本發(fā)明涉及石墨烯修飾的生物陶瓷支架及其制備方法和用途，屬生物材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥，是新世紀人類健康的最大威脅之一。骨特殊的微觀環(huán)境極易導(dǎo)致其他癌癥轉(zhuǎn)移到骨，乳腺癌、前列腺癌、肺癌極易會轉(zhuǎn)移到骨[1]。因此骨癌的治療也受到很大的關(guān)注。目前最常用的是化療和手術(shù)相結(jié)合的方法，通過切除腫瘤病灶，再利用骨移植材料修復(fù)損傷[2]。然而手術(shù)治療通常無法根治已有腫瘤轉(zhuǎn)移的晚期病人，放療和化療對病人會造成很大的毒副作用[3]。光熱治療作為較為安全的新型腫瘤治療方法得到了廣泛關(guān)注[4]。光熱治療在增加腫瘤療效和減小副作用上展現(xiàn)了顯著地優(yōu)勢。只有暴露在光照下的腫瘤才會有損傷，不會對沒有光照的正常組織造成明顯的傷害。因此，如何開發(fā)兼有骨修復(fù)和抗腫瘤能力的生物材料仍然是一個重大的挑戰(zhàn)。先前的研究表明，石墨烯具有很好的光熱性能[5]，生物相容性好[6]，可用于組織工程。多級孔結(jié)構(gòu)三維支架，提供一個有利于細胞黏附、增殖、分化及生長的三維支架式外環(huán)境。

參考文獻：

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種兼有骨修復(fù)和抗腫瘤能力的石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料及其制備方法和應(yīng)用。

在此，一方面，本發(fā)明提供一種石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料，其特征在于，包括β-磷酸三鈣支架和均勻涂覆于所述β-磷酸三鈣支架的表面的石墨烯層。

本發(fā)明的石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料(簡稱“β-TCP-GRA”)中，β-磷酸三鈣支架具有良好的誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化能力和體內(nèi)促進成骨的能力，可以起到修復(fù)骨缺損的作用；石墨烯的功能化并沒有改變生物陶瓷支架的生物活性，而且石墨烯具有良好的光熱性能，在近紅外光照射下可有效殺死腫瘤細胞，因此，本發(fā)明的石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料具有很好的抗腫瘤能力和促進成骨的特性，可以作為切除骨腫瘤后的修復(fù)材料，同時利用其光熱性能，殺死殘余腫瘤細胞，起到治療與修復(fù)的雙重作用。

較佳地，所述β-磷酸三鈣支架是通過3D打印制得的多級孔結(jié)構(gòu)三維支架(大孔100～500μm，小孔約1μm)。

較佳地，所述石墨烯層的厚度為1～10nm。

另一方面，本發(fā)明提供上述石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將β-磷酸三鈣粉末與粘結(jié)劑以一定比例充分混合，利用三維打印技術(shù)制備β-磷酸三鈣支架；

(2)將打印出的β-磷酸三鈣支架進行燒結(jié)，得到β-磷酸三鈣陶瓷支架；

(3)將所得的β-磷酸三鈣陶瓷支架浸泡在石墨烯溶液中一定時間后干燥，即得到石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料。

本發(fā)明中，通過3D打印制備β-磷酸三鈣支架，無需模具即可制備形狀復(fù)雜的三維支架，而且容易制得孔徑和孔隙率可控的多孔級結(jié)構(gòu)三維支架。此外，通過簡單的浸泡法即可在支架表面修飾石墨烯，制備工藝簡單，可控性強，重復(fù)性好。

較佳地，步驟(1)中，β-磷酸三鈣粉末與粘結(jié)劑的質(zhì)量比為(1.5～2):1。

較佳地，所述粘結(jié)劑包括聚乙烯醇、海藻酸鈉、和/或甲基纖維素等。

較佳地，步驟(1)中，三維打印的參數(shù)為：單層厚度為1mm，粘結(jié)劑濃度為5～15wt％，打印速度為1～10mm/s,氣壓為400～700kPa。

較佳地，步驟(2)中，在1100～1150℃燒結(jié)3～5小時。

較佳地，步驟(3)中，所述石墨烯溶液的濃度為0.25～1.0mg/mL，浸泡次數(shù)為1～6次，每次浸泡時間為10～15分鐘。

再一方面，本發(fā)明還提供上述石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料在制備用于切除骨腫瘤后的骨修復(fù)和骨腫瘤治療的材料中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為純β-磷酸三鈣支架光學顯微鏡圖(a)，SEM圖(b)，β-TCP-GRA光學顯微鏡圖(c)，SEM圖(d)。從圖中可以看出石墨烯均勻的修飾在β-TCP表面；

圖2為β-TCP-GRA光熱性能圖。從圖中可以看出β-TCP-GRA在極短時間內(nèi)，就可以迅速升溫，具有優(yōu)良的光熱性能；

圖3為骨髓基質(zhì)干細胞的增殖(a)和ALP活力表達(b)，β-TCP-GRA提高了骨髓基質(zhì)干細胞的成骨相關(guān)的基因表達(c),(d),(e),(f)；

圖4為在植入兩種材料4周和8周后，在缺損處骨形成能力的Micro-CT分析，植入β-TCP-GRA組在缺損處形成的新骨明顯比植入純β-磷酸三鈣支架組多；

圖5為在缺損處植入兩種材料4周和8周后的組織切片分析，石墨烯修飾組新骨形成的量明顯比β-TCP組更多，骨質(zhì)更好；

圖6為利用808nm近紅外光照射兩種材料，光照前后腫瘤細胞數(shù)量的變化?？煽闯靓?TCP-GRA能有效殺死腫瘤細胞；

圖7為改變光照時間，腫瘤數(shù)量的變化，可見光照30min，腫瘤死亡率更高。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和下述實施方式進一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明一方面提供一種石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料(β-TCP-GRA)，其包括β-磷酸三鈣支架和均勻涂覆于所述β-磷酸三鈣支架的表面的石墨烯層，石墨烯是以薄膜層涂覆用于支架表面。圖1示出發(fā)明一個示例的β-TCP-GRA的光學顯微鏡圖和SEM圖(圖1(c)、(d))以及未修飾石墨烯的純β-磷酸三鈣支架的光學顯微鏡圖和SEM圖(圖1(a)、(b))。從圖中可以看出石墨烯均勻地修飾在β-TCP表面。其中石墨烯層的厚度可為1～10nm。

本發(fā)明中，作為支架的β-磷酸三鈣支架可以是多級孔結(jié)構(gòu)三維支架。多級孔結(jié)構(gòu)中，可以是大孔100～500μm，小孔約1μm。另外，其優(yōu)選為通過3D打印制得。通過3D打印，可以無需模具即可制備形狀復(fù)雜的三維支架，而且可以控制多孔級結(jié)構(gòu)的孔徑和孔隙率。

通過在β-磷酸三鈣支架表面修飾石墨烯，一方面，β-磷酸三鈣支架能夠很好地支持骨髓基質(zhì)干細胞粘附，增殖和堿性磷酸酶的表達；另一方面，石墨烯具有優(yōu)異的光熱性能，可有效殺死腫瘤細胞，而且石墨烯的功能化并不會改變β-磷酸三鈣生物陶瓷支架的生物活性， 以此本發(fā)明的β-TCP-GRA具有很好的抗腫瘤能力和促進成骨的特性(參見后述的生物活性測試)，可作為切除骨腫瘤后的修復(fù)材料，同時利用其光熱性能，殺死殘余腫瘤細胞，起到治療與修復(fù)的雙重作用。

上述石墨烯修飾的生物陶瓷支架材料的制備可以包括：利用三維打印技術(shù)制備出β-TCP支架；將制得的β-TCP支架浸泡在石墨烯溶液中，得到石墨烯功能化的生物活性陶瓷支架。

在利用三維打印技術(shù)制備β-TCP支架的一個示例中，采用β-磷酸三鈣粉末為原材料，并將其與粘結(jié)劑充分混合，同時調(diào)整其與粘結(jié)劑的比例，例如β-磷酸三鈣粉末和粘結(jié)劑的質(zhì)量比可為(1.5～2):1，其中粘結(jié)劑包括但不限于聚乙烯醇、海藻酸鈉、甲基纖維素等；然后利用軟件設(shè)計支架具體參數(shù)，調(diào)控支架的形狀、尺寸等，進行3D打印。3D打印的參數(shù)可包括：單層厚度為1mm，粘結(jié)劑濃度為5～15wt％，打印速度為1～10mm/s,氣壓為400～700kPa。

通過3D打印制得的β-TCP支架素坯進行燒結(jié)，制得β-磷酸三鈣陶瓷支架。其中燒結(jié)例如可在1100～1150℃燒結(jié)3～5小時。

利用石墨烯對β-磷酸三鈣陶瓷支架進行改性。在一個示例中，改性方法是將支架浸泡在石墨烯溶液中一定時間后進行干燥。其中所浸泡的石墨烯溶液的濃度可為0.25～1.0mg/mL。浸泡次數(shù)可為一次以上，例如為1～6次，每次的浸泡時間可為10～15分鐘。通過改變浸泡次數(shù)、石墨烯濃度等可對功能化支架的光熱性能進行調(diào)控。

以下，作為示例，說明本發(fā)明的一個實施方式。

1.石墨烯修飾的β-磷酸三鈣陶瓷的制備和表征：

(1)將β-磷酸三鈣粉與PVA按質(zhì)量比(1.5－2):1的比例混合，利用軟件設(shè)計好所需程序，進行三維打??；

(2)將打印好的支架在1100－1150℃煅燒3-5小時，得到β-磷酸三鈣陶瓷；

(3)將β-磷酸三鈣陶瓷浸泡在0.25-1mg/mL的石墨烯中，浸泡1-6次，每次時間為10-15min。然后再120℃烘箱內(nèi)干燥；

(4)通過光學顯微鏡和SEM對合成的功能化支架進行表征。

2、GO功能化的β-磷酸三鈣的性能評價

2.1、功能化支架的光熱性能

將β-磷酸三鈣支架分別浸在石墨烯中，通過改變浸泡次數(shù)、石墨烯濃度、激光功率等可對功能化支架的光熱性能進行調(diào)控。利用808nm近紅外光照射功能化支架，利用熱成像儀實時 監(jiān)控溫度變化，結(jié)果參見圖2，顯示功能化支架在極短時間內(nèi)，溫度顯著升高，具有良好的光熱性能。

2.2、功能化支架與骨髓基質(zhì)干細胞的相互作用

將骨髓基質(zhì)細胞種分別植在純β-磷酸三鈣和功能化后的β-磷酸三鈣支架上，培養(yǎng)1，3，7天后用掃描電鏡觀察細胞的形貌，并采用MTT法檢測細胞的增殖能力。通過RT-PCR測試骨髓基質(zhì)干細胞在陶瓷片上的基因表達。結(jié)果參見圖3，結(jié)果表明骨髓基質(zhì)干細胞能夠在兩種支架材料上進行很好的黏附和增殖，石墨烯功能化支架相對于純β-磷酸三鈣陶瓷更能促進骨髓基質(zhì)干細胞的成骨相關(guān)的基因表達。說明功能化支架具有很好的誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化能力。

2.3、功能化支架動物體內(nèi)成骨能力

本發(fā)明首次證實GO修飾的β-磷酸三鈣有促進體內(nèi)成骨的能力。GO修飾后的支架具有很好的礦化能力，而純β-磷酸三鈣支架不具備這樣的能力。Micro-CT結(jié)果(參見圖4)顯示植入GO修飾支架組在缺損處形成的新骨明顯比植入純β-磷酸三鈣支架組多。組織切片分析(參見圖5)顯示植入材料4周后，β-TCP組骨缺損周圍形成少量的新骨，而石墨烯修飾組在骨缺損周圍和中心都有新骨形成。植入8周后，石墨烯修飾組新骨形成的量明顯比β-TCP組更多，而且骨質(zhì)更好。以上結(jié)果，說明功能化支架具有很好的體內(nèi)促進成骨的能力。

2.4、功能化支架抗腫瘤能力

將MG-63骨腫瘤細胞種植在純β-磷酸三鈣和功能化后的β-磷酸三鈣支架上，培養(yǎng)1、3天后，利用808nm近紅外光對兩種支架光照10min。用掃描電鏡觀察兩種支架上的細胞在光照前后細胞形貌的變化，并采用MTT法檢測細胞的數(shù)量的變化。結(jié)果(參見圖6)顯示功能化支架組光照后腫瘤細胞顯著減少，而純β-磷酸三鈣支架光照前后細胞數(shù)量沒有顯著變化。圖7示出改變光照時間時腫瘤數(shù)量的變化，可見光照30min，腫瘤死亡率更高。以上說明功能化后，利用其優(yōu)異的光熱性能，可以有效殺死腫瘤細胞。

石墨烯功能化的生物活性陶瓷支架具有優(yōu)異的光熱性能，通過改變石墨烯濃度、浸泡時間、浸泡次數(shù)、激光功率，可對其光熱性能進行調(diào)控。利用808nm近紅外光照射功能化材料，可有效殺死腫瘤細胞。同時功能化并沒有改變生物陶瓷支架的生物活性，能夠很好地支持兔子的骨髓基質(zhì)干細胞粘附，增殖和堿性磷酸酶的表達。動物體內(nèi)實驗進一步證實，功能化支架具有促進成骨的能力。因此，制備的石墨烯功能化的β-TCP具有很好的抗腫瘤能力和促進成骨的特性，可作為切除骨腫瘤后的修復(fù)材料，同時利用其光熱性能，殺死殘余腫瘤細胞，起到治療與修復(fù)的雙重作用。本發(fā)明的功能化支架不僅具有較好的體外生物活 性，體內(nèi)促進成骨能力，而且利用其光熱性能，可有有效抗腫瘤。有望作為切除骨腫瘤后的骨修復(fù)和骨腫瘤治療材料。是一種潛在的多功能硬組織生物活性植入材料。

下面進一步例舉實施例以詳細說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。

實例1：

(1)純β-磷酸三鈣粉體4.5g，與3gPVA充分混合后，利用三維打印技術(shù)制備支架材料；

(2)將打印支架在1100℃煅燒3小時，得到純的β-磷酸三鈣陶瓷；

(3)將純β-磷酸三鈣支架浸泡在1mg/mL石墨烯中10min，涂覆3次；

(4)在120℃烘箱內(nèi)干燥，制得β-TCP-GRA；

然后采用上述方法進行生物活性，成骨性和抗腫瘤性的評價。

實例2：

(1)純β-磷酸三鈣粉體4.5g，與2gPVA充分混合后，利用三維打印技術(shù)制備支架材料；

(2)將打印支架在1150℃煅燒3小時，得到純的β-磷酸三鈣陶瓷；

(3)將純β-磷酸三鈣支架浸泡在0.5mg/mL石墨烯中10min，涂覆6次；

(4)在120℃烘箱內(nèi)干燥，制得β-TCP-GRA；其結(jié)構(gòu)表征結(jié)果參見圖1；

然后采用上述方法進行生物活性，降解性和細胞相容性的評價，結(jié)果參見圖2～圖7。