本發(fā)明涉及獸藥技術領域，特別涉及一種防治副豬嗜血桿菌病的藥物，具體為大黃酸或/和其衍生物，本發(fā)明還涉及所述藥物的用途。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis，hps)普遍存在于豬的上呼吸道中，能夠引起豬的格拉賽爾氏病(
目前，國內(nèi)外對副豬嗜血桿菌病的防治方法主要是抗生素藥物防治和疫苗免疫。許多養(yǎng)殖戶和生產(chǎn)企業(yè)采取抗生素拌料的方式對整個豬群進行預防，發(fā)病豬群選用敏感抗生素大劑量肌肉注射進行治療。但在防治過程中由于不科學的、盲目的濫用抗生素，不但導致該病對很多抗生素產(chǎn)生了耐藥性，延誤了病情，還導致動物體內(nèi)抗生素毒性殘留，給食品安全帶來了潛在威脅。而疫苗免疫由于副豬嗜血桿菌眾多血清型間的交叉保護力低不能對該病提供完全有效的免疫保護。鑒于該病在養(yǎng)豬業(yè)中危害的嚴重性、濫用抗生素帶來的負面影響以及疫苗免疫經(jīng)常失敗的應用現(xiàn)狀，必須研究開發(fā)一種能夠很好地防治該病的安全無耐藥性產(chǎn)生的新獸藥并推廣應用。
基于發(fā)明者的知識，目前沒有報道顯示大黃酸及其衍生物制備用于預防和/或治療的藥物用途更是沒有報道。
參考文獻：
1.zhoux,xux,zhaoy,chenp,zhangx,chenh,caix.distributionofantimicrobialresistanceamongdifferentserovarsofhaemophilusparasuisisolates.veterinarymicrobiology,2010,141:168-173.
2.賈愛卿，李春玲，王貴平等.副豬嗜血桿菌毒力因子的研究現(xiàn)狀.畜牧與獸醫(yī)，2008,40:92-94.
3.萬世平，王建，葛菲菲等.副豬嗜血桿菌毒力因子的研宄進展.畜牧與獸醫(yī)，2010,42:101-104.
4.薛國聰，任濤.副豬嗜血桿菌病流行病學及致病因子的研宄進展.中國畜牧獸,2009,36:168-171.
5.oliveiras,pijoanc.haemophilusparasuis:newtrendsondiagnosis,epidemiol-ogyandcontrol.vetmicrobiol.2004,99:1-12.
6.costa-hurtadom,ballesterm,galofré-milàn,darjia,aragonv.vtaa8andvtaa9fromhaemophilusparasuisdelayphagocytosisbyalveolarmacrophages.vetres.2012,27:43-57.
7.naritam,kawashimak,matsuuras,uchimuraa,miuray.pneumoniainpigsinfectedwithpseudorabiesvirusandhaemophilusparasuisserovar4.jcomppathol.1994,110:329-39.
8.kimj,chunghk,jungt,chows,choic,chaec.postweaningmultisystemicwastingsyndromeofpigsinkorea:prevalence,microscopiclesionsandcoexistingmicroorganisms.jvetmedsci.2002,64:57-62.
9.蔡旭旺，陳煥春.副豬嗜血桿菌病的危害及其防治策略.養(yǎng)殖與飼料，2004,6:34-37.
10.strawbe,allairesd,meigelingwl,taylordj.diseasesofswine.8thedition.ames,lowa,usa:lowastateuniversitupress,1999,475-481.
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是經(jīng)過篩選后補化合物而提供一種新型的防治副豬嗜血桿菌病的藥物，安全無耐藥性；本發(fā)明的另一個目的是提供該種藥物作為制備預防或治療由副豬嗜血桿菌引起的相關疾病藥物中的應用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種防治副豬嗜血桿菌病的藥物是大黃酸或大黃酸衍生物，其分別由下式(i)或(ii)所定義：
包括其單獨的異構(gòu)體、異構(gòu)體的外消旋或非外消旋混合物、氧化物、或其藥學上可接受的鹽和水合物
其中，r1選自-cooh或-so3h；r2～r6選自氫、烴基、鹵素、-cn、-oh、-n3、-no2、-n(r)2、
-ch═nr、-or、-cor、-ocor，其中，r為甲基或乙基。
本發(fā)明涉及所述的取代基為烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的數(shù)目為1-10，環(huán)烷基的碳的數(shù)目為3-8，環(huán)烯基的碳的數(shù)目為5-6，烯基的碳的數(shù)目為2-6，炔基的碳的數(shù)目為2-6，芳基的碳的數(shù)目為6-10。
在本發(fā)明的另一個方面，所提供的藥學上可接受的鹽選自鉀鹽或鈉鹽。
在本發(fā)明的又一個方面，提供了所述藥物的可選劑型為口服制劑、外用制劑、吸入制劑、經(jīng)鼻制劑、經(jīng)直腸制劑、經(jīng)皮制劑或注射制劑。優(yōu)選為口服制劑。
在本發(fā)明的在一個方面，對已經(jīng)患有或正在患有或處在患有副豬嗜血桿菌病的風險的豬豬施用預防和/或治療有效量的含有大黃酸及其衍生物的藥物。
所述有效量包括對豬每天施用約0.1mg/kg至約10000mg/kg體重的。
在本發(fā)明的再一個方面，提供了含有大黃酸或/和其衍生物的藥物組合物，在所述的藥物組合物中，大黃酸或/和其衍生物所占比例，以重量計，占整個制劑的總重量為10％-80％。
在國際上，發(fā)明人使用從天然中草藥中篩選獲得了一個無任何毒副作用的大黃酸及其衍生物，首次有效地防止和/或治療副豬嗜血桿菌病。做到科學用藥，有的放矢。也是首次發(fā)現(xiàn)了副豬嗜血桿菌病的這種功能，填補了中草藥現(xiàn)代化的國內(nèi)、國際空白，利于豬的康復，生產(chǎn)和產(chǎn)量的提高。
具體實施方式
為了提供對本發(fā)明的實質(zhì)性理解，在下文中以不同的詳細程度描述了本發(fā)明的某些方面、模式、實施方式、變型和特征。
在實施本發(fā)明的過程中，使用了動物學、藥物有機化學、細胞生物學、免疫學、微生物學等很多傳統(tǒng)技術。這些技術是熟知的。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描闡述：
一種防治副豬嗜血桿菌病的藥物是大黃酸或大黃酸衍生物或其藥用鹽，所述的大黃酸衍生物為具有通式(1)的化合物，
其中，r1選自-cooh或-so3h；r2～r6選自氫、烴基、鹵素、-cn、-oh、-n3、-no2、-n(r)2、
-ch═nr、-or、-cor、-ocor，其中，r為甲基或乙基。
本發(fā)明涉及所述的取代基為烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的數(shù)目為1-10，環(huán)烷基的碳的數(shù)目為3-8，環(huán)烯基的碳的數(shù)目為5-6，烯基的碳的數(shù)目為2-6，炔基的碳的數(shù)目為2-6，芳基的碳的數(shù)目為6-10。
本發(fā)明提供的的藥用鹽選自鉀鹽、鈉鹽。
本發(fā)明還涉及所述的大黃酸或大黃酸衍生物或其藥用鹽作為制備預防或治療由副豬嗜血桿菌引起的相關疾病藥物中的應用。
本發(fā)明的藥物和制備方法在如下實施例中更詳細地敘述，但實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
本領域技術人員可以理解，所述大黃酸及其衍生物包括其單獨的異構(gòu)體、異構(gòu)體的外消旋或非外消旋混合物、氧化物、或其藥學上可接受的鹽和水合物。
在本發(fā)明的一個具體實施方式中，通過對大黃酸化合物進行基團修飾，如氨基化、羧基化、醛基化、芐基化等化學修飾，可制備活性以及理化特性不同的大黃酸化合物衍生物。
在本發(fā)明的一些具體實施方式中，制備了本發(fā)明的黃酸衍生物。所述的大黃酸衍生物包括但不限于：2,4,5,6,7-五甲基大黃酸(hx-1)、7-乙基大黃酸衍生物(hx-2)、7-乙?；簏S酸衍生物(hx-3)、7-乙烯基大黃酸衍生物(hx-4)、7-溴代大黃酸衍生物(hx-5)等。
本說明書中使用的一些術語的定義，除非另有說明，本文中使用的所有技術和科學用語通常具有和本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的意思相同的意思。
大黃酸及其衍生物的預防用途和治療用途
在本發(fā)明的一個實施方式中，通過使用潛在的候選者化合物進行篩選動力學實驗，本領域技術人員篩選具有對副豬嗜血桿菌菌株的預防和治療作用。特別地，通過候選者化合物的動力學篩選實驗確定大黃酸及其衍生物能夠完全預防和治療副豬嗜血桿菌菌株。
本文中使用的術語“治療”或指的是治療處理措施和預防的或防止的措施，其中，防止或減緩(減弱)受試者的患有的病理癥狀或失調(diào)。如果接受了根據(jù)本文所述的方法的治療量的大黃酸及其衍生物，則受試者的癥狀得到成功地“治療”，受試者顯示，可以觀察到和/或測定到癥狀的一種或多種跡象和癥狀減少和消失。還應當理解，本文描述的治療或防止醫(yī)療狀況的各種模式意在表示“顯著”，其包括全部治療或者預防以及小于全部治療或者預防，其中達到了某種生物學相關或醫(yī)學相關的結(jié)果。
本發(fā)明的一個具體實施方式中，對受試者施用預防和/或治療有效量的含有大黃酸及其衍生物的藥物。
本文中使用的術語“有效量”指的是足以獲得所需的治療和/或預防效果，例如引起預防或減輕與病理癥狀或疾病的癥狀的量。給藥至受試者的組合物的量將取決于疾病的類型和嚴重性以及個體的性質(zhì)，比如平時的健康情況、年齡、性別、體重和對藥物的耐受力。所述量還取決于患病程度、嚴重性和類型。本領域技術人員將能夠根據(jù)這些因素和其他因素來確定合適的劑量。所述組合物還可結(jié)合一種或多種其他的治療化合物來給藥。在本文描述的方法中，本發(fā)明的化合物可以給藥至具有病理癥狀的一種或多種跡象或病理癥狀的受試者。例如，“治療有效量”是指最小程度地減輕癥狀的生理作用的平均水平。
通常，所述劑量將能夠預防或減輕所治療狀況或指征的嚴重性或擴展。正確的劑量將依賴于環(huán)境，例如所治療的狀況、給藥時間表、所述化合物是否單獨施用或者與另一種治療劑結(jié)合施用、所述化合物的血漿半衰期和受試者的整體健康狀況。
可以采用包括口服，外用，吸入，經(jīng)鼻，經(jīng)直腸，經(jīng)皮或注射施用方式對受試者用藥。
在本發(fā)明的一個具體實施方式中，制備了含有對于本文公開的所述化合物，每日給藥劑量方案為約0.1mg/kg至約10000mg/kg體重、優(yōu)選為約1mg/kg至約1000mg/kg體重、更優(yōu)選為1mg/kg至約500mg/kg，最優(yōu)選為1mg/kg至約200mg/kg體重。每日可施用1至6次，優(yōu)選每日施用2或3次。間隔也可以是不規(guī)則的，本領域技術人員公認化合物或其藥學上可接受的鹽的最佳量和單次給藥的間隔將由待治療狀況的性質(zhì)和程度，給藥的形式、途徑和位點以及所治療的受試者的具體情況而確定，并且可以常規(guī)技術確定最優(yōu)選方案。本領域技術人員還應該理解，治療的最佳過程，即在給定的天數(shù)內(nèi)每日給予的化合物或其藥學上可接受的鹽的給藥數(shù)量可以由本領域技術人員利用常規(guī)的治療測試方法而確定。在治療應用中，在相對短的時間間隔中有相對高的劑量有時是需要的，直到疾病的進程減緩或終止為止，且優(yōu)選地直到受試者顯示部分或完全地改善了所述疾病或病理癥狀。因此，患者可以對患者實行預防性的給藥方式。本領域技術人員將認識到，某些因素可以影響有效地治療一受試者的劑量和時間，包括但不局限于疾病或失調(diào)的嚴重程度、先前的治療、健康情況和/或受試者的年齡以及存在的其它疾病。而且，利用本文描述的治療有效量的治療對照組合物來治療一受試者可以包括單次治療或一系列治療。
本發(fā)明的化合物可以與至少一種其他中草藥一起施用。中成藥可選用柴胡、當歸、丹參、桂枝、白芍、陳皮、清半夏、透骨草、羌活、生地黃、桔梗、木瓜丸、大活絡丹、小活絡丹、香附、白芥子、草烏、黑附片、忍冬藤、秦艽、桑枝、茯苓。本領域技術人員可以理解與本發(fā)明的化合物一起施用的上述化合物可以根據(jù)所述的不同疾病或病理癥狀做出選擇。
所述化合物或中草藥可以作為單獨的制劑或者組合在單位劑型中同時施用，或者順次施用。在任何情況下，多種治療劑可以以任何順序或甚至同時給藥。如果同時地，所述多種治療劑可以提供為單一、統(tǒng)一的形式或者以多個形式(例如，作為單一的片劑或者各自獨立的片劑或膠囊的兩種不同制劑)。所述治療劑中的一種治療劑可能以多劑量型提供，或者其中的兩種可以作為多劑量型提供。如果不同時地，則多次劑量之間的時間間隔可以從大于0周到小于約1周、小于約2周、小于約4周、小于約2個月、小于約4個月或甚至小于約半年的范圍中變化。
本文使用的術語“單位劑型”是指適合作為用于人和動物受試者的單位劑量的在物理上分離的單元，各單元包含單獨的預定量的化合物或者與其它試劑組合，其量經(jīng)計算足以與藥學上可接受的稀釋劑、載體或媒介組合產(chǎn)生期望效果。
在本發(fā)明的具體實施方式中，制備含有大黃酸或其衍生物的藥物組合物，其用于治療和/或預防副豬嗜血桿菌菌株的病理癥狀或疾病。其通過口服、外用、吸入法等方式，對受試者給藥而發(fā)揮作用。因此本發(fā)明的藥物組合物可以制備成各種劑型，例如，用于口服用藥的組合物可以為膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、含片、泡騰片、糖漿、乳化物、控釋的制備物、快速溶解的制備物、口服液體劑型等；用于外用用藥的組合物可以為涂抹劑型藥物、霜劑、外敷、軟膏、外用藥水、液體噴霧劑和氣噴霧劑等。用于吸入法給藥的組合物可以為溶液、分散液、干粉等；也可以從屬植物提取高純度的大黃酸化合物，制備脂質(zhì)體包裹的納米大黃酸，制備成注射制劑以及緩釋藥物劑型。在所述的藥物組合物中，大黃酸或者其衍生物所占比例，以重量占整個制劑的總重量為0.0％-99.0％，優(yōu)選地0.0％-90％，更優(yōu)選地為10％-80％，最優(yōu)選為25-70％。
在本發(fā)明藥物制劑中，以口服制劑為例，所用藥學上可接受的輔料包括但不局限于潤滑劑，如羧甲基纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，或硬脂酸鋅，硬脂酸、山崳酸甘油酯、十八烷基富馬酸鈉、滑石、硅膠；崩解劑，如淀粉、環(huán)糊精；稀釋劑或壓縮劑，如山梨糖醇、微晶纖維素、乳糖、蔗糖、甘露醇木糖醇、赤藻糖醇；調(diào)味料或其它成分，如草莓、桔子、香蕉、薄荷、蜂蜜。
載體顆粒可以為乳糖或蔗糖的晶體或球體；或復合球體或顆粒，如通過用淀粉作為粘合劑使蔗糖成粒狀形成的糖的球體，通過淀粉作為粘合劑形成的碳酸鈣球體或麥芽糊精。載體顆粒也可以是任何其他的醫(yī)藥可以接受的賦形劑的顆粒，如瓜爾豆膠顆粒、黃原膠顆粒/羥丙基纖維素顆粒。載體可以有多種形式，所有這些選擇和量的調(diào)整顯然在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。
通過如下實施例記載，更好地理解本發(fā)明，但不局限于該實施例。
實施例
實施例1大黃酸的抑菌活性
藥品與試劑：
大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(tsb)、大黃酸、氨芐西林、dmso、馬血清、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、乙醇、均為分析純試劑、pbs緩沖液(磷酸鹽緩沖液0.0lmol/l，ph7.4，二水磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，蒸餾水1000ml)。
菌種：
副豬嗜血桿菌
實驗方法：
培養(yǎng)基的配制
tsb培養(yǎng)基30g，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘備用。配置好的tsb培養(yǎng)基中每100ml加入5ml馬血清和100μgnad。
試驗菌的培養(yǎng)
在無菌室內(nèi)，副豬嗜血桿菌菌株(1-25號菌株均為臨床菌株)，于酒精燈下用接種針在試驗菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的無菌水制成菌懸液，然后取一定量加到己融化又冷卻至50℃左右的tsb培養(yǎng)基中，搖勻，即刻倒入無菌培養(yǎng)皿中，待充分冷凝后用膠塞密封后，于37℃培養(yǎng)18-24h備用。吸取菌液iml，用tsb培養(yǎng)基按1：1000稀釋，使菌液濃度約為105cfu/ml。
抗菌實驗：
將待測藥品溶于dmso中配制成2560/μml的溶液，然后用二倍稀釋法將藥品稀釋成—定濃度梯度(128/μml，64/μml，32/μml，16/μml，8/μml，4/μml，2/μml，1/μml，0.5/μml，0.25/μml)與dmso中。于滅菌微量滴定板第一條中分別加入100ul的培養(yǎng)基，第二條為陽性對照，加入100μl菌懸液。其余的孔中加入90μl的菌懸液和10μl的藥物溶液。每個藥物溶液濃度平行3次。將處理完的培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)24h，觀察。
mic的測定
在每個微量滴定板都可以直觀的測定其mic值之后，在板的每個孔中加入50μlpbs緩沖液(磷酸鹽緩沖液0.0lmol/l，ph7.4，二水磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化鈉18.0g，氯化鉀0.2g，蒸餾水l000ml)，其中包含2mgmtt/ml。在室溫下繼續(xù)孵育4-5h。將孔中的物質(zhì)移出并加入100μl含有5％1m鹽酸的異丙醇來萃取染料。繼續(xù)在室溫下孵育12h，于酶標儀測定各孔光吸收(od值)，測定波長550nm。根據(jù)各孔od值計算藥物對細菌生長的最小抑制濃度。
實驗結(jié)果
測得的mic見表l所示
表1大黃酸對細菌的抑制mic值(μg/ml)
實驗表明，大黃酸對副豬嗜血桿菌有明顯的抑制作用。
實施例2制備2,4,5,6,7-五甲基大黃酸(hx-1)
在250ml三頸瓶中依次加入大黃酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，攪拌下加入碘甲烷(7.1g，0.05mol)和對甲苯磺酸(0.17g)，室溫下，攪拌24h，tlc檢測顯示反應完全，加水(10ml)，在室溫下，攪拌24h，將反應液中倒入500ml冰水中，過濾，將濾餅經(jīng)真空干燥，得黃褐色固體1.6g，經(jīng)硅膠柱分離，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后，得2,4,5,6,7-五甲基大黃酸0.60g，收率為33.9％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，2.4～2.5(m,15h)。
實施例3制備7-乙基大黃酸衍生物(hx-2)
在250ml三頸瓶中依次加入大黃酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，攪拌下加入溴乙烷(1.1g，0.01mol)和對甲苯磺酸(0.17g)，60℃下，攪拌2h，tlc檢測顯示反應完全，加水(10ml)，在室溫下，攪拌24h，將反應液中倒入500ml冰水中，過濾，將濾餅經(jīng)真空干燥，得黃褐色固體1.5g，經(jīng)硅膠柱分離，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后，得7-乙基大黃酸0.31g，收率為21.4％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)，2.5(m,2h)，1.3(t,3h)。
實施例4制備7-乙?；簏S酸衍生物(hx-3)
在250ml三頸瓶中依次加入7-乙基大黃酸衍生物(hx-2)(1.56g，0.005mol)，乙酸(150ml)，攪拌下加入鉻酐(1.5g，0.015mol)，50℃下，攪拌4h，tlc檢測顯示反應完全，在室溫下，將反應液中倒入500ml冰水中，過濾，將濾餅經(jīng)真空干燥，得黃褐色固體1.5g，經(jīng)硅膠柱分離，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后，得7-乙?；簏S酸0.81g，收率為49.7％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.9(d,1h)，7.8(d,1h)，7.7(s,1h)，2.6(s,3h)。
實施例5制備7-乙烯基大黃酸衍生物(hx-4)
在250ml三頸瓶中依次加入7-乙基大黃酸衍生物(hx-2)(1.56g，0.005mol)，dmf(50ml)，攪拌下加入溴代丁二酰亞胺(1.0g，0.006mol)，80℃下，攪拌7h，tlc檢測顯示反應完全，加入叔丁醇鉀(0.6g，0.005mol)，在100℃下，攪拌1h，將反應液中倒入500ml冰水中，過濾，將濾餅經(jīng)真空干燥，得黃褐色固體1.1g，經(jīng)硅膠柱分離，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后，得7-乙烯基大黃酸0.11g，收率為7.01％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)，6.9(m,1h)，5.4(d,2h)。
實施例6制備7-溴代大黃酸衍生物(hx-5)
在250ml三頸瓶中依次加入大黃酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，攪拌下，緩慢滴加溴素(0.8g，0.005mol)，0℃下，攪拌1h，tlc檢測顯示反應完全，將反應液中倒入500ml冰水中，過濾，將濾餅經(jīng)真空干燥，得黃色固體1.1g，經(jīng)硅膠柱分離，收集產(chǎn)物，減壓回收溶劑后，得7-溴代大黃酸0.6g，收率為31.75％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)。
以副豬嗜血桿菌為受試菌株，對比大黃酸及部分大黃酸衍生物(hx-1、hx-2、hx-3、hx-4、hx-5)的最小抑制濃度(mic)，實驗結(jié)果表明，大黃酸衍生物hx-1的抑菌活性與大黃酸相近，大黃酸衍生物hx-2、hx-3、hx-4、hx-5的抑菌活性優(yōu)于大黃酸。
本發(fā)明不局限在本申請中描述的特定實施方式，用作本發(fā)明的單獨的方面的單一說明。本領域技術人員將理解，可以不脫離本申請的精神和范圍的情況下進行各種修改和改動。根據(jù)以上描述，除了本文中列舉的以外，本公開的范圍內(nèi)的功能上等同的用途對于本領域的本領域技術人員而言是明顯的。這樣的改動和修改意欲落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本公開僅受所附權(quán)利要求以及與這樣的權(quán)利要求的的范圍所等同的全部范圍限制。應當理解，本公開不局限于特定的方法、試劑、組合物和生物系統(tǒng)，當然，所述方法、試劑、組合物和生物系統(tǒng)可以變化。還可理解，本文中使用的術語僅用于描述特定的實施方式，不用來是限制性的。
本文所參考的或引用的所有專利、專利申請、在先申請和出版物通過引用而全文并入本文，使得它們不與本說明書的明確教導相矛盾。在權(quán)利要求范圍內(nèi)提出其他的實施方式。