本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及天然產(chǎn)物提取物，尤其涉及一種松仁提取物及其制備方法和用途。所述松仁提取物可用于預防和治療老年癡呆癥等疾病。

背景技術：

老年癡呆，又稱阿爾茲海默病(alzheimer’sdisease，ad)，是老年性癡呆的一種，是在意識清楚下發(fā)生的、后天的、持續(xù)的、全面認知障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為認知障礙、癡呆，其在神經(jīng)病理學上有兩個特征：神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillarytangles，nfts)和老年斑(senileplaques，sps)。歷經(jīng)一個多世紀的研究，阿爾茲海默病的病因仍未闡釋清楚，且目前臨床中使用的藥物多是針對ad的病理癥狀，并不能從根本上治療ad。隨著老齡化社會的到來，阿爾茲海默病的提早預防和干預是提高患者自身生活質(zhì)量和降低患者家庭及社會負擔的有力保障。ad是神經(jīng)退行性疾病，一旦發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)，松仁作為一種易得、可長期服用的堅果類食物在我國古代醫(yī)書中已有“延年不老”的功效記載。發(fā)掘中藥寶藏，從包括中藥材的天然產(chǎn)物中分離、純化和鑒定有效藥用成分，開拓醫(yī)藥用途，對于當今醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展有著非常重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種松仁提取物及其制備方法，以及所述松仁提取物用于制備藥物以及用于預防和治療老年癡呆癥的用途。

首先，本發(fā)明提供了一種松仁提取物(upno-1)。所述松仁提取物是由皮諾斂酸和亞油酸為主要組分的脂肪酸組合物。所述組合物包含下述成分：亞油酸：65.0～70.0％；皮諾斂酸：25.0～30.0％；其余脂肪酸：4.0～5.0％。

其中，所述其余脂肪酸包括：5,9-十八碳二烯酸(2.0～3.0％)、5,11,14-二十碳三烯酸(0.5～1.0％)、油酸(0.5～1.0％)。

根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式，上述脂肪酸組合物的成分按照質(zhì)量百分比進行計算確定。

另外，本發(fā)明還提供了所述松仁提取物的制備方法。所述方法如下步驟：提取、皂化、尿素包合、干燥。

所述步驟可進一步包括：

提取，包括采用正己烷為提取液，從松仁得到粗油脂提取物；

皂化，包括采用皂化用堿對所述粗油脂提取物進行水解；

尿素包合，包括采用尿素對所述水解產(chǎn)物進行純化；以及

干燥。

還有，本發(fā)明進一步提供了一種藥用組合物，其含有有效劑量的所述松仁提取物作為藥用活性成分，以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明還提供了所述松仁提取物或其組合物用于制備藥物的用途。所述藥物能夠用于預防和治療老年癡呆癥等疾病。所述藥物可制備成膠囊劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、口服液或注射劑。所述膠囊劑可為微型膠囊。

附圖說明

圖1顯示d-gal造模和各藥物組對大鼠腦海馬ca1區(qū)和ca3區(qū)神經(jīng)元細 胞影響。其中，a、e：腦海馬ca1區(qū)he染色(400×)；b、f：腦海馬ca3區(qū)he染色(400×)；c、g：腦海馬ca1區(qū)死亡神經(jīng)元百分比；d、h：腦海馬ca3區(qū)死亡神經(jīng)元百分比；*：t檢驗，p＜0.05；**：t檢驗，p＜0.01。

圖2顯示d-gal造模和各預防藥物在不同采樣點對血液氧化應激指標的影響。其中，a：血漿t-aoc活力；b：血漿t-sod活力；c：全血cat活力；*：t檢驗，p＜0.05；**：t檢驗，p＜0.01。

圖3顯示應用靶向代謝組學評價d-gal及各藥物在不同采樣點對大鼠的影響。其中，a：不同采樣點正常對照組(■)和模型組(◆)pls-da分組；b：不同采樣點診斷模型y’的roc曲線；c：不同采樣點藥物與正常對照組(■)和模型組(◆)pls-da分組，4周、8周、12周顯示松仁(◇)、upno-1魚油(▲)的預防作用，16周顯示陽性藥司來吉蘭upno-1的治療作用；d：不同采樣點診斷模型y’值箱圖。

具體實施方式

在下文中結合一些具體的實施方式對本發(fā)明作進一步的、示例性的描述。應該理解，這些描述不是用來限制本申請要求保護的范圍。

松仁提取物的制備

粗油脂提取物制備：以松仁重量為基準，設松仁重量為1。稱取1份松仁，研磨，加入正己烷4～6份，超聲提取20～60min，過濾，將濾液減壓蒸干，同時回收正己烷。重復此步驟，將兩次得到油狀物質(zhì)合并，即得到粗油脂提取物。

油脂的水解：用2～3份無水乙醇溶解粗油脂提取物、加入0.25～0.35份氫 氧化鈉，回流，2～4h后，減壓濃縮，得固體。

不飽和脂肪酸純化：將上述固體物質(zhì)調(diào)至酸性，然后用0.8～1.2份正己烷萃取兩次，有機層用水洗至中性，減壓濃縮，得黃色粘稠液體，同時回收正己烷。依次向粘稠液體中加入尿素0.8～1.2份、95％乙醇4～6份，80～85℃回流至溶解完全，降至室溫后，4℃下靜置24h，析出晶體。過濾，濾液減壓蒸干，加入酸使成酸性，隨后用0.8～1.2份正己烷萃取兩次，合并有機層。將有機層水洗至中性，除水，過濾，濾液減壓濃縮至恒重。

干燥：室溫下真空泵抽真空3～5h，得到產(chǎn)物松仁提取物，為黃色至棕黃色澄清的粘稠液體。

產(chǎn)品的藥學研究及功效

一、產(chǎn)品的質(zhì)量控制

制得的松仁提取物為黃色至棕黃色澄清的粘稠液體，溶解于乙醇、甲醇、乙腈、正己烷，不溶于水。

1.組成分析

(1)高分辨質(zhì)譜法

應用高分辨質(zhì)譜法對提取物的成分進行確認，根據(jù)獲得的精確分子量對提取物中物質(zhì)的化學式進行匹配，結果表明該松仁提取物(upno-1)中的成分包括18:2脂肪酸和18:3脂肪酸。

(2)氣相色譜-質(zhì)譜法

應用氣相色譜-質(zhì)譜法對松仁提取物的甲酯化樣品進行進一步的結構確認，獲得的氣相色譜-質(zhì)譜圖中可見5個色譜峰。提取每個色譜峰的質(zhì)譜裂解圖， 與標準譜庫或標準品進行匹配，5個物質(zhì)的結構為皮諾斂酸(與標準品保留時間、質(zhì)譜裂解一致)、亞油酸(與標準品保留時間、質(zhì)譜裂解一致)、5,9-十八碳二烯酸、油酸、7,11,14-二十碳三烯酸。且皮諾斂酸和亞油酸的峰響應強度遠高于其余3個化合物，表明此兩個化合物為松仁油提取物的主要成分。

2.質(zhì)量控制

(1)皮諾斂酸和亞油酸比例

應用液相色譜-紫外檢測器對三批松仁提取物的組成進行考察，得到色譜圖中共檢測到5個色譜峰，經(jīng)標準品保留時間比對，確認兩個主峰分別為皮諾斂酸、亞油酸。計算三批樣品中皮諾斂酸和亞油酸質(zhì)量百分比，亞油酸：65.0～70.0％，皮諾斂酸：25.0～30.0％，其余脂肪酸：4.0～5.0％(其中其余脂肪是5,9-十八碳二烯酸：2.0～3.0％；5,11,14-二十碳三烯酸：0.5～1.0％；油酸：0.5～1.0％)。

(2)殘留有機溶媒

對獲得的三批松仁提取物依照藥典(2015版)對提取過程中使用到的有機溶劑進行殘留有機溶媒檢查，未檢測到有機溶劑(乙醇、正己烷)。

二、產(chǎn)品具有防治老年癡呆作用

1、實驗動物與分組

實驗設為預防組和治療組，其中預防組設計有正常對照組(c組)、d-gal模型組(d組)、松仁組(d+p組)、松仁提取物upno-1組(d+u組)、魚油組(d+f組)，除正常對照組外，其余各組腹腔注射d-gal造模，并同時給予相應藥物預防，實驗周期為12周。治療組設計有正常對照組(c16組)、模型組-2(d8+8-16組)、陽性藥司來吉蘭組(d8+s8-16組)、松仁提取物組 (d8+u8-16組)，正常對照組自然喂養(yǎng)至第16周，其余各組于造模8周后停止造模，并開始給予相應藥物進行治療，實驗周期共計16周。

2.實驗結果

(1)松仁提取物upno-1對大鼠腦海馬神經(jīng)元的保護作用

觀察各預防組腦海馬的ca1區(qū)和ca3區(qū)he染色病理切片，統(tǒng)計神經(jīng)元死亡百分比，結果見圖1a～d?？梢娬φ战M(c12組)腦海馬ca1區(qū)、ca3細胞排列緊密，形態(tài)正常。模型組(d12)細胞排列松散，細胞核固縮、胞漿深染，部分神經(jīng)元表現(xiàn)為核膜核仁消失、空泡樣病變；各預防藥物組腦海馬ca1區(qū)、ca3區(qū)神經(jīng)元排列及形態(tài)有所好轉(zhuǎn)，兩個區(qū)域的死亡神經(jīng)元比例均顯著低于12周模型組(d12)。以上結果表明松仁、upno-1、魚油均具有一定預防作用，且upno-1和魚油的預防作用明顯，優(yōu)于松仁。

由于目前缺少對d-gal造模成功后，大鼠腦海馬神經(jīng)元病變的相關研究，因此本發(fā)明首先研究了于造模8周后停止造模的大鼠至16周時其海馬神經(jīng)元情況。如圖1.e、f所示，造模至第8周時(d8)神經(jīng)元已出現(xiàn)排列松散、核固縮、胞漿深染等病變；于第8周停止造模的d8+8-16組并沒有好轉(zhuǎn)的趨勢。以上結果表明d-gal造模成功后，大鼠腦海馬神經(jīng)元病變不能自然恢復。

治療藥物組中，upno-1治療后大鼠腦海馬ca1區(qū)、ca3區(qū)死亡神經(jīng)元比例均顯著低于d8+8-16組；陽性藥司來吉蘭治療后僅ca3區(qū)死亡神經(jīng)元比例顯著低于d8+8-16組。以上結果表明upno-1和陽性藥司來吉蘭均具有一定治療作用，且upno-1的治療作用優(yōu)于陽性藥司來吉蘭。綜上所述，松仁提取物upno-1具有對神經(jīng)元的保護作用，從而起到預防和治療老年癡呆的作用。

(2)松仁提取物upno-1的抗氧化損傷評價

追蹤記錄老年癡呆大鼠造模過程中各組實驗動物血中總抗氧化能力(t-aoc)、總sod活力和過氧化氫酶(cat)活力，結果見圖2。

本發(fā)明關注的3個生化指標中，對照組和模型組間第8周具有顯著性差異的指標有t-aoc、t-sod，表明此時模型組大鼠體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)明顯的氧化損傷。第12周時具有顯著性差異的指標有t-aoc、t-sod、cat，表明第12周時模型組的病情有所加重。此外，t-aoc和t-sod在疾病早期(第4周)已出現(xiàn)顯著的降低，表明氧化應激于疾病的早期就已經(jīng)出現(xiàn)。在疾病的早、中、晚期，d+p組分別有1、0、2個指標表現(xiàn)為有藥效；d+u組分別有1、1、2個指標表現(xiàn)為有藥效；d+f組分別有1、0、1個指標有藥效。以上結果表明，持續(xù)給予d-gal刺激，于第8周時出現(xiàn)明顯的氧化損傷，且造模至第12周時氧化損傷程度增加。各預防藥物組均具有一定抗氧化損傷作用，且松仁、upno-1的效果優(yōu)于魚油。

(3)應用代謝組學評價松仁提取物upno-1對老年癡呆的防治作用

應用輪廓代謝組學原理尋找靶向代謝組學的靶標，進行pls-da分組；應用靶標建立各個時期診斷數(shù)學模型，并根據(jù)數(shù)學模型計算各樣品的y’值，統(tǒng)計結果見圖3。各個采樣點正常對照組與模型組pls-da分組良好(圖3a)，且y’的roc曲線下面積均>0.88(圖3b)，表明所建立的診斷模型分組能力和預測能力均較好。應用各個采樣點的靶標進行各藥物組與正常對照組、模型組的pls-da分組(圖3c)，計算各組y’值箱圖(圖3d)。在預防作用評價中(4周、8周、12周顯示結果)upno-1和魚油的作用效果優(yōu)于松仁，表現(xiàn)為8周、12周pls-da分組時upno-1預防組和魚油預防組距離正常對照組更近，且此兩組的y’值顯著高于模型組。在治療作用評價中(16周顯示結果)upno-1 的治療作用優(yōu)于陽性藥司來吉蘭，表現(xiàn)為upno-1治療組距離模型組更遠，且該組y’值略高于模型組和陽性藥司來吉蘭組。

綜上所述，松仁中的藥效物質(zhì)upno-1對d-gal所致的大鼠ad具有預防和治療作用，且upno-1的預防作用強弱與魚油相近；upno-1的治療作用強于陽性藥司來吉蘭。

以上結果表明，本發(fā)明所制備的松仁提取物質(zhì)量符合藥品要求；且該產(chǎn)品可以對老年癡呆進行預防和治療。

本文結合附圖針對本發(fā)明的一些具體實施方式進行了描述，用作示例和解釋。應當理解，本發(fā)明的范圍不受這些具體實施方式的限制。對本文所描述內(nèi)容的修改或調(diào)整就本領域普通技術人員來說并不偏離本發(fā)明的精神和主旨，因而屬于本發(fā)明的范圍。