發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基連接的生長激素化合物及制備和使用這類化合物的方法。這些生長激素綴合物對蛋白水解性降解的抗性提高且作用特征延長，并且可用于治療。

發(fā)明背景

生長激素是一種由哺乳動物垂體前葉分泌的多肽激素。依物種而定，生長激素是一種由大約190個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，對應(yīng)分子量約為22kDa。生長激素與細(xì)胞表面受體即生長激素受體(GHR)結(jié)合，并通過生長激素受體發(fā)出信號。生長激素在促進(jìn)生長、保持正常身體組成、合成代謝和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用。它還對中間代謝具有直接作用，例如葡萄糖攝取降低、脂解作用(lipolysis)增加、氨基酸攝取和蛋白質(zhì)合成增加。該激素還對其它組織發(fā)揮作用，包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結(jié)締組織和肌肉。重組人生長激素(hGH)已有生產(chǎn)且可市售獲得，例如：健豪寧(Genotropin^TM)(Pharmacia Upjohn)、Nutropin^TM和普蘭品(Protropin^TM)(Genentech)、優(yōu)猛茁(Humatrope^TM)(Eli Lilly)、Serostim^TM(Serono)、諾地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope(Sandoz)、Nutropin Depot(Genentech和Alkermes)。另外，在N末端具有額外甲硫氨酸殘基的類似物還以例如速邁個(Somatonorm^TM)(PharmaciaUpjohn/Pfizer)銷售。

生長激素與蛋白質(zhì)生長激素家族的其它成員催乳素(PRL)和胎盤催乳激素(PL)有共同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。生長激素被歸類為4螺旋束蛋白質(zhì)(圖1)，顯示具有兩個保守二硫鍵的“上-上-下-下(up-up-down-down)”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。具體而言，野生型人生長激素(hGH)由191個氨基酸殘基組成，并在53、165、182和189位上具有4個半胱氨酸殘基，其通過形成分別連接C53與C165和C182與C189的2個分子內(nèi)二硫鍵而 穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(圖1)。通過X射線晶體學(xué)實驗性地測定了以下的hGH結(jié)構(gòu)：游離形式(Chantalet L.等,Protein andPeptideLetters 3，333-340,(1995))和與其結(jié)合蛋白(人GHR(hGHR)的胞外結(jié)構(gòu)域)的復(fù)合物(Devos，A.M.等,Science 255，306-312,(1992))。這些結(jié)構(gòu)已保藏在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中，并且是可公開獲取的(PDB登錄代碼分別為1HGU和1HWG)。因此，根據(jù)已發(fā)表的hGH結(jié)構(gòu)，可鑒定出對于hGH與hGHR結(jié)合重要的殘基。此外，通過核磁共振(NMR)波譜法研究了hGH的動力學(xué)性質(zhì)(Kasimova M.R.等.J.Mol.Biol.318，679-695,(2002))。X射線和NMR數(shù)據(jù)結(jié)合可區(qū)分結(jié)構(gòu)化良好和定義明確的hGH的區(qū)域與結(jié)構(gòu)化較少并且是動態(tài)的區(qū)域。預(yù)期hGH的較少結(jié)構(gòu)化的動態(tài)區(qū)特別易遭蛋白酶剪切，該區(qū)域的適當(dāng)穩(wěn)定可導(dǎo)致蛋白水解穩(wěn)定性改進(jìn)。

已對hGH進(jìn)行大量誘變以試圖產(chǎn)生具有所需化學(xué)或生物性質(zhì)的hGH類似物。具體而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突變體。

US 2003/0162949公開了GH超基因家族成員的半胱氨酸變體。提供用于產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性的生物活性綴合物的通用方法。所述方法包括將半胱氨酸殘基加到蛋白質(zhì)的非必需區(qū)或采用定點(diǎn)誘變用半胱氨酸殘基取代蛋白質(zhì)中的非必需氨基酸，然后通過所加入的半胱氨酸殘基，將半胱氨酸反應(yīng)性聚合物或其它類型的半胱氨酸反應(yīng)性部分與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)。

WO 02/055532描述了經(jīng)遺傳工程改造的具有至少一個共價連接的非多肽部分的hGH突變體，特別是其中所引入的半胱氨酸殘基被用于聚乙二醇化的hGH突變體。

US 5,951,972描述了有生理活性的衍生化的天然和重組的哺乳動物和人蛋白質(zhì)和多肽，其中蛋白質(zhì)內(nèi)至少一個天然存在的或摻入的半胱氨酸殘基用各種取代基衍生化。

詳細(xì)研究了hGH的蛋白酶剪切。由殘基128-154組成的長環(huán)具有例如以下幾種蛋白酶的推定切割位點(diǎn)：凝血酶、纖維蛋白溶酶、膠原 酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。因此，hGH的這個部分顯示特別易受蛋白酶剪切影響(Lewis，U.J.Ann.Rev.Physiol.46，33-42,(1984))。已報道的降解hGH的酶包括凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和激肽釋放酶。

已對大鼠組織中的hGH降解進(jìn)行了研究(Garcia-Barros等.J.Endocrinol.Invest.23，748-754，(2000))。

發(fā)現(xiàn)在大鼠甲狀腺中，有利于在大型和親脂性氨基酸殘基處切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶首先切割Y143和S144之間的肽鍵，產(chǎn)生2鏈分子，接著在Y42和S43之間切割，釋放N端肽F1-Y42。再通過胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶在F146和D147之間切割并再通過羧肽酶的作用，加工2鏈分子中的裂解環(huán)(split loop)。

已報道了產(chǎn)生對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH類似物的幾種方法。

Alam等人(J.Biotech.65，183-190,(1998))通過特異性點(diǎn)突變，設(shè)計了抗凝血酶和纖維蛋白溶酶的hGH突變體。凝血酶特別在R134和T135之間切割hGH，雙重突變體R134D,T135P產(chǎn)生抗凝血酶切割的hGH變體，而三重突變體R134D,T135P,K140A產(chǎn)生纖維蛋白溶酶抗性。此外，后一種hGH突變體具有在7天時間內(nèi)抗人血漿蛋白酶解的抗性。

EP 534568描述了通過使R134突變成丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或組氨酸而對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH突變體。

WO 2004/022593/Nautilus描述了通用的高通量定向進(jìn)化方法，以產(chǎn)生蛋白水解穩(wěn)定性提高的修飾細(xì)胞因子，包括GH變體。

WO 2006/048777/Nautilus特別描述了蛋白水解穩(wěn)定性改進(jìn)的修飾hGH類似物。類似物在1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1-5個突變。半胱氨酸殘基的引入可能導(dǎo)致形成不需要的二硫鍵連接的二聚體，在WO 2006/048777的范圍明確不包括氨基酸殘基被半胱氨酸取代；在WO 2006/048777(第65頁)中闡明： “明確避免氨基酸被半胱氨酸殘基置換，因為這種改變可能導(dǎo)致形成分子間二硫鍵”。

顯然需要開發(fā)抗蛋白水解性降解的hGH化合物。這種穩(wěn)定化合物對蛋白酶剪切應(yīng)顯示出穩(wěn)定性提高，同時保持所需的hGH的生物學(xué)性質(zhì)。這種GH分子應(yīng)具有高的穩(wěn)定性、較慢的清除率和/或延長體內(nèi)半衰期。

此外，通過使基團(tuán)與肽綴合(其適當(dāng)改變肽的性質(zhì))來修飾肽的性質(zhì)和特性是眾所周知的。這類綴合一般需要肽中的某一官能團(tuán)與綴合基團(tuán)中的另一官能團(tuán)反應(yīng)。通常，氨基例如N端氨基或賴氨酸中的ε-氨基與合適的?；噭┙M合使用?；蛘?，聚乙二醇(PEG)或其衍生物可與蛋白質(zhì)連接。有關(guān)綜述參見Exp.Opion.Ther.Patent.14，859-894，(2004)。已表明PEG與生長激素的連接可對生長激素的血漿半衰期具有積極作用，見WO 03/044056。

較早前描述了使用羧肽酶修飾肽的C端。WO 92/05271公開了使用羧肽酶和親核化合物使C端羧基酰胺化，WO 98/38285公開了特別適于該目的的羧肽酶Y的變體。

EP 243929公開了使用羧肽酶將多肽、報道基團(tuán)或細(xì)胞毒性劑摻入蛋白質(zhì)或多肽的C端。

WO 2005/035553描述了通過在肽的C端酶促摻入官能團(tuán)而選擇性綴合肽的方法。

活化鹵素衍生物和馬來酰亞胺代表了將綴合物摻入肽的巰基的一些最常用的官能團(tuán)(G.T.Hermanson in Bioconjugate Techniques 2.Ed.2008,Elsevier)。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶先前被用來改變肽的性質(zhì)。在食品工業(yè)，特別是在乳品工業(yè)，可獲得例如使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶使肽交聯(lián)的許多技術(shù)。其它文獻(xiàn)公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改變生理活性肽的性質(zhì)。EP 950665、EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504，(2002)公開了在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在時包含至少一個Gln的肽與胺官能化PEG或類 似配體之間的直接反應(yīng)，而Wada，Biotech.Lett.23，1367-1372，(2001)公開了β-乳球蛋白通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與脂肪酸的直接綴合。以WO2005/070468公布的國際專利申請公開了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶摻入柄(handle)，其中綴合基團(tuán)可與柄連接。

生長激素是一種關(guān)鍵激素，不僅僅參與調(diào)節(jié)身體生長，而且還參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的代謝。生長激素的主要作用是促進(jìn)生長。人生長激素是具有以下序列的191個氨基酸殘基蛋白質(zhì)：FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1)

給予人生長激素及其緊密相關(guān)的變體被用來治療各種生長激素缺乏相關(guān)疾病。由于是多肽，生長激素經(jīng)胃腸外即借助針給予。此外，生長激素的特征還在于相對短的半衰期，因此需要頻繁給藥，給患者帶來相當(dāng)?shù)奶弁春筒环奖?。因此，仍然需要提供具有改進(jìn)的藥理學(xué)性質(zhì)(例如半衰期延長)的生長激素化合物。

本發(fā)明提供具有改進(jìn)的藥代動力學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)的新的生長激素化合物綴合物以及其生產(chǎn)方法。

發(fā)明概述

皮下給予的藥物化合物的生物利用度可與吸收速率有關(guān)?；衔锿ㄟ^皮下毛細(xì)血管的緊密連接的能力可能部分與其物理和化學(xué)性質(zhì)以及化合物的分子大小或流體力學(xué)體積有關(guān)。具有40kDa PEG的蛋白質(zhì)綴合物例如聚乙二醇化hGH(PEG-hGH)的表觀分子量為150-250kDa。具有共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子的分子量為87kDa，而具有非共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子將因時間與白蛋白部分解離，因此分子量為22kDa。

預(yù)期耗費(fèi)在解離狀態(tài)的時間至少部分取決于白蛋白結(jié)合部分的親和力。因此具有非共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子的吸收速率可比PEG-hGH的吸收速率快。當(dāng)使用對白蛋白具有較低親和力的白蛋白結(jié) 合部分時，可獲得的吸收速率升高。

另外，供白蛋白結(jié)合部分與hGH連接的接頭和/或間隔基的物理和化學(xué)性質(zhì)可影響化合物的官能度。

本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，具有單個Cys突變和/或額外二硫鍵的生長激素化合物(GH)可通過分隔GH和白蛋白結(jié)合殘基的親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基選擇性連接，所述親水間隔基通常具有mLogP<0-或cLogP<0.5的化學(xué)部分以獲得具有改進(jìn)性質(zhì)的GH綴合物，例如高的體外效力，或者例如體內(nèi)半衰期延長，或者例如可能與延長體內(nèi)作用特征聯(lián)合的抗蛋白水解性降解抗性提高。通過使白蛋白結(jié)合殘基經(jīng)由親水間隔基與單個Cys突變連接可保持生物活性，并且可獲得一個或多個上述改進(jìn)。當(dāng)白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有額外二硫鍵的生長激素(例如與hGH的N端、40位或141位)連接時，也可獲得所述改進(jìn)。生長激素化合物還可包含單個Cys突變和額外的二硫鍵兩者，在此方面，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變連接。

在寬的方面，本發(fā)明涉及包含生長激素化合物(GH)的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物具有

a)單個Cys突變，

b)額外的二硫鍵，或者

c)單個Cys突變和額外的二硫鍵，

其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與所述GH連接。

在本發(fā)明的一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有一個或多個額外的二硫鍵。二硫鍵在半胱氨酸對之間形成，半胱氨酸對的一個或兩個通過點(diǎn)突變引入到野生型hGH序列。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有額外的半胱氨酸。通過點(diǎn)突變將半胱氨酸引入野生型hGH序列。

在本發(fā)明的又一個實施方案中，穩(wěn)定的hGH化合物具有一個或多個額外的二硫鍵和一個或多個額外的半胱氨酸。一個或多個額外的二硫鍵在額外的半胱氨酸對之間形成，而額外的半胱氨酸通過點(diǎn)突變引 入到野生型hGH序列。

此外，本發(fā)明基于這樣的觀測結(jié)果，即通過親水間隔基在人生長激素(hGH)中引入白蛋白結(jié)合殘基可選擇性地進(jìn)行，其中保持大部分的活性。優(yōu)選通過親水間隔基將白蛋白結(jié)合殘基引入具有SEQ ID NO:1序列的hGH中的對應(yīng)于所引入半胱氨酸的位置上和/或位置谷氨酰胺40上和/或位置谷氨酰胺141上和/或N端。使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)、特別是得自茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraenae)或利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的TGase允許通過親水間隔基在40位或141位選擇性引入白蛋白結(jié)合殘基，而將剩余的11個谷氨酰胺殘基保持不改變，盡管事實上谷氨酰胺是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物。

因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過親水間隔基與一個白蛋白結(jié)合殘基連接。通常，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與hGH的N端或18、30、40、42、62、69、88、95、98、99、100、101、102、108、135、141或154位連接。在其它實施方案中，2個白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變和上述位置的任一個(例如HGH的N端、40位或141位)連接。

與聚乙二醇化hGH相比，本發(fā)明的生長激素化合物綴合物具有較快的皮下吸收，因此，出現(xiàn)較少脂肪萎縮(lipoatrophy)或無脂肪萎縮。此外，與PEG大不相同，白蛋白結(jié)合殘基和親水間隔基是生物可降解的。

本發(fā)明的又一個目的是提供用于改進(jìn)GH性質(zhì)的方法，所述方法通過按照本發(fā)明方法綴合所述蛋白質(zhì)來進(jìn)行。

在其它方面，本發(fā)明涉及包含單個Cys突變、額外二硫鍵的分離的生長激素化合物(GH)或包含單個Cys突變、額外二硫鍵的生長激素化合物。在本發(fā)明的又一個目的中，這類化合物是可溶的。

附圖簡述

圖1是野生型人生長激素的三維結(jié)構(gòu)的圖示。該圖示顯示連接C53和C165以及連接C182和C189的分子內(nèi)二硫鍵。

圖2是人生長激素序列的圖示，其標(biāo)示出環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段。

定義

在本發(fā)明上下文中，本文所用術(shù)語“生長激素化合物”意指哺乳動物源的生長激素(例如人、牛或豬生長激素)和重組生長激素(例如重 組人、牛或豬生長激素)和這類生長激素的變體以及突變體。本文所用的“GH”和“生長激素化合物”可互換使用。當(dāng)GH是哺乳動物源的生長激素的變體(例如hGH和重組hGH)時，要理解所述變體是通過以下而獲得的化合物：通過生長激素(例如hGH)序列中的一個或多個氨基酸殘基被另一個天然或非天然的氨基酸取代；和/或通過將一個或多個天然或非天然的氨基酸添加至生長激素(例如hGH)序列中；和/或通過從生長激素(例如hGH)序列中缺失一個或多個氨基酸殘基，其中這些步驟的任一個可任選隨后對以一個或多個氨基酸殘基進(jìn)行進(jìn)一步衍生化。通常，GH與hGH具有至少80％同一性，且通常具有hGH生長激素活性的至少10％，如本文測定(I)(實施例46)中所測定的。

在本發(fā)明上下文中，本文所用術(shù)語“白蛋白結(jié)合殘基”意指與人血清白蛋白非共價結(jié)合的殘基。與生長激素化合物(GH)連接的白蛋白結(jié)合殘基通常對人血清白蛋白具有低于約10μM或甚至低于約1μM的結(jié)合親和力。已知各種白蛋白結(jié)合殘基，其中有含有12-40個碳原子的線性和分支的親脂部分、具有環(huán)戊烷并菲骨架的化合物和/或具有10-45個氨基酸殘基的肽等?？赏ㄟ^以下文獻(xiàn)所述的表面等離振子共振測量白蛋白結(jié)合性質(zhì)：J.Biol.Chem.277(38)，35035-35042，(2002)。

本文所用術(shù)語“親水間隔基”意指將生長激素化合物與白蛋白結(jié)合殘基分隔開的間隔基，其具有包含至少5個非氫原子(其中30-50％的這些非氫原子是N或O)的化學(xué)部分。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)氨基作用”和相關(guān)術(shù)語意欲說明這樣的反應(yīng)，其中谷氨酰胺側(cè)鏈中的酰胺氮與另一種化合物的氮，特別是來自另一種含氮親核體的氮交換。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)亦稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，并催化以下通用反應(yīng)

Q-C(O)-NH₂(胺受體)可表示含有谷氨酰胺殘基的肽或蛋白質(zhì)， Q’-NH₂(胺供體)表示含胺親核體?；蛘?，Q-C(O)-NH₂和Q’-NH₂可分別表示胺受體和含有賴氨酸的肽或蛋白質(zhì)。然而，在本發(fā)明中，Q-C(O)-NH₂表示含有谷氨酰胺殘基的生長激素，Q’-NH₂表示上述含胺親核體。

有用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的實例包括微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，例如來源于茂原鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)、肉桂鏈霉菌(Streptomyces cinnamoneum)和灰肉鏈霉菌(Streptomyces griseocarneum)(全部公開于US 5,156,956，其通過引用結(jié)合到本文中)及來源于淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)(公開于US 5,252,469，其通過引用結(jié)合到本文中)和拉達(dá)卡鏈霉菌(Streptomyces ladakanum)(JP 2003/199569，其通過引用結(jié)合到本文中)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。應(yīng)當(dāng)注意的是以前的(輪枝鏈霉菌屬(Streptoverticillium)的成員目前包括在鏈霉菌屬(Streptomyces)中(Kaempfer，J.Gen.Microbiol.137，1831-1892，(1991))。已自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(公開于US 5,731,183，其通過引用結(jié)合到本文中)和自各種粘菌(Myxomycetes)分離出其它有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的其它實例公開于WO 96/06931(例如來源于Bacilus lydicus的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)和WO 96/22366，兩者均通過引用結(jié)合到本文中。有用的非微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包括豚鼠肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和各種海產(chǎn)來源如扁魚真鯛(Pagrus major)(公開于EP-0555649，其通過引用結(jié)合到本文中)和日本牡蠣長牡蠣(Crassostrea gigas)(公開于US 5,736,356，其通過引用結(jié)合到本文中)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“不可接近的”意欲表示某物不存在或從其不能被觸及的意義而言實際上不存在。當(dāng)表明待綴合的蛋白質(zhì)的官能團(tuán)不可接近的時，意欲表示該蛋白質(zhì)中不存在所述官能團(tuán)，或若存在的話在某種程度上其被阻止參與反應(yīng)。舉例而言，所述官能團(tuán)可埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)深處，因而被屏蔽而不能參與反應(yīng)。要認(rèn)識到的是，官能團(tuán)是否可接近視反應(yīng)條件而定?？稍O(shè)想的是，例如在變性劑存在下 或在高溫下，蛋白質(zhì)可解折疊而暴露出本來不可接近的官能團(tuán)。應(yīng)該理解，“不可接近的”意指“在選擇用于特定目的反應(yīng)的反應(yīng)條件下不可接近的”。

術(shù)語“烷烴”或“烷基”意欲表示飽和、線性、分支和/或環(huán)狀烴。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具1-30(包括端值)個碳原子的烴，例如1-20(包括端值)個、例如1-10(包括端值)個、例如1-5(包括端值)個。術(shù)語烷基和亞烷基分別是指相應(yīng)的自由基和二價自由基。

術(shù)語"C_1-6烷基"是指具有1-6個碳原子的直鏈或分支飽和烴。所述基團(tuán)實例包括但不限于甲基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基和正己基。

術(shù)語"C_3-10環(huán)烷基"通常是指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基和環(huán)癸基。

術(shù)語“烯烴”意欲表示包含至少一個碳碳雙鍵的線性、分支和/或環(huán)狀烴。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具2-30(包括端值)個碳原子的烴，例如2-20(包括端值)個、例如2-10(包括端值)個、例如2-5(包括端值)個。術(shù)語烯基和亞烯基分別是指相應(yīng)的自由基和二價自由基。

術(shù)語“炔烴”意欲表示包含至少一個碳碳三鍵的線性、分支和/或環(huán)狀烴，其可任選包含一個或多個碳碳雙鍵。除非用另一碳原子數(shù)目規(guī)定，否則術(shù)語意欲表示具2-30(包括端值)個碳原子的烴，例如2-20(包括端值)個、例如2-10(包括端值)、例如2-5(包括端值)個。術(shù)語炔基和亞炔基分別是指相應(yīng)的自由基和二價自由基。

術(shù)語“同素環(huán)狀芳族化合物”意欲表示芳族烴，例如苯和萘。

術(shù)語“雜環(huán)化合物”意欲表示包含5、6或7個環(huán)原子的環(huán)狀化合物，所述環(huán)原子中的1、2、3或4個為選自N、O和/或S的雜原子。實例包括雜環(huán)芳族化合物，例如噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪以及其部分或完全氫化的 等同物，例如哌啶、吡唑烷(pirazolidine)、吡咯烷、吡咯啉(pyroline)、咪唑烷、咪唑啉、哌嗪和嗎啉。

術(shù)語“雜烷烴”、“雜烯烴”和“雜炔烴”意欲表示其中一個或多個雜原子或基團(tuán)已插入到所述部分的結(jié)構(gòu)中的如上所定義的烷烴、烯烴和炔烴。雜基團(tuán)和原子的實例包括-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-C(O)--C(S)-和-N(R*)-，其中R*表示氫或C₁-C₆-烷基。雜烷烴實例包括：

術(shù)語“自由基”或“二價自由基”意欲表示其中分別移除一個或兩個氫原子的化合物。當(dāng)明確指出時，自由基亦可表示通過自化合物形式上移除較大原子基團(tuán)(例如羥基)形成的部分。

術(shù)語“鹵素”意欲表示周期表的第7主族成員，例如F、Cl、Br和I。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“芳基”意欲表示碳環(huán)芳環(huán)自由基或稠合芳環(huán)系統(tǒng)自由基(其中至少一個環(huán)為芳族的)。典型的芳基包括苯基、聯(lián)苯基、萘基等等。

本文單獨(dú)或聯(lián)合所用術(shù)語“雜芳基(heteroaryl或hetaryl)”，是指含有選自氮、氧或硫雜原子的一個或多個雜原子作為環(huán)原子的具有例如5-7個環(huán)原子的芳環(huán)自由基或具有例如7-18個環(huán)原子的稠合芳環(huán)系統(tǒng)自由基(其中至少一個環(huán)為芳族的)，其中N-氧化物和硫一氧化物和硫二氧化物為允許的雜芳族取代物。實例包括呋喃基、噻吩基、苯硫基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、異噻唑基、吡啶基、噠嗪基、吡嗪基、 嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、吲哚基和吲唑基等等。

術(shù)語“綴合(物)”作為名詞意欲表示經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，即含為了修改所述蛋白質(zhì)的性質(zhì)而與其鍵合的部分的蛋白質(zhì)；作為動詞，該術(shù)語意欲表示讓部分與蛋白質(zhì)鍵合以修改所述蛋白質(zhì)性質(zhì)的過程。

術(shù)語“單個cys”或“游離半胱氨酸”是指不參與雙鍵的半胱氨酸殘基。因此除一個或多個額外的二硫鍵以外，蛋白質(zhì)還可包括一個或多個單個cys殘基，只要所述單個cys不會導(dǎo)致內(nèi)部二硫鍵。

本文所用術(shù)語“前藥”表示可生物水解的酰胺和可生物水解的酯，亦包括：a)其中在這類前藥中的可生物水解官能團(tuán)包含在本發(fā)明化合物中的化合物；和b)可在給定官能團(tuán)處生物氧化或還原以產(chǎn)生本發(fā)明藥物物質(zhì)的化合物。這些官能團(tuán)實例包括1,4-二氫吡啶、N-烷基羰基-1,4-二氫吡啶、1,4-環(huán)己二烯、叔丁基等等。

本文所用術(shù)語“可生物水解的酯”為藥物物質(zhì)(在本情形中為本發(fā)明化合物)的酯，其a)不干擾母體物質(zhì)的生物活性，但賦予該物質(zhì)有利的體內(nèi)性質(zhì)，例如作用持續(xù)時間、起效等等；或b)生物學(xué)上無活性，但易于被受試者在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為生物活性組分。優(yōu)點(diǎn)為例如增加溶解性，或可生物水解的酯經(jīng)口服從腸道吸收，在血漿中轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物。此類可生物水解的酯的很多實例為本領(lǐng)域已知，舉例而言包括低級烷基酯(例如C₁-C₄)、低級酰氧基烷基酯、低級烷氧基酰氧基烷基酯、烷氧基酰氧基酯、烷基?；被榛ズ湍憠A酯。

本文所用術(shù)語“可生物水解的酰胺”為藥物物質(zhì)(在本情形中為本發(fā)明化合物)的酰胺，其a)不干擾母體物質(zhì)的生物活性，但賦予該物質(zhì)有利的體內(nèi)性質(zhì)，例如作用持續(xù)時間、起效等等；或b)生物學(xué)上無活性，但易于被受試者在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為生物活性組分。優(yōu)點(diǎn)為例如增加溶解性，或可生物水解的酰胺經(jīng)口服從腸道吸收，在血漿中轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物。此類可生物水解的酰胺的很多實例為本領(lǐng)域已知，舉例而言包括低級烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷基氨基烷 基羰基酰胺。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”意欲表示對患者無害的鹽。所述鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽、藥學(xué)上可接受的金屬鹽、銨鹽和烷化銨鹽。酸加成鹽包括無機(jī)酸以及有機(jī)酸的鹽。合適的無機(jī)酸的代表性實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等等。合適的有機(jī)酸的代表性實例包括蟻酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、富馬酸、乙醇酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗壞血酸、撲酸、雙亞甲基水楊酸、乙二磺酸、葡糖酸、檸康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、對氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等等。藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸加成鹽的另外實例包括J.Pharm.Sci.66,2,(1977)中所列舉的藥學(xué)上可接受的鹽，其通過引用并入本文中。金屬鹽的實例包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽等等。銨鹽和烷化銨鹽的實例包括銨鹽、甲基銨鹽、二甲基銨鹽、三甲基銨鹽、乙基銨鹽、羥基乙基銨鹽、二乙基銨鹽、丁基銨鹽、四甲基銨鹽等等。

本文所用化合物的"治療有效量"，意指足以治愈、減緩或部分阻止給定疾病及其并發(fā)癥的臨床表現(xiàn)的量。將足以實現(xiàn)此的量定義為"治療有效量"。對于每一目的，有效量應(yīng)視疾病或損傷的嚴(yán)重程度以及受試者的體重和一般狀態(tài)而定。應(yīng)該理解，可用常規(guī)實驗通過構(gòu)建值的矩陣并測定矩陣中的不同點(diǎn)來實現(xiàn)合適劑量的確定，這完全在訓(xùn)練有素的醫(yī)生或獸醫(yī)的普通技術(shù)范圍內(nèi)。

本文所用術(shù)語“治療”意指為以與病況例如疾病或病癥斗爭為目的而管理及護(hù)理患者。所述術(shù)語意欲包括對患者罹患的給定病況的全方位治療，例如給予活性化合物，以減輕癥狀或并發(fā)癥，延遲疾病、病癥或病況的進(jìn)展，減輕或減緩癥狀及并發(fā)癥，和/或治愈或消除疾病、病癥或病況，以及預(yù)防病況，其中預(yù)防應(yīng)理解為以與疾病、病況或病癥斗爭為目的而管理及護(hù)理患者，并包括給予活性化合物以防止癥狀 或并發(fā)癥發(fā)作。待治療的患者優(yōu)選為哺乳動物；具體而言為人，但其亦可包括動物，例如狗、貓、牛、綿羊及豬。

發(fā)明描述

在寬的方面，本發(fā)明涉及包含生長激素化合物(GH)的穩(wěn)定的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物具有

a)單個Cys突變，

b)額外的二硫鍵，或者

c)單個Cys突變和額外的二硫鍵，

其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與所述GH連接。

如果單個Cys突變存在時，則白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與Cys的硫殘基連接。如果額外的二硫鍵存在時(但無單個Cys突變)，則白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與本文所述生長激素化合物中的某一位置連接，例如hGH的40位、141位或N端。如果兩個或更多個白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與生長激素化合物連接，則所述白蛋白結(jié)合殘基與單個Cys突變(如果該突變存在)連接，或者如果僅額外的二硫鍵存在，則白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與本文所述的生長激素化合物的某一位置連接。

在一個實施方案中，生長激素化合物具有一個單獨(dú)的Cys突變。

在另一個實施方案中，生長激素化合物具有兩個單獨(dú)的Cys突變。

在又一個實施方案中，生長激素化合物具有額外的二硫鍵。

在又一個實施方案中，生長激素化合物具有一個單獨(dú)的Cys突變和一個額外的二硫鍵。

在又一個實施方案中，GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物。在其它實施方案中，GH與hGH有至少80％、例如至少85％、例如至少95％同一性，例如與SEQ ID NO:1有至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％同一性。在其它實施方案中，所述與hGH的同一性與用本文測定法I測定的hGH的生長激素活性的至少 10％、例如至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％關(guān)聯(lián)。任一個序列同一性實施方案可與任一個活性實施方案聯(lián)合，例如GH與hGH有至少80％同一性并與hGH的生長激素活性的至少60％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少90％同一性并與hGH的生長激素活性的至少40％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少95％同一性并與hGH的生長激素活性的至少80％關(guān)聯(lián)等等。如本文所述，HG可表示為MetHG，其表明序列包含額外的N端甲硫氨酸。

在一個實施方案中，GH是其中引入單個Cys突變的生長激素變體。在其它實施方案中，GH表示除單個Cys突變以外還含有1-5個突變的生長激素化合物。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變連接。在一個實施方案中，單個Cys突變位于GH的N端、H1、H2、L2或H3的位置。在其它實施方案中，單個Cys突變位于N端，所述突變是例如T3C、P5C、S7C的任一個或在H1(相當(dāng)于AA 9-35)中；所述突變是例如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C的任一個或在L1(相當(dāng)于AA36-71)中；所述突變是例如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C的任一個或優(yōu)選Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C的任一個或在H2、L2或H3(相當(dāng)于AA 72-98、AA 99-106和AA 107-127)中；所述突變是例如hGH(SEQ ID NO:1)的E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C的任一個或位于L3或H4(相當(dāng)于AA128-154和AA155-184)。在L3和H4(128-154和AA155-184)中，所述突變是例如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C的任一個或位于C端，所述突變是例如E186C、G187C、G190C的任一個。

如果單個Cys突變存在于hGH變體中，則該突變位于相應(yīng)的氨基酸殘基上。

在具體實施方案中，GH單個Cys突變在相當(dāng)于母體GH的位置引入，其相當(dāng)于選自以下的hGH(SEQ ID NO:1)的位置：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、K38、E39、Y42、S43、D47、P48、S55、S57、P59、S62、E65、Q69、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、G126、E129、D130、G131、P133、T135、G136、T142、D147、N149、D154、A155、L156、R178、E186、G187和G190，例如選自：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122和G126。GH綴合物在所述單個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈上還包含白蛋白結(jié)合部分。

在其它實施方案中，單個Cys突變位于hGH中的AA 93-106或hGH變體中的相應(yīng)殘基內(nèi)。在其它特定的實施方案中，單個Cys突變位于L2內(nèi)，例如在AA 99-106或AA 99-103或相應(yīng)殘基內(nèi)。

如果單個Cys突變存在于本發(fā)明的生長激素化合物綴合物中，則典型的單個Cys突變是E30C。又一個典型的單個Cys突變是Y42C。又一個典型的單個Cys突變是S55C。又一個典型的單個Cys突變是S57C。又一個典型的單個Cys突變是S62C。又一個典型的單個Cys突變是Q69C。又一個典型的單個Cys突變是S95C。又一個典型的單個Cys突變是A98C。又一個典型的單個Cys突變是N99C。又一個典型的單個Cys突變是S100C。又一個典型的單個Cys突變是L101C。又一個典型的單個Cys突變是V102C。又一個典型的單個Cys突變是S108C。

根據(jù)rhGH/受體復(fù)合物(PDB:3HHR)的晶體結(jié)構(gòu)，束(bundle)由4個主要螺旋組成：第一螺旋(A)自殘基9到34，第二螺旋(B)自殘基72到92和自殘基94到100，第三螺旋(C)自殘基106到128，而第四螺旋(D)自殘基155到184(M.R.Kasimova等.J.Mol.Biol.318,679-695,(2002))。4個主要螺旋稱為蛋白質(zhì)的核心。不是螺旋區(qū)的部分的殘基 被定義為環(huán)殘基，并且可以是柔性區(qū)、環(huán)、β-轉(zhuǎn)角、發(fā)夾和卷曲(coil)的部分。當(dāng)hGH與其結(jié)合蛋白(PDB:1HWG)復(fù)合時，得到略微不同定位的螺旋，其是上文提及的螺旋定義。

此外，本發(fā)明涉及包含至少一個引入的半胱氨酸殘基的GH綴合物，該殘基被引入到相當(dāng)于hGH的螺旋或環(huán)區(qū)中的位置的位置上。具體地說，可將氨基酸殘基引入到螺旋或環(huán)區(qū)中的表面暴露的位置上，所述螺旋或環(huán)區(qū)在例如僅hGH的模型結(jié)構(gòu)中或與其2個受體分子復(fù)合的hGH的模型結(jié)構(gòu)中，其側(cè)鏈超過25％暴露在表面上、優(yōu)選其側(cè)鏈超過50％暴露在表面上。在一個優(yōu)選的實施方案中，螺旋或環(huán)中的位置相當(dāng)于hGH的受體結(jié)合部位以外的位置?？蓱?yīng)用計算化學(xué)算法，鑒定表面暴露的殘基。例如，可采用可公開獲取的結(jié)構(gòu)(PDB登錄代碼1HGU和1HWG結(jié)構(gòu))的原子坐標(biāo)和默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，用來自Accelrys Inc.的計算機(jī)程序Quanta 2005計算相對表面可及性。該算法基本原理的描述可參見B.Lee和F.M.Richards,“The Interpretation of Protein Structures:Estimation of Static Accessibility(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析：靜態(tài)可及性的估算)"J.Mol.Biol.55,379-400,(1971)。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有額外的二硫鍵的GH連接。通常，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與hGH的N端、40位或141位連接。

在又一個實施方案中，GH在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間包含額外的二硫鍵。

在又一個實施方案中，GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于例如來自氨基酸殘基128-154(L3)的環(huán)區(qū)段中。

在又一個實施方案中，GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段連接。

在又一個實施方案中，GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。

在又一個實施方案中，GH包含額外的二硫鍵，且額外的二硫鍵 將螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)與環(huán)3(相當(dāng)于AA 128-154)連接。

在又一個實施方案中，GH在相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間包含額外的二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，GH的額外二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1 的以下位置中的一個氨基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。通常，額外的二硫鍵是Q84C/Y143C。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有單個Cys突變和額外二硫鍵的GH連接。通常，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與單個Cys突變連接。在一個具體實施方案中，GH具有額外的二硫鍵Q84C/Y143C和單個Cys突變L101C，其通過親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基連接。

在其它實施方案中，GH具有額外的二硫鍵和選自hGH(SEQ ID NO:1)的以下任一個的單個Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C和G190C，例如以下的任一個：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C或hGH變體的相應(yīng)殘基。

在一個具體實施方案中，GH具有額外的二硫鍵和單個Cys突變，且所述單個Cys突變在相當(dāng)于母體GH的位置上引入，其相當(dāng)于選自hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置：T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、K38、E39、Y42、S43、D47、P48、S55、S57、P59、S62、E65、Q69、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122、G126、E129、D130、G131、P133、T135、G136、T142、D147、N149、D154、A155、L156、R178、E186、G187和G190，優(yōu)選選自；T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122和G126。GH綴合物在所述單個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈上還包含白蛋白結(jié)合部分。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和額外的二硫鍵，其在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于例如來自氨基酸殘基128-154(L3)的環(huán)區(qū)段中。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將例如來自氨基酸殘基128-154的環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和將螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)與環(huán)3(相當(dāng)于AA 128-154)連接的額外二硫鍵。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、 I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、 S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變和介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

親水間隔基(B)的溶解度可通過其logP值來描述。LogP，亦稱為分配系數(shù)，是平衡時化合物在兩種不混溶溶劑的混合物在兩相中的濃度比的對數(shù)。通常溶劑之一為水，而第二種溶劑選自辛-1-醇、氯仿、環(huán)己烷和二壬酸丙二醇酯(PGDP)。主要由于氫鍵合作用，在這些不同溶劑中測量的LogP值顯示差異。辛醇可提供和接受氫鍵，而環(huán)己烷為惰性的。氯仿可提供氫鍵，而PGDP僅可接受氫鍵。LogP值可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測量。

在本發(fā)明的一個實施方案中，親水間隔基在辛-1-醇、氯仿、環(huán)己烷和二壬酸丙二醇酯(PGDP)的任一種中的LogP低于0，例如低于0.5。

在又一個實施方案中，親水間隔基在辛-1-醇、氯仿、環(huán)己烷和二壬酸丙二醇酯(PGDP)任一種中的logP低于-1。

或者，可應(yīng)用已發(fā)表的算法，將白蛋白結(jié)合劑部分或親水間隔基部分的LogP值計算為mLogP和/或cLogP(T.Fujita；J.Iwasa和C.Hansch,J.Am.Chem.Soc.86,5175-5180,(1964)"A New Substituent Constant,Pi,Derived from Partition Coefficients(從分配系數(shù)推導(dǎo)的新的取代基常數(shù)π)",C.A.Lipinski等.Advanced Drug Delivery Reviews,23,3-25,(1997)"Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings(在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)背景下估算溶解度和滲透性的實驗和計算方法)"和I.Moriguchi,S.Hirono,I.Nakagome,H.Hirano,Chem.Pharm.Bull.42,976-978,(1994)"Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods(通過幾種方法計算的藥物logP值 的可靠度的比較)")。

在本發(fā)明的一個實施方案中，親水間隔基(B)的mLogP<0。

在又一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過親水間隔基(B)與一個白蛋白結(jié)合殘基結(jié)合。

在又一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過親水間隔基(B)與白蛋白結(jié)合殘基連接，所述親水間隔基(B)與生長激素化合物(GH)中的游離半胱氨酸偶聯(lián)。

在另一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過一個或兩個親水間隔基與2個白蛋白結(jié)合殘基連接。因此，在一個實例中，一個白蛋白結(jié)合殘基通過一個親水間隔基(B)與單個Cys突變連接，另一個白蛋白結(jié)合殘基通過一個親水間隔基(B’)與40位或141位的谷氨酰胺連接；或者2個白蛋白結(jié)合殘基通過一個親水間隔基(B)與單個Cys突變或與40位、141位或N端的谷氨酰胺連接。在又一個實施方案中，生長激素化合物(GH)通過一個或多個親水間隔基與3個白蛋白結(jié)合殘基連接。

在一個實施方案中，親水間隔基包含至少一個OEG基序，即自由基8-氨基-3,6-二氧雜辛酸，即-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-。在又一個特定的實施方案中，親水間隔基包含至少兩個OEG基序。在一個實施方案中，這類OEG基序的取向使得-C(O)-最接近生長激素化合物但不連接生長激素化合物和白蛋白結(jié)合劑接頭，且使-NH-最接近白蛋白結(jié)合殘基。在包含兩個OEG基序的其它實施方案中，兩個基序具有相同的取向或不同的取向。在一個實施方案中，兩個這類OEG基序彼此鄰近定位，而在備選的實施方案中，這類OEG基序被一個或多個共價連接的原子分開。

在一個實施方案中，親水間隔基包含至少一個谷氨酸殘基。氨基酸谷氨酸包含兩個羧酸基團(tuán)。其γ-羧基可用于與賴氨酸的ε-氨基或與OEG分子的氨基(如存在的話)或與另一個Glu殘基的氨基(如存在的話)形成酰胺鍵。或者α-羧基可用于與賴氨酸的ε-氨基或與OEG分子的氨基(如存在的話)或與另一個Glu殘基的氨基(如存在的話)形成相似 的酰胺鍵。Glu的氨基可進(jìn)而與白蛋白結(jié)合殘基的羧基或與OEG基序的羧基(如存在的話)或與另一個Glu的γ-羧基或α羧基(如存在的話)形成酰胺鍵。一個Glu的氨基與第二Glu的γ-羧基的連接可稱為“γ-Glu”基序。

在一個實施方案中，親水間隔基包含至少一個聯(lián)合的OEG-Glu基序(-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)NH-CH(C(O)OH)-(CH₂)₂-C(O)-)或至少一個聯(lián)合的Glu-OEG基序(-NH-CH(C(O)OH)-(CH₂)₂-C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-)或其組合，其中所述Glu-OEG和OEG-Glu基序可被一個或多個共價連接的原子分開或可通過形成γ-Glu的Glu酰胺鍵彼此直接鍵合。

又一方面，本發(fā)明涉及生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中生長激素綴合物具有下式(I)：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有單個Cys突變的生長激素化合物，

B表示與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

在又一個實施方案中，GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物。在其它實施方案中，GH與hGH(SEQ ID NO:1)具有至少80％、例如至少85％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％同一性。在其它實施方案中，所述與hGH的同一性與用本文測定法I測定的hGH的生長激素活性的至少10％、例如至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％關(guān)聯(lián)。任一個序列同一性實施方案可與任一個活性實施方案組合，例如GH與hGH有至少80％同一性并與hGH的生長激素活性的至少60％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少90％同一性并與hGH的生長激素活性的至少40％ 關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少95％同一性并與hGH的生長激素活性的至少80％關(guān)聯(lián)等等。

在其它實施方案中，綴合物的GH具有單個Cys突變，其選自GH的N端、H1、H2、L2或H3區(qū)中的單個Cys突變中的任一個。在其它這類實施方案中，單個Cys突變位于N端，所述突變是例如T3C、P5C、S7C的任一個或在H1(相當(dāng)于AA 9-35)中；所述突變是例如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C的任一個或在L1(相當(dāng)于AA36-71)中；所述突變是例如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C的任一個或優(yōu)選Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C的任一個或在H2、L2或H3(相當(dāng)于AA 72-98、AA 99-106和AA 107-127)中；所述突變是例如hGH(SEQ ID NO:1)的E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C的任一個或在L3或H4(相當(dāng)于AA128-154和AA155-184)中。在L3和H4(128-154和AA155-184)中，所述突變是例如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C的任一個或在C端，所述突變是例如E186C、G187C、G190的任一個。

如果單個Cys突變存在于hGH變體中，則該突變位于相應(yīng)的氨基酸殘基上。

其它實施方案包括其中GH中的單個Cys突變選自hGH(SEQ ID NO:1)的以下任一個的GH綴合物：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C和G190C，例如以下的任一個；T3C、P5C、S7C、 D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

在甚至更多的實施方案中，單個Cys突變位于hGH中的AA93-106或hGH變體中的相應(yīng)殘基內(nèi)。在其它特定的實施方案中，單個Cys突變位于L2內(nèi)，例如在AA 99-106或AA 99-103或相應(yīng)殘基內(nèi)。

在又一個實施方案中，A選自

其中*表示通過W與B連接。

在又一個實施方案中，W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

在其它實施方案中，B包含一個或多個OEG和/或上述γ-Glu基序或由一個或多個OEG和/或上述γ-Glu基序組成。

在又一個實施方案中，B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，C_1-6-烷基任選被氧代基(oxo)、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m2和m5獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中C_1-6-烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，其中E1和E2為-O-，選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵(open bond)。

在又一個實施方案中，X₄為價鍵，W₆選自吡咯烷-2,5-二酮、 -NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，B選自

在又一個實施方案中，GH綴合物選自

又一方面，本發(fā)明涉及具有下式(I)的生長激素綴合物及其藥學(xué)上 可接受的鹽：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有額外二硫鍵的生長激素化合物，

B表示親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

在又一個實施方案中，GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物。在其它實施方案中，GH與hGH(SEQ ID NO:1)有至少80％、例如至少85％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％同一性。在其它實施方案中，所述與hGH的同一性與用本文測定法I測定的hGH的生長激素活性的至少10％、例如至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％關(guān)聯(lián)。任一個序列同一性實施方案可與任一個活性實施方案組合，例如GH與hGH有至少80％同一性并與hGH的生長激素活性的至少60％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少90％同一性并與hGH的生長激素活性的至少40％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少95％同一性并與hGH的生長激素活性的至少80％關(guān)聯(lián)等等。

在又一個實施方案中，綴合物的GH在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間包含額外的二硫鍵。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段(例如來自氨基酸殘基128-154)中。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段，例如來自氨基酸殘基128-154(H3)與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含額外的二硫鍵，其將螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)與環(huán)3(相當(dāng)于AA 128-154)連接。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、 S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間的額外二硫鍵：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，A選自

其中*表示通過W與B連接。

在又一個實施方案中，W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

在其它實施方案中，B包含一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序或者由一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序組成。

在又一個實施方案中，B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基(hetaryl)、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m2和m5獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中C_1-6-烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-(其中E1和E2為-O-)選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

在又一個實施方案中，B選自

在又一個實施方案中，A通過B與相當(dāng)于SEQ ID NO:1中40位、141位的位置上的谷氨酰胺殘基或生長激素化合物的N端殘基連接。

在又一個實施方案中，GH綴合物選自

又一方面，本發(fā)明涉及生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中生長激素綴合物具有下式(I)：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有單個Cys突變和額外二硫鍵的生長激素化合物，

B表示與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

在又一個實施方案中，GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物。在其它實施方案中，GH與hGH(SEQ ID NO:1)具有至少80％、例如至少85％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％同一性。在其它實施方案中，所述與hGH的同一性與用本文測定法I測定的hGH的生長激素活性的至少10％、例如至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％關(guān)聯(lián)。任一個序列同一性實施方案可與任一個活性實施方案組合，例如GH與hGH有至少80％同一性并與hGH的生長激素活性的至少60％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少90％同一性并與hGH的生長激素活性的至少40％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少95％同一性并與hGH的生長激素活性的至少80％關(guān)聯(lián)等等。

在其它實施方案中，綴合物的GH具有額外的二硫鍵和選自GH的N端、H1、H2、L2或H3區(qū)中的單個Cys突變中任一個的單個Cys突變。在其它這類實施方案中，單個Cys突變位于N端，所述突變是例如T3C、P5C、S7C的任一個或在H1(相當(dāng)于AA 9-35)中；所述突變是例如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C的任一個或在L1(相當(dāng)于AA36-71)中；所述突變是例如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C的任一個或優(yōu)選Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C的任一個或在H2、L2或H3(相當(dāng)于AA 72-98、AA 99-106和AA 107-127)中；所述突變是例如hGH(SEQ ID NO:1)的E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C 和G126C的任一個或在L3或H4(相當(dāng)于AA128-154和AA155-184)中。在L3和H4(128-154和AA155-184)中，所述突變是例如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C的任一個或在C端，所述突變是例如E186C、G187C、G190C的任一個。

如果單個Cys突變存在于hGH變體中，則該突變位于相應(yīng)的氨基酸殘基上。

其它實施方案包括GH綴合物，其在GH中具有額外的二硫鍵和選自hGH(SEQ ID NO:1)的以下任一個的單個Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C和G190C，例如以下的任一個；T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

在甚至更多的實施方案中，單個Cys突變位于hGH的AA 93-106或hGH變體的相應(yīng)殘基內(nèi)。在其它特定的實施方案中，單個Cys突變位于L2內(nèi)，例如在AA 99-106或AA 99-103或相應(yīng)殘基內(nèi)。

在其它實施方案中，額外的二硫鍵可以是在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間的額外二硫鍵。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變型和額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段(例如來自氨基酸殘基128-154(L3))中。

在又一個實施方案中，GH包含單個Cys突變型和額外的二硫鍵， 其中額外的二硫鍵將例如來自氨基酸殘基128-154的環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含單個Cys突變型和將螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)與環(huán)3(相當(dāng)于AA 128-154)連接的額外二硫鍵。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含單個Cys突變型和額外二硫鍵，其介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H18C/Y143C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在又一個實施方案中，綴合物的GH包含單個cys突變型和額外二硫鍵，其介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C 和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，額外的二硫鍵介于相當(dāng)于SEQ ID NO:1的以下位置中的一個氨基酸對之間：S57C/Y143C，Q84C/Y143C，S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在又一個實施方案中，GH包含L2中的單個半胱氨酸突變和額外二硫鍵，其將環(huán)區(qū)段例如來自氨基酸殘基128-154(H3)與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。

在一個實施方案中，GH包含選自以下的突變的組合：A98C/Q84C/Y143C、A98C/S85C/Y143C、A98C/S85C/S144C、N99C/Q84C/Y143C、N99C/S85C/Y143C、N99C/S85C/S144C、S101C/Q84C/Y143C、S101C/S85C/Y143C、S101C/S85C/S144C、L101C/Q84C/Y143C、L101C/S85C/Y143C、L101C/S85C/S144C、C102C/Q84C/Y143C、C102C/S85C/Y143C和C102C/S85C/S144C。

在又一個實施方案中，A選自

其中*表示通過W與B連接。

在又一個實施方案中，W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

在其它實施方案中，B包含一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序或者由一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序組成。

在又一個實施方案中，B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN，-OH，-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、 -C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6。

在又一個實施方案中，m2和m5獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

在又一個實施方案中，D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

在又一個實施方案中，W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中C_1-6-烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-(其中E1和E2為-O-)選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

在又一個實施方案中，X₄為價鍵，W₆選自吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，B選自

在又一個實施方案中，GH綴合物選自

通常，本發(fā)明的綴合物具有通過親水間隔基(B)(例如一個親水間 隔基(B))與生長激素化合物(GH)連接的一個白蛋白結(jié)合殘基(A)。

然而，生長激素化合物(GH)可通過親水間隔基與2個白蛋白結(jié)合殘基連接。

因此，又一方面，本發(fā)明涉及下式(II)的生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：

A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)

其中

GH表示具有單個Cys突變的生長激素化合物，

B和B’獨(dú)立地為與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，

W’是連接A’和B’的化學(xué)基團(tuán)，

A和A’獨(dú)立表示白蛋白結(jié)合殘基。

此外，另一方面，本發(fā)明涉及下式(II)的生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：

A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)

其中

GH表示具有額外二硫鍵的生長激素化合物，

B和B’獨(dú)立地為親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，

W’是連接A’和B’的化學(xué)基團(tuán)，

A和A’獨(dú)立表示白蛋白結(jié)合殘基。

再一方面，本發(fā)明涉及下式(II)的生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：

A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)

其中

GH表示具有單個Cys突變和額外二硫鍵的生長激素化合物，

B和B’獨(dú)立地為與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，

W’連接A’和B’的化學(xué)基團(tuán)，

A和A’獨(dú)立表示白蛋白結(jié)合殘基。

在上述式(II)的綴合物中，W’選自與W相同的基團(tuán)，A’選自與A相同的基團(tuán)，B’選自與B相同的基團(tuán)，而且要理解的是W和W’、A和A’及B和B’獨(dú)立選自如本文定義的相應(yīng)基團(tuán)的任一個。因此，本文W、A和B的任何實施方案也是W’、A’和B’的實施方案。此外，本文所述任一個實施方案獨(dú)立地是指式(I)和式(II)的綴合物兩者以及適當(dāng)時其寬的方面和實施方案。

上述實施方案以及下述實施方案應(yīng)視為是指本文所述的任一個方面以及本文所述的任一個的實施方案，除非具體說明實施方案涉及本發(fā)明的某一方面或某些方面。

在一個實施方案中，GH是hGH的變體，其中變體要理解為是通過以下方法而獲得的化合物：將hGH序列的一個或多個氨基酸殘基用另一個天然或非天然的氨基酸取代；和/或通過將一個或多個天然或非天然的氨基酸添加至hGH序列；和/或通過缺失hGH序列中的一個或多個氨基酸殘基，其中這些步驟的任一個可任選隨后對一個或多個氨基酸殘基的進(jìn)行進(jìn)一步衍生化。

在又一個實施方案中，GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少90％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物。在其它實施方案中，GH與hGH(SEQ ID NO:1)具有至少80％、例如至少85％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％或例如至少99％同一性。在其它實施方案中，所述與hGH的同一性與用本文測定法I測定的hGH的生長激素活性的至少10％、例如至少20％、例如至少40％、例如至少60％、例如至少80％關(guān)聯(lián)。任一個序列同一性實施方案可與任一個活性實施方案組合，例如GH與hGH有至少80％同一性并與hGH的生長激素活性的至少60％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少90％同一性并與hGH的生長激素活性的至少40％關(guān)聯(lián)；GH與hGH有至少95％同一性并與hGH的生長激素活性的至少80％關(guān)聯(lián)等等。

在再一個實施方案中，GH是hGH(SEQ ID NO:1)。

在其它實施方案中，B包含一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序或者由一個或多個OEG和/或一個或多個上述γ-Glu基序組成。

在式(I)或式(II)的綴合物的又一個實施方案中，親水間隔基B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、 -(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，W₁選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₁選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂-。

在又一個實施方案中，W₂選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₂選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂-。

在又一個實施方案中，W₃選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₃選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂-。

在又一個實施方案中，W₄選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₄選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂-。

在又一個實施方案中，W₅選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₅選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂-。

在又一個實施方案中，W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。通常，W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、 -C(O)NHS(O)₂-或-NHC(O)C_1-6-烷基。

在又一個實施方案中，D1、D2、F均為價鍵，I6為0，W6選自吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

在又一個實施方案中，R¹選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH取代。通常，R¹選自-C(O)OH、-C(O)NH₂或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，R²選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH取代。通常，R²選自-C(O)OH、-C(O)NH₂或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，R³選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH取代。通常，R³選自-C(O)OH、-C(O)NH₂或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，R⁴選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH取代。通常，R⁴選自-C(O)OH、-C(O)NH₂或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，R⁵選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH取代。通常，R⁵選自-C(O)OH、-C(O)NH₂或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

在又一個實施方案中，E1選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。通常，E1選自-O-。

在又一個實施方案中，E2選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。通常，E2選 自-O-。

在又一個實施方案中，E1和E2兩者均為-O-。

在又一個實施方案中，E1和E2兩者均為-N(R⁶)-。

在又一個實施方案中，F(xiàn)為苯基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵。

在又一個實施方案中，D1選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。通常，D1選自-N(R⁶)-。

在又一個實施方案中，D2選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。通常，D1選自-N(R⁶)-。

在又一個實施方案中，I1為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，I2為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，I3為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，I4為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，I5為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，I6為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，m1為0-6，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，m2為0-10，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在又一個實施方案中，m3為0-5，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，m4為0-5，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，m5為0-10，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在又一個實施方案中，m6為0-5，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，m7為0-5，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，n1為0-10，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，n2為0-10，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，n3為0-10，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，n4為0-10，例如0、1、2、3、4、5或6。

在又一個實施方案中，

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

其中-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和

-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

在又一個實施方案中，所述親水間隔基的摩爾量在80道爾頓(D)-1500D的范圍內(nèi)或在300D-1100D的范圍內(nèi)。

在再一個實施方案中，W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、 -C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

在W的一個實施方案中，Y為-(CH₂)_I7-環(huán)己基-W₈-。

在又一個實施方案中，Y為價鍵。

在一個實施方案中，W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-，-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂。

在又一個實施方案中，W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-或價鍵。通常，W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-或-C(O)NHS(O)₂。

在又一個實施方案中，I7為0或1。

在又一個實施方案中，本發(fā)明的親水間隔基B選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

與本發(fā)明的生長激素化合物連接的白蛋白結(jié)合殘基(上述式(I)或式(II)的取代基A)是親脂性殘基，其與白蛋白非共價結(jié)合。通常，白蛋白結(jié)合殘基在生理pH下帶有負(fù)電荷，并且對人血清白蛋白的結(jié)合親和力低于約10μM或甚至低于約1μM。

在本發(fā)明的生長激素化合物的又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、支鏈烷基、具有ω-羧酸基團(tuán)或ω-羧酸等排體(isoster)的基團(tuán)。通常，白蛋白結(jié)合殘基具有6-40個碳原子。在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基具有8-26個碳原子。在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基具有8-20個碳原子。

在又一個實施方案中，A具有14-26個碳原子并包含ω-羧酸基團(tuán)。在又一個實施方案中，A具有14-26個碳原子和包含ω-羧酸等排體，例如四唑。

在又一個實施方案中，A選自

其中*表示通過W與B連接。

優(yōu)選以選擇性方式將親水間隔基(B)引入生長激素化合物(GH)的位置中以便能夠控制：應(yīng)將一個還是兩個白蛋白結(jié)合殘基(A)摻入生長激素化合物中。親水間隔基(B)可與GH化合物的氨基酸側(cè)鏈連接。這類氨基酸側(cè)鏈可以是GH化合物的經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸側(cè)鏈。另一個這樣的氨基酸側(cè)鏈可以是GH化合物的酶促修飾的氨基酸側(cè)鏈。優(yōu)選使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將親水間隔基引入相當(dāng)于SEQ ID NO:1的40位或141位的位置上的谷氨酰胺殘基。選擇性引入親水間隔基的另一種方式是在生長激素化合物例如hGH(SEQ ID NO:1)的N端殘基中。

在式(I)的生長激素綴合物中，片段A-W-B可以是線性或支鏈的。在一個實施方案中，A-W-B不是線性肽。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基在相當(dāng)于SEQ IDNO:1的40位的位置上與谷氨酰胺殘基連接。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基在相當(dāng)于SEQ ID NO:1的141位的位置上與谷氨酰胺殘基連接。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與生長激素化合物例如hGH(SEQ ID NO:1)的N端殘基連接。

在又一個實施方案中，白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與相當(dāng)于生長激素化合物例如hGH(SEQ ID NO:1)的40位、141位的位置上的谷氨酰胺殘基連接并與N端殘基連接。

本發(fā)明的生長激素綴合物選自

又一方面，本發(fā)明涉及生長激素變體，例如本文所述的生長激素化合物(GH)。生長激素變體可用作治療劑或在生長激素綴合物的制備中用作中間體。生長激素化合物可通過本領(lǐng)域已知的或本文描述的重組方法產(chǎn)生。在一個實施方案中，生長激素變體是可溶解的。

又一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述生長激素變體的組合物。

在一個實施方案中，組合物包含含有選自以下的單個Cys突變的生長激素變體：P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物的生長激素變體在生長激素化合物的N端(AA 1-8)、螺旋1、環(huán)1、螺旋2、環(huán)2或螺旋3中具有單個Cys突變。

在一個實施方案中，單個Cys突變位于N端，所述突變是例如P5C、S7C中的任一個。在一個實施方案中，單個Cys突變位于H1(相當(dāng)于AA 9-35)，例如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C中的任一個。在一個實施方案中，單個Cys突變位于L1(相當(dāng)于AA36-71)，所述突變是例如K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55、S57C、P59C、S62C、E65C、Q69C的任一個或優(yōu)選Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C的任一個。在一個實施方案中，單個Cys突變位于H2(AA 72-98)，例如E88C、Q91C、S95C和A98C的任一個。在一個實施方案中，單個Cys突變位于AA 99-127內(nèi)。在一個實施方案中，單個Cys突變位于L2(AA 99-106)，例如N99C、S100C、L101C、V102C和Y103C中的任一個。在一個實施方案中，單個Cys突變位于H3(AA 107-127)，所述突變是例如hGH(SEQ ID NO:1)的D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C中的任一個或位于L3或H4(相當(dāng)于AA128-154和AA155-184)，所述突變是例如E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、V180C中的任一個；或者位于C端，所述突變是例如E186C、G187C和G190C中的任一個。如果單個Cys突變存在于hGH變體中，則該突變位于相應(yīng)的氨基酸殘基上。在甚至更多的實施方案中，單個Cys突變位于hGH中的AA 93-106或hGH變體的相應(yīng)殘基內(nèi)。在其它特定的實施方案中，單個Cys突變位于L2內(nèi)，例如在AA 99-106或AA 99-104或相應(yīng)殘基內(nèi)。

在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含含有單個Cys突變和額外二硫鍵的生長激素變體。在一個實施方案中，單個Cys突變是上述單個Cys突變中的任一個。在一個實施方案中，GH中的單個Cys突變選自hGH(SEQ ID NO:1)中的以下任一個：T3C、P5C、S7C、D11C、 H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C和G190C，例如hGH(SEQ ID NO:1)中的以下任一個；P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C或相應(yīng)的殘基。在一個實施方案中，額外的二硫鍵選自以下胱氨酸突變對：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。在一個實施方案中，生長激素變體包含單個半胱氨酸和選自以下半胱氨酸突變對的額外二硫鍵：S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在一個實施方案中，生長激素變體包含L2中的單個半胱氨酸突變和額外二硫鍵，其將環(huán)區(qū)段例如來自氨基酸殘基128-154(H3)與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2(相當(dāng)于AA 72-98)連接。在一個實施方案中，生長激素變體包含選自以下突變的組合：A98C/Q84C/Y143C、A98C/S85C/Y143C、A98C/S85C/S144C、N99C/Q84C/Y143C、N99C/S85C/Y143C、N99C/S85C/S144C、S101C/Q84C/Y143C、S101C/S85C/Y143C、S101C/S85C/S144C、L101C/Q84C/Y143C、L101C/S85C/Y143C、L101C/S85C/S144C、C102C/Q84C/Y143C、 C102C/S85C/Y143C和C102C/S85C/S144C。在一個實施方案中，生長激素變體包含選自以下突變的組合：A98C/Q84C/Y143C、N99C/Q84C/Y143C、S101C/Q84C/Y143C、L101C/Q84C/Y143C和C102C/Q84C/Y143C。在一個實施方案中，生長激素變體包含突變L101C、Q84C和Y143C。

又一方面，本發(fā)明涉及用于治療的包含生長激素化合物(GH)的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物(GH)通過親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基連接。此外，在本發(fā)明的生長激素綴合物中，GH、白蛋白結(jié)合殘基和親水間隔基選自上述實施方案的任一個，具體地講，生長激素綴合物具有式(I)或式(II)。

又一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含生長激素綴合物或任選與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合的藥學(xué)上可接受的鹽，所述生長激素綴合物包含通過親水間隔基與白蛋白結(jié)合殘基連接的生長激素化合物(GH)。

本領(lǐng)域所知術(shù)語“同一性”是指兩個或更多個蛋白質(zhì)序列間的關(guān)系，這通過比較序列來確定。本領(lǐng)域中，“同一性”還意指蛋白質(zhì)之間序列相關(guān)性的程度，這通過兩個或更多個氨基酸殘基的串(string)之間的匹配數(shù)目確定?！巴恍浴睖y量具有兩個或更多個由具體數(shù)學(xué)模型或計算機(jī)程序(即“算法”)得出的空位比對(如果有的話)的序列之間較小者間的相同匹配的百分比?？梢酝ㄟ^已知方法容易地計算出相關(guān)蛋白質(zhì)的同一性。這類方法包括但不限于描述于以下文獻(xiàn)的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.主編,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.主編,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.主編,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.主編,M.Stockton Press,New York, 1991；以及Carillo等,SIAMJ.Applied Math.48,1073(1988)。

設(shè)計了確定同一性的優(yōu)選方法以得到所測試序列之間的最大匹配。確定同一性的方法描述于可公開獲取的計算機(jī)程序中。確定2個序列之間同一性的優(yōu)選計算機(jī)程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.12，387(1984)；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,J.Mol.Biol.215，403-410(1990))。BLASTX程序可公開獲自美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)和其它來源(BLAST手冊，Altschul等.NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等，同上)。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于確定同一性。

例如，運(yùn)用計算機(jī)算法GAP(Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)，針對其相應(yīng)氨基酸的最佳匹配，對待確定序列同一性百分比的兩個蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(“匹配跨度(matched span)”，由算法確定)?？瘴婚_放罰分(gap opening penalty)(經(jīng)計算為平均對角線(average diagonal)的三倍；“平均對角線”是所用比較矩陣對角線的平均值；“對角線”是通過具體比較矩陣賦予每個完全匹配氨基酸的分值或數(shù)目)，空位延伸罰分(其通常為{分?jǐn)?shù)(1/10)}乘以空位開放罰分)以及比較矩陣(例如PAM 250或BLOSUM 62)與算法結(jié)合使用。算法還利用了標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(對于PAM 250比較矩陣參見Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷,補(bǔ)充材料3,(1978)；對于BLOSUM 62比較矩陣參見Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,10915-10919,(1992))。

蛋白質(zhì)序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列參數(shù)：

算法：Needleman等,J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；比較矩陣：Henikoff等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10915-10919,(1992)的BLOSUM 62；空位罰分：12，空位長度罰分(Gap Length Penalty)：4，相似性閾值：0。

具有上述參數(shù)的GAP程序是有用的。運(yùn)用GAP算法，上述參數(shù)對于蛋白質(zhì)比較是默認(rèn)參數(shù)(連同末端缺口無罰分)。

與相應(yīng)的未綴合的生長激素(亦稱為母體化合物)相比，本發(fā)明的化合物具有改進(jìn)的藥理學(xué)性質(zhì)。這類藥理學(xué)性質(zhì)的實例包括功能性體內(nèi)半衰期、免疫原性、腎臟過濾、蛋白酶保護(hù)和白蛋白結(jié)合。

術(shù)語“功能性體內(nèi)半衰期”以其標(biāo)準(zhǔn)意義使用，即GH或GH綴合物的50％生物活性仍然存在于機(jī)體/靶器官中的時間，或GH或GH綴合物的活性是其起始值的50％時的時間。作為測定功能性體內(nèi)半衰期的備選方法，可測定“體內(nèi)血漿半衰期”，即在被清除前50％的GH或GH綴合物在血漿或血流中循環(huán)的時間。血漿半衰期的測定通常比測定功能性半衰期更簡單，血漿半衰期的大小常常是功能性體內(nèi)半衰期大小的良好指示物。血漿半衰期的替代術(shù)語包括血清半衰期、循環(huán)性半衰期、循環(huán)半衰期、血清清除率、血漿清除率和清除半衰期。

與功能性體內(nèi)半衰期或血漿半衰期聯(lián)用的術(shù)語“增加”用來說明GH綴合物的相關(guān)半衰期與母體GH的相比呈統(tǒng)計顯著性增加，這通過在相當(dāng)?shù)臈l件下測定。例如相關(guān)半衰期可增加至少約25％、例如至少約50％、例如至少約100％、150％、200％、250％或500％。在一個實施方案中，與母體GH的半衰期相比，本發(fā)明的化合物增加半衰期至少約5小時、優(yōu)選至少約24小時、更優(yōu)選至少約72小時、最優(yōu)選至少約7天。

體內(nèi)血漿半衰期的測量可按照文獻(xiàn)所述以多種方式進(jìn)行。體內(nèi)血漿半衰期的增加可量化為清除率(CL)降低或平均滯留時間(MRT)增加。認(rèn)為如下本發(fā)明綴合的GH具有增加的體內(nèi)血漿半衰期，即如在合適測定中所測定，其CL下降至小于母體GH的CL的70％，例如小于50％、例如小于20％、例如小于10％。認(rèn)為如下本發(fā)明綴合的GH具有增加的體內(nèi)血漿半衰期，即在合適測定中其MRT增加到多于母體GH MRT的130％，例如多于150％，例如多于200％，例如多于500％?？稍跇?biāo)準(zhǔn)藥代動力學(xué)研究中使用合適的試驗動物評估清除率和 平均滯留時間。為給定蛋白質(zhì)選擇合適的試驗動物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。當(dāng)然在人中的試驗代表最終測試。合適的本文動物包括標(biāo)準(zhǔn)Sprague-Dawley雄性大鼠、小鼠和食蟹猴(cynomolgus monkey)。通常以單次皮下推注來注射小鼠和大鼠，而可以單次皮下推注或以單次靜脈劑量來注射猴子。注射量視試驗動物而定。隨后酌情經(jīng)一到五天來采取血液樣品用于評估CL和MRT。通過ELISA技術(shù)適宜地分析血液樣品。

術(shù)語化合物的“免疫原性”是指當(dāng)將化合物給予人時引起有害免疫反應(yīng)(不論是體液的、細(xì)胞的還是二者)的能力。在任何人亞群中，可能有對特定給予的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出敏感性的個體?？赏ㄟ^用本領(lǐng)域已知常規(guī)方法量化敏感個體中存在的生長激素抗體和/或生長激素響應(yīng)性T-細(xì)胞來測定免疫原性。在一個實施方案中，相對于母體GH對敏感個體的免疫原性，本發(fā)明綴合的GH在敏感個體中的免疫原性減少至少約10％，優(yōu)選至少約25％，更優(yōu)選至少約40％和最優(yōu)選至少約50％。本文所用術(shù)語“蛋白酶保護(hù)”或“蛋白酶保護(hù)的”，意欲表示本發(fā)明綴合的GH比母體GH更能抵抗血漿肽酶或蛋白酶。已知存在于血漿中的蛋白酶和肽酶參與循環(huán)蛋白質(zhì)的降解，所述循環(huán)蛋白質(zhì)為例如循環(huán)肽激素，例如生長激素。所述蛋白酶保護(hù)可通過本文所述實施例A的方法測量。

生長激素可對例如凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白質(zhì)酶引起的降解易感。測定這些蛋白酶降解的試驗闡述于J.Biotech.,65,183,(1998)中。在一個實施方案中，GH綴合物的水解速率小于母體GH的70％，例如小于40％，例如小于10％。

哺乳動物物種循環(huán)血液中最豐富的蛋白質(zhì)組分是血清白蛋白，其正常以每100毫升全血大約3至4.5克的濃度存在。血清白蛋白是大約65,000道爾頓的血液蛋白質(zhì)，其在循環(huán)系統(tǒng)中具有若干重要功能。其作為在血液中發(fā)現(xiàn)的多種有機(jī)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用，作為經(jīng)由血液的不同代謝物例如脂肪酸和膽紅素的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用，并由于 其豐富性，作為循環(huán)血液的滲透調(diào)節(jié)劑起作用。血清白蛋白半衰期超過一周，增加蛋白質(zhì)血漿半衰期的一種方法是讓所述蛋白質(zhì)與結(jié)合血清白蛋白的基團(tuán)綴合?？扇鏙.Med.Chem.,43,1986,(2000)所述來測定白蛋白結(jié)合性質(zhì)，所述文獻(xiàn)通過引用并入本文。

式(I)或(II)的生長激素綴合物具有生長激素活性，并因此可用于從循環(huán)生長激素量的增加獲益的疾病或病態(tài)的治療。具體而言，本發(fā)明提供用于治療以下的方法：生長激素缺乏(GHD)；特納綜合征；普-韋綜合征(Prader-Willi syndrome,PWS)；努南綜合征；唐氏綜合征；慢性腎臟疾病、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化、接受HAART治療的兒童HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡(SGA)出生的矮小兒童(short children)；非SGA的以極低出生體重(VLBW)出生的兒童的身材矮小癥；骨骼發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小癥(ISS)；成人GHD；長骨骨折，所述長骨為例如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨(matacarpea)、跖骨(matatarsea)和指骨(digit)；海綿骨例如頭骨(scull)、手腕骨(base ofhand)和腳底骨(base of food)的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行或經(jīng)歷牽拉骨生成技術(shù)(distraction oteogenesis)的患者；髖關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)盤置換(discus replacement)、關(guān)節(jié)盤修復(fù)、脊柱融合或例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中的假體固定后的患者；其中已固定骨接合材料(例如釘、螺釘和板)的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如脛骨或第一腳趾的骨解剖(osteatomsia)后的患者；移植物植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝關(guān)節(jié)軟骨退化；特納綜合征患者中的骨質(zhì)疏松癥；男性骨質(zhì)疏松癥；長期透析的成年患者(APCD)；APCD中營養(yǎng)不良相關(guān)的心血管疾??；APCD中的惡病質(zhì)逆轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD中的慢性阻塞性肺病(chronic abstractive pulmonal disease)；APCD中的HIV；APCD老年人(elderlywith APCD)；APCD中的慢性肝病、APCD中的疲勞綜合征；克羅恩?。桓喂δ苁軗p；具有HIV感染的男性；短腸綜合征；向心性肥胖；HIV相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS)；男性 不育癥；大選擇性手術(shù)、酒精/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；老化；虛弱的老年人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷性損傷的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；外傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下腔出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素性肌病；或糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的兒童身材矮小癥，所述方法包括給予有需要的患者治療有效量的式(I)或(II)的生長激素綴合物。

又一方面，本發(fā)明提供用于加速肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口愈合；加快或改善血液流向受損組織；或降低受損組織的感染率的方法，所述方法包括給予有需要的患者治療有效量的式(I)或式(II)的生長激素綴合物。

在再一實施方案中，本發(fā)明涉及式(I)或(II)生長激素綴合物在制備疾病用藥中的用途，所述疾病自生長激素血漿水平的提高而受益，例如上述疾病。

典型的胃腸外劑量介于每次給予10^-9mg/kg-約100mg/kg體重。典型的給藥劑量為每次給予約0.0000001-約10mg/kg體重。準(zhǔn)確劑量將視以下因素而定，例如適應(yīng)癥、藥劑、給藥頻率和方式、待治療受試者的性別、年齡和一般情況、待治療的疾病或病況的性質(zhì)和嚴(yán)重性、期需的治療效果和對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其它因素。

典型的給藥頻率為每天兩次、每天一次、兩天一次、每周兩次、每周一次或甚至更長的給藥間隔。由于本發(fā)明融合蛋白的長半衰期，長給藥間隔的給藥方案是本發(fā)明的特別實施方案，所述長給藥間隔為例如每周兩次、每周一次或甚至更長的給藥間隔。

許多疾病在治療中使用同時給予或序貫給予的不止一種藥物治療。因此，將式(I)或(II)生長激素綴合物與一種或多種其它治療活性化合物聯(lián)合用于治療上述疾病之一的治療方法中在本發(fā)明范圍內(nèi)，所述其它治療活性化合物通常用于治療所述疾病。依次類推，亦在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，將式(I)或(II)生長激素綴合物連同通常用于治療上述疾病之一的其它治療活性化合物用于制備用于所述疾病的藥物中。

通用方法

酶綴合：

在本發(fā)明的生長激素綴合物的制備中，通常在制備式(I)的A-W-B-GH綴合物時建立的至少一個共價鍵通過使用如下面的實施例中說明的酶來制備。這類酶可例如選自轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。通常，所述酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。這類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可例如選自微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和因子XIII及其變體。在另一個實施方案中，所述酶是半胱氨酸蛋白酶。本發(fā)明的生長激素綴合物可用許多不同的方法制備，非限制性實例顯示如下。

本發(fā)明還提供用于制備式(I)的A-W-B-GH綴合物的方法。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

如上所述，在制備本發(fā)明的A-W-B-GH綴合物時建立的至少一個共價鍵可通過使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶來制備。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可包括自例如以下菌種分離的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶：鏈霉菌屬(Streptomyces)菌種；茂原鏈霉菌、肉桂鏈霉菌、灰肉鏈霉菌(US5156956，通過引用結(jié)合到本文)、淺紫灰鏈霉菌(US5252469，通過引用結(jié)合到本文)和拉達(dá)卡鏈霉菌(JP2003/199569，通過引用結(jié)合到本文)。已自枯草芽孢桿菌(公開于US5731183，其通過引用結(jié)合到本文中)和各種粘菌中分離出其它有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。有用的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的其它實例是公開于WO1996/06931(例如得自Bacilus lydicus的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)和WO1996/22366(兩份文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)的實例。有用的非微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包括豚鼠肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及得自各種海產(chǎn)來源像扁魚真鯛(公開于EP0555649，其通過引用結(jié)合到本文中)和日本牡蠣長牡蠣(公開于US5736356，其通過引用結(jié)合到本文中)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。也可使用其功能性類似物和衍生物。

通常，用于本發(fā)明方法的TGase是微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在一個實施方案中，TGase來自茂原鏈霉菌或其變體，例如參見WO2007/020290和WO2008/020075。在另一個實施方案中，TGase來 自拉達(dá)卡鏈霉菌或其變體，例如參見WO2008/020075。

可通過TGase介導(dǎo)的修飾，根據(jù)所用底物，在GH化合物的序列中的特定賴氨酸(Lys)或谷氨酰胺(Gln)位置處導(dǎo)致選擇性變化，來實現(xiàn)本發(fā)明的GH與A-W-B綴合。使用胺作為底物將導(dǎo)致谷氨酰胺被修飾，而使用伯酰胺將導(dǎo)致賴氨酸被修飾。hGH(SEQ ID NO:1)在38、41、70、115、140、145、158、168和172位具有9個賴氨酸殘基，在22、29、40、46、49、68、69、84、91、122、137、141和181位具有13個谷氨酰胺殘基，但是并非所有這些都可容易用于修飾，而且也不都適于修飾，因為這將導(dǎo)致與生長激素結(jié)合蛋白的結(jié)合效力降低，因此導(dǎo)致生物活性降低。hGH及其結(jié)合蛋白(pdb:3HHR)之間的X射線蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)顯示，至少4個賴氨酸(38、41、168和172)參與與結(jié)合蛋白結(jié)合，可能僅1個谷氨酰胺(Gln 46)參與結(jié)合。這就賦予谷氨酰胺更大的吸收力以作為用于選擇性引入白蛋白結(jié)合劑接頭的靶標(biāo)。這些結(jié)構(gòu)考量得到N.Chêne等(載于Reprod.Nutr.Develop.29,1-25(1989))概述的研究結(jié)果的進(jìn)一步支持，其中得出結(jié)論，發(fā)現(xiàn)影響賴氨酸的化學(xué)修飾對體內(nèi)生物活性和對與GH肝受體的結(jié)合能力具有負(fù)面作用。

化學(xué)法I

一方面，本發(fā)明涉及式(I)生長激素綴合物的制備，其中采用TGase催化的化學(xué)法，用改性基團(tuán)(property-modifying group)處理GH化合物。最初，使用氨基醇，通過2步反應(yīng)置入醛或酮官能團(tuán)，氨基醇隨后用高碘酸鹽處理通過氧化裂解產(chǎn)生醛或酮官能團(tuán)。僅用于說明的氨基醇的非限制性實例包括1,3-二氨基-2-丙醇和1-氨基-2,3-二羥基丙烷。

又一方面，本發(fā)明涉及式(I)的生長激素綴合物的制備，其包括用改性基團(tuán)衍生的苯胺或雜芳基胺處理衍生自GH化合物的醛或酮，得到胺(III→IV)。

在一個實施方案中，自GH化合物衍生的醛用改性基團(tuán)衍生的苯胺或雜芳基胺處理。

術(shù)語“GH化合物衍生的醛(或酮)”或“衍生自GH化合物的醛或 酮”意欲表示醛或酮官能團(tuán)已經(jīng)與其共價連接的GH化合物，或其上已經(jīng)產(chǎn)生醛或酮官能團(tuán)的GH化合物。下面說明的GH化合物衍生的醛(例如化合物(III))的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可采用這些已知方法的任一種制備用于實現(xiàn)本文公開的本發(fā)明所需的GH化合物衍生的醛(III)。

在一個實施方案中，如下所示制備綴合物A-W-B-GH(IV)：

TGase介導(dǎo)的與GH(I)的酶促反應(yīng)，導(dǎo)致141位和/或40位的Gln被修飾，得到(II)。用高碘酸鹽處理修飾的GH(II)以裂解氨基醇，得到GH衍生的醛(III)。通過還原烷基化而產(chǎn)生GH醛(III)與A-W-B1-NH₂的綴合(III→IV)本文例示的還原烷基化是本領(lǐng)域公認(rèn)的，導(dǎo)致GH化合物(IV)在Gln(141)和/或40位被修飾。

化學(xué)法II

在一個實施方案中，如下所示，采用GH的N端的還原胺化來制備綴合物A-W-B-GH：

GH與A-W-B1-CHO的綴合通過還原烷基化產(chǎn)生(GH→V)生以上例示的還原烷基化是本領(lǐng)域公認(rèn)的，用于修飾GH的N端。

化學(xué)法III

在一個實施方案中，如下所示制備綴合物A-W-B-GH：

其中半胱氨酸殘基任選作為混合的二硫化物(VI)(GH-S-S-R)被保護(hù)，且R是小的有機(jī)部分?；旌系亩蚧锏姆窍拗菩詫嵗砂装?R＝-CH₂CH₂NH₂)、半胱氨酸(R＝-CH₂CH(C(O)OH)NH₂)、高半胱氨酸(R＝-CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂)和谷胱甘肽(R＝-CH₂CH(C(O)NH-CH₂C(O)OH)NH-C(O)CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂)之間的二硫化物。

衍生化方法利用白蛋白結(jié)合接頭A-W-B1-LG，其中LG表示無機(jī)離去基團(tuán)例如-Cl、-Br、-I或有機(jī)離去基團(tuán)例如甲磺?；蚣妆交撬峄?。GH與A-W-B1-LG的綴合通過親核取代而發(fā)生(VII→IX)。

化學(xué)法IV

在一個實施方案中，如下所示制備綴合物A-W-B-GH：

可使從上述(VI)獲得的脫保護(hù)的Cys GH化合物(VII)與馬來酰亞胺(malimide)取代的白蛋白結(jié)合劑接頭(X)反應(yīng)，得到GH綴合物A-W-B1-NHC(O)CH₂CH₂-吡咯烷-2,5-二酮-3-GH(XI)。

其中親水間隔基B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5]_m7-，

X₄為價鍵，

I1、I2、I3、I4和I5獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

E1和E2獨(dú)立選自-O-、-NR⁶-、-N(COR⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。

化學(xué)法V

在一個實施方案中，如下所示制備綴合物A-W-B-GH：

可按WO2009/024791中所述，采用S-亞硝酰基化學(xué)法，使白蛋白結(jié)合劑與單個cys GH衍生物連接。

通過加入NO供體例如DEA NOnate(Sigma Aldrich)，對脫保護(hù)的Cys GH化合物(VII)進(jìn)行S-亞硝基化。然后使亞硝基化的單個cys GH(XII)與烯丙基胺取代的白蛋白結(jié)合劑(XIII)反應(yīng)，得到肟(XIV)，其在水解后，得到GH綴合物A-W-B1-C(O)NHCH₂C(O)CH₂-Cys GH(XV)

其中親水間隔基B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5]_m7-，

X₄為價鍵，

I1、I2、I3、I4和I5獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、 -S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。

通常認(rèn)為與天然肽的密切關(guān)系對于治療干預(yù)是優(yōu)點(diǎn)，所述治療干預(yù)包括給予該天然肽的變體或類似物，因為這使例如產(chǎn)生任何不想要的抗體的風(fēng)險最小化。

可通過使用羧肽酶Y(EC.3.4.16.5)，在其C端修飾GH，合適的修飾底物參見WO2007/093594。B.Peschke等.“C-Terminally PEGylated GH derivatives(C端聚乙二醇化GH衍生物)”Bioorg.Med.Chem.15,4382-4395,(2007)描述了兩步法，其中C端丙氨酸與N^ε-(4-乙?；锦；?賴氨酸進(jìn)行酶促交換，接著與本發(fā)明的白蛋白結(jié)合劑衍生物反應(yīng)。

從上文可明顯看出，本發(fā)明還涉及在制備綴合物A-W-B-GH中的中間體接頭。可通過式(III)描述所述接頭化合物

A-W-B1-U (III)

其中A表示白蛋白結(jié)合殘基，

B1表示親水間隔基，

W是連接A和B1的化學(xué)基團(tuán)，U表示綴合部分。

根據(jù)上文，綴合部分將隨所采用的綴合方法而變化，其最后在最終的hGH化合物(A-W-B-GH)中也可以是可見的。

在化合物A-W-B1-U的其它實施方案中，A和W如上述實施方案中任一個中所定義的。

如果采用本文上述方法如化學(xué)法IV，則化合物A-W-B1-U可進(jìn)一步定義為這樣的實施方案，其中U包含芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷-2,5-二酮例如-NHC(O)CH2CH2-吡咯烷-2,5-二酮，或者由芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷-2,5-二酮例如-NHC(O)CH2CH2-吡咯烷-2,5-二酮組成。

在化合物A-W-B1-U的備選實施方案中，U包含D1-(CH₂)_I6-D2，其中D1和D2獨(dú)立選自-O-、-N(R6)-、-NC(O)R7-或價鍵；其中R6和R7獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基。

同樣地，采用本文上述的化學(xué)法III可采用接頭化合物，其中U包含離去基團(tuán)或由離去基團(tuán)組成，離去基團(tuán)例如Cl、Br、I、-OH、-OS(O)₂Me、-OS(O)₂CF₃或-OTs，或優(yōu)選式(III)的化合物，其中離去基團(tuán)為選自Cl、Br和I(優(yōu)選Br)的鹵素化合物。

接頭化合物(其應(yīng)用于化學(xué)法V)的其它實施方案按照本發(fā)明式(III)所定義的，其中U包含烯丙基胺(H₂C＝CH-CH2-NH₂)或由其組成，所述烯丙基胺例如-C(O)NHCH₂-CH＝CH₂。

如果采用上文描述的方法如化學(xué)法I，則化合物A-W-B1-U可進(jìn)一步定義為這樣的實施方案，其中U包含胺(-NH₂)或由胺(-NH₂)組成。

在備選的實施方案中，U可包含醛(例如-CHO)或由其組成。

化合物接著可與包括“U”能夠與之綴合的受體基團(tuán)的任何類型的治療化合物綴合。在一個優(yōu)選的實施方案中，治療化合物是多肽。肽可天然地包括可起受體基團(tuán)作用的AA殘基，例如Gln殘基、Phe殘基和Cys殘基?；蛘呖蓪⑦@類氨基酸殘基引入多肽的合適位置。

藥物組合物

另一個目的是提供包含本發(fā)明生長激素綴合物例如式(I)或(II)生長激素綴合物的藥物組合物，所述綴合物以10^-15mg/mL-200mg/mL例如10^-10mg/mL-5mg/mL的濃度存在，其中所述組合物具有2.0-10.0的pH。組合物可進(jìn)一步包含藥物賦形劑(exhibient)，例如緩沖系統(tǒng)、防腐劑、張度劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明一個實施方 案中，藥物組合物為水性組合物，即包含水的組合物。所述組合物通常為溶液或懸液。在本發(fā)明另一實施方案中，藥物組合物為水溶液。術(shù)語“水性組合物”定義為包含至少50％w/w水的組合物。同樣地，術(shù)語“水溶液”定義為包含至少50％w/w水的溶液，術(shù)語“水性懸液”定義為包含至少50％w/w水的懸液。

在另一實施方案中，藥物組合物為凍干組合物，醫(yī)生或患者在使用之前向其中添加溶劑和/或稀釋劑。

在另一實施方案中，藥物組合物為無需任何預(yù)先溶解便可即時使用的干燥組合物(例如凍干的或噴霧干燥的)。

另一方面本發(fā)明涉及包含生長激素綴合物的水溶液和緩沖劑的藥物組合物，所述生長激素綴合物為例如式(I)或(II)生長激素綴合物，其中所述GH綴合物以0.1-100mg/mL或更高濃度存在，其中所述組合物具有約2.0-約10.0的pH。

在本發(fā)明另一實施方案中，組合物的pH選自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。

在本發(fā)明再一實施方案中，緩沖劑選自：乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥基甲基)-氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實施方案。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。在本發(fā)明再一實施方案中，防腐劑選自苯酚、鄰甲酚、間甲酚、 對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3對-氯苯氧丙烷-1,2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明再一實施方案中，防腐劑以0.1mg/mL-20mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，防腐劑以0.1mg/mL-5mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，防腐劑以5mg/mL-10mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，防腐劑以10mg/mL-20mg/mL的濃度存在。這些特定防腐劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實施方案。藥物組合物中防腐劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對Remington:TheScience andPractice of Pharmacy,第20版,2000的引用。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含等滲劑。在本發(fā)明再一實施方案中，等滲劑選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(例如丙三醇(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG 400)或其混合物?？墒褂萌魏翁牵鐔翁?、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普魯蘭、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羰甲基纖維素鈉。在一個實施方案中，糖添加劑為蔗糖。糖醇被定義為具有至少一個-OH基團(tuán)的C4-C8烴，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑為甘露醇?？蓡为?dú)地或聯(lián)合使用上述糖或糖醇。對所用量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中可溶且對用本發(fā)明方法獲得的穩(wěn)定作用不產(chǎn)生不利作用即可。在一個實施方案中，糖或糖醇濃度為約1mg/mL-約150mg/mL。在本發(fā)明再一實施方案中，等滲劑以1mg/mL-50mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，等滲劑以1mg/mL-7mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，等滲劑以 8mg/mL-24mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，等滲劑以25mg/mL-50mg/mL的濃度存在。這些特定的等滲劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實施方案。藥物組合物中等滲劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2000的引用。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含螯合劑。在本發(fā)明再一實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明再一實施方案中，螯合劑以0.1mg/mL-5mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，螯合劑以0.1mg/mL-2mg/mL的濃度存在。在本發(fā)明再一實施方案中，螯合劑以2mg/mL-5mg/mL的濃度存在。這些特定的螯合劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實施方案。藥物組合物中螯合劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,2000的引用。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。藥物組合物中穩(wěn)定劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,2000的引用。

更具體地，本發(fā)明組合物為穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物組合物儲存期間可能表現(xiàn)出聚集物形成的蛋白質(zhì)。“聚集物形成”意指蛋白質(zhì)分子之間的物理相互作用，其造成寡聚物的形成，該寡聚物可保持可溶性或從溶液中沉淀出來的可見的大聚集物。“儲存期間”意指液體藥物組合物或組合物在制備后沒有立即給予受試者。相反，其在制備后以液體形式、冷凍狀態(tài)或干燥形式包裝儲存，用于以后重構(gòu)成液體形式或適于給予受試者的其它形式?！案稍镄问健币庵敢后w藥物組合物或組合物通過凍干(即冷凍干燥；參見例如Williams和Polli,J.ParenteralSci.Technol.38,48-59,(1984))、噴霧干燥(參見Masters(1991)，載于Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical,Essez,U.K.),第491-676頁； Broadhead等Drug Devel.Ind.Pharm.18,1169-1206,(1992)；和Mumenthaler等,Pharm.Res.11,12-20(1994))或風(fēng)干(Carpenter和Crowe,Cryobiology 25,459-470,(1988)；和Roser,Biopharm.4,47-53,(1991))來干燥。在液體藥物組合物儲存期間蛋白質(zhì)聚集物形成可不利地影響該蛋白質(zhì)的生物活性，造成藥物組合物治療功效損失。此外，聚集物形成可引起其它問題，例如當(dāng)用輸注系統(tǒng)給予含有蛋白質(zhì)的藥物組合物時管道、膜或泵的堵塞。

本發(fā)明藥物組合物可進(jìn)一步包含一定量的氨基酸堿(amino acid base)，其足以降低組合物儲存期間蛋白質(zhì)導(dǎo)致的聚集物形成。“氨基酸堿”意指氨基酸或氨基酸組合，其中任何給定氨基酸以其游離堿形式或以其鹽形式存在。當(dāng)使用氨基酸組合時，所有氨基酸可以以其游離堿形式存在，所有氨基酸可以以其鹽形式存在，或一些可以以其游離堿形式存在而其它以其鹽形式存在。在一個實施方案中，用于制備本發(fā)明組合物的氨基酸為攜帶帶電側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。只要特定氨基酸或有機(jī)堿以其游離堿形式或其鹽形式存在，特定氨基酸(甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L或D異構(gòu)體或其混合物)或這些立體異構(gòu)體的組合或者甘氨酸或有機(jī)堿(例如但不限于咪唑)，都可存在于本發(fā)明藥物組合物中。在一個實施方案中，使用氨基酸的L-立體異構(gòu)體。在一個實施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明組合物也可用這些氨基酸的類似物配制。“氨基酸類似物”意指天然存在的氨基酸的衍生物，其導(dǎo)致減少本發(fā)明液體藥物組合物儲存期間蛋白質(zhì)聚集物形成的所需作用。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。至于其它氨基酸，以其游離堿形式或其鹽形式將氨基酸類似物摻入到組合物中。在本發(fā)明再一實施方案中，以足以防止或延緩蛋白質(zhì)聚集的濃度使用氨基酸或氨基酸類似物。

在本發(fā)明再一實施方案中，當(dāng)作為治療劑起作用的蛋白質(zhì)為包含至少一個對氧化易感的甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)時，可添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸類似物)以抑制將甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞砜?！耙种啤币庵鸽S著時間的推移甲硫氨酸氧化物質(zhì)的積聚最小化。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)以其適合的分子形式得到更大的保留?？墒褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體(L或D異構(gòu)體)或其任何組合。添加的量應(yīng)為足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸亞砜的量可被監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受。通常這意味著組合物含不多于約10％-約30％甲硫氨酸亞砜。通常這可通過添加甲硫氨酸使得添加的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比率范圍為約1:1-約1000:1例如10:1-約100:1來實現(xiàn)。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含選自高分子量聚合物或低分子化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明再一實施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基纖維素/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇及不同的鹽(例如氯化鈉)。這些特定的穩(wěn)定劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實施方案。

藥物組合物也可包含另外的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑進(jìn)一步提高其中治療活性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。對于本發(fā)明而言特別有興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于：甲硫氨酸和EDTA，它們保護(hù)蛋白質(zhì)對抗甲硫氨酸氧化；非離子表面活性劑，其保護(hù)蛋白質(zhì)對抗與凍融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集。

在本發(fā)明再一實施方案中，組合物進(jìn)一步包含表面活性劑。在本發(fā)明再一實施方案中，表面活性劑選自：洗滌劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙酰化單甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如泊洛沙姆例如F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯化山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫 例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和Brij-35)、單甘油酯或其乙氧基化衍生物、二甘油酯或其聚氧乙烯衍生物、醇類、甘油、凝集素類和磷脂類(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(例如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂衍生物(例如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)及溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂膽堿的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物、二棕櫚酰磷脂酰膽堿以及極性頭基團(tuán)(即膽堿類、乙醇胺類、磷脂酸、絲氨酸類、蘇氨酸類、甘油、肌醇)的修飾物，和帶正電的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸以及甘油磷酸脂類(例如腦磷脂)、甘油糖脂類(例如吡喃型半乳糖苷(galactopyransoide))、鞘糖脂類(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞卵溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物(例如?；嵌渌箧滄咚徕c等)、長鏈脂肪酸及其C₆-C₁₂鹽(例如油酸和辛酸)、酰基肉毒堿類及衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N^α-?；苌?、或者賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈?；苌?、包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸與中性或酸性氨基酸的任何組合的二肽的N^α-?；苌?、包括一個中性氨基酸與兩個帶電氨基酸的任何組合的三肽的N^α-?；苌?、DSS(多庫酯鈉，CAS登記號[577-11-7])、多庫酯鈣，CAS登記號[128-49-4])、多庫酯鉀，CAS登記號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽、甘氨酸或牛磺酸綴合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽類)一價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N,N-二甲基銨基-1-丙磺酸鹽、3-氯酰氨基-1-丙基二甲基銨基-1-丙磺酸鹽、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶)、非離子型表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、poloxamine(例如Tetronic's)，其為衍生自依次將環(huán)氧 丙烷和環(huán)氧乙烷加成至乙二胺的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物。這些特定的表面活性劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明備選實施方案。

藥物組合物中表面活性劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,2000的引用。

可能的是，在本發(fā)明藥物組合物中可存在其它成分。所述另外的成分可包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張度改性劑、螯合劑、金屬離子、油性載體、蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸，例如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。所述另外的成分當(dāng)然應(yīng)該對本發(fā)明藥物組合物的總體穩(wěn)定性沒有不利作用。

可在若干位點(diǎn)將包含本發(fā)明生長激素綴合物的藥物組合物給予需要這類治療的患者，所述位點(diǎn)為例如在局部位點(diǎn)，例如皮膚和粘膜位點(diǎn)；在旁路吸收位點(diǎn)，例如在動脈中、靜脈中、心臟中給予；和參與吸收的位點(diǎn)，例如在皮膚、皮下、肌肉內(nèi)或腹內(nèi)給予。

本發(fā)明藥物組合物的給予可通過數(shù)種給藥途徑給予需要這種治療的患者，所述給藥途徑為例如舌部給藥、舌下給藥、含服給藥、口腔內(nèi)給藥、口服給藥、胃腸內(nèi)給藥、鼻部給藥、肺部給藥例如通過細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮給藥、皮膚給藥、透皮給藥、陰道給藥、直腸給藥、眼部給藥例如通過結(jié)膜、輸尿管給藥和經(jīng)胃腸外給藥。

本發(fā)明的組合物可以以若干劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合型乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、硬膏、軟膏、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠囊例如硬膠囊和軟膠囊、栓劑、直腸用膠囊、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏、注射液、原位轉(zhuǎn)化溶液劑例如原位膠凝劑、原位沉降劑、原位沉淀劑、原位結(jié)晶劑、輸液劑和埋植劑。

為了進(jìn)一步提高生長激素綴合物的穩(wěn)定性、增加生物利用度、增加溶解性、降低不良作用、實現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的按時療法(chronotherapy)和增加患者依從性或其任何組合，可讓本發(fā)明組合物進(jìn)一步例如通過共價、疏水和靜電互相作用與藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和改良藥物遞送系統(tǒng)復(fù)合或連接。載體、藥物遞送系統(tǒng)和改良藥物遞送系統(tǒng)的實例包括但不限于：聚合物例如纖維素及衍生物、多糖例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯聚合物和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白例如白蛋白、凝膠例如熱膠凝體系，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的嵌段共聚物體系、膠束、脂質(zhì)體、微球、納米顆粒、液晶及其分散體、脂質(zhì)-水體系中相特性領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的L2相及其分散體、聚合膠束、復(fù)合型乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精及其衍生物，以及樹枝狀高分子(dendrimer)。

本發(fā)明組合物可用于固體、半固體、粉末和溶液組合物中，用于肺部給予生長激素綴合物，肺部給予使用例如定量吸入器、干粉吸入器和霧化器，所有裝置都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

本發(fā)明組合物尤其可用于控釋、持續(xù)釋放、延釋、阻釋和緩釋藥物遞送系統(tǒng)組合物中。更具體地但不限于，組合物可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的胃腸外控釋和持續(xù)釋放系統(tǒng)(二種系統(tǒng)都導(dǎo)致給藥次數(shù)減少許多倍)組合物中。甚至更優(yōu)選皮下給予的控釋和持續(xù)釋放系統(tǒng)。在不限制本發(fā)明范圍下，有用的控釋系統(tǒng)和組合物的實例為水凝膠、油凝膠、液晶、聚合膠束、微球、納米粒。

制備可用于本發(fā)明組合物的控釋系統(tǒng)的方法包括但不限于：結(jié)晶、冷凝、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻漿化、包囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以制備微球、擠壓和超臨界流體法。對以下文獻(xiàn)作出整體參考：藥物控釋手冊(Handbook of Pharmaceutical Controlled Release)(Wise,D.L.,編輯，Marcel Dekker,New York,2000)及藥物和藥物科學(xué)(Drug and the Pharmaceutical Sciences)，第99卷：蛋白質(zhì)組合物和遞送(Protein Composition and Delivery)(MacNally,E.J.,編輯，Marcel Dekker,New York,2000)。

胃腸外給藥可通過注射器、任選筆型(pen-like)注射器經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈注射來進(jìn)行?；蛘?，胃腸外給藥可以依靠輸注泵進(jìn)行。另一個選擇為可為溶液劑或混懸劑的組合物，用于以鼻用噴霧或肺部噴霧形式給予生長激素綴合物。作為又一個選擇，含有本發(fā)明生長激素綴合物的藥物組合物還可以適合于透皮給藥，例如通過無針注射或貼劑(任選離子電滲貼劑)來進(jìn)行；或跨粘膜給藥例如含服給藥。

術(shù)語“穩(wěn)定化組合物”是指物理穩(wěn)定性增加、化學(xué)穩(wěn)定性增加或物理和化學(xué)穩(wěn)定性增加的組合物。

本文所用關(guān)于蛋白組合物的術(shù)語“物理穩(wěn)定性”是指由于蛋白暴露至熱-機(jī)械應(yīng)力和/或與失穩(wěn)的界面和表面(例如疏水表面和界面)的相互作用，所述蛋白形成蛋白的生物失活和/或不溶性聚集體的趨勢。在將裝于合適的容器(例如藥筒或小瓶)中的組合物于不同溫度下暴露于機(jī)械/物理應(yīng)力(例如攪拌)中達(dá)各種時期后，通過目視檢查和/或濁度測定評估水性蛋白組合物的物理穩(wěn)定性。組合物的目視檢查在黑暗背景下于聚焦強(qiáng)光中進(jìn)行。組合物的濁度通過將濁度分級為例如0至3等級的目視評分來表征(未呈現(xiàn)混濁的組合物對應(yīng)于目視評分0，而在日光中呈現(xiàn)可視混濁的組合物對應(yīng)于目視評分3)。當(dāng)其在日光中呈現(xiàn)可視混濁時，將組合物分類為關(guān)于蛋白聚集的物理不穩(wěn)定?；蛘?，可通過技術(shù)人員熟知的簡易濁度測量來評估組合物的濁度。水性蛋白組合物的物理穩(wěn)定性還可通過使用蛋白構(gòu)象狀態(tài)的光譜劑或光譜探測物來評估。所述探測物優(yōu)選為優(yōu)先結(jié)合至蛋白的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子光譜探測物的一個實例為硫磺素T(Thioflavin T)。硫磺素T為已廣泛用于檢測淀粉狀原纖維的熒光染料。在存在原纖維以及也可能的其它蛋白構(gòu)型下，硫磺素T當(dāng)結(jié)合至原纖 維蛋白形式時在約450nm下產(chǎn)生新的激發(fā)最大值并在約482nm下發(fā)射增強(qiáng)。未接合的硫磺素T在所述波長下基本無熒光。

其它小分子可用作蛋白結(jié)構(gòu)從天然狀態(tài)向非天然狀態(tài)變化的探測物。例如優(yōu)先結(jié)合至蛋白的外露疏水補(bǔ)丁(hydrophobic patch)的“疏水補(bǔ)丁”探測物。所述疏水補(bǔ)丁通常埋藏于處于其天然狀態(tài)的蛋白三級結(jié)構(gòu)之內(nèi)，但隨著蛋白開始解折疊或變性而暴露。這些小分子光譜探測物的實例為芳族疏水染料，例如蒽(antrhacene)、吖啶、菲咯啉等。其它光譜探測物為金屬-氨基酸絡(luò)合物，例如疏水氨基酸(例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)的鈷金屬絡(luò)合物等。

本文所用關(guān)于蛋白組合物的術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)共價變化，所述變化導(dǎo)致形成與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比具有潛在較小生物效力和/或潛在增加的免疫原性的化學(xué)降解產(chǎn)物。根據(jù)天然蛋白的類型和性質(zhì)以及所述蛋白所暴露的環(huán)境，可形成各種化學(xué)降解產(chǎn)物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，幾乎不可能完全避免化學(xué)降解的消除，并且在儲存和使用蛋白組合物期間常常見到化學(xué)降解產(chǎn)物的量不斷增加。多數(shù)蛋白容易發(fā)生脫酰胺作用，其中谷氨酰胺酰或天冬酰胺酰殘基的側(cè)鏈酰胺基被水解而形成游離羧酸的過程。其它降解途徑涉及高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或更多個蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用相互共價結(jié)合，導(dǎo)致形成共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern.T.J.和ManningM.C.,Plenum Press,NewYork 1992)。可提及作為化學(xué)降解另一種變體的氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)?？赏ㄟ^在暴露至不同環(huán)境條件(可通常通過例如增加溫度來加速降解產(chǎn)物的形成)下之后的各個時間點(diǎn)測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量，來評估蛋白組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。通常通過利用各種色譜技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)根據(jù)分子大小和/或電荷將降解產(chǎn)物分離來測定各種降解產(chǎn)物的量。

因此，如上文所概述，“穩(wěn)定化組合物”是指物理穩(wěn)定性增加、 化學(xué)穩(wěn)定性增加或物理和化學(xué)穩(wěn)定性增加的組合物?？傊M合物在使用和儲存(依照推薦的使用和儲存條件)期間必須穩(wěn)定直至達(dá)到失效期。

在本發(fā)明的一個實施方案中，包含式(I)或(II)生長激素綴合物的藥物組合物對于超過6周的使用和超過3年的儲存為穩(wěn)定的。

在本發(fā)明另一實施方案中，包含式(I)或(II)生長激素綴合物的藥物組合物對于超過4周的使用和超過3年的儲存為穩(wěn)定的。

在本發(fā)明再一實施方案中，包含式(I)或(II)生長激素綴合物的藥物組合物對于超過4周的使用和超過2年的儲存為穩(wěn)定的。

在本發(fā)明又一實施方案中，包含式(I)或(II)生長激素綴合物的藥物組合物對于超過2周的使用和超過2年的儲存為穩(wěn)定的。

本文引用的包括出版物、專利申請和專利在內(nèi)的所有參考文獻(xiàn)在此通過引用結(jié)合中，其引用程度如同每一參考文獻(xiàn)單獨(dú)和明確地指出通過引用結(jié)合且在本文中以其整體提出一樣。

所有標(biāo)題和小標(biāo)題僅為了方便而在本文中使用，不應(yīng)該理解為以任何方式限制本發(fā)明。

除非本文另外指出或另外明顯地與上下文矛盾，否則呈其所有可能變化的上述要素的任何組合都包括在本發(fā)明中。

除非本文另外指出或另外明顯地與上下文矛盾，否則在闡述本發(fā)明的情形中所用的術(shù)語“一個”和“一種”和“該”和相似對象，應(yīng)理解為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者。

除非本文另外指出，否則本文對數(shù)值范圍的陳述僅意欲作為單獨(dú)提及落在該范圍內(nèi)的每一單獨(dú)值的速記方法，且如同本文單獨(dú)列舉每一單獨(dú)值一樣將每一單獨(dú)值包括在本說明書中。除非另外指出，否則本文提供的所有準(zhǔn)確值代表對應(yīng)的大約值(例如，合適時，可以認(rèn)為關(guān)于特定因子或測量提供的所有準(zhǔn)確例示性數(shù)值，亦提供了由“約”修飾的對應(yīng)的大約測量)。

除非本文另外指出或另外明顯地與上下文矛盾，否則可以以任何 合適次序?qū)嵤┍疚乃龅乃蟹椒ā?/p>

除非另外指出，否則本文提供的任何和所有實例或例示性語言(例如“例如”)的使用，僅意欲更好地闡明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。除非同樣明確指出，否則本說明書中的語言都不應(yīng)被理解為表示任何要素對實施本發(fā)明是必不可少的。

本文引用和并入專利文獻(xiàn)，只是為了方便，并不反映關(guān)于所述專利文獻(xiàn)的有效性、專利性和/或可執(zhí)行性的任何看法。

下面提供描述本發(fā)明的實施方案的非窮盡性列表。

實施方案列表

實施方案1：一種包含生長激素化合物(GH)的生長激素綴合物或其藥學(xué)上接受的鹽，所述生長激素化合物(GH)具有

a)單個Cys突變，

b)額外的二硫鍵，或者

c)單個Cys突變和額外的二硫鍵，

其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與所述GH連接。

2.實施方案1的綴合物，其中GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少80％同一性，例如與hGH有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物，或者GH為hGH(SEQ ID NO:1)。

3.實施方案1的綴合物，其中GH或GH綴合物具有hGH生長激素活性的至少80％。

4.實施方案1-3中任一個的綴合物，其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有單個Cys突變的GH連接。

5.實施方案4的綴合物，其中單個Cys突變位于選自GH的N端、H1、H2、L2或H3的任一個區(qū)域。

6.實施方案5的綴合物，其中GH具有選自以下任一個的單個Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、 L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

7.實施方案1-3中任一個的綴合物，其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有額外二硫鍵的GH連接。

8.實施方案7的綴合物，其中額外的二硫鍵處于環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間。

9.實施方案7-8中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段，例如來自氨基酸殘基128-154(L3)中。

10.實施方案7-9中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如螺旋B或H2連接。

11.實施方案7-10中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵將L3與H2連接。

12.實施方案7-11中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C，例如Q84C/Y143C。

13.實施方案1-3中任一個的綴合物，其中白蛋白結(jié)合殘基通過親水間隔基與具有單個Cys突變和額外二硫鍵的GH連接。

14.實施方案13的綴合物，其中GH具有選自以下任一個的單個 Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Y42C、S55C、S57C、S62C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

15.實施方案13-14中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間。

16.實施方案13-15中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段，例如來自氨基酸殘基128-154(L3)中。

17.實施方案13-16中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如螺旋B或H2連接。

18.實施方案13-17中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段例如來自氨基酸殘基128-154(L3)與螺旋B或H2連接。

19.實施方案13-18中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C，例如Q84C/Y143C。

20.實施方案1-19中任一個的綴合物，其中白蛋白結(jié)合殘基選自

其中*表示通過化學(xué)基團(tuán)與親水間隔基的連接，所述化學(xué)基團(tuán)連接白蛋白結(jié)合殘基和親水間隔基。

21.實施方案1-20中任一個的綴合物，其中連接白蛋白結(jié)合殘基和親水間隔基的化學(xué)基團(tuán)具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、 -C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

22.實施方案1-21中任一個的綴合物，其中親水間隔基具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、 -CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

23.實施方案1-22中任一個的綴合物，其中X₄為價鍵，W₆選自吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

24.實施方案22的綴合物，其中親水間隔基選自

25.一種生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述生長激素綴合物具有下式(I)：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有單個Cys突變的生長激素化合物，

B表示與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

26.實施方案25的綴合物，其中GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少80％同一性，例如與hGH有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO:1)。

27.實施方案25的綴合物，其中GH或GH綴合物具有hGH生長激素活性的至少80％。

28.實施方案25-27中任一個的綴合物，其中單個Cys突變位于選自GH的N端、H1、H2、L2或H3的任一個區(qū)域。

29.實施方案25-28中任一個的綴合物，其中GH具有選自以下任一個的單個Cys突變：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

30.實施方案25-29中任一個的綴合物，其中A選自

其中*表示通過W與B連接。

31.實施方案25-30中任一個的綴合物，其中W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

32.實施方案25-31中任一個的綴合物，其中B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，并且C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中 (*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

33.實施方案25-32中任一個的綴合物，其中

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6，

m2和m5獨(dú)立地為0-10，和

n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

34.實施方案25-33中任一個的綴合物，其中D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

35.實施方案25-34中任一個的綴合物，其中E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

36.實施方案25-35中任一個的綴合物，其中W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

37.實施方案25-36中任一個的綴合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

38.實施方案25-37中任一個的綴合物，其中-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-(其中E1和E2為-O-)選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

39.實施方案25-38中任一個的綴合物，其中X₄為價鍵，W₆選自吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

40.實施方案25-39中任一個的綴合物，其中B選自

41.實施方案25-40中任一個的綴合物，其中所述化合物選自

42.一種生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述生長激素綴合物具有下式(I)：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有額外二硫鍵的生長激素化合物，

B表示親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

43.實施方案42的綴合物，其中GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少80％同一性、例如與hGH有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO:1)。

44.實施方案42的綴合物，其中GH或GH綴合物具有hGH生長激素活性的至少80％。

45.實施方案44的綴合物，其中所述活性在體外BAF測定法(測定法I)中測量。

46.實施方案42-45中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間。

47.實施方案42-46中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段，例如來自氨基酸殘基128-154(L3)中。

48.實施方案42-47中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如螺旋B或螺旋2連接

49.實施方案42-48中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中額外的二硫鍵將L3(128-154)與螺旋B或螺旋2連接。

50.實施方案42-49中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C，例如Q84C/Y143C。

51.實施方案42-50中任一個的綴合物，其中A選自

其中*表示通過W與B連接。

52.實施方案42-51中任一個的綴合物，其中W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、 -C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

53.實施方案42-52中任一個的綴合物，其中B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、 -C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

54.實施方案42-53中任一個的綴合物，其中

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6，

m2和m5獨(dú)立地為0-10，和

n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

55.實施方案42-54中任一個的綴合物，其中D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

56.實施方案42-55中任一個的綴合物，其中E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

57.實施方案42-56中任一個的綴合物，其中W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基或-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

58.實施方案42-57中任一個的綴合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

59.實施方案42-58中任一個的綴合物，其中-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-(其中E1和E2為-O-)選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

60.實施方案42-59中任一個的綴合物，其中B選自

61.實施方案42-60中任一個的綴合物，其中A通過B與相當(dāng)于hGH SEQ ID NO:1的40位、141位的位置上的谷氨酰胺殘基或者與生長激素化合物的N端殘基連接。

62.實施方案42-61中任一個的綴合物，其中所述化合物選自

63.一種生長激素綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述生長激素綴合物具有下式(I)：

A-W-B-GH (I)

其中

GH表示具有單個Cys突變和額外二硫鍵的生長激素化合物，

B表示與Cys突變的硫殘基連接的親水間隔基，

W是連接A和B的化學(xué)基團(tuán)，和

A表示白蛋白結(jié)合殘基。

64.實施方案63的綴合物，其中GH表示包含與人生長激素(hGH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)有至少80％同一性、例如與hGH有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的生長激素化合物，或GH為hGH(SEQ ID NO:1)。

65.實施方案64的綴合物，其中GH或GH綴合物具有hGH生長激素活性的至少80％。

66.實施方案63-65中任一個的綴合物，其中單個Cys突變位于選自GH的N端、H1、H2、L2或H3的任一個區(qū)域。

67.實施方案63-66中任一個的綴合物，其中GH具有選自以下任一個的單個Cys突變；T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、K38C、E39C、Y42C、S43C、D47C、P48C、S55C、S57C、P59C、S62、E65C、Q69C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C、G126C、E129C、D130C、G131C、P133C、T135C、G136C、T142C、D147C、N149C、D154C、A155C、L156C、R178C、E186C、G187C和G190C，例如以下的任一個：T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

68.實施方案63-67中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵在環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段之間或在環(huán)區(qū)段之內(nèi)或在環(huán)區(qū)段之間或在螺旋區(qū)段之間。

69.實施方案63-68中任一個的綴合物，其中GH包含額外的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于環(huán)區(qū)段，例如來自氨基酸殘基128-154(L3)中。

70.實施方案63-69中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵將環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段例如H2連接。

71.實施方案63-70中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵將L3與螺旋H2連接。

72.實施方案63-71中任一個的綴合物，其中額外的二硫鍵介于相當(dāng)于hGH(SEQ ID NO:1)的以下位置中的至少一個氨基酸對之間：R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、I73C/S132C、I73C/F139C、 R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C，例如Q84C/Y143C。

73.實施方案63-72中任一個的綴合物，其中A選自

其中*表示通過W與B連接。

74.實施方案63-73中任一個的綴合物，其中W具有下式

-W₇-Y-，

其中

Y為-(CH₂)_I7-C_3-10-環(huán)烷基-W₈-或價鍵，

I7為0-6，

W₇選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s3為0或1，

W₈選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s4為0或1。

75.實施方案63-74中任一個的綴合物，其中B具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-，

X₄為F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

F為芳基、雜芳基、吡咯烷-2,5-二酮或價鍵，其中芳基和雜芳基任選被鹵素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基取代，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳 基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

D1、D2、E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1，

W₆選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s1-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中s1為0或1，并且C_1-6-烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

76.實施方案63-75中任一個的綴合物，其中

I1、I2、I3、I4、I5和I6獨(dú)立地為0-6，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立地為0-6，

m2和m5獨(dú)立地為0-10，和

n1、n2、n3和n4獨(dú)立地為0-10。

77.實施方案63-75中任一個的綴合物，其中D1和D2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

78.實施方案63-77中任一個的綴合物，其中E1和E2獨(dú)立選自-O-或-N(R⁶)-或價鍵。

79.實施方案63-78中任一個的綴合物，其中W₁-W₈獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基或-C(O)NHC_1-6-烷基或價鍵；其中烷基任選被氧代基、吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或 -NHC(O)CH₂CH*COOH取代；其中(*)表示CH的碳原子與X₄的連接點(diǎn)。

80.實施方案63-79中任一個的綴合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基任選被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH取代。

81.實施方案63-80中任一個的綴合物，其中-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-和-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-(其中E1和E2為-O-)選自

其中*意欲表示連接點(diǎn)，即開放鍵。

82.實施方案63-81中任一個的綴合物，其中X₄為價鍵，W₆選自吡咯烷-2,5-二酮、-NHC(O)CH*CH₂COOH或-NHC(O)CH₂CH*COOH，其中(*)表示CH的碳原子與GH的連接點(diǎn)。

83.實施方案63-82中任一個的綴合物，其中B選自

84.實施方案1-83中任一個的綴合物，其中一個白蛋白結(jié)合殘基(A)通過親水間隔基(B)與所述GH連接。

85.實施方案63-84中任一個的綴合物，其中所述化合物選自

86.實施方案1-85中任一個的綴合物，其中親水間隔基的mLogP<0。

87.實施方案1-86中任一個的綴合物，其中所述親水間隔基的摩爾量在80D-1500D的范圍內(nèi)或在300D-1100D的范圍內(nèi)。

88.實施方案1-87中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基是親脂性殘基。

89.實施方案1-88中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基與白蛋白非共價結(jié)合。

90.實施方案1-89中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基在生理pH下帶有負(fù)電荷。

91.實施方案1-90中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基對于人血清白蛋白的結(jié)合親和力低于約10μM或低于約1μM。

92.實施方案1-91中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、支鏈烷基、具有ω-羧酸基團(tuán)或ω-羧酸等排體的基團(tuán)。

93.實施方案1-92中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基具有6-40個碳原子、8-26個碳原子或8-20個碳原子。

94.實施方案1-93中任一個的綴合物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基是肽，例如包含小于40個氨基酸殘基的肽。

95.實施方案1-94中任一個的綴合物，其中2個白蛋白結(jié)合殘基(A)通過親水間隔基(B)與所述GH連接。

96.用于治療的實施方案1-95中任一個的綴合物。

97.一種藥物組合物，其包含任選與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合的實施方案1-95中任一個的綴合物。

98.實施方案97的藥物組合物，其中可通過舌、舌下、含服、口內(nèi)、口服、胃和腸內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、表皮、皮膚、透皮和胃腸外將所述組合物給予患者。

99.一種治療生長激素缺乏(GHD)的方法，所述方法包括將治療有效量的實施方案1-95中任一個的綴合物給予有此需要的患者。

100.一種治療以下疾病的方法：特納綜合征；普-韋綜合征(PWS)；努南綜合征；唐氏綜合征；慢性腎臟疾病、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化、接受HAART治療的兒童HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡(SGA)出生的矮小兒童；非SGA的以極低出生體重(VLBW)出生的兒童的身材矮小癥；骨骼發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小癥(ISS)；成人GHD；長骨骨折，所述長骨為例如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、跖骨和指骨；海綿骨例如頭骨、手腕骨和腳底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或 韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行或經(jīng)歷牽拉骨生成技術(shù)的患者；髖關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)盤置換、關(guān)節(jié)盤修復(fù)、脊柱融合或例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中的假體固定后的患者；其中已固定骨接合材料(例如釘、螺釘和板)的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如脛骨或第一腳趾的骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝關(guān)節(jié)軟骨退化；特納綜合征患者中的骨質(zhì)疏松癥；男性骨質(zhì)疏松癥；長期透析的成年患者(APCD)；APCD中營養(yǎng)不良相關(guān)的心血管疾病；APCD中的惡病質(zhì)逆轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD中的慢性阻塞性肺??；APCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病、APCD中的疲勞綜合征；克羅恩??；肝功能受損；具有HIV感染的男性；短腸綜合征；向心性肥胖；HIV相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS)；男性不育癥；大選擇性手術(shù)、酒精/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；老化；虛弱的老年人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷性損傷的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；外傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下腔出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素性肌病；或糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的兒童身材矮小癥；加快肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口的愈合；加快或改善血液流向受損組織或降低受損組織的感染率，所述方法包括將治療有效量的實施方案1-95中任一個的綴合物給予有此需要的患者。

101.實施方案1-95中任一個的綴合物在制備用于治療生長激素缺乏(GHD)的藥物中的用途。

102.實施方案1-95中任一個的綴合物在制備用于治療以下疾病的藥物中的用途：特納綜合征；普-韋綜合征(PWS)；努南綜合征；唐氏綜合征；慢性腎臟疾病、幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化、接受HAART治療的兒童HIV感染(HIV/HALS兒童)；小于胎齡(SGA)出生的矮小兒童；非SGA的以極低出生體重(VLBW)出生的兒童的身材矮小癥；骨骼發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小癥(ISS)；成人GHD；長骨骨折，所述長骨為例如脛骨、腓骨、股骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨、掌骨、跖骨和指骨；海綿骨例如頭骨、 手腕骨和腳底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韌帶手術(shù)后的患者；進(jìn)行或經(jīng)歷牽拉骨生成技術(shù)的患者；髖關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)盤置換、關(guān)節(jié)盤修復(fù)、脊柱融合或例如在膝、髖、肩、肘、腕或顎中的假體固定后的患者；其中已固定骨接合材料(例如釘、螺釘和板)的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如脛骨或第一腳趾的骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；創(chuàng)傷或關(guān)節(jié)炎引起的膝關(guān)節(jié)軟骨退化；特納綜合征患者中的骨質(zhì)疏松癥；男性骨質(zhì)疏松癥；長期透析的成年患者(APCD)；APCD中營養(yǎng)不良相關(guān)的心血管疾??；APCD中的惡病質(zhì)逆轉(zhuǎn)；APCD中的癌癥；APCD中的慢性阻塞性肺?。籄PCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病、APCD中的疲勞綜合征；克羅恩病；肝功能受損；具有HIV感染的男性；短腸綜合征；向心性肥胖；HIV相關(guān)脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS)；男性不育癥；大選擇性手術(shù)、酒精/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；老化；虛弱的老年人；骨關(guān)節(jié)炎；創(chuàng)傷性損傷的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛；記憶障礙；抑郁；外傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下腔出血；極低出生體重；代謝綜合征；糖皮質(zhì)激素性肌??；或糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的兒童身材矮小癥；加快肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口的愈合；加快或改善血液流向受損組織或降低受損組織的感染率。

103.一種下式(III)的化合物

A-W-B1-U (III)

其中A表示白蛋白結(jié)合殘基，

B1表示親水間隔基，

W是連接A和B1的化學(xué)基團(tuán)，U表示綴合部分。

104.實施方案103的化合物，其中A和W如上述實施方案任一個所定義的。

105.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷-2,5-二酮，例如-NHC(O)CH₂CH₂-吡咯烷-2,5-二酮或由芳基、雜芳基、取代的馬來酰亞胺或吡咯烷-2,5- 二酮，例如-NHC(O)CH₂CH₂-吡咯烷-2,5-二酮組成。

106.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含D1-(CH₂)_I6-D2，其中D1和D2獨(dú)立選自-O-、-N(R6)-、-NC(O)R7-或價鍵；其中R6和R7獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基。

107.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含離去基團(tuán)或由離去基團(tuán)組成，離去基團(tuán)例如Cl、Br、I、-OH、-OS(O)₂Me、-OS(O)₂CF₃、-Ots。

108.實施方案107的化合物，其中離去基團(tuán)是選自Cl、Br和I(優(yōu)選Br)的鹵素化合物。

109.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含烯丙基胺(H₂C＝CH-CH₂-NH₂)或由其組成，所述烯丙基胺例如-C(O)NHCH₂-CH＝CH2。

110.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含胺(例如-NH2)或由其組成。

111.實施方案103-110中任一個的化合物，其中治療化合物是多肽。

112.實施方案103-110中任一個的化合物，其中治療化合物是具有單個游離胱氨酸的多肽。

113.實施方案103或?qū)嵤┓桨?04的化合物，其中U包含醛例如-CHO或由醛例如-CHO組成。

114.實施方案103-113中任一項的化合物，其中親水間隔基B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁為-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂為-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃為-[(CHR⁵)_I5]_m7-，

X₄為價鍵，

I1、I2、I3、I4和I5獨(dú)立選自0-16，

m1、m3、m4、m6和m7獨(dú)立選自0-10，

m2和m5獨(dú)立選自0-25，

n1、n2、n3和n4獨(dú)立選自0-16，

R¹、R²、R³、R⁴和R⁵獨(dú)立選自氫、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(＝NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或雜芳基；其中烷基、芳基和雜芳基任選被鹵素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH取代，

E1和E2獨(dú)立選自-O-、-N(R⁶)-、-N(C(O)R⁷)-或價鍵；其中R⁶和R⁷獨(dú)立表示氫或C_1-6-烷基，

W₁-W₅獨(dú)立選自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH＝CH-、-CH＝CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或價鍵；其中s2為0或1。

除非另外指出或明顯與上下文矛盾，否則使用關(guān)于一個或多個要素的術(shù)語(例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”)的本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓桨傅谋疚拿枋?，旨在為“由”或“基本上由”具體一個或多個要素“組成”或者“基本包含”所述要素的本發(fā)明類似方面或?qū)嵤┓桨柑峁┲С?例如除非另外說明或明顯與上下文矛盾，否則在本文描述為包含特定要素的組合物應(yīng)理解為還描述了由該要素組成的組合物)。

本發(fā)明包括在本文提出的方面或權(quán)利要求中所述主題的適用法律所允許的最大程度的所有修改及等同物。

本發(fā)明進(jìn)一步由以下實施例闡明，然而，該實施例不應(yīng)理解為限制保護(hù)范圍。前述說明和以下實施例中公開的特征單獨(dú)或以其任意組合都可為用于以其多種形式實現(xiàn)本發(fā)明的素材。

實施例

縮略語：

amu＝原子質(zhì)量單位

CV＝柱體積

hr(s)＝小時

Hz＝赫茲

L＝升

M＝摩爾

mbar＝毫巴

mg＝毫克

min.＝分鐘

mL＝毫升

mM＝毫摩爾

mm＝毫米

mmol＝毫摩爾

nmol＝納摩爾

mol＝摩爾

μL＝微升

N＝標(biāo)準(zhǔn)

nm＝納米

sec＝秒鐘

ppm＝百萬分之幾

ESI＝電噴霧電離

i.v.＝靜脈內(nèi)

m/z＝質(zhì)荷比

MS＝質(zhì)譜法

HPLC＝高壓液相色譜法

RP＝反相

HPLC-MS＝高壓液相色譜法-質(zhì)譜法

NMR＝核磁共振波譜法

p.o.＝經(jīng)口服

rt或RT＝室溫

s.c.＝皮下

tr＝保留時間

Boc＝叔丁氧羰基

O-t-Bu＝叔丁酯

t-Bu＝叔丁基

Boc-4-ABZ-OH＝4-叔丁氧羰基氨基-苯甲酸

DCM＝二氯甲烷，CH₂Cl₂，亞甲基氯

DIC＝二異丙基碳二亞胺

DIPEA＝N,N-二異丙基乙胺

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲亞砜

DTT＝二硫蘇糖醇

EDAC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽

Et₂O＝乙醚

EtOAc＝乙酸乙酯

Fmoc＝9H-芴-9-基甲氧基羰基

Fmoc-Glu-O-t-Bu＝N-Fmoc-谷氨酸-1-叔丁酯

Fmoc-Lys(Mtt)-OH＝(S)-6-[(二苯基-對甲苯基-甲基)-氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸

Fmoc-OEG-OH＝(2[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基)乙酸

OEG＝(2[2-(氨基)乙氧基]乙氧基)乙?；?/p>

Fmoc-Thx-OH＝N-Fmoc-反式-4-氨基甲基環(huán)己烷甲酸

H₂O＝水

HOBt＝1-羥基苯并三唑

MeCN＝乙腈

MeOH＝甲醇

MTP＝3-甲基-硫代-1-丙醇

NaCl＝氯化鈉

NaOH＝氫氧化鈉

NMP＝N-甲基吡咯烷-2-酮

OEG＝(2[2-(氨基)乙氧基]乙氧基)乙酸

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氫呋喃

TIS＝三異丙基甲硅烷

CDCl₃＝氘氯仿

CD₃OD＝四氘代甲醇

DMSO-d₆＝六氘代二甲亞砜

TNBS＝三硝基苯磺酸

TSTU＝O-(N-琥珀酰亞胺基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸鈾

實施例還利用下列通用方法：

制備hGH化合物的通用方法。

將編碼生長激素化合物的基因重組插入質(zhì)粒載體中。合適大腸桿菌(E.coli)菌株隨后使用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化?？膳cN端甲硫氨酸一起或作為MEAE融合物(隨后自其中切割MEAE序列)表達(dá)hGH或GH變體。

在25％甘油中制備細(xì)胞原液，并保存在-80℃下。將甘油原液菌株接種到LB板，隨后在37℃下孵育過夜。將各板的內(nèi)容物用LB培養(yǎng)基洗滌，并稀釋至500mL LB培養(yǎng)基中用于表達(dá)。在以220rpm振蕩的同時，將培養(yǎng)物在37℃下孵育，直到達(dá)到OD₆₀₀ 0.6。使用0.2mM IPTG在25℃下進(jìn)行隨后的誘導(dǎo)6小時。最終通過離心收獲細(xì)胞。

隨后將細(xì)胞懸浮于含有0.05％吐溫20、2.5mMEDTA、10mM半胱胺和4M脲的10mM Tris-HCl(pH＝9.0)中，使用細(xì)胞破碎儀于30kPSI破碎。通過離心收集上清液，隨后進(jìn)行色譜純化。

純化采用離子交換色譜法和疏水相互作用進(jìn)行，隨后使用自CHO細(xì)胞表達(dá)的人二肽基肽酶I(hDPPI)除去肽標(biāo)簽。通過等電點(diǎn)沉淀 (isoprecipitation)和離子交換色譜法實現(xiàn)最終的純化。還可通過采用(但不限于)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的離子交換色譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、尺寸排阻色譜法和基于膜的分離技術(shù)實現(xiàn)純化。

純化的生長激素化合物的蛋白質(zhì)化學(xué)表征。

采用MALDI-MS分析完整的純化蛋白質(zhì)。所觀測的質(zhì)量對應(yīng)于根據(jù)氨基酸序列推斷的理論質(zhì)量。

可通過肽作圖法顯示預(yù)期的二硫鍵連接，肽作圖法用胰蛋白酶和AspN消化，接著在用DTT還原二硫鍵之前及之后對消化物進(jìn)行MALDI-MS分析。

用于測量蛋白酶降解GH和hGH化合物綴合物的速率的測定

用相關(guān)蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧肽酶、DPPIV、中性肽鏈內(nèi)切酶、粒酶B、脯氨酸-肽鏈內(nèi)切酶、葡萄球菌肽酶I、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N肽鏈內(nèi)切酶、胱天蛋白酶1-10、梭菌蛋白酶、腸激酶、谷氨?；逆渻?nèi)切酶、粒酶B、LysC、LysN、脯氨酸-肽鏈內(nèi)切酶和葡萄球菌肽酶I或組織提取物)在合適緩沖液(例如PBS或碳酸氫銨)中于37℃消化目的化合物直到24小時。通過HPLC測定評估蛋白水解降解。

蛋白水解消化：

通過酶在37℃降解碳酸氫銨緩沖液中的1mg/mL的100μL測試化合物溶液直至24小時。在不同時間點(diǎn)取子樣品，通過10倍稀釋到1％TFA中酸化樣品來終止蛋白水解反應(yīng)。通過反相HPLC分析這些稀釋的樣品，以評估蛋白水解消化的程度。

HPLC方法:

將10μL上述溶液注射入反相Vydac C42×150mm柱，經(jīng)30min時間從0.1％TFA/水至含0.1％TFA的100％乙腈的線性梯度洗脫，流速0.2ml/min。在214nm處UV吸收檢測峰。根據(jù)時間點(diǎn)t＝T(A_T)的峰面積和t＝0(A₀)時的峰面積，將時間點(diǎn)t＝T時完整化合物的百分比(％) 計算為(A_T/A₀)×100％。用GraphPad Prims軟件5.01版本將完整化合物百分比(％)對時間作圖。亦通過GraphPad Prism軟件按照單相衰減(one phase decay)計算半衰期(T_1/2)。可使用的酶實例為彈性蛋白酶(Sigma，來自豬胰腺)和胰凝乳蛋白酶(Roche，測序級)。緩沖液實例為50mM碳酸氫銨，pH＝8.5。

毛細(xì)管電泳

用Agilent Technologies 3DCE系統(tǒng)(Agilent Technologies)進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用Agilent Technologies 3DCE ChemStation進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和信號處理。毛細(xì)管為64.5cm(56.0cm有效長度)50μm內(nèi)徑的來自Agilent的“延長光路徑毛細(xì)管(Extended Light Path Capillary)”。在200nm(16nm Bw，參考380nm和50nm Bw)處實施UV檢測。運(yùn)行電解液為磷酸緩沖液50mM pH 7(方法A)。將毛細(xì)管用0.1M NaOH調(diào)節(jié)3min，然后用Milli-Q水調(diào)節(jié)2min，用電解液調(diào)節(jié)3min。在每次運(yùn)行后，用milli-Q水沖洗毛細(xì)管2min，然后用磷酸沖洗2min，用milli-Q水沖洗2min。流體力學(xué)注射在50毫巴下持續(xù)4.0秒完成。電壓為+25kV。毛細(xì)管溫度為30℃，運(yùn)行時間為10.5min。

Maldi-Tof質(zhì)譜

用Autoflex Maldi-Tof儀器(Bruker)測定分子量。用α-氰基-4-羥基-肉桂酸作為基質(zhì)制備樣品。

RP-HPLC

在Agilent 1100系統(tǒng)上用Vydac 218TP54 4.6mm x250mm 5μm C-18二氧化硅柱(The Separations Group,Hesperia)實施RP-HPLC分析。通過UV在214nm、254nm、280nm和301nm處檢測。用0.1％三氟乙酸/H₂O來平衡柱，通過0-90％乙腈對0.1％三氟乙酸/H₂O的合適梯度洗脫樣品。

LC-MS

在PE-Sciex API 100或150質(zhì)譜儀上實施LC-MS分析，所述質(zhì)譜儀配備有兩個Perkin Elmer Series 200微型泵、Perkin Elmer Series 200 自動進(jìn)樣器、Applied Biosystems 785A UV檢測儀和Sedex 75蒸發(fā)性光(Evaporative Light)散射檢測儀。以1.5ml/min在室溫洗脫Waters Xterra 3.0mmx50mm 5μC-18二氧化硅柱。其用5％MeCN/0.1％TFA/H₂O平衡，并用5％MeCN/0.1％TFA/H₂O洗脫1.0min，然后經(jīng)7min用到90％MeCN/0.1％TFA/H₂O的線性梯度洗脫。通過在214nm處UV檢測和蒸發(fā)性光散射來檢測。將柱洗出液流分引入到PE-Sciex API 100質(zhì)譜儀的離子噴霧界面。在運(yùn)行期間每2秒掃描一次300-2000amu質(zhì)量范圍。

蛋白質(zhì)定量

通過用NanoDrop ND-1000UV-分光光度計測量280nm處的吸光度來估測蛋白質(zhì)濃度。

用于確定衍生位點(diǎn)的酶促肽作圖法

用Asp-N消化還原和烷基化的蛋白質(zhì)來實施肽作圖法。首先按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒌鞍踪|(zhì)用DTT和碘乙酰胺處理。用HPLC純化烷基化產(chǎn)物。隨后用內(nèi)切蛋白酶Asp-N(Boehringer)以1:100的酶:底物比率過夜消化烷基化的純化產(chǎn)物。用C-18柱和標(biāo)準(zhǔn)TFA/MeCN緩沖系統(tǒng)HPLC分離消化物。將得到的肽圖與未衍生的hGH的肽圖比較，收集不同保留時間的流分，用Maldi-tof質(zhì)譜進(jìn)一步分析。

SDS page

用NuPAGE 4％-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen NP0321BOX)實施SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。銀染(Invitrogen LC6100)或考馬斯染色(Invitrogen LC6065)凝膠，其中如M.M.Kurfurst在Anal.Biochem.200(2),244-248,(1992)中所述還針對PEG用碘化鋇進(jìn)行相關(guān)染色。

蛋白質(zhì)色譜法

在Explorer色譜系統(tǒng)和來自GE Health Care的柱上實施蛋白質(zhì)色譜法。用Q-Sepharose HP 26/10柱進(jìn)行陰離子交換。起始緩沖液為20mM三乙醇胺緩沖液pH 8.5，洗脫緩沖液為起始緩沖液+0.2M NaCl。通常用0-75％洗脫緩沖液的梯度經(jīng)15個柱體積洗脫化合物。 用HiPrep 26/10柱實施脫鹽和緩沖液更換。

TNBS試驗

制備10％DIPEA/DMF溶液(溶液1)和1M TNBS水溶液(溶液2)。將少數(shù)樹脂珠置于小試管中，加入各溶液(1和2)1-3滴。在短暫混合后，將混合物置于室溫下10分鐘，檢查珠。強(qiáng)烈的橙色或紅色珠表示陽性結(jié)果(即存在游離胺)；黃色或微弱的橙色珠表示略微的陽性，無色珠為陰性。

LogP計算

白蛋白結(jié)合劑部分和/或親水間隔基部分的LogP值可用公開算法計算為mLogP和/或cLogP(J.Am.Chem.Soc.,86(1964)5175-5180"A New Substituent Constant,Derived from Partition Coefficients(來源于分配系數(shù)的新的取代常數(shù)"；C.A.Lipinski等Advanced Drug Delivery Reviews,23(1997)3-25，"Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings(在藥物發(fā)現(xiàn)及開發(fā)環(huán)境中估測溶解性及滲透性的實驗和計算方法)"；和I.Moriguchi,S.Hirono,I.Nakagome,H.Hirano,Chem.and Pharm.Bull.,42(1994)976-978"Comparison of Reliability oflogP Values for Drugs Calculated by Several Methods(由若干方法計算的藥物logP值的可靠性比較)"。本文中用來自clogP算法的Tripos(http://www.tripos.com)4.2版本的Sybyl 7.0及其相關(guān)片段數(shù)據(jù)庫的22版本計算clogP-Pomona College logP(辛醇/水分配系數(shù))，所述22版本由BioByte Corp(http://www.biobyte.com/)提供。

白蛋白結(jié)合劑的制備

實施例1

4-(1H-四唑-16-基-十六酰氨磺酰)丁酰-OEG-γGlu-γGlu-OEG-N^ε(C(O)CH₂Br)Lys-OH(I)：

按照流程1，采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-肽化學(xué)法在ABI433合成儀上，以1mM規(guī)模在固體載體上合成化合物(I)。使用Fmoc-OEG-OH和Fmoc-Glu-OtBu保護(hù)的氨基酸，在Fmoc-Lys(MTT)-Wang樹脂上裝配肽。使用DCM/NMP中的DIC/NHS，2eq，手動將4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰氨磺酰)丁酸偶聯(lián)過夜，TNBS試驗顯示待完成的反應(yīng)。然后，樹脂以穿流布置(flowthrough arrangement)用50mL DCM/TFA/TIS/水(94:2:2:2)處理直到黃色消失，約20分鐘，接著用DIPEA/DMF洗滌并中和。溴乙酸(4mM)/DCM/NMP(1:1)用1mM NHS和DIC的混合物活化，過濾，再將其與1mM DIPEA加入樹脂中。1小時后，反應(yīng)完成。樹脂用80mL TFA/TIS/水(95:2.5:2.5)處理1小時。用N₂流蒸發(fā)，通過加入Et₂O而沉淀，用Et₂O洗滌并干燥。粗產(chǎn)物在制備型HPLC(2次運(yùn)行)中純化，用針對0.1％TFA/水的30-80％0.1TFA/MeCN的梯度。收集流分，與約50％MeCN一起凍干，得到化合物(I)。

TOF-MS：質(zhì)量1272.52(M+1)

流程1

實施例2

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量536.52(M+1)

實施例3

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量810.80(M+1)

實施例4

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量844.84(M+1)

實施例5

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1151.27(M+1)

實施例6

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1272.30(M+1)

實施例7

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量984.01(M+1)

實施例8

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量882.95(M+1)

實施例9

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量782.74(M+1)

實施例10

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1127.14(M+1)

實施例11

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH、碘乙酸和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1174.14(M+1)

實施例12

按照上述實施例1中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH、氯乙酸和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1061.89(M+1)

實施例13

(19-羧基十九烷酰)-Thx-γGlu-Glu-N-{3-[2-(2-{3-[3-馬來酰亞胺基(malimido)-丙酰基氨基]丙氧基}乙氧基)乙氧基]丙基}酰胺(II)

使2-氯三苯甲基樹脂(2.0g，2.6mmol)在DCM中溶脹0.5小時。加入4,7,10-三氧雜-1,13-二胺的DCM溶液(30mL)。將樹脂在室溫下攪拌1小時。樹脂用DCM洗滌一次，然后加入DIPEA:MeOH:DCM(15mL:15mL:20mL)的溶液。將樹脂振蕩0.5小時，然后用DCM洗滌兩次。然后如下通過標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)法，依次進(jìn)行Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu-OtBu和FmocThexOH偶聯(lián)：將0.5M Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt每種的NMP(11.7mL)溶液混合，2分鐘后加到樹脂中。將樹脂在室溫下振蕩45分鐘，然后用5xNMP和5xDCM洗滌。加入Ac₂O/DIPEA/NMP(1:1:5)的溶液，將樹脂在室溫下攪拌10分鐘。洗滌樹脂(5xNMP和5xDCM)。然后樹脂用30％哌啶/NMP處理2x10分鐘，最后用5xNMP和5xDCM洗滌。然后將肽加入含有0.125MHOAt(3eq)、0.125MDIC(3eq)和0.125M二甲基吡啶(3eq)的0.25 M二十烷二酸(6eq)的溶液中。將樹脂在室溫下振蕩2小時，接著用5xNMP和8xDCM洗滌。使用10％TFA-DCM，從樹脂上切割產(chǎn)物，持續(xù)20分鐘。濾出樹脂后，再用10％TFA-DCM處理一次達(dá)20分鐘。收集合并的濾液后，蒸發(fā)至干。

將上述干燥產(chǎn)物溶于DMF(6mL)，加入TSTU活化的3馬來酰亞胺丙酸(通過使TSTU與3馬來酰亞胺丙酸/DMF(2mL)反應(yīng)45分鐘預(yù)先制備)和DIPEA(200μL)。將混合物在室溫下攪拌1小時。使反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干后，將殘余物溶于95％TFA-MilliQ水中，在室溫下攪拌20分鐘。使混合物蒸發(fā)至干。向殘余物中加入少量的水以沉淀固體。濾出沉淀后，從MeCN中重結(jié)晶。收集晶體，用Et₂O充分洗滌，得到化合物(II)，為白色固體。

TOF-MS：質(zhì)量1094.39(M+1)。

實施例14

按照上述實施例1中所述和下述流程2中描述的類似方法，使用Boc-Gly-PAM樹脂為起始原料和一-叔丁基-二十烷酸、4-Boc-氨基苯甲酸、Fmoc-Thx-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-t-Bu保護(hù)的氨基酸制備下列化合物。在溫和脫保護(hù)后，使用2,2-二甲氧基乙胺從樹脂上切割肽產(chǎn)物，接著使用TFA進(jìn)行脫縮醛反應(yīng)，得到白蛋白結(jié)合劑(IV)。

TOF-MS：質(zhì)量1128.38(M+1)

流程2:

實施例15

按照上述實施例14中所述類似方法，使用Boc-Gly-PAM樹脂為起始原料和一-叔丁基-二十烷酸、4-Boc-氨基苯甲酸、Fmoc-Thx-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH、Fmoc-Glu(OH)-t-Bu保護(hù)的氨基酸制備下列化合物。在溫和脫保護(hù)后，使用2,2-二甲氧基乙胺從樹脂上切割肽產(chǎn)物，接著使用TFA進(jìn)行脫縮醛反應(yīng)，得到白蛋白結(jié)合劑(V)。

TOF-MS：Rt＝15.2分鐘，質(zhì)量＝967.11(M+1)

實施例16

按照上述實施例14所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂為起始原料和一-叔丁基-十八烷二酸、Boc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH和氧化的Fmoc-Cys-OH保護(hù)的氨基酸制備化合物(VI)。使用2.5％TIS、2.5％H₂O/THF，從樹脂上切割肽產(chǎn)物達(dá)3小時，并通過制備型HPLC純化：

柱：2cm C18

洗脫液A：0.1％TFA i Milli-Q水

洗脫液B：0.1％TFA i MeCN

起始％B：40％

終止％B：75％

梯度：5分鐘用10％MeCN，5-10分鐘直到起始％B(在51分鐘內(nèi))，5分鐘用終止％B+10％MeCN約1小時

流分通過LC-MS-TOF分析。

收集所需流分，合并后凍干，得到化合物(VI)

TOF-MS：Rt＝6.3分鐘，質(zhì)量＝955.1(M+1)

(VI)的氧化：

MTP-溶液：

將3-甲基-硫代-1-丙醇(290mg)溶于4mL 25mM HEPES(pH＝7.00)

高碘酸鹽-溶液：

將96mgNaIO₄溶于2mL Milli-Q水

向化合物(VI)的Milli-Q水(1mL)溶液中加入MTP溶液(3.6mL)+高碘酸鹽溶液(560μL)，用一滴1NNaOH調(diào)節(jié)pH至9.5。

反應(yīng)燒瓶用錫紙覆蓋，在室溫下攪拌1小時。加入另一份高碘酸鹽溶液(560μL)，將反應(yīng)混合物置于環(huán)境溫度下4.5小時。使所得混合物流過兩個NAP柱，以除去NaIO₄。柱用25mMHEPES(5x2.5mL)(pH＝7.0)預(yù)洗。

將樣品(2.5mL)加入各柱后，用3.5mL 25mMHEPES(pH＝7.00)洗脫，合并2x3.5mL共10.5mL，其含有酮-醛(VII)，直接用于與GH類似物綴合。

TOF-MS：質(zhì)量＝924.08(M+1)

實施例17

4-(1H-四唑-16-基-十六酰氨磺酰)丁酰-OEG-γGlu-γGlu-OEG-N^ε(4-氨基苯甲酰)Lys-NH₂(VIII)：

按照流程3，在固體載體上合成化合物(VIII)。將Fmoc保護(hù)的Rink-酰胺-樹脂(2.2g，0.6mMol/g)稱入燒瓶。樹脂用NMP(3x30mL)溶脹2小時。將樹脂與25％哌啶/NMP(30mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干后，用25％哌啶/NMP(30mL)處理1小時，接著瀝干后用NMP(6x30mL)洗滌。將Fmoc-Lys(Mtt)-OH和HOBt稱入燒瓶中，溶于溴酚藍(lán)/NMP(30mL，0.5mM)中。將該溶液加入上述瀝干的樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩21小時。將樹脂瀝干后，用NMP(6x30mL)洗滌，接著用DCM(3x30mL)洗滌。樹脂用六氟異丙醇(20mL)處理10分鐘。振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用DCM(3x30mL)洗滌。樹脂再次用六氟異丙醇(20mL)處理10分鐘后振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用DCM(3x30mL)洗滌，接著瀝干后用NMP(3x30mL)洗滌。將4-(Boc-氨基)苯甲酸和HOBt稱入燒瓶中，溶于溴酚藍(lán)/NMP(30mL，0.5mM)中。將該溶液加入上述瀝干的樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩。將樹脂瀝干后，用NMP(6x30mL)洗滌。將樹脂與25％哌啶/NMP(10mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用25％哌啶/NMP(10mL)處理1小時，接著瀝干后用NMP(6x15mL)洗滌。將Fmoc-OEG-OH和HOBt稱入燒瓶，溶于溴酚藍(lán)/NMP(15mL，0.5mM)中。將該溶液加入瀝干樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩23小時。將樹脂瀝干后，用NMP(6x15mL)洗滌。將樹脂與25％哌啶/NMP(10mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用25％哌啶/NMP(10mL)處理1小時，接著瀝干 后用NMP(6x15mL)洗滌。將Fmoc-Glu-O-t-Bu和HOBt稱入燒瓶，溶于溴酚藍(lán)/NMP(15mL，0.5mM)中。將該溶液加入瀝干樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩18小時。將樹脂瀝干，用NMP(6x15mL)洗滌。將樹脂與25％哌啶/NMP(10mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干后，用25％哌啶/NMP(10mL)處理1小時，接著瀝干后用NMP(6x15mL)洗滌。將Fmoc-Glu-O-t-Bu和HOBt稱入燒瓶，溶于15ml 0.5mM溴酚藍(lán)/NMP中。將該溶液加入瀝干樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩18小時。將樹脂瀝干，用NMP(6x15mL)洗滌。將樹脂與25％哌啶/NMP(10mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用25％哌啶/NMP(10mL)處理1小時，接著瀝干后，用NMP(6x15mL)洗滌。將Fmoc-OEG-OH和HOBt稱入燒瓶，溶于溴酚藍(lán)/NMP(15mL，0.5mM)中。將該溶液加入瀝干樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩。將樹脂瀝干后，用NMP(6x15mL)洗滌。將樹脂與25％哌啶/NMP(10mL)一起振蕩10分鐘。將樹脂瀝干，用25％哌啶/NMP(10mL)處理1小時，接著瀝干后，用NMP(6x15mL)洗滌。

將4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰氨磺酰)丁酸和HOBt稱入燒瓶，溶于溴酚藍(lán)/NMP(15mL，0.5mM)中。將該溶液加入瀝干樹脂中，接著加入DIC。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下振蕩21小時。將樹脂瀝干，用NMP(6x15mL)洗滌，接著瀝干后，用DCM(6x15mL)洗滌。樹脂用95％TFA/水(10mL)+DCM(0.25mL)和TIS(0.25mL)的混合物裂解。將樹脂在環(huán)境溫度下振蕩2小時后，濾入冰冷的Et₂O(75mL)中。所得沉淀通過離心分離，接著用Et2O(3x)洗滌后，真空干燥48小時，得到粗制的300mg化合物(VIII)。

粗制化合物(VIII)用prep-HPLC(GILSON)，30->80％MeCN純化。將合并的流分蒸發(fā)至干，將殘余物溶于H₂O/MeCN 1:1后，凍干過夜，得到170mg化合物(VIII)。

TOF-MS：Rt＝4.7分鐘，質(zhì)量1268.71(M+1)

流程3

實施例18

按照上述實施例17中所述類似方法，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1124.33(M+1)

實施例19

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂(Rink amid resin)制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1333.64(M+1)

實施例20

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1320.67(M+1)

實施例21

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量2114.64(M+1)

實施例22

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1534.82(M+1)

實施例23

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量823.05(M+1)

實施例24

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量980.22(M+1)

實施例25

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量851.10(M+1)

實施例26

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1258.51(M+1)

實施例27

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Wang樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1269.49(M+1)

實施例28

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量841.04(M+1)

實施例29

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量863.07(M+1)

實施例30

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量855.07(M+1)

實施例31

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量883.12(M+1)

實施例32

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1123.35(M+1)

實施例33

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：Rt＝4.7分鐘，質(zhì)量1267.45(M+1)

實施例34

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1310.67(M+1)

實施例35

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1308.58(M+1)

實施例36

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Glu(ODmab)-OH和2-氯三苯甲基氯樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1235.56(M+1)

實施例37

按照上述實施例17中所述類似方法，使用Fmoc-Glu(ODmab)-OH和2-氯三苯甲基氯樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1173.40(M+1)

實施例38

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量703.93(M+1)

實施例39

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Rink酰胺樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量689.90(M+1)

實施例40

按照上述實施例17中所述類似方法，使用FMOC-Glu(ODmab)-OH和2-氯三苯甲基氯樹脂制備下列化合物。

TOF-MS：質(zhì)量1182.34(M+1)

實施例41

17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-氨基戊基氨甲?；?甲氧基]乙氧基}乙基氨甲?；?-甲氧基]乙氧基}乙基氨甲?；?-1-羧基-丙基氨甲?；鵠-十七烷酸：

將N-叔丁氧羰基尸胺(24.3mg；0.12mmol)加入17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙基氨甲?；鶀甲氧基)乙氧基]乙基氨甲?；鶀丙基氨甲?；?-十七烷酸(100mg；0.12mmol)和DIPEA(46.68mg；0.36mmol)的THF(2.0ml)溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，然后真空濃縮。將殘余物溶于水(5ml)和THF(2ml)的混合物中，通過制備型HPLC(RP18柱)純化。合并含有Boc保護(hù)的偶聯(lián)產(chǎn)物的流分后，使之干燥。將殘余物溶于50％TFA-DCM(4ml)，在室溫下攪拌1小時，然后真空濃縮，得到54mg(55％)標(biāo)題產(chǎn)物，為其三氟乙酸鹽。

TOF-MS：質(zhì)量815.5(M+1)

GH白蛋白結(jié)合劑化合物的制備：

實施例42

先前已在WO2005/070468中描述了使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將柄與GH連接，并可按照本發(fā)明用于白蛋白結(jié)合劑的連接。按照US5156956，所使用的TGase是得自茂原鏈輪絲菌的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在上述化學(xué)法I部分描述了通用方法。

1.轉(zhuǎn)氨基的和氧化的GH化合物(I)與白蛋白結(jié)合劑(II)的偶聯(lián)

制備下列溶液：

緩沖液A：將三乙醇胺(119mg，0.8mmol)溶于水(40mL)中，調(diào)節(jié)pH至8.5。

(A)hGH(III)與1,3-二氨基-2-丙醇的轉(zhuǎn)氨基作用

在下一步驟中，向轉(zhuǎn)氨基的GH(III)中加入高碘酸鹽。氧化通常在30分鐘內(nèi)在低溫(例如4-10℃)下進(jìn)行，任選避光進(jìn)行。高碘酸鹽可將GH中的甲硫氨酸殘基氧化為其相應(yīng)的甲硫氨酸亞砜殘基。為了使這種氧化風(fēng)險降到最低，在高碘酸鹽氧化期間可加入小分子有機(jī)硫醚。合適有機(jī)硫醚是3-甲基硫丙-1-醇，但技術(shù)人員能夠提出其它有機(jī)醚。

轉(zhuǎn)氨基的GH化合物(IV)的氧化：

可進(jìn)行緩沖液更換以得到有效還原氰基硼氫化鈉所需要的酸溶液。通常，使用過量的A-W-B1-NH2胺，可隨時間加入較少部分的氰基硼氫化鈉。

制備下列溶液：

緩沖液A：將三乙醇胺(119mg，0.8mmol)溶于水(40mL)中，調(diào)節(jié)pH至8.5。

緩沖液B：將3-甲基硫丙醇(725mg，7.1mmol)溶于緩沖液A(10mL)中。

緩沖液C：將HEPES(5.96g)溶于水(1.0L)中，調(diào)節(jié)pH至7.0。

高碘酸鹽：將NaIO₄(48.1mg，0.225mmol)溶于水(1.0mL)中。

向(IV)(10mg，0.5μmol)的溶液中加入緩沖液B(0.2mL)，接著 加入高碘酸鹽溶液(0.03mL)。在冷孵育20分鐘后，混合物用緩沖液C透析4次。使殘余物濃縮至1mL。

(C)(I)與白蛋白結(jié)合劑(II)的還原胺化

可以使用實施例17-40中描述的白蛋白結(jié)合劑(II)。

將來自(B)(1mL，10mg，0.45μmol(I))的最終溶液與白蛋白結(jié)合劑(II)溶液(2mL，10mg，0.3μmol)在25mM HEPES緩沖液(pH 7.0)中混合，使所得混合物在室溫下慢慢旋轉(zhuǎn)1小時。1小時后，分批加入NaCNBH₃(100μL NaCNBH₃(20mg)的水(0.5mL)溶液)。將混合物避光置于室溫下18-24小時。

可如下進(jìn)行稍后的反應(yīng)：

向氧化的轉(zhuǎn)氨基的GH溶液中加入白蛋白結(jié)合劑接頭在AcOH(1.5mL)和50mM MES(0.5mL)的混合物(pH 6.00)中的溶液。將所得反應(yīng)混合物在室溫下輕輕振蕩30分鐘，此時加入NaCNBH₃溶液(15μL，(22mg NaCNBH₃溶于500μL Milli-Q水+AcOH(15μL)))。樣品用錫紙覆蓋，在室溫下攪拌過夜

可如下通過陰離子交換色譜法分離綴合物：

采用Amicon Ultra15裝置(Ultracel 10K管)，以4000rpm/分鐘離心3x8分鐘，通過用純水(3X)更換的緩沖液除去乙酸。然后采用Amicon Filter裝置，對混合物進(jìn)行緩沖液更換至20mM TEA(pH：8.50)，用20mM TEA稀釋至50mL的最終體積，然后加樣至HiLoad Q Sepharose，26/10柱中。該柱最初用20mM TEA，pH 8.50(緩沖液A)洗滌，然后使用0-100％(B)梯度經(jīng)20個CV，以2mL/分鐘的流速，用20mM TEA、500mMNaCl，pH 8.50(緩沖液B)洗脫。采用Amicon Ultra15裝置(Ultracel 10K管)，通過以4000rpm/分鐘離心3x8分鐘，對合并的流分進(jìn)行5次緩沖液更換至10mM碳酸氫銨緩沖液/純水。

使用實施例18的白蛋白結(jié)合劑將產(chǎn)生下列化合物

42.1

TOF-MS：質(zhì)量23301.63

使用實施例41的白蛋白結(jié)合劑制備下列化合物

42.2

TOF-MS：質(zhì)量23727.6245

向hGH(1mg，45nmol)和17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-氨基戊基氨甲?；?甲氧基]乙氧基}乙基氨甲酰基)甲氧基]乙氧基}乙基氨甲?；?-1-羧基-丙基氨甲?；鵠十七烷酸(2.10mg；2250nmol)的20mM三乙醇胺(1000ul；pH 8.5)溶液中加入TGase(0.12nmol；茂原鏈輪絲菌)。使反應(yīng)混合物在25℃下孵育146小時，其中倍增時，得到上式的衍生化hGH類似物。

實施例43

1.N端具有白蛋白結(jié)合劑(IV)的GH化合物(I)的偶聯(lián)

(A)(I)與白蛋白結(jié)合劑醛(IV)的還原烷基化

如上所示的衍生化方法利用白蛋白結(jié)合接頭A-W-B，其中B具有末端醛官能團(tuán)。hGH與A-W-B-CHO的綴合通過還原烷基化(hGH→ VI)產(chǎn)生。還原烷基化在本文中是示例性的，并且是本領(lǐng)域公認(rèn)的，導(dǎo)致hGH化合物在N端位置被修飾。

如實施例14中所述，得到白蛋白結(jié)合劑(IV)。

2-(C₂₀二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-甘氨酰胺(Glycin amid))-乙基-N^α1-hGH[Q84C，Y143C]的合成

43.0

將hGH[Q84C，Y143C](23mg)溶于Hepes緩沖液(2.3mL 0.25mM pH 7.0)中。將C₂₀二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-Gly-二甲基縮醛(2mg，參見上述實施例14)用TFA(50μL)處理6分鐘后，真空蒸發(fā)至干。殘余物用EtOH(200μL)汽提，真空蒸發(fā)至干。將殘余物溶于DMF(100μL)后，加入hGH溶液中。形成沉淀，通過加入DMF(1mL)重新溶解。1小時后，分批加入NaCNBH₃(20mg，0.5mL MeCN中(230μL))的溶液，靜置20小時。反應(yīng)物通過加入AcOH(2mL)猝滅，用水稀釋至20mL的總體積，然后在C18柱上，用0.1％TFA/MeCN的從40-80％針對0.1％TFA/水的梯度，在制備型HPLC中純化。收集最后的洗脫峰，用水自70％MeCN稀釋到10％，然后凍干，得到4.51mg 2-(C₂₀二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-甘氨酰胺)-乙基-N^α1-hGH[Q84C，Y143C]。

TOF-MS：Rt＝15.25分鐘，質(zhì)量＝23150

按照上述類似方法，使用實施例16的白蛋白結(jié)合劑制備下列化合物。

43.1

TOF-MS：Rt＝15.2分鐘，質(zhì)量＝23033

按照上述類似方法，使用實施例15的白蛋白結(jié)合劑制備下列化合物。

43.2

TOF-MS：Rt＝15分鐘，質(zhì)量＝22989.1

實施例44

1.具有內(nèi)部游離的單個cys的GH化合物(VII)與白蛋白結(jié)合劑(VIII)的偶聯(lián)

1)通過將二硫化物(VI)用合適的選擇性還原劑還原來釋放游離的Cys GH(VII)：

2)用鹵素活化的白蛋白結(jié)合劑(VIII)將游離Cys GH(VII)烷基化，得到Cys綴合的GH化合物(IX)

44.1

2-(C₂₀二酸-Trx-γGlu-OEG-OEG-δLys)-羰基亞甲基-S¹⁰¹-hGH[L101C]hGH[L101C](VII)的制備：

在如上得到的hGH[L101C]中，其游離半胱氨酸的部分用谷胱甘肽和胱胺封閉。在含有GSH和GSSG的平衡緩沖液中，使用谷氧還蛋白II(Grx2)，以酶促法進(jìn)行解封閉。通過在Sephadex G25柱上進(jìn)行緩沖液更換，將解封閉的hGH[L101C]與低分子量GSH/GSSG分開。

白蛋白結(jié)合劑(VIII)與hGH[L101C](VII)的綴合：

將實施例5的白蛋白結(jié)合劑(78mg，5eq)溶于具有5％羥丙基-β-環(huán)糊精的170mL HEPES/EDTA緩沖液中，加入MTP(2.1mL，1％)和0.5MNaCl(6.34g)。

向該混合物中加入濃縮的hGH[L101C](1eq，46mL)，混合物置于室溫下過夜。過夜后溶液變得混濁。因為HPLC顯示未反應(yīng)的起始原料，因此再加入5eq.實施例5的白蛋白結(jié)合劑(其溶于最少的NMP中)。將所得混合物再在室溫下攪拌16小時。

純化：

所用緩沖液：

緩沖液A.

20mM三乙醇胺(TEA)+10％乙二醇

5.96g三乙醇胺

200mL乙二醇

MQ水加至2L

用1NHCl調(diào)節(jié)pH至8.5

緩沖液B:

20mM三乙醇胺(TEA)+1.0MNaCl+10％乙二醇

5.96g三乙醇胺

116.88gNaCl

200mL乙二醇

MQ水加至2L

用1NHCl調(diào)節(jié)pH至8.5

在Sephadex柱中經(jīng)過3次運(yùn)行，將反應(yīng)緩沖液更換為具有乙二醇的TEA-緩沖液A。

柱：50/30Sephadex G25 fine

緩沖液A：

流速：10mL/分鐘

溫度：RT(在12℃下收集流分)

流分：30mL/流分

收集所需流分，合并，然后在Q Sepharose柱中純化：

柱：26/10Q Sepharose HP

緩沖液A：

緩沖液B：

梯度1：0-10％緩沖液B經(jīng)1個CV

梯度2：10-40％緩沖液B經(jīng)20個CV

梯度3：40-100％緩沖液B經(jīng)1個CV

流速：8mL/分鐘

溫度：RT(在室溫下收集流分)

流分：5mL/流分

收集所需流分，合并，在Sephadex G25柱中進(jìn)行緩沖液更換至10mM碳酸氫銨(pH 8.0)：

柱：50/30Sephadex G25 fine

緩沖液A：10mM碳酸氫銨(pH 8.0)

流速：10mL/分鐘

溫度：RT(在12℃下收集流分)

流分：30mL/流分

合并5個流分后凍干。

通過MS分析合并物，觀察到大量二聚體(MS 44491.7)。

將凍干的小瓶溶于緩沖液A后，在新的Q Sepharose柱中再純化：

柱：26/10Q Sepharose HP

緩沖液A：

緩沖液B：

梯度1：0-10％緩沖液B經(jīng)1個CV

梯度2：10-40％緩沖液B經(jīng)20個CV

梯度3：40-100％緩沖液B經(jīng)1個CV

流速：8mL/分鐘

溫度：RT(在室溫下收集流分)

流分：5mL/流分

合并流分，通過進(jìn)行超濾脫鹽/緩沖液更換至10mM碳酸氫銨。將合并物濃縮至25mL，通過RP-HPLC和MS-TOF定量：

TOF-MS：Rt＝16.15分鐘，質(zhì)量＝23315.96

采用相同方法制備下列化合物。

44.2

TOF-MS：Rt＝15,24分鐘，質(zhì)量＝22676.8

44.3

TOF-MS：Rt＝10.5分鐘，質(zhì)量＝22975.1

44.4

TOF-MS：Rt＝15.5分鐘，質(zhì)量＝23009

44.5

TOF-MS：Rt＝14.0分鐘，質(zhì)量＝23305,5

44.6

TOF-MS：Rt＝15.27分鐘，質(zhì)量＝23148

44.7

TOF-MS：Rt＝16.40分鐘，質(zhì)量＝23048

44.8

TOF-MS：Rt＝15.3分鐘，質(zhì)量＝22884.4

44.9

TOF-MS：Rt＝14.6分鐘，質(zhì)量＝23291.4

44.10

TOF-MS：Rt＝15.05分鐘，質(zhì)量＝23097.76

44.11

TOF-MS：Rt＝14.2分鐘，質(zhì)量＝23420.83

44.12

TOF-MS：Rt＝15.7分鐘，質(zhì)量＝23289.6

44.13

TOF-MS：Rt＝17.0分鐘，質(zhì)量＝23324.55

44.15

TOF-MS：Rt＝12.85分鐘，質(zhì)量＝23337.5

44.16

TOF-MS：Rt＝15,24分鐘，質(zhì)量＝22676.8

實施例45

1.具有內(nèi)部游離單個cys的GH化合物(VII)與白蛋白結(jié)合劑(X)的偶聯(lián)

1)游離Cys GH(VII)與馬來酰亞胺取代的白蛋白結(jié)合劑(X)的烷基化，得到Cys綴合的GH化合物(XI)

可使如上所述在實施例44中得到的脫保護(hù)的Cys GH化合物(VII)與馬來酰亞胺取代的白蛋白結(jié)合劑接頭(X)反應(yīng)，得到GH綴合物A-W-B1-NHC(O)CH₂CH₂-吡咯烷-2,5-二酮-3-hGH(XI)，其中B1如上述化學(xué)法IV中描述所定義的。

馬來酰亞胺官能化白蛋白結(jié)合劑(X)與hGH L101C綴合

步驟(a)半胱氨酸殘基的解封閉

在含有GSH和GSSG的平衡緩沖液中，使用谷氧還蛋白II(Grx2)，對谷胱甘肽/半胱胺封閉的Cys hGH(VI)進(jìn)行酶促解封閉。通過在Sephadex G25柱上的緩沖液更換，將解封閉的Cys hGH(VII)與低分子 量GSH/GSSG分開。

步驟(b)與馬來酰亞胺官能化白蛋白結(jié)合劑(X)的偶聯(lián)

將馬來酰亞胺官能化白蛋白結(jié)合劑(X)溶于含有5％羥丙基-β-環(huán)糊精的緩沖液。然后將溶液加入解封閉的Cys hGH(VII)中，并使之在室溫反應(yīng)過夜。

使用氯化鈉的梯度，在綴合之后，將綴合的蛋白質(zhì)在含有10％乙二醇的20mM三乙醇胺緩沖液(pH 8.5)中的Q Sepharose HiLoad柱上純化。合并收集的流分，使用G25柱轉(zhuǎn)移至10mM碳酸氫銨后凍干。45.1

TOF-MS：Rt＝16.0分鐘，質(zhì)量＝23352

45.2

TOF-MS：Rt＝15.98分鐘，質(zhì)量＝23338

45.3

TOF-MS：Rt＝16.62分鐘，質(zhì)量＝23324.6

45.4

TOF-MS：Rt＝16.20分鐘，質(zhì)量＝23339.7

45.5

TOF-MS：Rt＝15.72分鐘，質(zhì)量＝23316.35

45.6

TOF-MS：Rt＝17.2分鐘，質(zhì)量＝23365.9

45.7

TOF-MS：Rt＝17.2分鐘，質(zhì)量＝23366

45.8

TOF-MS：Rt＝16.5分鐘，質(zhì)量＝23366

45.9

TOF-MS：Rt＝16.8分鐘，質(zhì)量＝23323.8

45.10

TOF-MS：Rt＝17.1分鐘，質(zhì)量＝23382

45.11

TOF-MS：Rt＝17.2分鐘，質(zhì)量＝23338.8

45.12

TOF-MS：Rt＝17分鐘，質(zhì)量＝23353.9

45.13

TOF-MS：Rt＝15.65分鐘，質(zhì)量＝23323.7

45.14

TOF-MS：Rt＝16.5分鐘，質(zhì)量＝23365.8

45.15

TOF-MS：Rt＝17.2分鐘，質(zhì)量＝23365.9

實施例46

測定生長激素活性的測定法(I)BAF-3GHR測定法

BAF-3細(xì)胞(源自骨髓的鼠前B淋巴樣細(xì)胞系)的生長和存活最初是IL-3依賴性的。IL-3活化JAK-2和STAT，其為在刺激時GH所活化的相同介導(dǎo)物。在轉(zhuǎn)染人生長激素受體后，使細(xì)胞系轉(zhuǎn)變成生長激素依賴性細(xì)胞系。該克隆可用來評價不同的生長激素樣品對BAF-3GHR存活的作用。

在饑餓培養(yǎng)基(不含生長激素的培養(yǎng)基)中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)BAF-3GHR細(xì)胞24小時。

洗滌細(xì)胞，重新懸浮于饑餓培養(yǎng)基中，并接種至板上。將10μL不同濃度的生長激素化合物或人生長激素或?qū)φ占尤爰?xì)胞中，且將板于37℃、5％CO₂孵育68小時。

將加入各孔中，然后再將細(xì)胞孵育4小時。 是氧化還原指示劑，被細(xì)胞代謝固有的反應(yīng)還原，因此提供活細(xì)胞數(shù)的間接量度。

最后，細(xì)胞的代謝活性是熒光讀板儀中的量度。樣品中的吸光度以未用生長激素化合物刺激的細(xì)胞或?qū)φ盏模ケ硎?，可從濃?反應(yīng)曲線計算活性(刺激50％細(xì)胞的化合物的量)。

在BAF-3hGH受體測定法中化合物45.4的體外效力見下表1。

按照通用方法所述，通過將化合物與胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶一起孵育4小時，來測定化合物45.5的蛋白酶穩(wěn)定性。測量完整GH化合物的百分比，表1中包括了所述結(jié)果。

表1.與化合物45.4相關(guān)的數(shù)據(jù)

實施例47

藥代動力學(xué)

在雄性Spraque Dawley大鼠中，在靜脈內(nèi)(i.v.)和皮下(s.c.)單劑量給藥后，對實施例的化合物的藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究。

將試驗化合物在由甘氨酸20mg/mL、甘露醇2mg/mL、NaHCO₃ 2.5mg/mL組成的稀釋緩沖液中稀釋至1mg/mL的終濃度，調(diào)節(jié)pH至8.2。

在重為250g的雄性Spraque Dawley大鼠中研究試驗化合物。用25G針以60nmol/kg體重的劑量，在尾靜脈i.v.或在頸部s.c.單次注射給予試驗化合物。

對于各試驗化合物，按照表2提供的下列方案進(jìn)行采血。

表2.各試驗化合物的采血方案。

在各采樣時間，使用25G針從尾靜脈抽取0.25ml血液。將血液采入EDTA包被的試管中，在冰上保存，直到在4℃下以1200xG離心10分鐘。將血漿轉(zhuǎn)移至Micronic管中，并保存在-20℃下直到分析。

使用豚鼠抗hGH多克隆抗體作為捕捉器(catcher)，生物素化的hGH結(jié)合蛋白(人GH受體的可溶部分)作為檢測器，通過夾心ELISA測定試驗化合物濃度。測定的檢測極限為0.2nM.

應(yīng)用WinNonlin Professional(Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)，對各試驗化合物的平均濃度-時間概況進(jìn)行非房室藥代動力學(xué)分析。計算終末半衰期(t_1/2)和平均滯留時間(MRT)的藥代動力學(xué)參數(shù)估計值。

表3.Spraque Dawley大鼠中單劑量i.v.和s.c.給藥后，實施例的GH化合物的半衰期(t_1/2)和平均滯留時間(MRT)。

實施例45.4的生物利用度估計為48.3％。皮下給藥后至最大血漿濃度的時間(tmax)為8.0小時。在i.v.和s.c.給藥后，Cmax分別為1670和151nM。在i.v.給藥后零時，推算的血漿濃度為1710nM。

實施例48

如上所述測定一系列化合物的體外效力和半衰期。化合物的綴合物相同，但通過表4中所述經(jīng)突變引入的備選半胱氨酸連接。

表4.體外效力和半衰期(t_1/2)。

實施例49

切除垂體的Sprague Dawley大鼠中的體內(nèi)劑量反應(yīng)研究

在切除垂體的雄性Sprague Dawley大鼠中，研究體內(nèi)劑量反應(yīng)關(guān)系。切除垂體的大鼠是眾所周知和公認(rèn)的生長激素缺乏動物模型，其中在手術(shù)切除腦垂體后，不產(chǎn)生生長激素。這還導(dǎo)致低的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)循環(huán)水平，這是人生長激素缺乏的另一個重要臨床特征。

對重為90-100g的4周齡雄性大鼠進(jìn)行垂體切除術(shù)。手術(shù)后3-4周重為100-110g的動物進(jìn)入該研究，手術(shù)后3-4周期間體重增加大于10％的動物不允許進(jìn)入該研究。

使用5個劑量水平的化合物45.4(從1-150nmol/大鼠)進(jìn)行劑量反應(yīng)研究。

在所有給藥組中，切除垂體的Sprague Dawley大鼠中血漿IGF-1的基線水平為約80-100ng/mL。在第一天，在單劑量后，IGF-1水平快速增加到800-1000ng/mL，幾乎不依賴于劑量。血漿IGF-1水平在隨后的數(shù)天內(nèi)，以劑量依賴性方式再次下降，其中最低劑量中觀察到最快降低，而最高劑量觀察到最慢降低。在最高劑量下，在開始更快速地下降之前，IGF-1血漿水平保持在800-900ng/mL持續(xù)3天。對于所有給藥組，與溶媒對照組相比，IGF-1血漿濃度水平升高直到第3天。對于10nmol、50nmol和150nmol給藥組，在整個研究(7天)期間，IGF-1血漿濃度水平升高。

實施例50

消除

據(jù)假設(shè)，吸收速率與分子通過皮下毛細(xì)血管的緊密連接的能力有關(guān)，這是一種與分子大小的性質(zhì)。具有40kDaPEG的PEG-hGH的表觀分子量(mw)為150-250kDa。具有共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子的mw＝87kDa，而具有非共價結(jié)合的白蛋白的hGH分子將因時間與白 蛋白部分解離，因此mw＝22kDa。在解離狀態(tài)中耗用的時間將取決于白蛋白結(jié)合部分的親和力。因此這類化合物的吸收速率比PEG-hGH的吸收速率快，并且速率應(yīng)隨對白蛋白具有較低親和力的白蛋白結(jié)合部分的使用而提高。

將試驗溶液在由甘氨酸20mg/mL、甘露醇2mg/mL、NaHCO₃ 2.4mg/mL組成的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中稀釋，調(diào)節(jié)pH至8.2。

用¹²⁵I碘化由Chemistry&Isotope Lab.Novo Nordisk A/S進(jìn)行。最終的放射性制劑的比放射活性為3μCi/mL，并在3mL Penfill中提供。

將該溶液保存在2-8℃下直至使用。

在5只雜種LYD雌性豬中測量選定化合物的消除率(Disappearance rate)。給豬稱重，禁食，分發(fā)特殊的“豬外套”以攜帶γ計數(shù)器和發(fā)射器，并且在開始研究前關(guān)在單獨(dú)的欄中。

研究前，使所有豬禁食18小時。

用具有固定黑色針塞(needle stopper)的和28G針分別在頸部左右側(cè)對動物皮下給藥(60nmol)。注射深度為5mm。

通過便攜式設(shè)備測量放射性貯庫的消除，持續(xù)約24-48小時。

對于各單獨(dú)的動物，結(jié)果表示為AUC(0-45小時)，如表5所示。

如上所述和如表5所示，測定一系列化合物的體外效力、半衰期和其它特征。

表5.化合物特性。

實施例51

豬中的體內(nèi)研究

為了進(jìn)一步證實本發(fā)明的hGH白蛋白綴合物的功能，選擇3種化合物用于在豬中的其它藥代動力學(xué)研究。制備相當(dāng)于化合物44.1、44.4和44.5的化合物，在脫去MAEA純化標(biāo)簽后，使白蛋白結(jié)合劑與hGH變體綴合。

在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(20mg/mL甘氨酸、2mg/mL甘露醇、2.4mg/mL NaHCO₃，pH調(diào)節(jié)至8.2)中，將試驗化合物稀釋至100nmol/mL的終濃度。研究中使用5月齡和重為9-12kg的二十四只雄性小型豬(minipig)。將各試驗化合物給予8只動物，其中4只小型豬接受靜脈內(nèi)推注給藥，4只動物接受皮下給藥。靜脈內(nèi)注射通過24G Venflon在耳部給予。在最長5秒內(nèi)，推注給予該劑量，接著給予2mL0.9％NaCl。在距耳約5-7cm且距頸中部7-9cm的頸部右側(cè)給予皮下注射。每只動物接受單劑量的10nmol/kg試驗化合物。在下列時間點(diǎn)自每只動物中收集血樣：給藥前、注射后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、18、24、48、72、96、120、168、240和336小時。自各個血樣中分離血漿，在分析試驗化合物前保存在-20℃下。通過非房室藥代動力學(xué)方法對血漿濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表6.單劑量皮下給予10nmol/kg后的藥代動力學(xué)參數(shù)估算值。

()中為平均值±SD

表6表示3種試驗化合物的關(guān)鍵藥代動力學(xué)參數(shù)。AUC/劑量是 試驗化合物劑量校正的暴露的估值。T_1/2是吸收期完成后試驗化合物的終末半衰期。MRT是試驗化合物的平均滯留時間，相當(dāng)于試驗化合物分子在體內(nèi)的平均時間。MAT是相應(yīng)的平均吸收時間，并且是分子處于吸收期的平均時間的估值。F是有關(guān)靜脈內(nèi)給藥的試驗化合物的絕對生物利用度。

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<210> 1

<211> 191

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

1 5 10 15

Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu

20 25 30

Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro

35 40 45

Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg

50 55 60

Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu

65 70 75 80

Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val

85 90 95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp

100 105 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu

115 120 125

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser

130 135 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe

165 170 175

Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

180 185 190