本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)腙鍵連接的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束作為炎癥靶向傳遞系統(tǒng)的用途。。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種累及多個(gè)關(guān)節(jié)的對(duì)稱模式的慢性炎癥性疾病，它是以滑膜的炎癥過(guò)程為特征，這一過(guò)程最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)周圍骨破壞，并最終改變關(guān)節(jié)的功能和完整性，除了有關(guān)節(jié)癥狀，很多病人還出現(xiàn)全身和關(guān)節(jié)外炎癥。在RA病人中，疾病相關(guān)的殘疾通常發(fā)生得比較早，大約35%的患者在被診斷為RA后的10年內(nèi)就過(guò)早地失去勞動(dòng)能力。此外，研究發(fā)現(xiàn)RA病人的壽命也較之正常人短。目前RA的治療主要分為藥物治療，手術(shù)治療和生物治療，而藥物治療因其治療費(fèi)用低，給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，受到很多RA患者的青睞。

糖皮質(zhì)激素能夠迅速控制RA病情和緩解疼痛，使得其在RA的藥物治療中占有重要地位。但是游離的糖皮質(zhì)激素類（GCs）藥物最大的缺點(diǎn)包括：水溶性差，需要反復(fù)給藥，不具備靶向性且長(zhǎng)期應(yīng)用后全身毒副作用很大，因此病人依從性較差。因此，為了增加藥物的安全性和有效性，炎癥靶向給藥系統(tǒng)的研究很有必要。

已有的靶向治療RA的納米載藥系統(tǒng)包括載藥脂質(zhì)體，納米粒，聚合物膠束等。這些納米載體，可通過(guò)被動(dòng)靶向作用將GCs藥物遞送到炎癥關(guān)節(jié)中，從而達(dá)到治療RA的目的。但這些納米載藥系統(tǒng)也存在以下問(wèn)題：（1）脂質(zhì)體和普通的物理包封的膠束在體內(nèi)血循環(huán)中不穩(wěn)定，其主要原因有：首先是會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬；其次是會(huì)與血漿中的許多成分（白蛋白、脂蛋白、IgG等）相互作用；再者，被血液稀釋后容易導(dǎo)致藥物提前泄漏；（2）由于上述脂質(zhì)體、納米粒和普通的物理包封的膠束在體內(nèi)釋藥行為的不可控性，也就難以保證其療效的充分發(fā)揮。（3）普通的納米載藥系統(tǒng)的載藥量較低，使其臨床應(yīng)用受到限制。

本發(fā)明通過(guò)pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物支鏈末端的肼基團(tuán)與小分子藥物的羰基連接合成了pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物，并通過(guò)自組裝方法制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束，有效避免了上述普通納米級(jí)載藥系統(tǒng)的缺陷，并且能夠有效地靶向到低pH的炎癥區(qū)域。具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）首先以pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物載體與小分子藥物偶聯(lián)后，再通過(guò)自組裝方式制備成聚合物膠束，能夠避免藥物在體循環(huán)中提前被降解的缺陷，而且在聚乙二醇衍生物外殼的保護(hù)下能夠達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)目的。此外，一方面能夠減少藥物在非炎癥部位的分布，另一方面能夠保護(hù)藥物在血液循環(huán)中不被降解。（2）通過(guò)共價(jià)鍵將聚乙二醇衍生物載體與小分子藥物偶聯(lián)后制備成聚合物膠束，以確保膠束在血循環(huán)中時(shí)藥物分子仍能夠滯留于核內(nèi)，進(jìn)一步達(dá)到可調(diào)節(jié)釋藥行為，比如通過(guò)響應(yīng)環(huán)境的變化的共價(jià)鍵，這樣會(huì)引起更加特異和持續(xù)的藥物釋放，達(dá)到在靶向部位的蓄積。（3）通過(guò)響應(yīng)炎癥病理部位pH低于正常組織的特點(diǎn)，以pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物載體與小分子藥物偶聯(lián)后，進(jìn)一步通過(guò)自組裝方式制備成聚合物膠束，相比較普通的物理包封的納米級(jí)給藥系統(tǒng)僅依賴于被動(dòng)靶向釋藥行為，該體系能夠隨著環(huán)境pH的變化而達(dá)到主動(dòng)釋藥目的。（4）相比較傳統(tǒng)的直鏈聚乙二醇載體而言，我們合成的聚乙二醇衍生物能夠提供更多的化學(xué)修飾位點(diǎn)，從而極大地提高載藥量，此外，通過(guò)改變聚乙二醇衍生物支鏈部分肼基團(tuán)的數(shù)目還可以自由調(diào)節(jié)載藥量。

現(xiàn)有技術(shù)中，CN201310756002.9和CN2013755517.7分別利用腙鍵連接聚乙二醇單甲醚-聚乳酸和單端酚羥基羰基化的姜黃素以及雙端酚羥基羰基化的姜黃素，制備成pH敏感的姜黃素載藥膠束（單鏈）和pH敏感的姜黃素載藥膠束（雙鏈），然而這兩種載藥膠束中具有如下問(wèn)題：①所述化學(xué)式中必須加入PLA才能增強(qiáng)疏水性來(lái)實(shí)現(xiàn)膠束，然而我國(guó)FDA并未批準(zhǔn)將聚乳酸（PLA）用于靜脈注射藥用輔料，其使用可能造成不可評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)；②兩種載藥膠束的載藥量分別不超過(guò)15%和5%，臨床使用價(jià)值有待提高。

現(xiàn)有技術(shù)中，CN201310229332.2披露了通過(guò)腙鍵和二硫鍵連接的雙功能聚乙二醇-阿霉素偶聯(lián)物及其制備方法，該偶聯(lián)物具有pH敏感和癌細(xì)胞內(nèi)還原性的藥物控制釋放功能，并能自組裝成納米藥物，具有通過(guò)EPR效應(yīng)靶向腫瘤組織的能力。然而，該偶聯(lián)物中的聚乙二醇是直鏈結(jié)構(gòu)，只能在一端連接一個(gè)小分子藥物，所以該偶聯(lián)物的最大分子量是3021.52，此時(shí)載藥量是17.4%。而據(jù)研究，當(dāng)大分子藥物的分子量低于40000時(shí)，腎臟對(duì)其清除率非常大，所以該類偶聯(lián)物難以達(dá)到腫瘤靶向的目的。

目前，尚未見(jiàn)關(guān)于利用腙鍵連接的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束靶向炎癥的報(bào)道。本發(fā)明中，利用腙鍵連接聚乙二醇衍生物和小分子藥物，并通過(guò)自組裝制備成聚合物膠束，相比較現(xiàn)有的用于腫瘤靶向的pH敏感的聚乙二醇-小分子藥物偶聯(lián)物及其制劑來(lái)講，所合成的炎癥靶向的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束最大的優(yōu)勢(shì)在于，通過(guò)在多個(gè)支鏈末端接上肼基團(tuán)，能夠顯著增加與帶有羰基的小分子藥物連接的化學(xué)修飾位點(diǎn)，這就能夠極大地提高對(duì)小分子藥物的載藥量（34%～40%）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人通過(guò)創(chuàng)造性的研究發(fā)現(xiàn)，式（I）結(jié)構(gòu)的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束具有炎癥靶向作用。

本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思：（1）通過(guò)pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物載體支鏈末端的肼基團(tuán)與小分子藥物的羰基偶聯(lián)后，進(jìn)一步通過(guò)自組裝方法制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物聚合物膠束，能夠避免藥物在體循環(huán)中提前被降解的缺陷，而且在聚乙二醇衍生物外殼的保護(hù)下能夠達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)目的。（2）當(dāng)?shù)竭_(dá)炎癥部位時(shí)，聚合物膠束通過(guò)ELVIS被動(dòng)靶向到炎癥滑膜組織，pH敏感的腙鍵可特異性地在pH降低的炎癥滑膜中斷裂，從而釋放出小分子藥物，增加藥物的蓄積。采用本發(fā)明中的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束不僅極大地提高小分子藥物D在低pH的炎癥部位的濃度，還延長(zhǎng)了其在低pH的炎癥部位的時(shí)間或提高了其抗炎效果。

本發(fā)明的目的在于提供pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束在制備治療炎癥靶向藥物中的用途。

所制備的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束是利用炎癥部位的通透性增加的脈管系統(tǒng)的滲漏作用和隨后的炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的滯留作用（Extravasation through Leaky Vasculature and subsequent Inflammatory cell-mediated Sequestration，ELVIS）而增加納米級(jí)給藥系統(tǒng)的靶向性。具體的機(jī)制：在RA慢性炎癥環(huán)境，炎癥介質(zhì)可以持久地過(guò)量地表達(dá)，導(dǎo)致了“漏的”脈管系統(tǒng)，這和實(shí)體腫瘤相似。此外RA病人血循環(huán)中存在大量的白細(xì)胞，這些白細(xì)胞會(huì)增加對(duì)偶聯(lián)物的攝取，然后這些細(xì)胞進(jìn)一步在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，因此促進(jìn)了偶聯(lián)物在炎癥組織中的蓄積。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種具有較高炎癥靶向性能的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束。通過(guò)pH敏感的腙鍵來(lái)連接聚乙二醇衍生物的肼基團(tuán)和小分子藥物的羰基，并通過(guò)自組裝方法制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物聚合物膠束，該聚合物膠束能夠在低pH的炎癥環(huán)境中釋放出小分子藥物，從而使藥物能夠主動(dòng)地靶向到炎癥部位，降低藥物在全身其他部位的濃度和副作用，可減低給藥劑量和增加療效。

本發(fā)明提供了一個(gè)式（I）的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物，其中通過(guò)pH敏感的腙鍵將A部分的聚乙二醇衍生物支鏈末端的肼基團(tuán)與B部分小分子藥物的羰基連接，而且 A部分的聚乙二醇衍生物作為B部分小分子藥物D的炎癥靶向修飾基團(tuán)：

式（I）

其中：

n=1至200的任意整數(shù)；

m=1至100的任意整數(shù)；

R₁為氫、羥基、氨基、烷氧基、巰基、乙酸酯基、乙酰氨基、葉酸等靶向配體；

烷氧基含碳數(shù)為1-10；

通過(guò)pH敏感的腙鍵將A部分的聚乙二醇衍生物支鏈末端的肼基團(tuán)與B部分小分子藥物的羰基連接；其中，B部分小分子藥物的羰基為藥物自身具有或通過(guò)修飾添加；

氨基為游離氨基；

X為巰基乙酸甲酯、巰基丙酸甲酯中的一種；

藥物D優(yōu)選是分子量小于1000道爾頓的用于治療炎癥疾病的化學(xué)合成藥物或治療炎癥疾病的天然藥物單體。

本發(fā)明中，所述小分子藥物D為疏水性藥物，包含但是不限于：抗炎癥藥物和抗腫瘤藥物等。

抗炎藥物（如潑尼松龍、地塞米松、氫化可的松、醋酸可的松，甲基強(qiáng)的松龍，倍他米松，倍氯米松，來(lái)氟米特，以及類似物和衍生物）。

抗腫瘤藥物（如阿霉素，柔紅霉素，放線菌素D，表阿霉素，表柔比星，吡柔比星以及類似物和衍生物）。

所連接的X包含但是不限于：巰基乙酸甲酯、巰基丙酸甲酯的一種或多種。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了式（I）中A部分的聚乙二醇衍生物作為B部分的小分子藥物D的炎癥靶向修飾基團(tuán)的用途。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種制備式（I）化合物的方法，首先以以Boc-氨基乙醇（此處Boc-氨基也可以為羥基、氨基、烷氧基、巰基、乙酸酯基、乙酰氨基或者葉酸）為引物，以氫化鈉為活化劑，在60°C相繼進(jìn)行環(huán)氧乙烷和烯丙基縮水甘油醚開(kāi)環(huán)反應(yīng)，然后再與巰基乙酸甲酯（或巰基丙酸甲酯）在偶氮二異丁腈的催化催化下，合成animo-(EO)n-(AGE)m-O-CH₃，接著該化合物與水合肼連接，合成末端帶有肼基團(tuán)的聚乙二醇衍生物。最后在醋酸酸性條件下，將A部分的聚乙二醇衍生物支鏈末端的肼修飾基團(tuán)與B部分的小分子藥物D的活性基團(tuán)羰基采用pH敏感的腙鍵連接。

本發(fā)明提供了一種pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合膠束，由本發(fā)明所述的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物自組裝形成聚合膠束。

本發(fā)明提供了一種如式（I）的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的自組成形成的聚合物膠束：

式I

n=1至200的任意整數(shù)；

m=1至100的任意整數(shù)；

R₁為氫、羥基、氨基、烷氧基、巰基、乙酸酯基、乙酰氨基、葉酸等靶向配體；

烷氧基含碳數(shù)為1-10；

氨基為游離氨基；

X為巰基乙酸甲酯、巰基丙酸甲酯中的一種；

通過(guò)pH敏感的腙鍵將A部分的聚乙二醇衍生物支鏈末端的肼基團(tuán)與B部分小分子藥物的羰基連接；B部分小分子藥物的羰基為藥物自身具有或通過(guò)修飾添加。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備本發(fā)明的炎癥靶向pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束的方法：

（1）將小分子藥物上的活性基團(tuán)羰基與聚乙二醇衍生物支鏈末端的活性基團(tuán)肼基團(tuán)在催化劑的作用下通過(guò)pH敏感的腙鍵連接；

（2）通過(guò)自組裝制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束。

作為本發(fā)明的具體實(shí)施方案和非限制性的說(shuō)明例，下面將以上述糖皮質(zhì)激素潑尼松龍和抗腫瘤藥物柔紅霉素為例，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施技術(shù)路線進(jìn)行說(shuō)明，但是整體的實(shí)施方案不限于潑尼松龍和柔紅霉素。

糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗休克、抗病毒、免疫抑制等作用，常用的有潑尼松龍、地塞米松、倍他米松，臨床上廣泛用于炎癥疾病。但其毒副作用不容忽視：首先對(duì)消化系統(tǒng)損傷較大，常引起激素性胰腺炎、激素性潰瘍及小腸穿孔；其次，引起糖、脂、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)代謝紊亂；第三，其免疫抑制作用降低細(xì)胞免疫和體液免疫功能，使機(jī)體更易受外來(lái)病原菌侵害。RA炎癥關(guān)節(jié)局部的一個(gè)比較獨(dú)有的特征是其pH值比正常部位偏低，這是由于在RA關(guān)節(jié)內(nèi)以及關(guān)節(jié)周圍的炎癥反應(yīng)促使其局部環(huán)境呈弱酸性，也稱酸中毒?；谘装Y關(guān)節(jié)低pH的特點(diǎn)，我們采用pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物與小分子藥物偶聯(lián)形成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物，并通過(guò)自組裝形成聚合物膠束。該聚合物膠束能夠在低pH的炎癥環(huán)境中釋放出小分子藥物，從而使藥物能夠主動(dòng)地靶向到炎癥部位，降低藥物在全身其他部位的濃度和副作用，可減低給藥劑量和增加療效。所以，為了增強(qiáng)潑尼松龍局部抗炎作用，減小其毒副作用，本實(shí)驗(yàn)中采用pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物與潑尼松龍偶聯(lián)后，并通過(guò)自組裝方式制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束，對(duì)于促進(jìn)潑尼松龍的炎癥靶向非常必要。

本技術(shù)路線中，以pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物與潑尼松龍藥物連接，即得pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物I。

I

pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物及聚合物膠束制備方法簡(jiǎn)述如下：

首先將氨基乙醇用BOC酸酐保護(hù)得到BOC-氨基乙醇，接著B(niǎo)OC-氨基乙醇分別通過(guò)與EO和AGE兩步開(kāi)環(huán)共聚反應(yīng)，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通過(guò)在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脫掉BOC保護(hù)基團(tuán)，得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述產(chǎn)物適量溶于THF中，進(jìn)一步與巰基乙酸甲酯在偶氮二異丁腈（AIBN）的催化下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)5 h，旋蒸后得到產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃，該產(chǎn)物再接著與水合肼在THF溶液中回流反應(yīng)7 h，旋蒸得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。然后將該產(chǎn)物與潑尼松龍溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和無(wú)水硫酸鈉，在室溫下避光攪拌反應(yīng)48 h后，過(guò)濾，濾液經(jīng)蛋白純化儀分離純化，最后凍干，即得產(chǎn)物pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物。取上述化合物適量，溶于雙蒸水中，通過(guò)自組裝制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束。

柔紅霉素為第一代蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是一種周期非特異性化療藥。主要用于各種類型的急性白血?。ò＜?xì)胞性、淋巴細(xì)胞性和單核細(xì)胞性以及粒-單核細(xì)胞性）、紅白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、惡性淋巴瘤，也可用于神經(jīng)母細(xì)胞病、尤因肉瘤和腎母細(xì)胞瘤等。臨床使用較廣泛但由于柔紅霉素具有嚴(yán)重的毒副作用，使其臨床上的應(yīng)用受到限制。其主要的不良反應(yīng)包括：1. 心肌毒性：如出現(xiàn)心律異常、氣急和下肢浮腫，則應(yīng)警惕充血性心力衰竭的可能；2.血液系統(tǒng)毒性：白細(xì)胞減少和血小板減少；3. 高尿酸血癥和腎臟損；4. 骨髓抑制嚴(yán)重；5.可引起肝臟中心靜脈及肝小葉靜脈閉塞導(dǎo)致黃疸、肝大、肝性腦病及腹水。實(shí)體腫瘤內(nèi)部的缺氧狀態(tài)使腫瘤細(xì)胞無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生乳酸，而腫瘤內(nèi)部血管系統(tǒng)的缺乏使產(chǎn)生的乳酸不能充分排出, 導(dǎo)致腫瘤局部環(huán)境pH偏低?；谀[瘤部位低pH的特點(diǎn)，為了增強(qiáng)柔紅霉素局部抗腫瘤作用，減小其毒副作用，本實(shí)驗(yàn)中采用pH敏感的腙鍵將聚乙二醇衍生物與柔紅霉素偶聯(lián)后，并通過(guò)自組裝方法制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物的聚合物膠束，該聚合物膠束能夠在低pH的腫瘤環(huán)境中釋放出柔紅霉素，從而使柔紅霉素能夠主動(dòng)地靶向到腫瘤部位，降低其在全身其他部位的濃度和副作用，可減低給藥劑量和增加療效。所以，對(duì)于促進(jìn)柔紅霉素的腫瘤靶向非常必要。

本技術(shù)路線中以聚乙二醇衍生物作為腫瘤靶向修飾基團(tuán)，藥物為柔紅霉素，通過(guò)pH敏感的腙鍵將上述載體和藥物偶聯(lián)后，得產(chǎn)物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物II，其結(jié)構(gòu)式如下：

II

pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物及聚合物膠束制備方法簡(jiǎn)述如下：

首先將氨基乙醇用BOC酸酐保護(hù)得到BOC-氨基乙醇，接著B(niǎo)OC-氨基乙醇分別通過(guò)與EO和AGE兩步開(kāi)環(huán)共聚反應(yīng)，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通過(guò)在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脫掉BOC保護(hù)基團(tuán)，得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述產(chǎn)物適量溶于THF中，進(jìn)一步與巰基乙酸甲酯在偶氮二異丁腈（AIBN）的催化下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)5 h，旋蒸后得到產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃，該產(chǎn)物再接著與水合肼在THF溶液中回流反應(yīng)7 h，旋蒸得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。然后將該產(chǎn)物與柔紅霉素溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和無(wú)水硫酸鈉，在室溫下避光攪拌反應(yīng)48 h后，過(guò)濾，濾液經(jīng)蛋白純化儀分離純化，最后凍干，即得產(chǎn)物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物。取上述化合物適量，溶于雙蒸水中，通過(guò)自組裝制備成pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物的聚合物膠束。

采用pH敏感的腙鍵將潑尼松龍或柔紅霉素與聚乙二醇衍生物偶聯(lián)，并通過(guò)自組裝方式制備成上述偶聯(lián)物的聚合物膠束。

本發(fā)明還提供了上述聚合物膠束的臨床上可以接受的制劑，例如溶液劑、氣霧劑或混懸劑、注射劑，優(yōu)選注射劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目的為pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束及其制劑在制備治療炎癥疾病或腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一個(gè)目的是pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束及其制劑在制備預(yù)防和控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及其他炎癥疾病和腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束是一種適宜的炎癥靶向給藥系統(tǒng)：① pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束在聚乙二醇衍生物外殼的保護(hù)下，增加在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)作用；②pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束可以通過(guò)ELVIS被動(dòng)靶向到炎癥滑膜中；③ pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束在體內(nèi)低pH的炎癥部位可降解，釋放出小分子藥物以發(fā)揮藥物作用；④ pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束在體內(nèi)的藥物釋放具有pH依賴性，因此釋藥行為可控制；⑤其載藥量提高，連接方法簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的目的還在于pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束具有顯著提高了B部分小分子藥物D在低pH的炎癥部位或低pH的腫瘤部位的濃度或延長(zhǎng)了其在低pH的炎癥部位或低pH的腫瘤部位的時(shí)間或提高其抗炎或抗腫瘤效果的用途。

為了證明本發(fā)明的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束的炎癥靶向性，故對(duì)上述聚合物膠束進(jìn)行了體內(nèi)藥物分布實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明上述pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束較原藥在相同給藥方式和給藥劑量下在低pH的炎癥部位有較高的分布濃度。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1 pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的合成路線。

圖2 pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物的合成路線。

圖3 pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束分別在pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH6.8和pH7.4條件下的體外釋放圖。

圖4 pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥1 小時(shí)，在血漿、各組織及臟器濃度分布圖。

圖5 pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束及潑尼松龍?jiān)幬察o脈給藥后在炎癥關(guān)節(jié)的經(jīng)時(shí)分布圖

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

首先將β-氨基乙醇(7.37 g, 0.12 mol)，用BOC酸酐(32.72 g, 0.15 mol)保護(hù)得到BOC-氨基乙醇。接著取BOC-氨基乙醇(0.88 g, 5 mmol)，分別通過(guò)與EO(100 mL, 1.98 mol)和AGE(30.1 g, 0.26 mol)兩步開(kāi)環(huán)共聚反應(yīng)，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通過(guò)在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脫掉BOC保護(hù)基團(tuán)，得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m (6.72 g, 7.53 mmol C=C)溶于THF中，進(jìn)一步與巰基乙酸甲酯在偶氮二異丁腈（AIBN）的催化下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)5 h，旋蒸后得到產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃。接著上述所有產(chǎn)物再接著與水合肼(37.7 g, 36.6 mL, 753 mmol)在THF溶液中回流反應(yīng)7 h，旋蒸得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。最后將聚乙二醇衍生物(189 mg, 176 μmol hydrazide)與潑尼松龍(21 mg, 58.3 μmol)溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和無(wú)水硫酸鈉，在室溫下避光攪拌反應(yīng)48h后，過(guò)濾，濾液經(jīng)蛋白純化儀分離純化，最后凍干，即得產(chǎn)物pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 0.90 (t, 3H), 1.54 (m, 2H), 1.779 (m, 2H), 2.635 (t, 2H), 3.235 (s, 2H), 3.37 (t, 2H), 3.644 (s, 3H)，3.676（m, 1H），5.426 (s, 1H)，5.923 (s, 1H)，6.176 (dd, 1H)，7.323 (dd, 1H), 9.113（m, 1H）。

實(shí)施例2

首先將β-氨基乙醇(7.37 g, 0.12 mol)，用BOC酸酐(32.72 g, 0.15 mol)保護(hù)得到BOC-氨基乙醇。接著取BOC-氨基乙醇(0.88 g, 5 mmol)，分別通過(guò)與EO(100 mL, 1.98 mol)和AGE(30.1 g, 0.26 mol)兩步開(kāi)環(huán)共聚反應(yīng)，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通過(guò)在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脫掉BOC保護(hù)基團(tuán)，得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m (6.72 g, 7.53 mmol C=C)溶于THF中，進(jìn)一步與巰基乙酸甲酯在偶氮二異丁腈（AIBN）的催化下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)5 h，旋蒸后得到產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃。接著上述所有產(chǎn)物再接著與水合肼(37.7 g, 36.6 mL, 753 mmol)在THF溶液中回流反應(yīng)7 h，旋蒸得產(chǎn)物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。最后將聚乙二醇衍生物(189 mg, 176 μmol hydrazide)與柔紅霉素(31 mg, 58.3 μmol)溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和無(wú)水硫酸鈉，在室溫下避光攪拌反應(yīng)48h后，過(guò)濾，濾液經(jīng)蛋白純化儀分離純化，最后凍干，即得產(chǎn)物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔紅霉素偶聯(lián)物。

實(shí)施例3

分別精密稱取上述兩種pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物30 mg，溶于7.5 ml雙蒸水中，然后再25℃沿著同一個(gè)方向攪拌0.5小時(shí)，即得4 mg/ml pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子藥物偶聯(lián)物的聚合物膠束。

實(shí)施例4

首先, 取1 mL 4 mg/ml的 pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束5份置于透析袋（MW1000）中。然后上述5份裝有藥物的透析袋分別被浸沒(méi)于裝有等量 pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH6.8 和pH7.4的醋酸鹽緩沖液的圓底燒瓶中，然后在37 °C速度為每分鐘100 rpm的搖床中孵育。分別在特定的時(shí)間點(diǎn)取300 μL 釋放介質(zhì)進(jìn)樣HPLC測(cè)定，同時(shí)補(bǔ)充等量的緩沖液于圓底燒瓶中，所有的樣品均測(cè)定60小時(shí)內(nèi)的釋放率 (n = 3)。

試驗(yàn)例1

小鼠的RA CIA模型的建立

DBA/1小鼠，體重20 ± 2 g，雄性，于第0天，取等體積的牛二型膠原蛋白和完全弗氏佐劑制備成乳劑（上述乳劑滴入冰水中成滴狀不散開(kāi)視為乳化終點(diǎn)），每只小鼠各皮下注射100 μl。然后于第21天進(jìn)行第二次boost，取等體積的牛二型膠原蛋白和不完全弗氏佐劑制備成乳劑（上述乳劑滴入冰水中成滴狀不散開(kāi)視為乳化終點(diǎn)），每只小鼠各皮下注射50 μl，第50天挑選出發(fā)病的小鼠進(jìn)行體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。

小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

將上述發(fā)病的DBA/1小鼠隨機(jī)分為兩大組，每組30只。第一大組為游離潑尼松龍對(duì)照組，以6只為一小組分為5個(gè)小組，按15.0 mg/kg(潑尼松龍/體重)尾靜脈注射給藥；第二大組為pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束實(shí)驗(yàn)組，以6只為一小組分為5個(gè)小組，按15mg/kg(按照劑量相當(dāng)于潑尼松龍15mg/kg來(lái)計(jì))尾靜脈注射給藥。上述兩組均于給藥后0.5, 1, 2, 4和 6 h分別取一組，眼眶取血后處死，全血于4500 rpm/min離心5 min，取血漿置-40℃冷凍待用。立即分離心、肝、脾、肺、腎組織各加入兩倍量的生理鹽水勻漿，然后置于-40℃冷凍待用。然后剪下關(guān)節(jié)組織，剪碎后，各加入兩倍量的生理鹽水勻漿，離心，取上清，置于-40℃冷凍待用。將血漿各臟器勻漿及關(guān)節(jié)組織勻漿解凍后，分別按樣品預(yù)處理方法和樣品測(cè)定方法進(jìn)行處理和測(cè)定。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

取小鼠血漿0.3 ml，組織勻漿0.3 ml，置于5 ml EP管中，再加10 μl 6N HCl，渦旋5 min，然后加入等量的6N NH₄OH，渦旋5 min。加入300 μl 乙腈溶液，渦旋萃取5 min，12000 r/min，離心10 min，精密吸取上清液50 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖和藥物的峰面積。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱：Dikma Diamonsil column，ODS-C₁₈，5 μm，150*4.6 mm，梯度洗脫，流動(dòng)相0.05 mol/L檸檬酸三鈉緩沖液（磷酸調(diào)pH4.1）從70%到30%，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：35 ℃，流速：1 ml/min，檢測(cè)時(shí)間：7.2 min，進(jìn)樣量：50 μl。

圖3的結(jié)果表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束在偏酸性的pH 5.5和pH6.0的環(huán)境中，潑尼松龍的釋放率遠(yuǎn)快于在偏中性的pH6.5，pH6.8和pH7.4環(huán)境中的釋放率。在pH 5.5和pH6.0時(shí)，60小時(shí)內(nèi)藥物釋放率達(dá)到100%，甚至在10小時(shí)內(nèi)藥物釋放率接近80%。在pH6.5時(shí)，60小時(shí)內(nèi)藥物釋放率低于70%，然而在偏中性的pH6.8和pH7.4時(shí)，60小時(shí)內(nèi)藥物的釋放率低于40%，以上結(jié)果均表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束的體外釋放具有pH依賴性。

圖4的結(jié)果表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束尾靜脈給藥后，在關(guān)節(jié)的藥物濃度遠(yuǎn)高于潑尼松龍?jiān)幗M，1小時(shí)的藥物濃度時(shí)其3.36倍。

圖5的結(jié)果表明，pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物的聚合物膠束尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn)（0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h），在關(guān)節(jié)的藥物濃度均遠(yuǎn)高于潑尼松龍?jiān)幗M，分別是潑尼松龍?jiān)幍?.58倍，3.36倍，4.89倍，7.41倍，40.8倍。

綜上所述，通過(guò)采用聚乙二醇衍生物與潑尼松龍化學(xué)連接后形成pH敏感的聚乙二醇衍生物-潑尼松龍偶聯(lián)物，通過(guò)自組裝制備成聚合物膠束，能夠?qū)⑺幬锾禺惖貍鬟f到低pH的炎癥關(guān)節(jié)，提高藥物在低pH的炎癥關(guān)節(jié)部位的濃度和抗炎效果，可降低給藥劑量，減少毒副作用。