本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗，特別涉及一種含有包埋有滅活的prrsv抗原的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒及卡介菌裂解物的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗，本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是豬的慢性病，在全球養(yǎng)殖豬的國家流行，國內(nèi)流行prrs，每年造成經(jīng)濟損失約400億。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒((porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)是prrs的病原，prrsv是動脈炎病毒科的一雙鏈rna病毒，有二種基因型，歐洲型(i型)和美洲型(ii型)。每種基因型又有多種遺傳譜系。prrsv病毒基因型、抗原性變化多樣，在自然界容易變異、重組。
prrsv感染機體后2天到數(shù)周可重塑免疫系統(tǒng)，通過重要抗病毒細胞因子生成減少和一些負向抑制免疫反應的細胞因子生成增強抑制機體免疫反應。除此之外，豬感染prrsv后，病毒中和抗體生成延遲，感染3-4周后才產(chǎn)生中和抗體且水平低下。自prrsv病毒發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外開發(fā)了滅活和減毒修飾活疫苗(modifiedlive，prrs-mlv)用于prrsv控制。盡管如此,prrs-mlv對易感豬有傳播疫苗突變株的風險，活疫苗株也有毒力返祖的可能，對異型基因病毒攻擊保護力低，不能消除病毒感染。滅活疫苗盡管安全性好，但免疫原性弱。因此，急需研制出一種安全、高效、且能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒交叉保護的prrsv疫苗。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對目前存在的問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種安全、高效、且能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒交叉保護的prrsv疫苗。
為了達到上述目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
本發(fā)明的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)納米顆粒疫苗(命名為np-plga-pkwag)，其特征在于含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒以及佐劑，其中所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒中包埋有純化滅活的完整prrsv抗原。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，滅活前的prrsv滴度為1×105-1×107tcid50/ml，滅活后的疫苗中含有20-60μg/ml純化滅活的完整prrsv抗原。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，包埋有純化滅活的完整prrsv抗原的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒是通過以下方法制備得到的：
稱取plga50/50750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其終濃度為15％(w/v)，加入含5毫克純化滅活的完整prrsv抗原的溶液100微升，用勻漿器以6000rpm速度混勻90秒，獲得均勻混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)的聚乙烯醇溶液,勻漿器中混勻5分鐘，最后室溫攪拌過夜讓溶劑揮發(fā)，用蒸餾水通過三次11000g離心洗滌3次，濕的納米顆粒凍干或4℃保存，即得。
其中，優(yōu)選的，所述的純化滅活的完整prrsv抗原是通過以下方法制備得到的：
(1)病毒培養(yǎng)
細胞工廠培養(yǎng)marc-145細胞，培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清、100μg/ml鏈霉素以及100iu/ml青霉素的dmem培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，5％co2環(huán)境；
marc-145細胞用細胞工廠培養(yǎng)擴大，轉(zhuǎn)入盛有含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基和微載體cytodex1的生物反應器，37℃培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)液ph7.2±0.2，氧飽和度25±0.1％，攪拌速度中速；prrsv以0.01moi感染，分別在第7、11、15天收獲病毒培養(yǎng)液，每收獲一次，補加病毒液感染；
(2)澄清
收獲的病毒培養(yǎng)液用8μm的聚丙烯預過濾器過濾，再經(jīng)0.8μm和0.2μm的過濾器過濾澄清，測定病毒滴度；
(3)離子交換層析
澄清的病毒液加入經(jīng)平衡緩沖液平衡的離子交換層析柱，用洗脫液進行洗脫；
其中，所述的平衡液為含有150mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；所述的洗脫液為含有600mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；
(4)超濾透析
從離子交換層析柱洗脫的病毒液用100kd膜超濾透析，透析液為含有150mmnacl的20mmtris溶液，ph＝7.5；
(5)蔗糖密度梯度超速離心
30-60％蔗糖密度梯度超速離心病毒液，21000rpm的轉(zhuǎn)速下離心2小時，收集分布在蔗糖區(qū)帶的病毒液，用ph＝7.5的，含有150mmnacl的50mm磷酸緩沖液稀釋至原來體積的12-13倍；
(6)滅活
純化的病毒用rpmi1640稀釋至1×107-1×108tcid50/ml，用0.1m雙乙烯亞胺37℃滅活1小時，0.1mm磷酸硫代納37℃中和2小時；
(7)透析
用100kda的膜濃縮6倍，用ph＝7.5的，含有150mmnacl的50mm磷酸緩沖液透析；
經(jīng)以上方法制備的純化滅活的完整prrsv抗原的含量相當于滅活前的0.5×106tcid50-2.5×106tcid50/ml。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的prrsv為高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒hp-prrsv-jxm-f5株，其為在marc-145細胞上傳至5代的適應株，其微生物保藏號是：cgmccno.9453，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日。該病毒株已記載在申請日為2014-12-30，申請?zhí)枮?01410842421.9，發(fā)明名稱為“一種廣譜粘膜免疫防控豬繁殖與呼吸綜合癥的疫苗組合物及其應用”的專利申請中。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的佐劑為卡介菌裂解物。更優(yōu)選的，所述的卡介菌裂解物為卡介菌d2bp302s11的裂解物。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的卡介菌裂解物的含量為100-500μg/ml。
在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的卡介菌裂解物是通過以下方法制備得到的：
卡介菌用培養(yǎng)基37℃靜止培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)物于121℃下30分鐘進行殺菌處理，離心收獲菌體，pbs洗滌2次，按2g/ml懸浮于含8mmedta、蛋白酶抑制劑、dna酶、rna酶的pbs中，用玻璃珠破碎細菌，期間快速染色觀察破碎狀況，直到90％菌體破碎，3000g離心沉淀未破碎的細胞、不溶的細胞壁成分，收獲裂解上清液獲得全菌體裂解物；上清液經(jīng)0.2μm、低蛋白結(jié)合的膜過濾，按3.0g/l加入苯酚，內(nèi)毒素含量≤0.002μg/mg蛋白，于2-8℃保存，即得。
使用本發(fā)明的疫苗組合物經(jīng)鼻內(nèi)免疫豬后，采用同型prrsv病毒和異型prrsv病毒進行攻擊，結(jié)果表明：本發(fā)明的疫苗組合物能夠激發(fā)豬體產(chǎn)生抗prrsv感染的保護性免疫應答，能夠抵抗同型病毒和異型病毒的感染，完全清除病毒血癥。與使用滅活純化的完整prrsv抗原(pkwag)免疫比較，本發(fā)明的prrsv納米顆粒疫苗(np-plga-pkwag)可成倍增強抗同型prrsv攻擊的體液免疫和細胞免疫，顯著、成倍增強豬肺部和血液的病毒中和抗體和iga應答，顯著、成倍降低肺部il-10水平。
因此，進一步的，本發(fā)明還提出了所述的疫苗在制備預防或治療豬繁殖與呼吸綜合癥藥物中的用途。
本發(fā)明也提供了所述納米顆粒疫苗的給苗劑量，即10ug/頭-100μg/頭，優(yōu)選20ug/頭-60ug/頭；給苗次數(shù)可為1-2次，間隔2-4周，優(yōu)選2周；給苗途徑可為鼻內(nèi)點滴、鼻內(nèi)氣霧膠、肌肉、皮下，優(yōu)選鼻內(nèi)點滴。
相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
1、本發(fā)明所述疫苗中的抗原為具有完整病毒顆粒結(jié)構(gòu)的滅活prrsv病毒抗原，經(jīng)紫外輻射或bei滅活，由于是完整病毒顆粒，故保留了prrsv功能性免疫表位，在佐劑的作用下，能夠高效誘導了th1免疫反應，而一般滅活疫苗只誘導th2反應。
2、本發(fā)明所述疫苗中含包埋有滅活的prrsv抗原的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒，在本發(fā)明中使用生物可降解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactideco-glycolide)(plga))作為納米載體，其可自我組裝納米顆粒，具有良好的重復性。在ph中性環(huán)境帶有正電荷。納米顆?？赏哆f滅活prrsv到目標靶位且具有免疫原性。滅活prrsv包埋于或包裹于納米顆粒中，可通過水/油/水乳化方法獲得。根據(jù)多聚化中乳酸和羥基乙酸的使用比例，可獲得不同形式的plga。乳酸和羥基乙酸的不同比例適合本發(fā)明，如0:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90，本發(fā)明中共多聚體組合中plga50:50含50％乳酸和50％羥基乙酸。在實例中，750mgplga和5mg滅活(或150mgplga和1mg滅活prrsv)混合，包埋或包裹效率不同，在實例中納米顆粒有50-55％的包埋或包裹效率。
3、抗原一般通常需要佐劑增強免疫反應使疫苗有效。佐劑的組分增強抗原單獨引起的免疫反應。本發(fā)明所述疫苗中，進一步包括一或多種佐劑，佐劑可以是獸醫(yī)學和藥學接受的組合。優(yōu)選的，所述的佐劑為bcg疫苗株全菌體裂解物，其具有高度安全性，另外制造工藝簡單、造價低廉。
4、本發(fā)明的疫苗組合物能夠激發(fā)豬體產(chǎn)生抗prrsv感染的保護性免疫應答，能夠抵抗同型病毒和異型病毒的感染，完全清除病毒血癥。與使用滅活純化的完整prrsv抗原(pkwag)免疫比較，本發(fā)明的prrsv納米顆粒疫苗(np-plga-pkwag)可成倍增強抗同型prrsv攻擊的體液免疫和細胞免疫，顯著、成倍增強豬肺部和血液的病毒中和抗體和iga應答，顯著、成倍降低肺部il-10水平。
5、prrsv起初感染豬的途徑是呼吸道和生殖器粘膜，感染靶位是巨噬細胞。鼻內(nèi)投遞疫苗對動物無侵襲性，可在系統(tǒng)部位和粘膜部位，如呼吸道黏膜、生殖道粘膜引起保護性的免疫。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1滅活純化完整的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原制備
1.1病毒、細胞、培養(yǎng)液
高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒hp-prrsv-jxm-f5株，其為在marc-145細胞上傳至5代的適應株，分類命名為高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，其微生物保藏號是：cgmccno.9453，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2014年7月8日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該病毒株已記載在申請日為2014-12-30，申請?zhí)枮?01410842421.9，發(fā)明名稱為“一種廣譜粘膜免疫防控豬繁殖與呼吸綜合癥的疫苗組合物及其應用”的專利申請中。
穩(wěn)定無外源因子、符合疫苗抗原生產(chǎn)的marc-145細胞用于疫苗抗原生產(chǎn)和體外分析，細胞維持液為含10％胎牛血清、100μg/ml鏈霉素以及100iu/ml青霉素的dmem(invitogen)培養(yǎng)液，病毒培養(yǎng)液為含0.1％的馬血清mem培養(yǎng)液。
1.2病毒培養(yǎng)
細胞工廠培養(yǎng)marc-145細胞，培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清、100μg/ml鏈霉素以及100iu/ml青霉素的dmem(invitogen)培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件37℃，5％co2環(huán)境。
marc-145細胞用細胞工廠培養(yǎng)擴大，轉(zhuǎn)入盛有含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基(invitrogen)和微載體cytodex1的生物反應器，37℃培養(yǎng)3-4天，培養(yǎng)液ph7.2±0.2，氧飽和度25±0.1％，攪拌速度中速。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒hp-prrsv-jxm-f5以0.01moi感染，分別在第7、11、15天收獲病毒培養(yǎng)液，每收獲一次，補加病毒液感染。
1.3澄清
收獲液用8μm的聚丙烯預過濾器過濾，再經(jīng)0.8μm和0.2μm的過濾器過濾澄清，測定病毒滴度(tcid50)。
1.4離子交換層析
澄清的病毒液加入經(jīng)平衡緩沖液(20mmtris，150mmnacl，ph＝7.5)平衡的離子交換層析柱，用洗脫液(20mmtris，600mmnacl，ph＝7.5)進行洗脫。
1.5超濾透析
從離子交換層析柱洗脫的病毒液用100kd膜超濾透析(20mmtris，150mmnacl，ph＝7.5)。
1.6蔗糖密度梯度超速離心
30-60％蔗糖密度梯度超速離心病毒液，21000rpm的轉(zhuǎn)速下離心2小時，收集分布在蔗糖區(qū)帶的病毒液，用磷酸緩沖液(50mm磷酸緩沖液，150mmnacl,ph＝7.5)稀釋至原來體積的12-13倍。
1.7滅活
純化的病毒用rpmi1640稀釋至108tcid50/ml，用0.1m雙乙烯亞胺37℃滅活1小時，0.1mm磷酸硫代納37℃中和2小時。
滅活驗證試驗：1ml滅活液加入裝有50ml培養(yǎng)液的150cm2細胞瓶，37℃培養(yǎng)1周，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1周。同時接種1ml的未滅活病毒液到相同細胞瓶觀察細胞病變效應。
1.8透析
用100kda的膜濃縮6倍，用磷酸緩沖液(50mm磷酸緩沖液，150mmnacl,ph7.5)透析。
經(jīng)以上方法制備的純化滅活的完整prrsv抗原(pkwag)含量相當于滅活前的0.5×106tcid50-2.5×106tcid50/ml。蛋白含量用商用bca蛋白檢測試劑盒(bicinchoninicacidproteinassaykit，購自pierce公司)測定。以親和層析純化的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒多克隆抗體為基礎(chǔ)建立間接elisa法定量豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的含量，利用平行線法測定豬體中和抗體的水平和純化全病毒抗原量的關(guān)系，結(jié)果：純化滅活豬繁殖與呼吸綜合癥病毒為20μg可產(chǎn)生保護性中和抗體，定為20單位，通過間接elisa法可估算滅活豬繁殖與呼吸綜合癥疫苗的效價。
實施例2.np-plga-pkwag的制備
1、材料：
聚乳酸-羥基乙酸共聚物50/50(plga50/50，mol.wt40-75kda)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，mol.wt.30-70kda)(購自sigma-aldrich公司)、二氯甲烷(購自acrosorganics公司)、bca蛋白檢測試劑盒(bicinchoninicacidproteinassaykit，購自pierce公司)。
2、np-plga-pkwag的制備
采用標準雙乳化溶劑蒸發(fā)方法制備，簡述如下：
稱取plga50/50750mg溶于5ml二氯甲烷中，使其終濃度為15％(w/v)，加入100微升含5毫克hp-prrsv-jxm-f5株純化滅活蛋白(pkwag，實施例1制備)，用勻漿器以6000rpm速度均勻90秒，獲得均勻混合物，在混合物中加入60毫升10％(w/w)聚乙烯醇(10％pva)溶液,勻漿器中均勻5分鐘，最后室溫攪拌過夜讓溶劑揮發(fā)，用蒸餾水通過三次11000g離心洗滌3次，濕的納米顆粒凍干或4℃保存，命名為np-plga-pkwag。
3、納米顆粒大小、形態(tài)以及納米顆粒包埋蛋白效率
用掃描電鏡測定、觀察納米顆粒大小、形態(tài)(電鏡hitachis-3500n)。待測凍干納米顆粒使用離子包被儀置于金鉑包被的粘附片上，在電鏡上10kv觀察。納米包埋蛋白效率：凍干np-plga-pkwag(10mg)加入0.1nnaoh，37℃處理1小時，渦旋收獲上清，用0.1nnaoh配制bsa和bca蛋白檢測試劑盒(購自美國pierce公司)檢測蛋白濃度。
4、包埋純化滅活prrsv的納米疫苗np-plga-pkwag的特征
掃描電鏡觀察plga包埋純化滅活prrsv的納米顆粒np-plga-pkwag為光滑圓球狀，大小在200-600nm之間。以plga多聚體的使用量為準，納米顆粒的產(chǎn)率為82.32±3.3％，納米顆粒np表面靜電荷-26mv。以包埋使用的prrsv總蛋白為準，納米顆粒中平均蛋白含量0.50-0.55％(w/w)，代表包裹或包埋效率50-55％。在pbs中np-plga-pkwag重新擴散，在48小時prrsv緩慢釋放，在接下來5周，也有釋放。
5、聚焦顯微鏡下np-plga-pkwag的特征
3頭4-6周齡、健康的spf豬支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，bal)分離收集巨噬細胞(bal-mnc)，接種24孔板，接種濃度1×106細胞/ml。24孔板含包被多聚l-賴氨酸的蓋玻片，bal-mnc板37℃5％co2孵育1小時，倒去沒有結(jié)合的細胞液，蓋玻片用pbs輕輕洗滌。將凍干的np-plga-pkwag重懸于含10％fbs的dmem中，使其濃度達到0.2微克/ml。加入含bal-mnc的培養(yǎng)板，37℃孵育3小時。未感染prrsv或以0.1moi感染prrsv(hp-prrsv-jxm-f5)的bal-mnc板在37℃5％co2孵箱孵育12小時，用3％多聚甲醛在冰上固定15分鐘，用0.1％tritonx-100浸透15分鐘，室溫下用含5％bsa、0.2％tritonx-100pbs封閉1小時。接著細胞加入抗prrsv核衣殼特異性單克隆抗體mabsdow17(美國農(nóng)村技術(shù)有限公司產(chǎn)品)和內(nèi)源交叉反應的抗豬人抗體(溶于含1％bsa、0.1％tritonx-100的pbs，購自美國santa-cruz公司)，室溫放置1小時，加入羊抗鼠iggalexaflour488和驢抗羊抗體alexaflour633(購自美國invitrogen公司)，室溫孵育1小時。在加入抗體步驟之間細胞洗滌且用含2.5％dabco(購自美國sigma公司)的液體處理。染色的蓋玻片移到玻片在leica聚焦顯微鏡下觀察，圖像使用leica聚焦軟件分析。用u型底的96孔板，每孔含1×106bal-mnc板也可用上述類似處理，獲得類似可比結(jié)果。
6、流式細胞儀確定cd80/86細胞體外吸收np-plga-pkwag
抗原遞呈細胞cd80/86接種24孔板，接種濃度1×106細胞/ml。分別向cd80/86中加入pkwag(純化滅活的prrsv抗原)或np-plga-pkwag，使prrsv蛋白含量分別達到2、0.2、0.02微克/ml。在37℃5％co2孵箱孵育3小時。以0.1moi感染prrsv(hp-prrsv-jxm-f5)，在37℃5％co2孵箱孵育12小時。以未感染prrsv的cd80/86板細胞作為對照。洗滌后用生物素結(jié)合人ctla4鼠免疫球蛋白融合蛋白(購自美國ancell公司)、pe-結(jié)合cd172(購自美國southernbiotech公司)和streptavidinpercp-cy5.5依次染色，用1％多聚甲醛固定，使用facsariaii流式細胞儀(購自bdbiosciences公司)分析。
上述體外試驗顯示在正常生理條件下，納米顆粒np-plga-pkwag在數(shù)周內(nèi)間歇釋放已經(jīng)包埋或包裹的prrsv抗原，相比較未包裹的抗原pkwag，能夠被豬肺泡巨噬細胞以及抗原遞呈細胞cd80/86有效吸收。
實施例3卡介菌全菌體裂解物制備和檢定
菌種卡介菌d2bp302s11，由中國藥品和生物制品檢定研究院提供，按生物制品生產(chǎn)檢定用菌種管理規(guī)程建立種子批。工作種子批至菌體收集不應超過12代，在蘇通培養(yǎng)基上卡介菌應浮于表面，為多皺、為黃色的菌膜，毒力試驗、無有毒卡介菌試驗結(jié)果陰性，凍干菌種于2-8℃保存，液體菌種-70℃以下保存。
卡介菌d2bp302s11用改良蘇通綜合培養(yǎng)基37℃靜止培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)物于121℃下30分鐘進行殺菌處理，用制備型低速離心機收獲菌體，pbs(ph7.4)洗滌2次，按2g/ml懸浮于含8mmedta、蛋白酶抑制劑、dna酶、rna酶的pbs中，用玻璃珠破碎細菌，期間快速染色觀察破碎狀況，直到90％菌體破碎，3000g離心沉淀未破碎的細胞、不溶的細胞壁成分，收獲裂解上清液獲得全菌體裂解物(wcl)，上清液經(jīng)0.2μm、低蛋白結(jié)合的膜過濾，按3.0g/l加入苯酚。bcg的裂解物wcl原液中含水溶性蛋白、脂類以及碳水化合物，內(nèi)毒素水平應不高于0.002μg/mg蛋白，于2-8℃保存。bcg的裂解物wcl原液在2-8℃保存可保存5年，和prrsv滅活抗原配制疫苗時所用稀釋液為0.01m/lpbs(ph7.2-7.4，含0.0005％聚山梨酯80及3.0g/l苯酚)。
wcl中的蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(中國藥典三部，2005年版附錄vib)；wcl中內(nèi)毒素水平依法檢測(中國藥典三部，2005年版附錄xiie)；多糖含量測定、無有毒卡介菌試驗、鑒別試驗、致敏效應試驗按中國藥典三部(2005年版)p254-p255的方法進行；核酸含量測定采用紫外-可見分光光度法(中國藥典三部(2005年版)附錄iia；無菌檢測按中國藥典三部(2005年版)附錄xiia的方法；異常毒性檢測按中國藥典三部(2005年版)附錄xiif依法檢查。
實施例4滅活純化豬繁殖與呼吸綜合癥全病毒疫苗抗原納米顆粒在豬體上安全、劑量、效果
1、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒納米顆粒疫苗的制備
1.1豬繁殖與呼吸綜合癥病毒納米顆粒疫苗np-plga-pkwag(不含佐劑)的制備
按照實施例2方法制備得到。
1.2含有卡介菌全菌體裂解物的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒納米顆粒疫苗的制備
在實施例2制備得到的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒納米顆粒疫苗np-plga-pkwag的基礎(chǔ)上，加入實施例3制備得到的卡介菌全菌體裂解物(佐劑)，使得每毫升疫苗(一劑)中含有滅活純化完整prrsv抗原5-30μg，含有卡介菌裂解物500μg。
2、免疫效力實驗
2.1方法
普通斷奶，年齡在3-4周的豬在山西隆克爾生物制藥有限公司bsl-2級豬舍飼養(yǎng)，經(jīng)檢驗確證prrsv、豬呼吸冠狀病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬流感病毒、豬口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、豬戊型肝炎病毒陰性，且血清中無prrsv抗體。
np-plga-pkwag疫苗鼻內(nèi)免疫豬，用同型prrsv病毒攻擊進行評估。結(jié)果顯示：和未免疫豬、純化滅活prrsv疫苗抗原(pkwag)免疫豬比較，np-plga-pkwag疫苗免疫豬發(fā)生強烈的體液免疫和細胞免疫，病毒血癥被完全清除。np-plga-pkwag疫苗免疫豬肺、血液的中和抗體、iga顯著提升；np-plga-pkwag疫苗免疫豬肺裂解物含高水平的ifn-.gamma，低水平il-10；總之，結(jié)果顯示：plga包埋純化滅活prrs抗原形成的納米疫苗np-plga-pkwag鼻內(nèi)免疫在粘膜和系統(tǒng)部位安全、可激發(fā)強烈、豐足的免疫反應，可清除豬的病毒血癥。
經(jīng)篩選獲得100頭豬隨機分成6組(n＝10頭/每組)，鼻內(nèi)分別免疫表1所示不同配方疫苗二劑，2ml/每頭/每次,二次間隔2周，見表1，所有豬在免疫后28天鼻內(nèi)感染攻擊異型基因prrsv病毒(vr-2385基因i型)，感染劑量5×105tcid50/頭，佐劑、抗原、單獨配制、包埋，使用前配制。低劑量疫苗含抗原10μg/劑，高劑量疫苗含抗原30μg/劑，低劑量疫苗抗原含0.5×106tcid50滅活純化prrsv，高劑量疫苗抗原含2.5×106tcid50滅活純化prrsv，在納米顆粒中包埋或不包埋。豬每日觀察和檢測呼吸癥狀。感染攻擊后每隔3天測量肛門溫度和體重并記錄，在感染攻擊第15天麻醉，進行進一步取樣觀察。
表1
2.2豬肺部肉眼損傷和病理觀察
對上述所有病毒攻擊后的豬的肺葉的肉眼損傷進行觀察。從右邊上肺葉取樣本，用中性緩沖液配制的10％福爾馬林固定，進行切片，切片厚度5微米，用蘇木精和伊紅染色，觀察并對prrsv誘導的炎癥打分。
2.3疫苗免疫作用評估
2.3.1支氣管肺泡灌洗液收集、肺勻漿液制備、肺單核細胞分離
尸檢收集豬肺，用25-30ml含抗生素和edta冷pbs洗滌氣道，收集豬支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage，bal)液。收集液在4℃以2,851×g離心15分鐘，獲得澄清液分裝貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>
每頭豬收集1克從頂部右肺葉獲得的組織，加到5毫升冰冷的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem)中，使用混合器破碎研磨、攪勻(stomacher400實驗室混合器，購自英國seward有限公司)10分鐘，(肺勻漿/非裂解物)澄清上清分裝、貯存-70℃?zhèn)溆?。各豬肺收集后，用膠原蛋白、dnase處理、研磨、分離獲得肺單核細胞(lungmononuclearcells，lmncs)。
2.3.2總免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)評估
豬總的同型特異性抗體水平用elisa評估。預先定量含羊抗豬igm、igg、iga液，按1：1000稀釋，室溫下包被96孔板，孵育過夜。96孔板封閉后，10倍稀釋肺部勻漿物確定各同型抗體的量。用肺部勻漿物優(yōu)化稀釋度所測定的光密度(opticaldensity，od)值與所推算的同型抗體質(zhì)量在一定范圍值作為標準曲線，篩選所有測試樣本。測定igm時，樣本按1:200稀釋，測定iga時，樣本按1:3,000稀釋。測定igg樣本按1:100,000稀釋。含1,000ng/mliga和igm、500ng/mligg的豬血清參考品用作各同型抗體的標準曲線，和各同型抗體標準曲線對比、調(diào)整稀釋因子計算出肺組織同型抗體濃度，以mg/gm肺組織表示。
肺部prrsv特異同型抗體igg和iga
elisa板用預先測定的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒hp-prrsv-jxm-f5株純化滅活抗原pkwag(在碳-雙碳緩沖液中，濃度5μg/ml，ph8.8)包被、封閉，肺勻漿液或bal液10倍系列稀釋，用1；2000稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗豬iga或igg(美國kpl公司產(chǎn)品)檢測，用含0.3％h2o2abts溶液(2,2′-azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid]-diammoniumsalt,2,2′二聯(lián)氨-[3乙苯)咪唑-6磺酸二胺鹽]]和顯色，用1％十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，sds)終止顯色反應,在od405nm讀板，根據(jù)背景和10倍稀釋對照樣本od值計算抗體水平。
2.3.3肺部prrsv特異性抗體的親和性
bal(1:1)稀釋液和肺勻漿1:10稀釋液加入prrsv抗原包被和封閉好的板孔,室溫孵育2小時，洗滌4次，2倍系列稀釋硫代氰酸銨(ammoniumthiocyanate，nh4cn)使終濃度在5-0.313摩爾，每孔加入100μl，室溫孵育10分鐘，洗滌4次，按以上描述elisa方法進行其余步驟。nh4cn-微處理板孔(0m)有100％吸收(prrsv特異性抗原和抗體反應)，不同摩爾濃度nh4cn的od值和100％吸收值比較用以計算抗原和抗體相互反應。
2.3.4prrsv特異性igg1和igg2亞型評估
肺勻漿物10倍系列稀釋加入封閉pkwag包被板，分別用鼠抗豬igg1或igg2亞型(購自美國abd血清公司)作為第二抗體，按1:250稀釋使用，檢測病毒特異性igg1或igg2亞型。洗滌板三次，辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗鼠igg-hrp(購自美國sigma-aldrich公司)按1:10,000稀釋加入，用tmb(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，四氨基聯(lián)苯，購自美國kpl,公司)作為底物，1m磷酸作為終止液，在od450nm讀數(shù)。待測樣本按1：500稀釋獲得od值體現(xiàn)待檢測樣本prrsv特異性igg1和igg2抗體水平。
2.3.5酶聯(lián)免疫點(enzyme-linkedimmunospot，elispot)法檢測prrsv特異性ifn-γ分泌細胞
96孔板(multiscreenemd板，購自美國millipore公司)，預先過夜包被濃度為10μg/ml鼠抗豬ifn-γ單克隆抗體(購自bd生物科學公司),分離的lmncs加入豐富rpmi-1640培養(yǎng)基中，按5×105細胞/孔加入板中，加入hp-prrsv-jxm-f5純化滅活全病毒抗原pkwag(50μg/ml)刺激24小時，洗板三次，加入用生物素標記濃度為3μg/ml抗豬ifn-γ抗體，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物，加入3-氨基9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，aec)底物(購自美國sigma-aldrich公司)。prrsv特異性免疫刺激細胞點(iscsspots)用讀數(shù)儀計數(shù)(
2.3.6elisa評估不同細胞因子
肺勻漿物用于分析豬細胞因子。th1細胞反應的ifn-γ、il-12,炎癥前期分子il-6，免疫抑制細胞因子il-10、β-轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactorbeta，tgf-β)分別用elisa法或商用elisa試劑盒檢測。
2.3.7流式細胞儀分析
洗滌分離的lmnc，用含10μmcfse的pbs(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,cfse)在室溫染色15分鐘，用含10％fbs的冰冷rpmi終止反應，并洗滌2次，重懸于10％fbs的rpmi，37℃孵育30分鐘，在平底96孔板上調(diào)整細胞濃度使每孔含有5×105細胞。
免疫染色lmncs中淋巴、骨髓t細胞的以及在免疫應答反應5000多次事件的表型以及發(fā)生頻率采用流式細胞分析。上述hp-prrsv-jxm-f5純化滅活全病毒抗原pkwag(50μg/ml)刺激lmncs孵育48小時或未用抗原刺激的lmncs孵育48小時，在孵育到42小時加入莫能菌素(monensin，golgiplug,購自bd生物科學公司)。用特異性、熒光素結(jié)合的不同豬淋巴細胞單克隆抗體染色使lmncs中cd3ε、cd4α、cd8α、cd56、tcr1n4細胞首先著色。細胞用1％多聚甲醛固定，用細胞透化緩沖液(85.9％去離子水、11％不含鈣離子、鎂離子的去離子pbs、0.1％不含鈣離子、鎂離子的福爾馬林溶液、0.1％皂角素)4℃透化過夜處理。細胞洗滌三次，用熒光素標記的抗豬或用含0.1％皂角素的熒光素激活細胞分選(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)緩沖液配制對照同型單克隆抗體(購自美國bd生物科學公司)染色。用facsariaii(購自美國bd生物科學公司)獲得經(jīng)過免疫染色lmncs，使用flowjo軟件分析(software(美國treestar有限公司產(chǎn)品)。所有特異性免疫細胞頻率用占總淋巴細胞或骨髓細胞百分比表示。
2.3.8prrsv載量、病毒中和抗體滴度、rna拷貝數(shù)
肺勻漿物和bal液中prrsv滴度、中和抗體滴度采用間接免疫熒光法檢測。marc-145細胞培養(yǎng)達80-90％單層鋪滿時，加入倍比稀釋的待測樣本，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。為檢測prrsv特異中和抗體滴度，待測樣本56℃水浴滅活30分鐘，254nm的紫外光滅活45分鐘，2倍系列稀釋樣本與hp-prrsv-jxm-f5株病毒液、prrsvvr2385株病毒液之一混合，加入板孔在37℃孵育2小時，與hp-prrsv-jxm-f5株病毒混合時，每孔hp-prrsv-jxm-f5株病毒量為250tcid50；與prrsvvr2385株病毒混合時，每孔含prrsvvr2385株病毒量為200tcid50。prrsvn蛋白抗體(美國llc產(chǎn)品),作為第一抗體，按1：5000稀釋使用，alexafluor488結(jié)合抗鼠igg(h+l)(美國生命技術(shù)公司產(chǎn)品)作為第二抗體，使用按1：3000稀釋。細胞固定后進行熒光灶單位檢測。經(jīng)以上處理的板子用60％甘油-pbs(ph8)處理后在倒置熒光顯微鏡下觀察。
肺勻漿物和bal液中prrsvrna提取采用magmaxtm96-病毒分離試劑盒(購自美國生命技術(shù)公司)，操作按廠家提供的說明書進行，cdna獲得采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國qiagen公司產(chǎn)品),cdna含量用定量實時多聚酶鏈反應法(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qpcr)，使用perfectasybr綠色快速混合試劑盒(美國quanta生物科學公司產(chǎn)品)，內(nèi)含引物為prrsvorf-6引物，正向引物gataaccacgcatttgtcgtc，反向引物tgccgttgttatttggcata。用hp-prrsv-jxm-f5病毒液10倍稀釋液制作病毒滴度與病毒rna定量的標準曲線，病毒液起始濃度為107tcid50/μl。
2.3.9統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)均為10頭豬平均數(shù)，以平均數(shù)±標準誤表示。統(tǒng)計用graphpadinstat5軟件(美國lajolla公司產(chǎn)品)，采用方差單向、tukey’s多重比較檢驗或非配對t-檢驗分析。不同組比較p值小于0.05可認為有統(tǒng)計學顯著意義。a表示2組與3組；b表示表示2組與4組；c表示2組與5組；d表示2組與6組；e表示3組與4組；f表示3組與5組；g表示3組與6組；h表示4組與5組；i表示4組與6組；表示5組與6組；
3結(jié)果
3.1含有bcgwcl作為佐劑的np-plga-pkwag疫苗能夠顯著減小肺部肉眼觀察病理
蘇木精、伊紅染色肺切片進行顯微觀察有助于辨識肺炎癥損傷部位的強度和范圍。觀察顯示第6組豬肺部顯示明顯的有嚴重肺損傷，肺間質(zhì)內(nèi)伴有單核細胞大量浸潤。而3-5組豬肺肉眼損傷與模擬6組豬肺有差別，且豬在感染攻擊后一周內(nèi)沒有進食減少、不規(guī)則發(fā)熱。4組豬肺肉眼觀察到損傷介于3和5組豬肺損傷之間。相反在1組和2組豬肺觀察到肉眼損傷、可檢測到顯微病理，損傷程度介于6組和3-5組之間。3-5組(np-plga-pkwag+bcgwcl)疫苗免疫豬肺損傷中等減小說明包埋有純化滅活的完整prrsv抗原的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒與佐劑組合能夠最大限度的介導保護性免疫反應。
3.2prrsv感染攻擊后豬肺的體液免疫反應
10μg和60μg/頭劑量免疫組在感染攻擊后的15天收集肺勻漿和bal液樣本，通過elisa評估分析總igm、總igg、總iga，用elisa分析和評估prrsv特異性iga、prrsv特異性igg。prrsv特異性抗體量取3頭豬(n＝10)od405nm平均值，以平均值±標準誤表示；總抗體量取10頭豬(n＝10)od405nm平均值，以平均值±標準誤表示；p小于0.05可認為統(tǒng)計學顯著差別。
1組到5組在2周內(nèi)全部免疫，感染攻擊后總igg的量都有2-3倍的增加。肺部勻漿總igm和iga量在prrsv感染攻擊豬中都有差別。盡管如此，在肺勻漿物和bal液中igg水平、1組到5組在bal中igm和iga水平均高于空白免疫6組的4-5倍。重要的是np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫組(4組)豬肺勻漿物中總igg水平和pkwag+bcgwcl疫苗免疫組(1組)比較顯著提高，prrsv同型特異iga抗體和prrsv同型特異igg抗體顯著提高，結(jié)果如下表2所示。
表2.疫苗誘導的體液免疫反應和異型基因prrsv中和抗體(免疫后15天)
在低劑量疫苗(10μg/頭)免疫3組和高劑量免疫((60μg/頭)5組豬bal液、肺勻漿物中，prrsv特異性iga反應與其1組、2組比較顯著提高。各病毒感染攻擊組bal液中，病毒特異性igg水平有差異。低劑量或高劑量免疫2組和5組豬肺勻漿中，有高水平病毒特異性igg檢出，病毒特異性igg水平顯著提高。這表明佐劑-np-pkwag疫苗免疫組(3-5組)在氣道表面(bal液中)病毒特異性iga是主要的同型抗體，iga和igg同型抗體在肺粘膜發(fā)揮重要作用。
抗原對異源抗體的結(jié)合強度為抗體的親和性。np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫的豬，無論低劑量或高劑量免疫，在bal液中的特異性iga親和性顯著提高，只有低劑量免疫豬(3組)肺勻漿物中，特異性iga親和性顯著提高。高劑量疫苗免疫豬(5組)肺勻漿物中病毒特異性iga親和性和所有免疫豬病毒特異iga親和性水平相當。這些數(shù)據(jù)表明：prrsv特異iga親和性增強，且在np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫豬氣道表面維持較長時間。
通過定量檢測抗原特異性igg亞型確定是否發(fā)生th1或th2為主的免疫反應。在豬的免疫反應中，高水平igg2表明疫苗誘導th1為主的免疫反應。高水平igg1表明疫苗誘導th2為主的免疫反應。在5組豬肺勻漿中igg2和igg1水平顯著提高，igg1:igg2比例大于1為th2介導免疫反應，小于1為th1介導免疫反應。np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫的豬(3-5組)在感染攻毒15天后(pc15)，在肺勻漿物檢測igg1和igg2，igg1:igg2比例接近1。在1組豬中，盡管igg1:igg2比例接近1，但檢測到病毒特異igg1和igg2亞型抗體數(shù)量低。
除過6組(空白模擬組)，其他組所有豬用基因i型prrsvvr-2385株感染攻擊，該毒株和疫苗株hp-prrsv-f5株(ii型)基因組序列有50％的差別。分析bal液和肺勻漿物中抗hp-prrsv-jxm-f5中和抗體，與bal液和肺勻漿物中抗prrsvvr2385中和抗體比較。在2-5組的豬中，bal液、肺勻漿物中抗hp-prrsv-jxm-f5中和抗體滴度平均為16、32，顯著高于1組。5組接受高劑量免疫豬抗prrsvvr2332、抗prrsvvr2385中和抗體滴度顯著高于4組、3組。pkwag和可溶性bcgwcl免疫豬(1組)的抗prrsvvr2385中和抗體滴度，顯著低于5組豬抗vr-2385中和抗體滴度。
以上結(jié)果表明卡介菌全菌體可溶性裂解物(bcgwcl)佐劑納米顆粒疫苗(np-pkwag)激發(fā)了廣譜交叉反應中和抗體滴度。
3.3np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫豬肺中上調(diào)th1反應、下調(diào)免疫抑制細胞因子
在實際的應用中，通過elispot確定病毒特異iscs的頻率檢測抗prrsvcmi反應，是一種標準且商業(yè)化的方法。2-3組低劑量免疫豬的lmncsiscs與1組和4組、5組高劑量免疫豬比較，iscs的頻率顯著提高。5組豬肺勻漿物ifn-γ含量顯著高于2組、4組和3組免疫豬。另外一種重要th1細胞因子il-12量在高劑量免疫豬中(5組)沒有顯著變化，但4組、3組豬的il-12量明顯高于1組、6組、5組。所有免疫組肺重要的炎癥前體細胞因子il-6量，與空白模擬感染攻擊組(6組)比較，顯著減少。
細胞因子il-10、細胞因子tgf-β在prrsv引起的病理和免疫抑制過程中具有關(guān)鍵作用。5組tgf-β量與2組比較顯著減少。所有疫苗免疫組il-10量都有顯著差異。
3.4np-plga-pkwag+bcgwcl疫苗免疫豬肺中ifn-γ分泌淋巴細胞亞群和抗原遞呈細胞(apcs)頻率增大
5組豬疫苗免疫，從豬分離lmnc免疫染色分析淋巴細胞、骨髓細胞、difn-γ+產(chǎn)生淋巴細胞分析。用hp-prrsv-jxm-f5抗原刺激或不做刺激細胞內(nèi)fn-γ+產(chǎn)生細胞頻率經(jīng)辨識為病毒特異性回憶淋巴反應。在5組免疫豬cd4+和cd8+亞群中的prrsv特異回憶ifn-γ反應顯著提高。表明在5組豬肺中輔助t細胞、細胞毒殺傷反應被強力激活。和1-4組比較，這些細胞經(jīng)再次刺激，prrsv特異ifn-γ分泌淋巴亞群頻率顯著提高；5組與2組比較，cd4+cd8-ifn-γ+細胞頻率顯著提高。5組cd4+cd8-ifn-γ+細胞頻率與2組、3組、4組比較顯著提高。同樣5組cd4+cd8-ifn-γ+細胞ifn-γ+γδt細胞頻率顯著高于2組、3組、4組。5組激活γδt細胞頻率與其他組比較顯著提高。盡管各組豬總自然殺傷細胞(naturalkiller，nk)(cd56+)頻率沒有變化，但5組與其他組比較，ifn-γ+nk細胞頻率顯著提高。除此之外，4組和5組豬apc群中，巨噬細胞(cd172+cd163+slaii+)和樹突狀細胞(cd172+cd11c+slaii+)含量豐富，顯著高于2組免疫豬，表明佐劑np-pkwag疫苗免疫豬在肺部病毒有完全清除的趨勢或免疫反應。
3.5prrsv載量、rna拷貝數(shù)
5組和3組免疫豬bal液可檢測復制的prrsv相對減少，與1組和6組比較顯著差別。5組可檢測復制prrsv和2組有顯著差別。3組疫苗免疫豬的肺勻漿物中，可檢測復制prrsv病毒載量與模擬-感染攻擊豬(6組)比較，顯著減小。5組疫苗免疫豬與1組和3組豬可檢測復制病毒載量有顯著差異。進一步對3組和4組疫苗免疫豬bal液和肺勻漿物的prrsvrna拷貝數(shù)用qpcr定量，prrsvrna拷貝數(shù)減少，但與疫苗免疫5組比較無顯著差異。4組和5組疫苗免疫豬bal液和肺勻漿物的prrsvrna載量與1組疫苗免疫動物比較顯著減少5-10倍，結(jié)果如表3所示。
表3攻毒后15天prrsv載量、rna拷貝數(shù)統(tǒng)計