本發(fā)明涉及一種絲蛋白纖維支架及其制備方法，所制備的材料可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、藥物裝載等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于疾病和事故導(dǎo)致的器官或組織損傷和功能缺失的病人每年都有數(shù)百萬之多，僅美國(guó)每年需要800多萬次手術(shù)對(duì)這類病人進(jìn)行救治，其經(jīng)濟(jì)花費(fèi)在4000億美元以上。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復(fù)功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學(xué)手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復(fù)提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性，特別是其與膠原同等的生物相容性而成為理想的再生醫(yī)學(xué)支架的原材料。我國(guó)是蠶絲的主要生產(chǎn)國(guó)，蠶絲產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的70%以上。近年來，蠶絲的研究與應(yīng)用從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域延伸到高新技術(shù)領(lǐng)域，如光電子與生物醫(yī)用材料，特別是作為生物醫(yī)用材料已經(jīng)取得了重要進(jìn)展。

絲蛋白多孔支架因具有三維多孔結(jié)構(gòu)，可以為細(xì)胞的粘附增殖、及組織的再生提供三維空間，并且有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，因此受到了廣泛研究。目前，制備絲素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷凍干燥、鹽析法、氣體發(fā)泡法、三維打印等，然而這些方法都依然存在一些難以克服的不足，例如，冷凍干燥法易形成片層結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞與組織生長(zhǎng)。現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了一種反復(fù)進(jìn)行膜溶解控制絲素蛋白自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成多孔支架，但該方法的效率低，重復(fù)性差，并且孔壁結(jié)構(gòu)的存在直接限制細(xì)胞的遷移與相互作用，組織生長(zhǎng)也因此受限。在此方面，利用靜電紡絲技術(shù)制備的纖維支架被認(rèn)為是組織工程理想的支架結(jié)構(gòu)。然而靜電紡絲技術(shù)加工復(fù)雜、產(chǎn)量低、且靜電紡纖維膜結(jié)構(gòu)致密，也不利于細(xì)胞與組織生長(zhǎng)。因此，如能構(gòu)建一種支架材料，具有多孔支架的大孔徑高空隙率優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有纖維狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，將極大促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，如細(xì)胞增殖與遷移、和組織生長(zhǎng)，對(duì)組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用非常有利。

為此，克服現(xiàn)有加工技術(shù)與絲蛋白支架結(jié)構(gòu)的上述問題，開發(fā)一種制備方法，并構(gòu)建出有利于細(xì)胞與組織生長(zhǎng)的絲素蛋白支架對(duì)絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用及再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用都具有非常重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可行的再生絲蛋白多孔材料的制備方法，及由該方法制備的再生絲蛋白纖維支架。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種再生絲蛋白纖維支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）脫膠蠶絲溶解于鹽-甲酸溶液，然后自然干燥得到含鹽絲蛋白膜；

（2）將含鹽絲蛋白膜溶解于中性鹽溶液中，透析后獲得絲蛋白水溶液；

（3）將絲蛋白水溶液注入模具中，冷凍處理，然后經(jīng)冷凍干燥處理得到再生絲蛋白纖維；

（5）將再生絲蛋白纖維經(jīng)有機(jī)溶劑后處理得到水不溶再生絲蛋白纖維支架。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲中的一種或幾種；所述鹽為溴化鋰、氯化鈣、氯化鋅、氯化鎂、硫氰酸鋰、硫氰酸鈉、硫氰酸鎂、硝酸鈣、硝酸銅、碳酸鈣、磷酸鈣中的一種或幾種。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，所述鹽-甲酸溶液中甲酸濃度為50～98wt%；鹽濃度為1～10w/v%。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，中性鹽為氯化鈣、溴化鋰、硝酸鈣、氯化鎂、氯化鋅、硫氰酸鋰；優(yōu)選為氯化鈣、溴化鋰、硫氰酸鋰。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，所述溶解溫度為0～50℃，優(yōu)選20～37℃。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，所述絲蛋白溶解濃度為0.1～10 wt%，優(yōu)選1～5wt%。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）和（2）中的溶劑均可溶解蠶絲，但本發(fā)明創(chuàng)造性的先進(jìn)行步驟（1），然后再進(jìn)行步驟（2），在此條件下即可獲得纖維化的再生絲素蛋白支架，而非多孔絲素蛋白支架；取得了意想不到的技術(shù)效果。

本發(fā)明還公開了按照上述技術(shù)方案制成的再生絲蛋白纖維支架，主要由再生絲蛋白纖維組成，纖維直徑為50nm～10μm，支架孔隙率大于80%。

本發(fā)明中，鹽-甲酸溶解蠶絲主要發(fā)生在原纖水平，因此溶解后獲得絲蛋白原纖膜；再利用中性鹽溶液（如9.3M LiBr溶液）在較低溫度下（本發(fā)明限制在0~50℃，優(yōu)選20~37℃）溶解絲蛋白原纖膜，經(jīng)透析后即可獲得由絲蛋白原纖組成的水溶液；該溶液經(jīng)冷凍處理時(shí)會(huì)誘導(dǎo)絲蛋白原纖自組裝結(jié)合形成纖維，經(jīng)冷凍干燥后即形成纖維狀支架（參見本發(fā)明說明書附圖）。該再生絲蛋白纖維支架具有不同傳統(tǒng)絲蛋白多孔材料的纖維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為生物支架材料具有高孔隙率，且非常有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長(zhǎng)，是理想的組織工程支架。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)與實(shí)施例一制得的再生絲蛋白水溶液和再生絲蛋白纖維支架的外觀與掃描電鏡圖；

圖2為實(shí)施例二制得的再生絲蛋白纖維支架的掃描電鏡圖；

圖3為實(shí)施例三制得的再生絲蛋白纖維支架的掃描電鏡圖；

圖4為實(shí)施例四制得的再生絲蛋白纖維支架的掃描電鏡圖；

圖5為實(shí)施例五制得的再生絲蛋白纖維支架的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一

（1）脫膠桑蠶絲溶解于含2%氯化鈣的80%甲酸溶液，蠶絲濃度15wt%,溶解后干燥成膜。

（2）將步驟（1）的絲蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解溫度30℃，溶解濃度5wt%，透析后獲得純絲蛋白水溶液。

（3）將步驟（2）的絲蛋白水溶液用去離子水稀釋至濃度1 wt%。

（4）將1 wt%絲蛋白水溶液置于-20℃冷凍24h，然后于-20℃凍干即為可溶絲蛋白纖維。

（5）將可溶絲蛋白纖維支架浸入75%乙醇處理30min，然后重復(fù)步驟（4）獲得水不溶再生絲蛋白纖維支架。

對(duì)照樣為脫膠絲直接溶解于60℃的9.3M LiBr溶液中，然后與實(shí)施例一經(jīng)過同樣的透析、稀釋、冷凍、冷凍干燥、有機(jī)溶劑后處理工藝。附圖1為對(duì)照樣與實(shí)施例一獲得的絲蛋白水溶液的照片和支架的掃描電鏡。由圖可見，對(duì)照樣絲蛋白水溶液為白色，而實(shí)施例一絲蛋白水溶液為藍(lán)色；對(duì)照樣絲蛋白支架內(nèi)部為片層結(jié)構(gòu)，而實(shí)施例一絲蛋白支架內(nèi)部為纖維結(jié)構(gòu)。采用溴化鋰在30℃溶解5wt%的絲素蛋白，可以在不嚴(yán)重破壞蠶絲的條件下溶解獲得絲素蛋白水溶液，且5wt%的濃度既保證了適宜的溶解效率，同時(shí)避免高濃度透析時(shí)易凝膠的問題，最終獲得具有較好纖維結(jié)構(gòu)的再生絲素蛋白纖維支架。顯然，支架內(nèi)的片層結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙細(xì)胞的遷移和組織的生長(zhǎng)；相反，纖維化的結(jié)構(gòu)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移及相互作用、和組織的生長(zhǎng)融合，因此更適合用作組織工程支架。

實(shí)施例二

（1）脫膠桑蠶絲溶解于含5%氯化鈣的90%甲酸溶液，蠶絲濃度10wt%,溶解后干燥成膜。

（2）將步驟（1）的絲蛋白膜溶解于氯化鈣-乙醇-水三元溶劑，溶解溫度30℃，溶解濃度3wt%，透析后獲得純絲蛋白水溶液。

（3）將步驟（2）的絲蛋白水溶液用去離子水稀釋至濃度1.5 wt%。

（4）將1.5 wt%絲蛋白水溶液置于-40℃冷凍24h，然后于-40℃凍干即為可溶絲蛋白纖維。

（5）將可溶絲蛋白纖維支架浸入甲醇處理30min，然后重復(fù)步驟（4）獲得水不溶再生絲蛋白纖維支架。

附圖2為實(shí)施例二獲得的絲蛋白支架的掃描電鏡。由圖可見，按照實(shí)施例二制得的絲蛋白支架內(nèi)部為纖維結(jié)構(gòu)，非常有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長(zhǎng)，是理想的組織工程支架。

實(shí)施例三

（1）脫膠桑蠶絲溶解于含5%硝酸鈣的88%甲酸溶液，蠶絲濃度20wt%,溶解后干燥成膜。

（2）將步驟（1）的絲蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解溫度25℃，溶解濃度6wt%，透析后獲得純絲蛋白水溶液。

（3）將步驟（2）的絲蛋白水溶液用去離子水稀釋至濃度0.8 wt%。

（4）將0.8 wt%絲蛋白水溶液置于-20℃冷凍24h，然后于-20℃凍干即為可溶絲蛋白纖維。

（5）將可溶絲蛋白纖維支架浸入50%乙醇處理30min，然后重復(fù)步驟（4）獲得水不溶再生絲蛋白纖維支架。

附圖3為實(shí)施例三獲得的絲蛋白支架的掃描電鏡。由圖可見，按照實(shí)施例三制得的絲蛋白支架內(nèi)部為纖維結(jié)構(gòu)，非常有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長(zhǎng)，是理想的組織工程支架。

實(shí)施例四

（1）脫膠柞蠶絲溶解于含8%氯化鈣的98%甲酸溶液，蠶絲濃度5wt%,溶解后干燥成膜。

（2）將步驟（1）的絲蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解溫度50℃，溶解濃度2wt%，透析后獲得純絲蛋白水溶液。

（3）將步驟（2）的絲蛋白水溶液用去離子水稀釋至濃度1 .5wt%。

（4）將1.5 wt%絲蛋白水溶液置于-20℃冷凍24h，然后于-20℃凍干即為可溶絲蛋白纖維。

（5）將可溶絲蛋白纖維支架浸入甲醇處理30min，然后重復(fù)步驟（4）獲得水不溶再生絲蛋白纖維支架。

附圖4為實(shí)施例四獲得的絲蛋白支架的掃描電鏡。由圖可見，按照實(shí)施例四制得的絲蛋白支架內(nèi)部為纖維結(jié)構(gòu)，非常有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長(zhǎng)，是理想的組織工程支架。

實(shí)施例五

（1）脫膠蓖麻蠶絲溶解于含5%氯化鈣的95%甲酸溶液，蠶絲濃度10wt%,溶解后干燥成膜。

（2）將步驟（1）的絲蛋白膜溶解于9.3M LiBr溶液，溶解溫度37℃，溶解濃度8wt%，透析后獲得純絲蛋白水溶液。

（3）將步驟（2）的絲蛋白水溶液用去離子水稀釋至濃度0.5 wt%。

（4）將0.5 wt%絲蛋白水溶液置于-20℃冷凍24h，然后于-20℃凍干即為可溶絲蛋白纖維。

（5）將可溶絲蛋白纖維支架浸入80%乙醇處理30min，然后重復(fù)步驟（4）獲得水不溶再生絲蛋白纖維支架。

附圖5為實(shí)施例五獲得的絲蛋白支架的掃描電鏡。由圖可見，按照實(shí)施例五制得的絲蛋白支架內(nèi)部為纖維結(jié)構(gòu)，非常有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長(zhǎng)，是理想的組織工程支架。