料，利用3D打印技術(shù)以多元聚合物為原料制備角膜三維支架；然后利用脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉（ECM）對(duì)三維支架進(jìn)行功能修飾，使用3D打印方式或使用直接涂覆的方式將細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻覆蓋到角膜三維支架表面；最后將患者的殘余角膜進(jìn)行“微組織化處理”，也即將自體角膜“種子細(xì)胞”復(fù)合到角膜三維支架中，促進(jìn)了人工角膜的最優(yōu)微環(huán)境，避免了種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)環(huán)節(jié)，具有快速臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。本發(fā)明所提到的比例、“份”，如果沒(méi)有特別的標(biāo)記，均以重量為準(zhǔn)。

本發(fā)明提供了一種人工角膜的制備方法，利用化學(xué)合成的方法，制備一種力學(xué)性能可調(diào)的合成生物材料，利用3D打印技術(shù)打印出人工角膜支架，為了改善其生物相容性，用ECM進(jìn)行生物功能性修飾，使其在具有良好力學(xué)性能的前提下，得到優(yōu)異的生物活性。步驟包括：

1）合成多元共聚材料：取多種單體原料混合，加入催化劑，抽真空，充氮?dú)猓诿荛]的容器中，在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行反應(yīng)，溫度為130-160℃，反應(yīng)時(shí)間為10-24h；反應(yīng)完成后將產(chǎn)物溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使多元共聚物沉淀，過(guò)濾，將沉淀于30-50℃條件下真空干燥，得到多元共聚物。

由反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間控制多元共聚物的分子量為3000-50000。多元共聚物的分子量影響三維支架的力學(xué)性能，包括支架的拉伸強(qiáng)度、彈性模量以及斷裂伸長(zhǎng)率，本實(shí)施例中分子量在3000-50000的范圍內(nèi)力學(xué)性能的綜合指標(biāo)是最優(yōu)異的，滿足角膜在臨床上對(duì)力學(xué)強(qiáng)度的所有需求；而且分子量大的多聚物降解速率比分子量小的慢。

本實(shí)施例中所述單體選自ε-己內(nèi)酯、丙交酯、三亞甲基碳酸酯或乙二醇中的幾種組合，使用時(shí)的質(zhì)量比為，ε-己內(nèi)酯：丙交酯：三亞甲基碳酸酯：乙二醇=5-90:5-90:3-50:5-30。當(dāng)只使用其中兩種或三種時(shí)，仍然滿足以上質(zhì)量比關(guān)系，例如使用ε-己內(nèi)酯與丙交酯二元單體時(shí)，二者質(zhì)量比為5-90:5-90；又如使用ε-己內(nèi)酯、丙交酯、三亞甲基碳酸酯三元單體時(shí)，三者質(zhì)量比為5-90:5-90:3-50。其中所述丙交酯可以為左旋丙交酯和/或右旋丙交酯。

所述催化劑為辛酸亞錫、有機(jī)胍、金屬鋅、三丁基氯化錫、乙酰丙酮鐵、乳酸鋅、納米氧化鋅、牛磺酸、乙醇鐵、正丙醇鐵或正丁醇鐵。催化劑的質(zhì)量為原料質(zhì)量的0.1%-1%，優(yōu)選為0.5%。

2）制備角膜三維支架：使用步進(jìn)電動(dòng)驅(qū)動(dòng)的3D生物打印機(jī)，將上述多元共聚物為原料置于打印機(jī)的料筒中，一次打印需要原料8-12g，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的模型，將多元共聚物材料擠出在載有滅菌玻璃底板的打印平臺(tái)上，打印出角膜形狀的三維立體支架。打印頭直徑為200μm，擠出速度為0.022-0.033mm/s，打印溫度為120℃-180℃，優(yōu)選為150℃，打印速度為6mm/s，打印層厚為0.01-0.1mm。

上述3D打印的工藝參數(shù)會(huì)影響三維支架的精度，且它們之間相互影響，例如（1）打印頭直徑，直接影響打印輸出纖維的粗細(xì)，還與材料的粒徑大小有關(guān)。（2）打印溫度，影響到材料的黏度、供料壓力、成型固化速度等，從而間接影響成型精度。（3）打印速度，與材料擠出速度、材料黏度、材料固化成型速度匹配，太快不易成型或出現(xiàn)斷絲，太慢出現(xiàn)材料堆積。（4）打印層厚，本身是打印精度指標(biāo)，層厚過(guò)大，要求擠出速度高，在材料黏度過(guò)高時(shí)難以實(shí)現(xiàn)。層厚設(shè)置與材料黏度、打印溫度、打印速度、擠出速度相關(guān)。

打印得到的角膜三維支架的孔隙率為90%，孔隙直徑為200-500μm，所述孔隙率及孔隙直徑對(duì)支架的生物相容性有很大影響，孔隙率決定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞，孔隙直徑影響細(xì)胞生長(zhǎng)所需空間，二者直接決定細(xì)胞能否在支架上存活。

3）利用ECM對(duì)三維支架進(jìn)行功能修飾：取脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉溶于蒸餾水中，制備成納米顆?；鞈乙?，將上述三維支架浸泡入混懸液中，使用直接涂覆的方式將混懸液中的細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻覆蓋到角膜三維支架表面，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

所述脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉的制備方法為：將新鮮動(dòng)物眼角膜放于生理鹽水中洗凈瀝干后切成小塊，使用雙氧水浸泡，雙氧水的質(zhì)量濃度為3%，浸泡時(shí)間為10-24h；再使用蒸餾水和三蒸水清洗干凈，細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性后，將小塊角膜使用超微濕法粉碎，在4℃條件下分三次離心，離心時(shí)間分別為10-20min，離心速度分別為1000rmp-8000rmp，且三次離心的速率是遞增的；收集沉淀，冷凍干燥制備成脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)納米級(jí)干粉，平均直徑為130-180nm，在4℃下保存。

4）殘余角膜微組織化方法的構(gòu)建：取患者角膜，去除退化變性組織，保留“相對(duì)正常”組織備用。將殘余角膜組織進(jìn)行微組織化處理，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)的培養(yǎng)皿中，切成小塊，轉(zhuǎn)移到消毒好的玻璃瓶?jī)?nèi)，加入1-5μL質(zhì)量濃度為0.1%-1%的膠原酶，用于將角膜組織分離成為單個(gè)細(xì)胞，充分剪碎，制備成均勻的殘余角膜組織混懸液，通過(guò)300μm直徑的濾網(wǎng)過(guò)濾，離心，棄掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入1-5mL生物蛋白膠，用于粘連ECM，防止其滲出；在無(wú)菌條件下，將其注入到被修飾支架材料中。

本發(fā)明采用的多元聚合物人工合成材料能夠滿足人工角膜光學(xué)性能、力學(xué)強(qiáng)度和降解性能的需求。利用3D生物打印機(jī)打印角膜三維支架，精度高。利用脫細(xì)胞眼角膜細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)角膜三維支架進(jìn)行功能修飾，使得修飾后的眼角膜支架具有良好的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，在具有良好力學(xué)性能的前提下，獲得更為優(yōu)秀的生物相容性，并且可以進(jìn)一步發(fā)揮細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和分化的作用，從而使得修飾后的支架具有更好的促進(jìn)眼角膜再生的作用。同時(shí)，患者殘余角膜微組織化處理能夠獲得自體的種子細(xì)胞，促進(jìn)了組織工程角膜的“最優(yōu)微環(huán)境化” ，具有快速向臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用前景。

實(shí)施例1

以如下步驟制備人工角膜：

（1）二元共聚材料的合成：按質(zhì)量百分比取35%的ε-己內(nèi)酯單體、65%的丙交酯單體為原料投入反應(yīng)設(shè)備中，加入原料質(zhì)量0.5%的辛酸亞錫作為催化劑，抽真空，充氮?dú)猓诿荛]的聚合設(shè)備中，于150℃條件下反應(yīng)20h，即可獲得分子量為22938的多元共聚物。

（2）打印眼角膜三維支架：以上述三元共聚材料為原料，利用生物打印機(jī)，構(gòu)建人角膜形狀的三維立體構(gòu)，結(jié)構(gòu)體的孔隙直徑為350μm，孔隙率為90%，得到可負(fù)載細(xì)胞的角膜三維支架。打印頭直徑為200μm，擠出速度為0.022mm/s，打印溫度為120℃，打印速度為6mm/s，打印層厚為0.1mm。

（3）利用脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)3D打印支架進(jìn)行功能修飾：取新鮮的豬眼眼角膜，生理鹽水洗凈瀝干后切成小塊，浸泡3%的雙氧水20小時(shí)，蒸餾水和三蒸水清洗干凈后，將角膜小塊超微濕法粉碎，4℃條件下分三次離心，離心時(shí)間依次為10min、15min、20min，離心速度依次為1000rmp、5000 rmp、8000rmp；收集沉淀，冷凍干燥制備成干粉4℃下保存，干粉直徑為150-180nm。將脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉溶于蒸餾水中，制備成納米顆?；鞈乙海瑢⒋蛴『玫慕悄ぶЪ芙萑牖鞈乙褐?，并用涂覆的方式將混懸液中的細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻分布于角膜支架表面，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）殘余角膜微組織化方法的構(gòu)建：取角膜損傷患者角膜全切除后的殘余角膜若干，去除退化變性組織，保留“相對(duì)正常”組織備用。將殘余角膜組織在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，在培養(yǎng)皿里切成小塊，然后轉(zhuǎn)移到消毒好的玻璃瓶?jī)?nèi)，加入2μL質(zhì)量濃度為0.1%的膠原酶，充分剪碎，制備成均勻的殘余角膜組織混懸液，通過(guò)300μm直徑的濾網(wǎng)過(guò)濾，離心，棄掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入3mL生物蛋白膠，在無(wú)菌條件下，將其注入到被修飾支架材料中。

本實(shí)施例制備的人工角膜，拉伸強(qiáng)度為2.3MPa，彈性模量為4.2MPa，完全滿足組織工程眼角膜對(duì)力學(xué)強(qiáng)度的需求。

實(shí)施例2

以如下步驟制備人工角膜：

（1）三元共聚材料的合成：按質(zhì)量百分比取5%-90%的ε-己內(nèi)酯單體、5%-90%的丙交酯單體和3%-50%的三亞甲基碳酸酯單體為原料投入反應(yīng)設(shè)備中，加入質(zhì)量為所投入原料質(zhì)量的0.5%的三丁基氯化錫作為催化劑，抽真空，充氮?dú)?，在密閉的聚合設(shè)備中，于158℃條件下反應(yīng)20小時(shí)，即可獲得分子量為48338的多元共聚物。

（2）打印眼角膜三維支架：以上述三元共聚材料為原料，利用生物打印機(jī)，構(gòu)建人角膜形狀的三維立體構(gòu)，結(jié)構(gòu)體的孔隙直徑為250μm，孔隙率為90%，得到可負(fù)載細(xì)胞的角膜三維支架。打印頭直徑為200μm，擠出速度為0.028mm/s，打印溫度為150℃，打印速度為6mm/s，打印層厚為0.05mm。

（3）利用脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)3D打印支架進(jìn)行功能修飾：取新鮮的豬眼眼角膜，生理鹽水洗凈瀝干后切成小塊，浸泡3%雙氧水18h，蒸餾水和三蒸水清洗干凈后，將角膜小塊超微濕法粉碎，4℃條件下分三次離心，離心時(shí)間依次為10min、10min、10min，離心速度依次為3000rmp、6000 rmp、9000rmp；收集沉淀，冷凍干燥制備成干粉4℃下保存，干粉直徑為130-150nm。將脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉溶于蒸餾水中，制備成納米顆粒混懸液，將打印好的角膜支架浸泡入混懸液中，用涂覆的方式使混懸液中的細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻分布于角膜支架表面，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）殘余角膜微組織化方法的構(gòu)建：取角膜損傷患者角膜全切除后的殘余角膜若干，去除退化變性組織，保留“相對(duì)正?！苯M織備用。將殘余角膜組織在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，在培養(yǎng)皿里切成小塊，然后轉(zhuǎn)移到消毒好的玻璃瓶?jī)?nèi)，加入3μL質(zhì)量濃度為0.5%的膠原酶，充分剪碎，制備成均勻的殘余角膜組織混懸液，通過(guò)300μm直徑的濾網(wǎng)過(guò)濾，離心，棄掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入4mL生物蛋白膠，在無(wú)菌條件下，將其注入到被修飾支架材料中。

本實(shí)施例制備的人工角膜，拉伸強(qiáng)度為2.68MPa，彈性模量為3.2MPa，完全滿足組織工程眼角膜對(duì)力學(xué)強(qiáng)度的需求。

實(shí)施例3

以如下步驟制備人工角膜：

（1）三元共聚材料的合成：按質(zhì)量百分比取40%的ε-己內(nèi)酯單體、40%的丙交酯單體和20%的乙二醇單體為原料投入反應(yīng)設(shè)備中，加入所投入原料質(zhì)量0.5%的乳酸鋅作為催化劑，抽真空，充氮?dú)?，在密閉的聚合設(shè)備中，于160℃條件下反應(yīng)24h，即可獲得分子量為32838的多元共聚物。

（2）打印眼角膜三維支架：以上述三元共聚材料為原料，利用3D生物打印機(jī)，構(gòu)建人角膜形狀的三維立體構(gòu)，結(jié)構(gòu)體的孔隙直徑為350μm，孔隙率為90%，得到可負(fù)載細(xì)胞的角膜三維支架。打印頭直徑為200μm，擠出速度為0.033mm/s，打印溫度為150℃，打印速度為6mm/s，打印層厚為0.01mm。

（3）利用脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)3D打印支架進(jìn)行功能修飾：取新鮮的豬眼眼角膜，生理鹽水洗凈瀝干后切成小塊，浸泡3%的雙氧水20小時(shí)，蒸餾水和三蒸水清洗干凈后，將角膜小塊超微濕法粉碎，4℃條件下分三次離心，離心時(shí)間依次為15min、15min、20min，離心速度依次為4000rmp、5000 rmp、6000rmp；收集沉淀，冷凍干燥制備成干粉4℃下保存，干粉直徑為140-160nm。將一定量的脫細(xì)胞角膜細(xì)胞外基質(zhì)干粉溶于蒸餾水中，制備成納米顆?；鞈乙?，將打印好的角膜支架浸泡入混懸液中，并用涂覆的方式使混懸液中的細(xì)胞外基質(zhì)顆粒均勻分布于角膜支架表面，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）殘余角膜微組織化方法的構(gòu)建：取角膜損傷患者角膜全切除后的殘余角膜若干，去除退化變性組織，保留“相對(duì)正?！苯M織備用。將殘余角膜在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，在培養(yǎng)皿里切成小塊，然后轉(zhuǎn)移到消毒好的玻璃瓶?jī)?nèi)，加入5μL質(zhì)量濃度為1%的膠原酶，充分剪碎，制備成均勻的殘余角膜組織混懸液，通過(guò)300μm直徑的濾網(wǎng)過(guò)濾，離心，棄掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入5mL生物蛋白膠，在無(wú)菌條件下，將其注入到被修飾支架材料中。

本實(shí)施例制備的人工角膜，拉伸強(qiáng)度為2.38MPa，彈性模量為1.6MPa，完全滿足組織工程眼角膜對(duì)力學(xué)強(qiáng)度的需求。

以上實(shí)施例僅是本發(fā)明若干種優(yōu)選實(shí)施方式中的幾種，應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例；對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。