專利名稱：在相同細(xì)胞中表達(dá)豬生殖呼吸綜合癥病毒多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的糖基化形式的方法，用于該方法的宿主細(xì)胞或載體病毒，編碼所述ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的DNA分子，所說的ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的糖基化形式以及包含所說的ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的疫苗。
豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)是一種新的豬疾病的病因，從1990年底起，它襲擊了5,000多個(gè)北歐養(yǎng)豬農(nóng)場。現(xiàn)在稱作豬生殖呼吸綜合癥(PRRS)的這種疾病也稱為神秘豬疾病。1990年12月首次在德國鑒定后，在1991年年初問題變得越來越嚴(yán)重。1991年1月和2月，該疾病傳播到荷蘭和比利時(shí)。也有報(bào)道蔓延到西班牙。從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來看，預(yù)測該疾病的代價(jià)將會(huì)非常高昂，和Auieszky′s疾病差不多甚至比它更壞。
在大母豬中的基本臨床證狀是厭食和在受孕達(dá)110天后流產(chǎn)。對于小豬觀察到除呼吸困難外的死產(chǎn)和/或病弱小豬的高發(fā)病率。在養(yǎng)肥的豬中出現(xiàn)慢性肺炎和死亡率升高。
為了開發(fā)保護(hù)豬以抵抗PRRS的疫苗或開發(fā)在豬中檢測感染的診斷方法，必須鑒定、分離該疾病的病原體并使其適于作為診斷試驗(yàn)中疫苗或抗原的免疫原。
常規(guī)疫苗可包含化學(xué)滅活的病毒疫苗或經(jīng)修飾的活病毒疫苗。然而，滅活的疫苗需要額外免疫，具有包含佐劑的不利因素，生產(chǎn)昂貴且用藥費(fèi)力。而且，一些感染性病毒顆?？赡茉跍缁钸^程中存活并在施用到動(dòng)物體后引起疾病。
一般來說，優(yōu)選減毒的活病毒疫苗，因?yàn)樗鼈冋T發(fā)常以體液和細(xì)胞反應(yīng)兩者為基礎(chǔ)的免疫應(yīng)答。直到現(xiàn)在，這種以PRRSV病毒株為基礎(chǔ)的疫苗僅以在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)和系列傳代有毒病毒株來制備。然而，由于這種處理將無法控制的突變導(dǎo)入了病毒基因組，導(dǎo)致病毒顆粒群體的毒性和免疫特性不均勻。另外，已熟知這類傳統(tǒng)的減毒活病毒疫苗可回復(fù)突變成有毒型，引起接種的動(dòng)物發(fā)病并可能將病原體傳給其它動(dòng)物。而且在巨噬細(xì)胞系上培養(yǎng)PRRSV病毒株非常費(fèi)力從而使所得的病毒產(chǎn)量很低。
根據(jù)重組DNA技術(shù)可構(gòu)建改進(jìn)的疫苗(活的和亞單位疫苗)。這些疫苗可僅含有能誘發(fā)抗PRRSV病原體免疫應(yīng)答的必須的和相關(guān)的PRRSV免疫原性物質(zhì)或編碼所說物質(zhì)的遺傳信息而不表現(xiàn)出活的或滅活的疫苗的上述不利情況。
現(xiàn)在已知該疾病的病原體是一種小的被膜RNA病毒，Wensvoort等(The Vet.Quarterly13，121-130，1991)描述了該病毒的歐洲型。Conzelmann等(Virology193，329-339，1993)和Meulenberg等(Virology192，62-72，1993)描述了它與乳酸脫氫酶升高病毒(LDV)和馬動(dòng)脈炎病毒的親緣關(guān)系，因此將該病毒放入動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)的組中。
這種歐洲型的一個(gè)病毒株稱為“Lelystad病毒”(LV)以nr.I-1102保藏于法國巴黎的巴斯德研究所并與荷蘭Lelystad獸醫(yī)研究中心提交的PCT WO92/21375相聯(lián)系。
在EPA no.91.202，646.5中描述了另一種歐洲病毒株，并以nr.I-1140保藏于法國巴黎巴斯德研究所的Collection NationaledeCultures de Micro-organismes(CNCM)。
Conzelmann等(Viology193，329-339，1993)最近描述了這種歐洲病毒株。
Benfield等描述了該病毒的美國型(J.Vet.Diagn.Invest.4，127-133，1992)。一種美國型的病毒株以nr.VR-2332保藏于ATCC并在PCT WO93103760和歐洲專利申請0529584中提到。在該病毒發(fā)現(xiàn)后的早期，當(dāng)Wensvoort等(J.Vet.Diagn，Invest.4，134-138，1992)根據(jù)其抗原性特征比較美國和歐洲毒株時(shí)進(jìn)行了重要觀察并證實(shí)歐洲和美國毒株表現(xiàn)出相當(dāng)大的抗原性差異。
PRRSV的兩個(gè)歐洲病毒株的基因組和美國分離物的部分基因組已被分子克隆和測序(PCT WO92/21375；Meulenberg etal.，Virology 192，62-72，1993；Conzelmann et al.，出處同上；Kwang etal.，J.Vet Diagn，Invest.6，293-296，1994；Mardassiet al.，J.Gen.Virol.75，681-685，1994；Meng et al.，Proc.13th IPVSCongress，61，1994)。
PRRSV基因組的RNA包含大約15kb并可鑒定其中有8個(gè)開架閱讀框(ORF)，即ORF1A，B和ORF2到7.ORF1A，B編碼病毒RNA聚合酶，而ORF2至6編碼病毒膜(被膜)蛋白。ORF7編碼病毒核殼蛋白。在歐洲和美國分離株中都證實(shí)在感染的細(xì)胞中存在一套同3′末端嵌套的6個(gè)主要亞基因組mRNA(Meng et al.，出處同上)。表1概括了編碼PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的ORF的特征(Conzelmann et al.，出處同上)。
表1
ORF在PRRSV基因組中的分布如圖1所示并與Meulenberg等(出處同上)的發(fā)現(xiàn)相對應(yīng)。
對于前述ORF表達(dá)的PRRSV蛋白質(zhì)知之甚少。在用歐洲或美國PRRS分離株接種的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中鑒定了大約15-26KD的5種病毒蛋白質(zhì)(Nelson et al.，J，Clin，Microbiol.31，3184-3189，1993和Benfield et al，Proc，13th IPVS Congress，62，1994)。證實(shí)ORF7，ORF6和ORF5蛋白質(zhì)存在于病毒粒子中(Meulenberg et al.，Virology206，155-163，1995)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的兩種不同形式(小型和大型)存在于被PRRSV感染的細(xì)胞中，但只有一種形式存在于從感染細(xì)胞上清液中分離的純化的病毒粒子中。以其碳水化合物鏈的加工水平區(qū)分每種ORF蛋白質(zhì)的兩種形式。大型(存在于純化的病毒粒子中的形式)為內(nèi)糖苷酶H(Endo-H)抗性，而小型對Endo-H敏感。Endo-H酶的底物僅僅是糖蛋白的“高甘露糖基化”形式。該酶裂解緊接于同氨基酸天冬酰胺(Asn)偶聯(lián)的糖基GlcNac之后的低聚糖鏈。更復(fù)雜的形式(即糖基化加工完全的形式)對Endo-H裂解具抗性。本文使用Endo-H抗性測定ORF3和4蛋白質(zhì)糖基化加工的階段并用于區(qū)分ORF蛋白質(zhì)的小型(“高甘露糖”)和其大型(“復(fù)合物”)。肽-N-糖水解酶(PnGase-F)用于獲得ORF3和4的完全去糖基化形式(多肽骨架)。發(fā)現(xiàn)摻入病毒粒子的ORF3和4糖蛋白質(zhì)是大型(“復(fù)合物”)，它來自經(jīng)過進(jìn)一步加工的其前體小型(“高甘露糖”)，因此所說的大型變成Endo-H抗性。經(jīng)SDS-PAGE測定的ORF3和ORF4蛋白質(zhì)形式的分子量(MW)如表2所示。
表 2
1.Endo-H敏感型2.Endo-H抗性型在用單獨(dú)的ORF轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞中表達(dá)單獨(dú)的ORF后發(fā)現(xiàn)與被病毒感染的細(xì)胞相反，僅產(chǎn)生ORF3和ORF4蛋白的小型形式。由于單獨(dú)的蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中不完全加工，因此，很可能蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體中央池的運(yùn)輸是不可能的。令人驚奇的是現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)為了獲得PRRSV ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的大型形式，只需要在一種細(xì)胞中共同表達(dá)ORF2，ORF3和ORF4就足夠了。在感染過程中，動(dòng)物面臨的是該蛋白質(zhì)的成熟形式(大型)。因此，本發(fā)明提供了重組DNA制備PRRSV ORF3和ORF4蛋白質(zhì)成熟大型形式的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種用于制備PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的糖基化形式的方法，包含在表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)一種合適的用編碼ORF2和ORF4蛋白質(zhì)的DNA片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或一種用含有編碼ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的DNA片段的載體病毒感染的宿主細(xì)胞，并收獲表達(dá)的蛋白質(zhì)的步驟，其特征在于同一宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PRRSVORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。
ORF2，ORF3和ORF4定義為在聚合酶編碼區(qū)ORF1下游(3′-方向)的大型蛋白質(zhì)編碼(部分重迭)區(qū)，由圖1所示的顯示ORF在PRRSV基因組上分布的圖譜來定義。該圖譜與Meulenberg等(出處同上)的所示相對應(yīng)并認(rèn)為是所有PRRS病毒的代表性圖譜。ORF5-7也以它們在前述圖譜上的位置來限定。
具體地說，上述ORF的特征為PRRSV蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別由Conzelmann等(出處同上)公開的ORF編碼。應(yīng)理解對于特定的ORF蛋白質(zhì)，在不同的PRRSV分離株之間可存在天然變異體。這些變異體可用在全部序列上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的差異來證實(shí)。這種PRRSV變異體的一個(gè)例子和這些ORF蛋白質(zhì)的氨基酸序列由Meulenberg等(出處同上)公開。
用于本發(fā)明的ORF蛋白質(zhì)優(yōu)選與Conzelmann等(出處同上)公開的氨基酸序列在氨基酸序列水平上表現(xiàn)出至少55％的同源性，更優(yōu)選至少70％的同源性。
本發(fā)明的一個(gè)基本的方面是一種和相同的宿主細(xì)胞共同表達(dá)PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。這可經(jīng)過用包含所說3種ORF的DNA片段轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或經(jīng)過用一個(gè)以上的DNA片段轉(zhuǎn)化細(xì)胞以便所有3種ORF都導(dǎo)入細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。例如，可共同轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的3種DNA片段第一種包括ORF2，第二種包含ORF3，第三種包含ORF4。
同樣地，只要上述3種ORF被導(dǎo)入相同細(xì)胞，可用一種載體病毒或多種載體病毒來感染(共同感染)宿主細(xì)胞。
為了生產(chǎn)ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的大型成熟形式，盡管在宿主細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)ORF2，ORF3和ORF4是必需的，也是足夠的，但如果還需要，PRRSV的其它ORF如ORF5-7中的一種或多種，特別是ORF5和/或ORF7，可用所說的宿主細(xì)胞來共同表達(dá)。
而且，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所有ORF2，ORF3和ORF4都受啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以便保證所說的ORF得以表達(dá)。優(yōu)選每個(gè)ORF與分離的啟動(dòng)子有效地相連。
用于本發(fā)明的DNA片段可包含各種影響復(fù)制的DNA序列(天然情況下，ORF與之無關(guān)或不相連)以產(chǎn)生可用于轉(zhuǎn)化合適宿主的所謂的重組核酸分子。這種雜交DNA優(yōu)選來自例如質(zhì)粒?？捎糜诳寺RRSV ORF的特異性載體是本領(lǐng)域已知的且特別包括質(zhì)粒載體，如pBR322，各種pUC，pGEM和Bluescript質(zhì)粒(也見Rodrigquez.R.L.and D.T.Denhardt，ed.，Vectors；A Survey ofmolecular cloningvectors and their uses，Butterworths，1988；Lenstra，J.A.etal，Arch，Virol.110，1-24，1990)。用于構(gòu)建這種重組核酸分子的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，特別是在Maniatis，T等(Molecular Cloning A Laboratory Manual；ColdSpringHarbor Laboratory，Znd edition，1989)中所闡述的方法。
合適的宿主細(xì)胞是能被編碼PRRSV ORF蛋白質(zhì)的DNA片段轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，它能以糖基化形式表達(dá)PRRSV ORF蛋白質(zhì)。本文所用的“轉(zhuǎn)化”指不論使用何種方法(例如直接吸收或轉(zhuǎn)導(dǎo))將異源核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞。異源核酸序列可整合進(jìn)宿主基因組。為了表達(dá)異源DNA片段，提供了與指定宿主相配伍的且能調(diào)控插入的核酸序列表達(dá)的合適的表達(dá)控制序列。
宿主優(yōu)選來源于真核生物，如酵母(例如啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae)或高等真核細(xì)胞，例如昆蟲，植物或哺乳動(dòng)物，包括HeLa細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞包括Spodoptera frugiperda的Sf9細(xì)胞系(Luckow et al.，Bio-technology.6，47-55，1988)。至于在真核克隆系統(tǒng)中克隆和表達(dá)PRRSV ORF的資料可參見Esser，K等的著作(PlasmidsofEukaryotes，Springer，Verlag，1986)。
當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，有用的表達(dá)控制序列的例子包括(例如)α-交配因子。對于昆蟲細(xì)胞，可使用多角體蛋白或桿狀病毒p10啟動(dòng)子(Smith，G.E et al.，Mol.，Cell，Biot，3，2156-65，1983)。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物來源時(shí)，有用的表達(dá)控制序列的例子包括(例如)SV-40啟動(dòng)子(Berman，P，W，et al.，Science 222，524-527，1983)或(例如)金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Brinster，R.L.，Nature 296，39-42，1982)或熱休克啟動(dòng)子(Voellmy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA82，4949-53，1985)。
作為選擇，合適的宿主細(xì)胞是易于被含有編碼PRRSV ORF的DNA片段的載體病毒感染的細(xì)胞。在載體病毒中，異源DNA片段插入病毒的非必要區(qū)域，即能用于摻入所說的DNA片段而又不會(huì)破壞病毒感染或病毒復(fù)制所必須的那些基本功能的區(qū)域。各種病毒(包括皰疹病毒和痘病毒)的這類區(qū)域是本領(lǐng)域公知的。
為了獲得大量的PRRSV ORF蛋白質(zhì)，優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BVES)。在此系統(tǒng)中，昆蟲細(xì)胞(如Spodopterafurgiperda(Sf，IPLB-Sf21)細(xì)胞)被保持在細(xì)胞培養(yǎng)物中以作為桿狀病毒(如Autographa california核多角體病病毒(AcNPV))的宿主。AcNPV的有些基因高水平表達(dá)，但對病毒感染周期又不是必需的。這些基因是轉(zhuǎn)染細(xì)胞中在桿狀轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(如pAcAS3)和野生型(wt)AcNPV DNA之間進(jìn)行同源重組的靶基因。在pAcAS3(J.Vlaket al.，Virology179，312-320，1990)中異源基因插入p10啟動(dòng)子的下游，以代替非必須的p10基因，它被作為重組過程中靶基因的wt AcNPV序列包圍。為了便于篩選重組子，pAcAS3還含有l(wèi)acZ基因，當(dāng)向培養(yǎng)基中加入X-gal時(shí)，它導(dǎo)致重組子斑變蘭。
在所要求的方法中，上面限定的宿主細(xì)胞可在最適于表達(dá)PRRSVORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。使用粗制培養(yǎng)物，宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或宿主細(xì)胞提取物的樣品可制備疫苗或進(jìn)行診斷試驗(yàn)，盡管在另一實(shí)施例中根據(jù)其所需用途可制備更純化的ORF3或ORF4蛋白質(zhì)。為了純化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在足夠的體積中培養(yǎng)表達(dá)ORF2，ORF3和ORF4的宿主細(xì)胞并從這類細(xì)胞或培養(yǎng)基中(如果蛋白質(zhì)分泌出細(xì)胞)分離產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離和純化分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，例如鹽分離，離心，超濾，色譜，凝膠過濾免疫沉淀或免疫親和層析，而分離細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可通過下列方法，首先收集所說的細(xì)胞，破碎該細(xì)胞(例如經(jīng)聲處理或經(jīng)其它機(jī)械破裂方法如French壓碎)，接著如果需要的話從其它細(xì)胞內(nèi)成份中分離該蛋白質(zhì)。細(xì)胞破碎也可用化學(xué)(例如EDTA處理)或酶方法(如溶菌酶消化)。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種載體病毒，所說的載體病毒含有1個(gè)或多個(gè)外源DNA片段，其特征在于該DNA片段編碼PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。該載體病毒在上文已作了一般性描述。該載體病毒可用于疫苗開發(fā)的新方法，即使用活的減毒病毒疫苗株作載體(病毒疫苗載體)表達(dá)外源病原體的基因。由活載體病毒表達(dá)抗原可模擬自然感染后的表達(dá)并可同時(shí)刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。這種載體可用于免疫以抵抗現(xiàn)在沒有足夠的疫苗可用或疫苗生產(chǎn)不安全或不容易的疾病。正如上面所概括的，發(fā)現(xiàn)如果應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的載體病毒，由含有PRRSV ORF3或ORF4的載體病毒表達(dá)免疫原僅模擬自然感染。
適于同時(shí)表達(dá)PRRSV ORF2，ORF3和ORF4的病毒載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并包括痘病毒，如牛痘病毒(PicciniandPaoletti，Aolv.Vi r，Res.34，43-64，1988；Riviere etal，J.Virol.66，3424-3434，1992，Mengeling et al.，Arch.Virol.134，259-269，1994)，豬痘病毒(Van der Leeket al.，The Vet.Record.134，13-18，1994)，腺病毒(Hsu et al.，Vaccine12，607，1994)和皰疹病毒，如假狂犬病病毒。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的載體病毒來自假狂犬病病毒(PRV)。
例如，已公開了PRV的一些非必需區(qū)域并用于摻入外源DNA序列，如編碼gp50，gp63，gI，gIII，gX，11K，胸苷激酶(TK)，核糖核苷酸還原酶(RR)，蛋白激酶(PK)或28K的基因(Peeters etal.，J，Virol，67，170-177，1993，de Wind，N，et al.，J，Virol64，4691-4696，1990，Moorman，R.J.M.et al.，J，Gen Virol71，1591-1595，1990，Petrovskis，E，A，et al.，Virology159，193-195，1987；Van Zijl，M，etal.，J.Gen，Virol71，1747-1755，1990；Thomsen，D.R.et al.，Gene57，261-265，1987；Keeler，C.L.et al.，Gene50，215-224，1986；Whealev，M.E.etal.，J，Virol62，4185-4194，1988；VanZijl，M.et al.，J.Virol65，2761-2765，1991；Mettenleiter，Th.C.et al.，Virology179，498-503，1990；美國專利號(hào)4609548，歐洲專利號(hào)0263207，歐洲專利申請?zhí)?4203643和PCT申請WO/94/01573)。
用于將DNA序列插入克隆載體和體內(nèi)同源重組的公知方法或粘粒(cosmid)克隆技術(shù)可用于將ORF插入皰疹病毒基因組的非必需區(qū)(Maniatis，T.et al.，in“Molecular cloning”，Cold SpringHarborLaboratory，1989；歐洲專利申請?zhí)?74808；Roizman，B.andJenkins，F(xiàn).J.，Science229，1208，1985；Higuchi，R.et al.，Nueleic AcidsRes，16，7351，1988，de Wind，N，et al.，J.Virol.64，4691-4696，1990；VounZijl，M，et al.，J，Virol，62，2191-2195，1988；Ackermann，M.，J，Vet-Med，B.，35，379-396，1988，和上段描述的方法)。
編碼PRRSV ORF2，ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的DNA片段可插入載體病毒基因組的相同或不同區(qū)域。
本發(fā)明理所當(dāng)然還提供了兩種或多種(優(yōu)選兩種或三種)載體病毒的混合物，所說的混合物能在體內(nèi)共同感染宿主細(xì)胞以使相同細(xì)胞能在體內(nèi)同時(shí)表達(dá)PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。該混合物也可用作疫苗的活性成份。如果混合物含有兩種載體病毒，那么一種病毒含有上述三個(gè)ORF中的兩個(gè)，第二種病毒含有第三個(gè)所需的ORF。如果混合物含有三種載體病毒，那么，每種病毒含有所需ORF中的一種。如果需要的話，混合物中的一個(gè)或多個(gè)載體病毒可含有PRRSV的ORF5-7中的一個(gè)或多個(gè)。
優(yōu)選的是摻入所說混合物中的載體病毒來自PRV疫苗病毒，優(yōu)選使用基因型是gD-(如果需要可為gD+表型)和/或gE-的PRV病毒株(PCT申請WO94/01573，EP申請?zhí)枺?4203643)。
根據(jù)本發(fā)明的載體病毒或摻入上述混合物的載體病毒可經(jīng)過培養(yǎng)用載體病毒感染的宿主細(xì)胞來制備，然后任選以純化的形式收集含病毒的細(xì)胞和/或生長于細(xì)胞中的載體病毒，任選以凍干的形式摻入疫苗中或用于診斷試驗(yàn)。
本發(fā)明還提供了含有編碼PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的核酸序列的DNA片段，其中編碼所說蛋白質(zhì)的每種ORF與啟動(dòng)子以可操縱的形式相聯(lián)。這種DNA片段可用于制備上面限定的宿主細(xì)胞或載體病毒。
本發(fā)明的范圍還包括純化的Endo-H抗性PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)。Endo-H抗性O(shè)RF3或ORF4蛋白質(zhì)的一種優(yōu)選的形式分別具有55-60KD或40-70KD的分子量。
這些Endo-H抗性O(shè)RF蛋白質(zhì)可以基本純化的形式提供，它不含天然情況下與其正常相聯(lián)的PRRSV物質(zhì)，或以根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的PRRSV蛋白質(zhì)的混合物形式提供。
而且，本發(fā)明提供了可誘導(dǎo)豬抗PRRS病毒的有效免疫反應(yīng)的疫苗。該疫苗可以是一種亞單位疫苗，它包含根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的ORF3和/或ORF4蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
作為選擇，所提供的載體疫苗包含根據(jù)本發(fā)明的載體病毒或上面限定的載體病毒與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的混合物。
例如，疫苗也可含有一種含水介質(zhì)或含水懸液，例如通常可與其它組份混合，以便增加活性和/或存儲(chǔ)期。這些組份可以是鹽，pH緩沖液，穩(wěn)定劑(如脫脂乳，酪蛋白水解產(chǎn)物或檸檬酸)或防腐劑(如thimerosal，硫柳汞和慶大霉素)。
如果需要，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可與一種或多種佐劑配制。合適的例子是皂苷(例如Quil A)，氫氧化鋁，霍亂或破傷風(fēng)類毒素，油乳劑(o/w或w/o)和含水維生素E分散體。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以常規(guī)主動(dòng)免疫方式用藥，以與劑量形式相匹配的方式和以預(yù)防和/或治療上有效的和致免疫的量一次性或重復(fù)用藥。疫苗的用藥可經(jīng)過，例如皮內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，鼻內(nèi)或口服方式進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及“免疫化學(xué)試劑”，該試劑包含根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)中的至少一種。
術(shù)語“免疫化學(xué)試劑”指所說的蛋白質(zhì)結(jié)合到合適的支持物上或被提供了一種標(biāo)記物質(zhì)。
例如，可使用的支持物是微量試驗(yàn)孔或小池的內(nèi)壁，試管或毛細(xì)管，膜，濾紙，試紙或顆粒的表面，如乳液顆拉，紅細(xì)胞，染料溶膠，金屬溶膠或以膠體顆粒存在的金屬化合物。
合適的標(biāo)記物質(zhì)特別是放射活性同位素，熒光化合物，酶，染料溶膠，金屬溶膠或以膠體顆粒存在的金屬化合物。
在診斷試驗(yàn)中可使用“免疫化學(xué)試劑”，其中所說的試劑與懷疑含有抗-PRRSV抗體的樣品保溫，然后確定是否存在該抗體。
本發(fā)明還涉及用于免疫試驗(yàn)的試驗(yàn)試劑盒，該試劑盒含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的免疫化學(xué)試劑。
使用該試劑盒發(fā)生的免疫化學(xué)反應(yīng)優(yōu)選夾心反應(yīng)，凝集反應(yīng)，競爭反應(yīng)或抑制反應(yīng)。
實(shí)施例1以牛痘病毒在同一細(xì)胞中瞬時(shí)同時(shí)表達(dá)PRRSV ORF來自PRRSV的cDNA克隆pRRSV-T1的制備和分析在Conzelmann等(出處同上)的文章中進(jìn)行了描述。含PRRSV整個(gè)ORF并起始于接近各自ATG起始密碼子的片段經(jīng)Klenow聚合酶處理后克隆到載體pBluescript SKII-(Stratagene)T7啟動(dòng)子下游的EcoRV限制性位點(diǎn)(ORF2和5)或SmaI限制性位點(diǎn)(ORF3和4)。插入片段含下列PRRSV-T1序列殘基(Conzelmann等，出處同上)ORF2(EcoR I-Ndel，Klenow補(bǔ)齊)1602-2381ORF3(HTncII-HinfI，Klemow補(bǔ)齊)2207-3040ORF4(BstYI-SpeI，Klenow補(bǔ)齊)2673-4920
ORF5(BstXI-HindIII，Klenow補(bǔ)齊)，3304-3954用表達(dá)T7 RNA聚合酶的vTF7-3(Fuerst et al.，1986，PNAS83，8122，8126)以5m.o.i感染后在BHK-21(倉鼠幼腎)細(xì)胞，克隆BSR中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。根據(jù)廠商的說明書使用Stratagene“哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒”用2μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感染后1小時(shí)的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染后用無甲硫氨酸的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞4小時(shí)。饑餓30分鐘后，每培養(yǎng)皿加入50μCi Tran(35S)-標(biāo)記物并將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，在1％Triton中溶胞并以95℃和2％SDS變性蛋白質(zhì)。
用抗ORF4單克隆抗體(mab35)沉淀粗制蛋白質(zhì)樣品并根據(jù)Kessler(Methods Enzymol，73，442-459，1981)的方法固定金黃色葡萄球菌細(xì)胞。離心收集免疫復(fù)合物。所得的沉淀重懸于30μlLaemmili樣品緩沖液中并在95℃下培養(yǎng)5分鐘。離心后，在SDS-10％聚丙烯酰胺凝膠上分析上清液。固定凝膠，用En 3Hance浸滲，在Whatman 3MM濾紙上干燥并在-70℃下用Kodak x-AR5膠片曝光。
用Endo-H對表達(dá)的蛋白質(zhì)去糖基化可按如下方法進(jìn)行將已沉淀和洗過的免疫復(fù)合物重懸于NEB緩沖液(New EnglandBiolabs)中。加入1.5單位的Endo-H并將樣品在37℃保溫16小時(shí)，接著重懸于30μlLaemmili樣品緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE分析。
在第一次實(shí)驗(yàn)(圖2)中進(jìn)行一些ORF組合的共同表達(dá)。證實(shí)ORF2，ORF3和ORF4的共同表達(dá)是必需的，并足以支持成熟大型ORF4(40-47KD)的表達(dá)。為了證實(shí)觀察到的ORF4蛋白質(zhì)分子量形式與在病毒粒子中所存在的相似，在不同組合的表達(dá)產(chǎn)物中用Endo-H進(jìn)行了去糖基化實(shí)驗(yàn)(圖3)。表明只有用ORF2，ORF3和ORF4共同轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)ORF4蛋白質(zhì)的大型形式且這些大型形式對Endo-H處理具有抗性。
實(shí)施例2表達(dá)PRRSV ORF2，3和4的PRV載體病毒混合物構(gòu)建PRV gD-和gE-載體病毒。
將PRV NIA-3菌株的含gD的PstI NcoI片段亞克隆進(jìn)PGEM5ZF(+)載體中。用TransformerTM方法(clonetech)導(dǎo)入SpeI和AvrII限制性位點(diǎn)。在gD ATG起始密碼子上游17個(gè)核苷酸處導(dǎo)入SpeI位點(diǎn)。在TAG終止密碼子之后的第一個(gè)核苷酸處導(dǎo)入AvrII位點(diǎn)。導(dǎo)入這些突變后，用SpeI和AvrII經(jīng)限制性酶消化去掉全部gD基因。在以前的gD位置插入含SpeI，EcoRI，EcoRV，HindIII和AvrII限制性位點(diǎn)的寡核苷酸。然后從質(zhì)粒中分離PstI-NcoI片段并用于以Peeters等(J，Virology 66，894-905，1992)所述的方法與PRV R1菌株進(jìn)行同源重組(de Wind et al.，J，Virology64，4691-4696，1990)。
為了獲得gD-和gE-陰性突變體，用含gD-缺失的NdeI-StuI片段置換PRV Hind III-B片段中的NdeI-StuI片段。這個(gè)HindIII片段也含有包含gE的缺失(從6831位的DraI位點(diǎn)到突變體324的8562位的連接子插入位點(diǎn)(de Wind et al.，1990，出處同上))。然后，經(jīng)過與野生型粘粒c-179，c-27和c-443重組將所得的質(zhì)粒用于產(chǎn)生gD-，gE-病毒(Van Zijl et al.，J，Virology62，2191-2195，1988)。
構(gòu)建表達(dá)PRRSV ORF2，3和4的PRV gD突變體。
將每個(gè)ORF單獨(dú)插入上述假狂犬病gD-，gE-載體D57中。下列方法可用于得到重組病毒，通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異地?cái)U(kuò)增ORF，然后將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pCRtmII載體中。接著從該載體中分離ORF并克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pDHβ中。再將該載體用于將PRRSVORF轉(zhuǎn)移進(jìn)PRV D57菌株的病毒基因組中。
PRRSV ORF的PCR擴(kuò)增為了擴(kuò)增特異性O(shè)RF，使用相應(yīng)于PRRSV序列的下列引物對ORF2上部引物；包含核苷酸1609-1628，下部引物；包含核苷酸2351-2370的互補(bǔ)序列。
ORF3上部引物；包含核苷酸2211-2230，下部引物；包含核苷酸3025-3044的互補(bǔ)序列。
ORF4上部引物；包含核苷酸2747-2766；下部引物；包含核苷酸3296-3315的互補(bǔ)序列。
涉及PRRSV序列的所有核苷酸號(hào)由Conzelmann等(Virology193，329-339，1993)提供。
以下面方法從含有PRRSV全部結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒(pPRRSV)擴(kuò)增ORF經(jīng)過加入5μl(10X)PCR緩沖液(購自酶供應(yīng)者)，5μl(2mM)dNTP，5μl(10μM)上部引物，5μl(10μM)下部引物，0.2USuperTaq(Sepharo Q)，1μl(1μg/μl)pPRRSV并加水至總體積為50μl來制備PCR混合物。在混合物頂部加上一滴礦物油后，使用在94℃下1分鐘，55℃1分鐘和72℃1分鐘的循環(huán)達(dá)30次來進(jìn)行PCR。擴(kuò)增后，可在含0.5μg/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上觀察產(chǎn)物?？寺U(kuò)增的ORF使用Invitrogen TA克隆試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)pCRtmII載體。按照廠商說明書進(jìn)行全部程序。將ORF從該載體克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pDHβ。經(jīng)BamHI消化從載體中切下以正確方向克隆的PCR產(chǎn)物(ORF的ATG起始密碼子位于pCRtmII載體T7啟動(dòng)子一側(cè))，接著用Klenow處理產(chǎn)生鈍端，然后用xbaI消化。在1％瓊脂糖凝膠上分離產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書用Geneclean從凝膠上純化含ORF的帶。首先用EcoRI，接著用xbaI消化載體，在凝膠上分離，使用Geneclean純化線性載體。使用T4連接酶將含ORF的所有片段連接到線性化載體上。所有酶都購自Pharmacia，所有方法使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology)進(jìn)行。含PRRSV插入片段的PRV突變體的產(chǎn)生在補(bǔ)充gD的Vero細(xì)胞上培養(yǎng)gD和gE基因缺失的PRV病毒(D57株)。在CPE最高時(shí)收獲病毒并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取其DNA。利用位于正規(guī)gD座的單一EcoRI位點(diǎn)以EcoRI裂解病毒DNA。用MluI使含PRRSV插入片段的pDHβ載體線性化。根據(jù)廠商說明書線性化質(zhì)粒和切開的病毒D57 DNA與DOTAP(BoehringerManheim)混合。在總體積為500μl的20mH Hepes緩沖液中將總共5μgDNA與10μlDOTAP混合。對于DNA，使用的摩爾比率為10拷貝的質(zhì)粒DNA對1拷貝的病毒DNA?；旌衔镌谝讶サ襞囵B(yǎng)基的補(bǔ)充gD的Vero細(xì)胞80％匯合的單層上37℃培養(yǎng)6小時(shí)。經(jīng)過這段培養(yǎng)期之后加入培養(yǎng)基，平板在37℃進(jìn)一步培養(yǎng)。在CPE最高時(shí)收獲培養(yǎng)基。最后，以有限稀釋法從收獲的培養(yǎng)基中分離重組病毒，并使用免疫熒光以插入的PRRSV基因的表達(dá)來鑒定之。制備表達(dá)ORF2，3和4的載體病毒混合物并用于免疫豬。


圖1開架閱讀框在測定的PRRSV序列中的分布和亞基因組mRNA(sgmRNA，方框代表先導(dǎo)RNA)的位置。圖2瞬時(shí)表達(dá)PRRSV ORF的放射免疫沉淀。在10％SDS-PA凝膠上分離表達(dá)的蛋白質(zhì)。左側(cè)泳道含標(biāo)記物(M)蛋白質(zhì)。其他泳道表示用頂端提及的ORF轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記蛋白的電泳情況。圖3與圖2相同。用Endo-H(EH)處理的其它的一些表達(dá)產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.制備豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)ORF3或ORF4蛋白質(zhì)糖基化形式的方法，包含下列步驟a.在表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用編碼ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的DNA片段轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞，或用含有編碼ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的DNA片段的載體病毒感染的合適的宿主細(xì)胞；b.收獲表達(dá)的蛋白質(zhì)，其特征在于，同一宿主細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，用PRRSVORF2，ORF3和ORF4轉(zhuǎn)化同一宿主細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，由于用一個(gè)或多個(gè)載體病毒感染或共感染，該同一宿主細(xì)胞內(nèi)含有PRRSV ORF2，ORF3和ORF4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于載體病毒是桿狀病毒。
5.用PRRSV ORF2，ORF3和ORF4轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.含有一個(gè)或多個(gè)異源DNA片段的載體病毒，其特征在于，該DNA片段編碼PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的載體病毒，其特征在于該病毒是假狂犬病病毒。
8.一種兩個(gè)或多個(gè)載體病毒的混合物，每個(gè)載體病毒含有一個(gè)或多個(gè)PRRSV ORF，所說的混合物能共同感染宿主細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)PRRSV ORF2，ORF3和ORF4。
9.包含編碼PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)的核酸序列的DNA分子，每種ORF與啟動(dòng)子以可操縱的方式相連。
10.PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)的Endo-H抗性形式。
11.一種誘導(dǎo)豬抗PRRS病毒的有效免疫反應(yīng)的疫苗，其包含以根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法產(chǎn)生的ORF蛋白質(zhì)，根據(jù)權(quán)利要求10的ORF3和/或ORF4蛋白質(zhì)，根據(jù)權(quán)利要求6或7的載體病毒或根據(jù)權(quán)利要求8的載體病毒的混合物以及一種藥用上可接受的載體或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于PRRSV ORF3或ORF4蛋白質(zhì)成熟形式的重組DNA生產(chǎn)的方法。它經(jīng)過以同一細(xì)胞共同表達(dá)PRRSV ORF2，ORF3和ORF4蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1139703SQ9610733
公開日1997年1月8日 申請日期1996年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月14日
發(fā)明者P·A·M·范沃恩斯, K·K·康澤曼 申請人:阿克佐諾貝爾公司