專利名稱：果糖氨基酸氧化酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的果糖氨基酸氧化酶。特別涉及一種來源于鐮刀菌屬的新的果糖氨基酸氧化酶，一種生產(chǎn)這種酶的方法，以及一種用這種酶，測(cè)定阿瑪竇利(amadori)化合物的方法和含有這種酶的試劑或試劑盒。
當(dāng)活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)，肽以及帶有一個(gè)(或多個(gè))氨基的氨基酸與一種還原糖如含有一個(gè)(或多個(gè))醛基的醛糖共同存在時(shí)，二者通過氨基和醛基發(fā)生非酶催化性不可逆結(jié)合，之后通過阿瑪竇利重排形成一種阿瑪竇利化合物。阿瑪竇利化合物的生產(chǎn)率是反應(yīng)物濃度，接觸時(shí)間，溫度等的函數(shù)，可以從阿瑪竇利化合物的數(shù)量中獲得許多關(guān)于含有一種(或多種)活性物質(zhì)的樣品的有用信息。含有一種阿瑪竇利化合物的物質(zhì)的例子包括食品如醬油和體液如血液。
在一種活體內(nèi)，通過葡萄糖和一種氨基酸反應(yīng)生成果糖胺，將血液中所得的血紅蛋白，白蛋白和蛋白的糖化衍生物相應(yīng)地稱為糖血紅蛋白，糖白蛋白和果糖胺。因?yàn)檠褐羞@些糖化衍生物的濃度能夠反映一個(gè)特定時(shí)期內(nèi)血糖的平均水平，所以它可作為一個(gè)診斷和控制糖尿病的重要指標(biāo)。因此，建立一種測(cè)定血液中阿瑪竇利化合物的方法對(duì)臨床非常有益。
此外，可以根據(jù)食品中阿瑪竇利化合物的數(shù)量確定食品生產(chǎn)后的保存條件和時(shí)間。因而，這種測(cè)定阿瑪竇利化合物的方法還有助于食品的質(zhì)量控制。
如此看來，阿瑪竇利化合物的測(cè)定在包括藥品和食品的許多領(lǐng)域中都非常有用。
阿瑪竇利化合物測(cè)定的已知方法有利用高效液相層析[Chromatogr.Sci.10659(1979)]將硼酸加于固體物質(zhì)填充的層析柱[Clin.chem.282088-2094(1982)]，電泳[Clin.chem.261598-1602(1980)]或抗原-抗體反應(yīng)[JJCLA18620(1993)，J.clin.Lab.Inst.Reag.1633-37(1993)]，一種測(cè)定果糖胺數(shù)量的方法[Clin.chim，Acta 12787-95(1982)]，用硫代巴比土酸氧化后的比色測(cè)定[Clin.chim.Acta 112197-204(1981)]等等。但是這些已有方法需要的裝置昂貴，缺乏必要的準(zhǔn)確性而且不夠迅速。
目前利用酶催化的方法已廣泛應(yīng)用于臨床測(cè)定和食品分析領(lǐng)域，因?yàn)榭梢愿鶕?jù)酶的特性(在底物，反應(yīng)，結(jié)構(gòu)，活性部位等方面的特異性)準(zhǔn)確和快速地選擇分析預(yù)測(cè)定物質(zhì)。
已經(jīng)提出的測(cè)定方法包括一種氧化還原酶與阿瑪竇利化合物反應(yīng)，測(cè)定氧消耗或過氧化氫的產(chǎn)生作為阿瑪竇利化合物數(shù)量的一個(gè)指標(biāo)(如日本專利說明書(kokoku)第5-33997和6-65300，以及日本公開專利說明書第2-195900，3-155780，4-4874，5-192193和6-46846)。此外，測(cè)定糖化蛋白用于診斷糖尿病也已經(jīng)公開(日本公開專利說明書第2-195899，2-195900，5-192193和6-46846)。
由一種氧化還原酶催化的阿瑪竇利化合物的分解反應(yīng)可以用下列的反應(yīng)式表示其中R1是一個(gè)醛糖殘基，R2是一個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)或肽的殘基。
催化上述反應(yīng)的酶的實(shí)例如下1.來源于棒狀桿菌屬(日本專利說明書第5-33997和6-65300)或曲霉菌屬(日本公開專利說明書第3-155780)]的果糖氨基酸氧化酶；2.來源于念珠菌屬的果糖胺脫糖酶(日本公開專利說明書第6-46846)；3.來源于青霉菌屬的果糖氨基酸脫糖酶(日本公開專利說明書第4-4874)；4.來源于棒狀桿菌屬，鐮刀菌屬，支頂孢屬或德氏酵母菌屬的酮胺氧化酶(日本公開專利說明書第5-192193)]；以及5.可以按照J(rèn).Biol.Chem.，Vol.239，pp.3790-3796(1964)中所述的方法制備的烷基賴氨酸酶。
但是，涉及這些已有酶的測(cè)定方法存在一些缺陷。
例如，血液中充當(dāng)診斷糖尿病的指標(biāo)的糖化蛋白是糖化白蛋白，糖化血紅蛋白和果糖胺。葡萄糖與蛋白分子ε-位置的賴氨酸殘基結(jié)合可生成糖化白蛋白[J.Biol.Chem.，26113542-13545(1986)]。如果生成的是糖化血紅蛋白，葡萄糖還與β-鏈的N-末端纈氨酸結(jié)合[J.Biol.Chem.2543892-3898(1979)]。因此，必須使用一種對(duì)果糖纈氨酸和果糖賴氨酸高度特異的酶測(cè)定糖化蛋白作為一種診斷疾病的有效指標(biāo)。但是，已有的來源于棒狀桿菌屬的酶對(duì)果糖賴氨酸不起作用。至于來源于曲霉菌屬的酶，它對(duì)糖化蛋白及其水解產(chǎn)物作用不明顯。雖然日本公開專利說明書第5-192193中所述的酮胺氧化酶對(duì)果糖纈氨酸起作用，但是它不能準(zhǔn)確地測(cè)定賴氨酸殘基與糖結(jié)合的糖化蛋白。因?yàn)楣前访撎敲笇?duì)于二果糖賴氨酸是高特異性，所以它不可用于特異性測(cè)定賴氨酸殘基在ε-位被糖化或者纈氨酸殘基被糖化的物質(zhì)。而且，由于烷基賴氨酸酶缺乏特異性并與其賴氨酸殘基與非糖部分結(jié)合的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以使用烷基賴氨酸酶的方法不可靠和不準(zhǔn)確。來源于青霉菌屬的果糖氨基酸脫糖酶(日本公開專利說明書第4-4874)對(duì)果糖賴氨酸和果糖丙氨酸發(fā)生作用，但對(duì)果糖纈氨酸沒有作用。
如上所述，已有的酶不能為糖化蛋白提供一個(gè)必要的準(zhǔn)確測(cè)定方法，因此需要開發(fā)一種酶，這種酶對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸具有很高的特異性。
通常，為了提高一種含有酶催化步驟的測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，必須使用一種適合于測(cè)定目的具有催化活性的酶。因此，有必要考慮如待測(cè)定物質(zhì)，酶底物，樣品的情況，測(cè)定條件等許多因素，選擇一種合適的酶以便準(zhǔn)確測(cè)定并且可重復(fù)生產(chǎn)。為了選擇一種適宜的酶，必須先得到許多酶并分析其活性，底物特異性，溫度穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性等方面的特性。因而，開發(fā)更多的果糖氨基酸氧化酶并對(duì)其特性進(jìn)行相同分析就十分必要。
為了提供一種對(duì)阿瑪竇利化合物，特別是對(duì)糖化蛋白具有特異性的新的果糖氨基酸氧化酶，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)可以通過在果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸存在下對(duì)鐮刀菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得所要的酶。
因此，本發(fā)明提供了一種對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸都有活性的新的果糖氨基酸氧化酶，這種酶可以通過在含有果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生一種果糖氨基酸氧化酶的鐮刀菌株而獲得。
本發(fā)明中，一種含果糖賴氨酸的培養(yǎng)基可含有果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸，用于培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明果糖氨基酸氧化酶的微生物。果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸(此后簡稱為“FZL”)通過葡萄糖與賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸在100-150℃下壓熱器中處理3-60分鐘而獲得。正如下文所述，本發(fā)明的果糖氨基酸氧化酶對(duì)包括FZL在內(nèi)的果糖賴氨酸和果糖纈氨酸具有意想不到的特異性，其中對(duì)前者的活性等于或大于對(duì)后者的活性。本發(fā)明說明書中“果糖氨基酸氧化酶”一詞簡稱為“FAOD”。
通過在含果糖賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生FAOD的鐮刀菌株可制造本發(fā)明的酶。
鐮刀菌菌株的例子包括亞麻尖孢鐮孢(IFONO.5880)，甘薯尖孢鐮孢(IFO NO.4668)，瓜類尖孢鐮孢(IFO NO.4471)，黃瓜尖孢鐮孢(IFO NO.6384)，蘋果尖孢鐮孢(IFO NO.7706)芹尖孢鐮孢(9964)，松尖孢鐮孢(IFO NO.9971)和草莓尖孢鐮孢(IFONO.31180)。
本發(fā)明的FAOD通常具有以下理化特性1)能夠在有氧條件下催化阿瑪竇利化合物氧化，產(chǎn)生α-酮醛，胺的衍生物和過氧化氫；2)在約4.0-13.0的pH范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定，最佳pH為8.5；3)在約20-50℃的溫度范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定，最佳溫度為30-35℃；以及4)通過Superdex 200pg上的凝膠過濾，估計(jì)其分子量約為106,000(106KDa) 。
將0.01-50％(W/W)葡萄糖與0.01-20％(W/W)賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的溶液在100-150℃下置于壓熱器中處理3-60分鐘，可以獲得用于制備本發(fā)明FAOD的果糖賴氨酸和/或FZL。特別是通過將總體積為1000ml，含葡萄糖200g，Nα-Z-賴氨酸10g的溶液在120℃下置于壓熱器中處理20分鐘，制備FZL。
雖然將用上述方法制備的果糖賴氨酸和/或FZL加入任何一個(gè)常用培養(yǎng)基都可獲得一種含果糖賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基可稱為FZL-培養(yǎng)基)，但通過如下制備更方便，即將含有0.01-50％(W/W)葡萄糖，0.01-20％(W/W)賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸，0.1％(W/W)K2HPO4，0.1％(W/W)NaH2PO4，0.05％(W/W)MgSO4·7H2O，0.01％(W/W)CaCl2·2H2O和0.2％(W/W)酵母抽提物的混合液(最佳pH為5.6-6.0)在100-150℃下置于壓熱器中處理3-60分鐘。
用于制備本發(fā)明FAOD的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域中常用的合成或天然培養(yǎng)基，它含有碳源，氮源，無機(jī)物以及其它養(yǎng)分。碳源的例子有葡萄糖，木糖，甘油等，氮源的例子有胨，酪蛋白水解液，酵母抽提物等；無機(jī)物的例子有鈉，鉀，鈣，錳，鎂，鈷等其它一般培養(yǎng)基中常含的物質(zhì)。
當(dāng)一種微生物在含有果糖賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出時(shí)，就在很大程度上誘導(dǎo)出了本發(fā)明的FAOD。最佳的培養(yǎng)基有含果糖賴氨酸-和/或FZL-的培養(yǎng)基(1.0％葡萄糖，0.5％果糖賴氨酸和/或FZL，1.0％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.01％維生素的混合液)，其中果糖賴氨酸和/或FZL為唯一的氮源，葡萄糖為碳源。
特別優(yōu)選的一種培養(yǎng)基為1000ml總體積中含20g(2％)葡萄糖，10g(1％)果糖賴氨酸和/或FZL，1.0g(0.1％)K2HPO4，1.0(0.1％)NaH2PO4，0.5g(0.05％)MgSO4·7H2O，0.1g(0.01％)CaCl2·2H2O和2.0g(0.2％)酵母抽提物(其pH為5.6-6.0)。
含果糖賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基可以通過向任何一種常用培養(yǎng)基中加果糖賴氨酸和/或FZL制備，也可以通過將含有葡萄糖和賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基置于壓熱器中處理而制備。由于果糖賴氨酸和/或FZL的存的，用任一方法制備的培養(yǎng)基均為褐色，因此被稱為“FZL褐色培養(yǎng)基或GL(糖化賴氨酸和/或糖化Nα-Z-賴氨酸)褐色培養(yǎng)基”。
培養(yǎng)通常在pH為4.0-8.0的培養(yǎng)基中(優(yōu)選pH為5.5-6.0)，25-37℃的溫度(28℃為優(yōu)選)下進(jìn)行，但是，培養(yǎng)的條件可根據(jù)各種因素如微生物的情況等而變化，并不局限于如上所述條件。例如，亞麻鐮刀菌屬尖孢菌株，當(dāng)它在這種條件下培養(yǎng)20-100小時(shí)，優(yōu)選80小時(shí)，在培養(yǎng)基中則有FAOD積累(見附

圖1)。
然后用常規(guī)的方法處理所得的培養(yǎng)基，去掉核酸，細(xì)胞壁碎片等等，得到一種酶制劑。
因?yàn)楸景l(fā)明FAOD的酶活性通常在細(xì)菌/霉菌的細(xì)胞中積累，所以收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞并進(jìn)行研磨以提取此酶。
研磨細(xì)胞可以使用常規(guī)的方法，例如用機(jī)械研磨，用一種溶劑自動(dòng)水解，冷凍，超聲處理，高壓密封等等。
分離和純化一種酶的方法是本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，可以結(jié)合以下已知方法進(jìn)行，如用硫酸銨鹽析，用如乙醇等的有機(jī)溶劑沉淀，離子交換層析，疏水性層析，凝膠過濾，親合層析等。
例如，通過對(duì)所得的培養(yǎng)物進(jìn)行離心或吸濾來收集菌絲，沖洗菌絲并將其懸浮于0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.5)中，用Dino-Mill研磨并進(jìn)行離心。然后用硫酸銨分餾作為胞外提取物的上清液，經(jīng)苯-瓊脂糖疏水性柱層析而純化。
本發(fā)明中，F(xiàn)AOD包括從所有純化步驟中所得的任何含酶物質(zhì)和溶液，不必顧及其酶的純度，它也包括培養(yǎng)基，只要這些物質(zhì)和溶液，具有如上所述的催化阿瑪竇利化合物氧化的作用。
此外，任何具有FAOD活性或與FAOD酶催化活性有關(guān)的FAOD片段均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些片段也可用于本發(fā)明。
如此獲得的FAOD可用于阿瑪竇利化合物，特別是糖尿病診斷中糖化蛋白的阿瑪竇利化合物的測(cè)定。
因而，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)FAOD的方法，它包括在一個(gè)含選擇性被保護(hù)的糖化氨基酸和/或糖化蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)霉菌菌株。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)FAOD的方法，它包括在一個(gè)含果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)能產(chǎn)生FAOD的鐮刀菌株，并且從所得的培養(yǎng)基中回收FAOD。
本發(fā)明中通過鐮刀菌株產(chǎn)生的所有FAOD均可用于解決本發(fā)明要解決的問題。因臨時(shí)需要，將說明書中通過亞麻鐮刀菌屬尖孢菌株產(chǎn)生的FAOD稱為FAOD-L。
本發(fā)明的FAOD具有以下特性1.一般的誘導(dǎo)特性本發(fā)明的FAOD是一種由果糖賴氨酸和/或FZL誘導(dǎo)的可誘導(dǎo)酶，它可以通過在含有果糖賴氨酸和/或FZL作氮源以及葡萄糖作碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生FAOD的鐮刀菌株而制備。FAOD可以在一種GL褐色培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生，這種培養(yǎng)通過將葡萄糖與賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸置于壓熱器中處理而獲得，但不是含經(jīng)過單獨(dú)壓熱處理的葡萄糖以及賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基。這表明此酶對(duì)阿瑪竇利化合物具有特異性。
2.反應(yīng)特異性和酶底物特異性本發(fā)明的FAOD對(duì)下式表示的反應(yīng)具有催化作用其中R1是一個(gè)醛糖殘基，R2是一個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)或肽的殘基。
在上反應(yīng)式中，用通式R1-CO-CH2-NH-R2表示的阿瑪竇利化合物，其中R1是-OH，-(CH2)n-或-[CH(OH)]n-CH2OH(n是0-6中的一個(gè)整數(shù))，R2是-CHR3-[CONHR3]mCOOH(R3是一個(gè)α-氨基酸的側(cè)鏈殘基，m是1-480中的一個(gè)整數(shù))是優(yōu)選的底物。其中，R3為從賴氨酸，多聚賴氨酸，纈氨酸，天冬氨酸等中選擇的一種氨基酸側(cè)鏈殘基，n為5-6，m≤55的化合物為更優(yōu)選的底物。
本發(fā)明FAOD的底物特異性顯示于表1中。
表1酶底物對(duì)純化的FAOD-L的特異性酶底物 濃度 特異性活性(％)Ne-果糖Nα-Z-賴氨酸1.67mM100果糖纈氨酸 1.67 30.1Ne-甲基-左旋-賴氨酸 1.67 N.D.*)Ne-果糖多聚-左旋-賴氨酸 0.02％0.24多聚-左旋-賴氨酸 0.02 N.D.
FBSA*20.17 N.D.
FHSA*30.17 N.D.
加有胰蛋白酶的FBSA 0.17 0.62加有胰蛋白酶的FHSA 0.17 N.D.
1)未測(cè)到
2)果糖牛血清白蛋白3)果糖人血清白蛋白從表1中可以明顯地看出本發(fā)明FAOD對(duì)FZL和果糖纈氨酸均有很高的特異性。FAOD對(duì)果糖多聚賴氨酸和糖化蛋白的蛋白酶水解產(chǎn)物具有活性。
表2中顯示能夠產(chǎn)生FAOD的鐮刀菌株的例子。
表2酶底物對(duì)從生長于FZL褐色培養(yǎng)基的鐮刀菌株中純化的FAOD的特異性特異性活性(10-2μ/mg蛋白)IFONO，尖孢鐮刀菌菌株果糖Nα-Z-賴氨酸 果糖纈氨酸 L/V1)4468甘薯菌株 3.76 0.22816.54471瓜類菌株 3.37 0.3409.95880亞麻菌株 48.6 13.5 3.66384黃瓜菌株 2.26 0.2349.77706蘋果菌株 4.86 0.27617.69964芹菌株 2.65 0.16915.79971松菌株 1.92 0.13813.931180 草莓菌株 25.2 2.27 11.11)對(duì)FZL的活性/對(duì)果糖纈氨酸的活性從表2中可以明顯地看出本發(fā)明FAOD對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸均有活性，這表明所述的FAOD還可用于糖化血紅蛋白的分析。
3.pH和溫度條件pH值條件的測(cè)量用pH值為4-13的多種緩沖液如0.1M磷酸鉀緩沖液(KPB)，鹽酸三羥甲基氨基甲烷緩沖液，甘氨酸(Gly)-NaOH緩沖液等取代常用緩沖液，在一個(gè)常規(guī)測(cè)定FAOD活性的反應(yīng)系統(tǒng)中(如在下面“4滴度評(píng)價(jià)”中所顯示的)完成酶反應(yīng)，以此來測(cè)定最佳pH值。
將FAOD加入上述多種緩沖液中并在通常條件下(30℃，pH8.0)保溫30℃10分鐘后，測(cè)量FAOD的活性，以此測(cè)定pH值穩(wěn)定性。
溫度條件的測(cè)量在20-60℃不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)量酶活性，以此測(cè)定最佳溫度。以通常條件下在酶溶液中保持活性為標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定溫度穩(wěn)定性，這種酶溶液可以通過將FAOD溶于0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.0)，并在20-60℃范圍的不同溫度下保溫10分鐘制備。
按照這些方法評(píng)價(jià)本發(fā)明的FAOD，它在pH為4.0-13.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，最佳pH為7.5-9.0，更優(yōu)選pH為8.5(見附圖2)。
在20-50℃下酶化反應(yīng)能有效進(jìn)行，優(yōu)選溫度為25-40℃，更優(yōu)選溫度為35℃(見附圖3)。本發(fā)明的FAOD在20-50℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定。
4.滴度評(píng)價(jià)滴定進(jìn)行如下(1)用比色法測(cè)定所產(chǎn)生的過氧化氫的方法A.測(cè)量產(chǎn)生率將已經(jīng)得到的FZL溶于蒸餾水中制備100mMFZL溶液。向100μl的45mM4-氨基安替比林，100μl的過氧化物酶(60U/ml)，100μl的60mM苯酚，1ml的0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.0)和50μl的酶溶液的混合物加蒸餾水，得到總體積為3.0ml。將此溶液在30℃下保溫2分鐘。加入50μl100mM FZL溶液后，測(cè)量在505nm下的吸光度的時(shí)間長度。按照所產(chǎn)生的醌顏料的摩爾吸光系數(shù)(5.16×103m-1cm-1)計(jì)算每分鐘所產(chǎn)生的過氧化氫的量(μmol)，所得的數(shù)值被作為酶活性的一個(gè)單位(U)。
B.終點(diǎn)方法按照上述方法A中的相同方法，制備一種溶液并將一種酶底物溶液加入其中。在30℃下保溫30分鐘后測(cè)量505nm下的吸光度。以所產(chǎn)生的過氧化氫的量為依據(jù)，參照用一種標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫溶液所獲得的校準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)酶活性。
(2)測(cè)定酶反應(yīng)氧吸收的方法向1ml 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和50μl的一種酶溶液的混合液中加蒸餾水，所得的總體積為3.0ml。在一個(gè)由Lank兄弟公司生產(chǎn)的氧電極槽中對(duì)所得溶液通電。在30℃下攪拌此溶液以使溶于其中的氧在此溫度達(dá)到平衡，并向溶液中加入100μ500mM FZL。然后用記錄器連續(xù)測(cè)量氧吸收度以獲得最初的速率。按照一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定一分鐘的氧吸收量，此氧吸收量被看成一個(gè)酶單位。
5.酶的抑制、活化和穩(wěn)定(1)金屬的影響向一種酶溶液中加一種溶液，此溶液為含有一種最終濃度為1mM的被測(cè)金屬離子的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，在30℃下保溫5分鐘后，評(píng)價(jià)酶活性，結(jié)果顯示于下表3中。
表3金屬離子對(duì)FAOD-L活性的影響金屬(1mM)特異性活性 金屬(1mM) 特異性活性(％) (％)無 100 FeSO493LiCl 99 CoSO4110KCl 104 CuCl235NaCl 109 ZnSO411RbCl 109 AgNO30CsCl 108 BaCl2116MgCl2103 HgCl20CaCl298 FeCl377MnCl2143從表3中可以明顯地看出本發(fā)明FAOD的活性被銅和鋅離子輕微抑制，被銀和汞離子完金抑制。
(2)多種抑制劑的影響用與上述(1)中基本類似的方法測(cè)定多種物質(zhì)的抑制作用。其中PCMB(對(duì)氯苯甲酸汞)的最終濃度為0.1mM，其它的最終濃度為1mM。結(jié)果顯示于表4中。將純化的FAOD對(duì)含2mM二硫蘇糖醇(DTT)的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)滲析一夜并測(cè)酶的活性，以此來確定其穩(wěn)定作用。
表4
多種抑制劑對(duì)FAOD活性的影響試劑(1mM) 特異性 試劑(1mM) 特異性活性(％) 活性(％)無 100氨基脲 96PCMB*10 苯肼49DTNB*20 肼 10碘乙酸 90羥基胺 17NaN3102 ClorgylineN.D*3α，α′-鄰聯(lián)吡啶 103n，α-二甲基-n-2-丙炔基苯乙胺104o-菲咯啉 114氨基胍 73*1PCMB，對(duì)氯苯甲酸汞*2DTNB，5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)*3未測(cè)到從表4中可以明顯看出FAOD的活性被PCMB，DTNB，肼和苯肼很強(qiáng)地抑制，這表明SH和/或羰基在酶反應(yīng)中具有重要作用。
用二硫蘇糖醇DTT可以穩(wěn)定此酶，含2mM DTT的50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.5)為本發(fā)明的優(yōu)選溶劑。
6.分子量分子量的測(cè)定用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)和Superdex 200pg上的凝膠過濾測(cè)定。
按照Davis方法用10％凝膠在40mA進(jìn)行SDS-PAGE三小時(shí)，并用考馬斯亮藍(lán)G-250給蛋白染色。通過用相同的方法對(duì)幾種標(biāo)準(zhǔn)已知蛋白如磷酸化酶B，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行電泳，獲得校準(zhǔn)曲線，以校準(zhǔn)曲線為依據(jù)確定其分子量。結(jié)果一個(gè)亞單位的分子量約為51,000(51KDa)。(見附圖4)Suprerdex 200pg上的凝膠過濾顯示FAOD的分子量約為106,000(106KDa)(見附圖5)，這表明本發(fā)明的FAOD是一個(gè)二聚物。
7.等電點(diǎn)FAOD的等電點(diǎn)(PI)為6.8，是用盤式聚焦電泳法測(cè)得的。
8.與已知酶的對(duì)照本發(fā)明的FaOD與來源于多種微生物的已知果糖氨基酸氧化酶進(jìn)行對(duì)照。
表5與來源于微生物的多種果糖氨基酸氧化酶的對(duì)照微生物亞麻鐮刀菌屬 棒狀桿菌1)曲霉菌2)尖孢菌(IF05880)分子量(凝膠過濾 106,000 88,00083,000(SDS-PAGE) 51,000 44,00043,000輔酶 共價(jià)結(jié)合的FAD 非共價(jià)結(jié)合的FAD 非共價(jià)結(jié)合的FAD酶底物的特異性(U/mg蛋白)(果糖賴氨酸)18.53)N.D.4)11.284)(果糖纈氨酸)6.837.09 59.8米氏常數(shù) 0.37mM(FZL) 0.74mM(Gly) 2.2mM(Gly)最佳pH 8.5 8.3 7.7最佳溫度(℃) 30～35 4040等電點(diǎn) 6.8 4.6 6.8用SH試劑滅活 滅活 未滅活 滅活1)T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(1)，103-110(1989)
2)T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(2)333-338(1991)3)對(duì)果糖Nα-Z-賴氨酸的特異活性4)對(duì)Ne-D-果糖Nα-甲酰賴氨酸的特活性從表5中可以明顯地看出，本發(fā)明的FAOD與來源于兩個(gè)菌株的其它酶存在以下區(qū)別。
(1)分子量本發(fā)明的FAOD的分子量明顯大于其它兩種酶的分子量。
(2)輔酶本發(fā)明的FAOD的輔酶是共價(jià)結(jié)合的FAD，而其它酶的輔酶是非共價(jià)結(jié)合的FAD。
(3)底物的特異性本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖賴氨酸的特異性比對(duì)果糖纈氨酸的特異性高，而來源于棒狀桿菌的酶對(duì)果糖賴氨酸沒有作用，來源于曲霉菌的酶對(duì)果糖賴氨酸的作用比對(duì)果糖纈氨酸的作用小。
(4)米氏常數(shù)米氏常數(shù)的不同表明本發(fā)明的FAOD對(duì)底物果糖賴氨酸的親合力大于其它酶對(duì)它的親合力。
(5)最佳pH，最佳溫度，等電點(diǎn)以及SH試劑對(duì)其的抑制資料表明本發(fā)明的FAOD與其它酶明顯不同。
如上所述，本發(fā)明的FAOD可用于阿瑪竇利化合物的測(cè)定。
因此，本發(fā)明提供了一種測(cè)定樣品中阿瑪竇利化合物的方法，這個(gè)方法包括將含阿瑪竇利化合物的樣品與本發(fā)明的FAOD接觸，并測(cè)定其耗氧量或過氯化氫的生成量。本發(fā)明以糖化蛋白量和/或糖化率的測(cè)定為依據(jù)，或以來源于活體的樣品中果糖胺的測(cè)定為依據(jù)進(jìn)行測(cè)定。
FAOD的酶活性用下反應(yīng)式表示其中R1是一個(gè)醛糖殘基，R2是一個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)或肽的殘基。
關(guān)于待測(cè)的樣品溶液，可以使用任何含有一種(或多種)阿瑪竇利化合物的溶液，例如來源于食品的如醬油。以及來源于活體的如血(例如全血、血漿或血清)和尿等等。
本發(fā)明的FAOD與含有一種阿瑪竇利化合物的樣品在一種適宜的緩沖液中反應(yīng)。雖然反應(yīng)混合物的適宜pH和溫度隨所用的酶和待測(cè)樣品的不同而變化，但它們有一個(gè)如上所述的范圍，那就是，pH為4.0-13.0，優(yōu)選8.5，溫度為20-50℃，優(yōu)選35℃。至于緩沖液，可以用Tris-HCl緩沖液。
用于測(cè)定的FAOD的量通常大于等于0.1單位/ml，如果使用的是終點(diǎn)方法，1-100單位/ml的量為優(yōu)選量。
本發(fā)明可以用如下所示的任一已知方法對(duì)阿瑪竇利化合物進(jìn)行測(cè)定。
(1)根據(jù)所產(chǎn)生的過氧化氫的量測(cè)定按照一種過氧化氫的測(cè)定方法，如比色方法或使用過氧化氫電極的方法，可以從所產(chǎn)生的過氧化氫量中推算樣品中阿瑪竇利化合物的量。根據(jù)一條關(guān)于過氧化氫量與阿瑪竇利化合物量的相關(guān)校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中阿瑪竇利化合物的量。特別是，用與“表4滴定的評(píng)價(jià)”中所述的類似方法進(jìn)行推算，這種方法除FAOD的量為1單位/ml和在測(cè)定所產(chǎn)生的過氧化氫量之前對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋外，其它都相似。
至于過氧化氫的顯色系統(tǒng)，可以使用任何由于一種色原與一種成色劑在過氧化物酶存在下發(fā)生氧化縮合而顯色的系統(tǒng)，色原如苯酚，成色劑如4-安替比林，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮。色原有苯酚衍生物，苯胺衍生物以及甲苯胺衍生物，例如N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，2，4-二氯苯酚，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺。也可應(yīng)用一種無色型顯色劑，它在過氧化物酶存在下依靠氧化作用顯色，這些無色型顯色劑在本領(lǐng)域中是已知的，它們的例子包括鄰聯(lián)(二)茴香胺，鄰聯(lián)甲苯胺，3，3-二氨基聯(lián)苯胺，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲基氨基)-聯(lián)二苯胺，10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪等。
(2)根據(jù)耗氧量測(cè)定應(yīng)用關(guān)于耗氧量和阿瑪竇利化合物數(shù)量間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，通過從反應(yīng)起始時(shí)的氧量中減去反應(yīng)完成時(shí)的氧量而計(jì)算出耗氧量來估計(jì)樣本中阿瑪竇利化合物的量。特別是，除了FAOD的量為1單位/ml以及在測(cè)定耗氧量之前對(duì)將加入的樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屚?，它可以按照類似于上面?.滴度評(píng)價(jià)”中所述的滴定法進(jìn)行測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法，對(duì)一種樣品溶液也可應(yīng)用此法，但最好對(duì)此樣品進(jìn)行預(yù)處理，以便在糖化蛋白中稀放出聯(lián)接有糖的賴氨酸和/或纈氨酸殘基。
為了這樣的目的，用一種蛋白酶(酶法)或諸如鹽酸等的化學(xué)物質(zhì)(化學(xué)法)處理此樣品，酶法為優(yōu)選方法。在此情況下，本領(lǐng)域中已知的內(nèi)、外型蛋白酶均可用于本發(fā)明方法。內(nèi)型蛋白酶的例子包括胰蛋白酶，2-糜蛋白酶，枯草溶菌素，蛋白酶K，木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B， 胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶XIV，賴氨酸肽鏈內(nèi)切酶，proleser和菠蘿蛋白酶F。外型蛋白酶的例子包括氨肽酶和羧肽酶。酶處理的方法也是已知的，例如，可進(jìn)行如下面實(shí)施例中所述的胰蛋白酶處理。
如上所述，本發(fā)明的FAOD對(duì)糖蛋白中的果糖賴氨酸具有高特異性。因此，可應(yīng)用于糖尿病狀態(tài)的診斷與控制，它包括測(cè)定血樣中的糖蛋白。另一方面，本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖纈氨酸具有特異性。因此，可用于糖化血紅蛋白的測(cè)定。
當(dāng)測(cè)定血液時(shí)(例如全血、血漿或血清)，來源于活體的血樣可按此法應(yīng)用，或者在諸如透析等預(yù)處理后應(yīng)用。
另外，用于本發(fā)明中的酶(例如FAOD，過氧化物酶等)可以液態(tài)形式使用或固定于適宜的固體支持劑后使用。例如，可使用一種填充有固定于顆粒的酶的柱獲得一種測(cè)定糖化蛋白等的自動(dòng)裝置，這種裝置能提高諸如臨床檢驗(yàn)的常規(guī)測(cè)定的有效率，其中許多樣品必須快速準(zhǔn)確地測(cè)定。因這種固定酶可反復(fù)使用，所以它在經(jīng)濟(jì)效益方面還有另一種優(yōu)勢(shì)。
而且，以一種適宜的方式將一種(或多種)酶與一種(或多種)顯色劑結(jié)合，有可能提供一種試劑盒。此試劑盒可用于阿瑪竇利化合物的臨床檢測(cè)和食品分析。
可以用本領(lǐng)域中的已知方法進(jìn)行酶的固定。例如，通過載體結(jié)合方法，交聯(lián)方法，包合方法，配位方法等等。載體的例子包括聚合物凝膠，微膠囊，瓊脂糖，藻酸，角叉膠等。按照本領(lǐng)域中的已知方法，可以通過共價(jià)鍵，離子鍵，物理吸收，生物化學(xué)親合等將酶結(jié)合于載體。
使用固定酶時(shí)，測(cè)定可在流動(dòng)或批量系統(tǒng)中進(jìn)行。如上所述，此固定酶特別適用于血樣中糖蛋白的常規(guī)檢測(cè)(臨床檢驗(yàn))。
當(dāng)此臨床檢驗(yàn)用于指導(dǎo)糖尿病的診斷時(shí)，作為糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果用果糖胺值，糖蛋白濃度或糖化率表示，其糖化率指血樣中糖蛋白濃度與全部蛋白濃度的比率。全部蛋白濃度可用常規(guī)方法測(cè)定，例如通過280nm吸光度測(cè)定法，布來得福特法，洛里法，子彈法，白蛋白天然熒光，或血紅蛋白吸光度等方法。
本發(fā)明還提供了一種用于阿瑪竇利化合物測(cè)定的試劑或試劑盒，它由本發(fā)明的FAOD和一種緩沖液組成，此緩沖液的優(yōu)選pH值為7.5-8.5，最佳pH值為8.0。固定FAOD時(shí)，固體支持劑可從聚合物凝膠等中選擇，而且優(yōu)選藻酸。
在終點(diǎn)測(cè)定中，對(duì)一個(gè)樣品的試劑通常含有1-100單位/ml的FAOD，而且以Tris-HCl(pH8.0)作為緩沖液。
當(dāng)根據(jù)所產(chǎn)生的過氧化氫測(cè)定阿瑪竇利化合物時(shí)，任何如上“(1)根據(jù)所產(chǎn)生的過氧化氫的量測(cè)定”所述的因氧化縮合反應(yīng)而顯色的顯色系統(tǒng)，無色型顯色劑等等均可使用。
可將此用于本發(fā)明阿瑪竇利化合物測(cè)定的試劑與一種適宜的顯色劑結(jié)合，連同顯色標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一起制成試劑盒，用于初步診斷和檢查。
如上所述的試劑或試劑盒可用于來源于活體的樣品的糖蛋白量和/或糖化率的測(cè)定或果糖胺的測(cè)定。
從上述內(nèi)容可明顯地看出本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸均有特異性，其中對(duì)前者的特異性更大，在底物的特異性等方面與已有的類似果糖氨基酸氧化酶不同。因此，本發(fā)明的FAOD可用于開發(fā)新的臨床檢測(cè)方法和食品分析方法。因而，它對(duì)糖尿病的診斷和食品的質(zhì)量控制有很大幫助。特別是，可用于糖尿病的診斷，其中血中糖蛋白量和/或糖化率或果糖胺值可作為診斷或控制糖尿病狀態(tài)的指標(biāo)?，F(xiàn)在通過使用本發(fā)明的一種用于測(cè)定阿瑪竇利化合物的試劑的方法，使準(zhǔn)確有效地確定糖蛋白成為可能，這可以促進(jìn)糖尿病狀態(tài)的診斷或控制。
附圖1是說明培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)基所產(chǎn)生的FAOD量之間關(guān)系的圖表。
附圖2是說明溶劑中pH值與FAOD活性之間關(guān)系的圖表。
附圖3是說明溶劑中溫度與FAOD活性之間關(guān)系的圖表。
附圖4顯示通過對(duì)純化FAOD進(jìn)行SDS-PAGE而獲得的移動(dòng)方法。
附圖5是顯示通過Superdex 200pg上的凝膠過濾測(cè)定FAOD-L分子量的圖表。
附圖6顯示純化FAOD-L的吸收光譜附圖7是說明作為一種底物的糖化人血清白蛋白的濃度與由于FAOD作用而產(chǎn)生的過氧化氫的量之間關(guān)系的圖表。
附圖8是說明人血清白蛋白的糖化率與由于FAOD作用而產(chǎn)生的過氧化氫量之間關(guān)系的圖表。
附圖9是說明糖化血紅蛋白的濃度與由于FAOD作用而產(chǎn)生的過氧化氫量之間關(guān)系的圖表。
下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但并不將本發(fā)明限于其范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 亞麻鐮刀菌屬尖孢菌株的發(fā)酵和FAOD-L的純化1)發(fā)酵將亞麻鐮刀菌屬尖孢菌株(IFO第5880)培植于含有O.5％FZL，1.0％葡萄糖，0.1％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.2％酵母抽提物的一種培養(yǎng)基中，并且在28℃下培養(yǎng)80小時(shí)，同時(shí)用一個(gè)發(fā)酵桶進(jìn)行通氣(2升/分鐘)和攪拌(400轉(zhuǎn)/分鐘)。過濾培養(yǎng)物獲得菌絲。
2)粗提液的制備將一部分菌絲(270g濕重)懸浮于含2mM DTT的0.1M Tris-HCl緩沖液中(pH值8.5，800ml)，并且用Dino-Mill進(jìn)行研磨，將研磨混合物以9,500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘以獲得作為粗提液的上清液(無胞提取液)，然后對(duì)其進(jìn)行純化。
3)純化第一步硫酸銨分餾將粗提液加入硫酸銨達(dá)到40％飽和度，將混合物進(jìn)行12,000轉(zhuǎn)/分鐘的離心，保持4℃，以去除沉淀物。向上清液中加入硫酸銨達(dá)到75％飽和度，并且分離沉淀物。
第二步疏水性層析(分批法)將從上面第一步中獲得的沉淀物溶于含2mM DTT的50mM Tris-HCl(pH8.5)(此后稱為“緩沖液A”)中。加入含有40％硫酸銨的同體積的緩沖液A后，將丁基-Toyopearl樹脂(200ml)加入粗提物的溶液以進(jìn)行吸附。用緩沖液A通過分批法進(jìn)行洗脫。用硫酸銨濃縮活性餾分。
第三步疏水性柱層析將從上面第二步中獲得的濃縮液在用含25％飽和度硫酸銨的緩沖液A平衡過的苯基-Toyopearl柱上吸附。用相同的緩沖液沖洗后，在25-0％飽和度硫酸銨的線性梯度下進(jìn)行洗脫。收集活性餾份并用硫酸銨濃縮，所得的濃縮液在下一步中使用。
第四步疏水性層析(柱方法)將從上面第三步中獲得的濃縮液用含40％飽和度硫酸銨的緩沖液A平衡過的丁基-Toyopearl柱上吸附，用相同的緩沖液沖洗柱。在40-0％飽和度硫酸銨的線性梯度下進(jìn)行洗脫，得到活性餾分。
第五步離子交換柱層析然后，將從上面第四步中獲得的活性餾分加于用緩沖液A平衡過的DEAE-Toyopearl柱上。在收集并用硫酸銨濃縮的沖洗餾分中檢測(cè)FAOD活性。所得的濃縮液在下一步中使用。
第六步凝膠過濾作為最后一步，用含有0.1M NaCl和2mM DTT的0.1M Tris-HCl緩沖液平衡過的sephacryl 300完成凝膠過濾，以得到一種70-100單位的酶制劑。
此純化酶的紫外吸收光譜顯示于附圖6中，它表明此酶是一種黃素酶。
通過SDS-PAGE(十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)和Superdex 200pg上的凝膠過濾確定此純化酶的分子量。
按照Davis法用10％凝膠在40mA下進(jìn)行SDS-PAGE三小時(shí)。用考馬斯亮藍(lán)G-250給蛋白染色。用一條通過用相同方法對(duì)如磷酸化酶B，牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白，磷酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行電泳所獲得的校準(zhǔn)曲線，推算其分子量。SDS-PAGE顯示此純化酶的亞單位的分子量約為51,000(51KDa)(見附圖4)。
用含有0.1M NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.5)進(jìn)行凝膠過濾，顯示其分子量約為106,000(106KDa)，此見于附圖5中。
另外，在實(shí)施例1中制備的FAOD-L顯示出如前所述相同的與酶活性、最佳pH值和溫度，pH值和溫度的穩(wěn)定性，金屬和抑制劑的影響等相關(guān)的數(shù)值和理化特性。
實(shí)施例2 糖化人白蛋白量的測(cè)定通過將糖化人血清白蛋白(Sigma)溶解于0.9％NaCl溶液中，制備一組濃度為0-10％之間不等的糖化人白蛋白溶液。用這些溶液按下面的方法進(jìn)行測(cè)定。
1)蛋白酶處理將一種糖化白蛋白溶液(60μl)和12.5mg/ml蛋白酶XIV(Sigma)溶液(60μl)的混合物在37℃下保溫30分鐘。然后在約90℃下給此混合物加熱5分鐘以終止反應(yīng)。
2)活性測(cè)定FAOD反應(yīng)混合物由下列試劑制備45mM 4-氨基安替此林溶液30μl60mM N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺溶液30μl過氧化物酶溶液(60單位/ml)30μl0.1M tris-HCl緩沖液(pH8.0)300μlFAOD-L溶液(6單位/ml)50μl混合這些試劑后，用蒸餾水將總體積調(diào)到1ml。通過用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋由實(shí)施例1獲得的純化FAOD-L，制備FAOD-L溶液(6單位/ml)。將FAOD反應(yīng)混合物在30℃下保溫2分鐘后，向其中加入每種經(jīng)蛋白酶處理的溶液(100μl)。然后，測(cè)量其30分鐘后555nm下的吸光度，以評(píng)價(jià)糖化白蛋白濃度與吸光度間的關(guān)系。其結(jié)果顯示于附圖7中，其中縱坐標(biāo)表示555nm下的吸光度，它與所產(chǎn)生的過氧化氫的量相對(duì)應(yīng)，橫坐標(biāo)表示糖化白蛋白濃度。附圖7表明糖化白蛋白的濃度與過氧化氫的量是相互關(guān)聯(lián)的。
實(shí)施例3人血清白蛋白糖化率的測(cè)定將糖化人血清白蛋白(sigmaCo.)(150mg)和人血清白蛋白(Sigma Co.)(150mg)分別溶于0.9％NaCl溶液中(3ml)。將這些溶液合并以制備不同糖化率的溶液，用一種糖化白蛋白自動(dòng)測(cè)定裝置(kyoto Daiichi KagakuCo.Ltd.)測(cè)定其糖化率。測(cè)定顯示其糖化率為24.6-61.1％。用這些溶液按下面的方法進(jìn)行測(cè)定。
1)蛋白酶處理將一種糖化白蛋白溶液(60μl)和12.5mg/ml蛋白酶XIV(Sigma)溶液(60μl)的混合物在37℃下保溫30分鐘。然后在約90℃下給此混合物加熱5分鐘以終止反應(yīng)。
2)活性測(cè)定FAOD反應(yīng)混合物由下列試劑制備45mM 4-氨基安替比林溶液30μl60mM N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺溶液30μl過氧化物酶溶液(60單位/ml)30μl0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)300μlFAOD-L溶液(6單位/ml)50μl
混合這些試劑后，用蒸餾水將總體積調(diào)到1ml。通過用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋由實(shí)施例1獲得的純化FAOD-L，制備FAOD-L溶液(6單位/ml)。
將FAOD反應(yīng)混合物在30℃下保溫2分鐘后，向其中加入每種經(jīng)蛋白酶處理的溶液(100μl)，然后，測(cè)量其30分鐘后555nm下的吸光度，以評(píng)價(jià)白蛋白糖化率與吸光度之間的關(guān)系。其結(jié)果顯示于附圖8中，其中縱坐標(biāo)表示555nm下的吸光度，它與所產(chǎn)生的過氧化氫的量相對(duì)應(yīng)，橫坐標(biāo)表示白蛋白的糖化率。附圖8表明白蛋白的糖化率與過氧化氫的量是相互關(guān)聯(lián)的。
實(shí)施例4 糖化血紅蛋白水平的測(cè)定通過將糖化血紅蛋白對(duì)照物(Sigma)溶于蒸餾水中，制備一組0-35％不同濃度的糖化血紅蛋白溶液。用這些溶液按下面的方法的進(jìn)行測(cè)定。
1)蛋白酶處理將一種糖化血紅蛋白溶液(25μl)，500單位/ml氨肽酶溶液(5μl)和0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)的混合液，在30℃下保溫30分鐘，向其中加入10％三氯乙酸(50μl)并攪拌。此混合物在0℃下靜置30分鐘后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。用約50μl 2M NaOH中和此上清液。
2)活性測(cè)定FAOD反應(yīng)混合物由下列試劑制備
3mM N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲氨)二苯胺溶液30μl過氧化物酶溶液(60單位/ml)30μl0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)300μlFAOD-L溶液(4單位/ml)10μl混合這些試劑后，用蒸餾水將總體積調(diào)到1ml。通過用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋由實(shí)施例1獲得的純化FAOD-L，制備FAOD-L溶液(4單位/ml)。將FAOD反應(yīng)混合物在30℃下保溫2分鐘后，向其中加入每種經(jīng)蛋白酶處理的溶液(80μl)。然后，測(cè)量其30分鐘后727nm下的吸光度，以評(píng)價(jià)糖化血紅蛋白濃度與吸光度間的關(guān)系。其結(jié)果顯示于附圖9中，其中縱坐標(biāo)表示727nm下的吸光度，它與所產(chǎn)生的過氧化氫的量相對(duì)應(yīng)，橫坐標(biāo)表示糖化血紅蛋白濃度。附圖9表明，糖化血紅蛋白的濃度與過氧化氫的量是相互關(guān)聯(lián)的。
權(quán)利要求
1.一種果糖氨基酸氧化酶，它對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸均有活性，并且通過一種含果糖賴氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)一種能產(chǎn)生果糖氨基酸氧化酶的鐮刀菌屬菌株產(chǎn)生。
2.如權(quán)利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶，它對(duì)果糖賴氨酸的活性高于或等于對(duì)果糖纈氨酸的活性。
3.如權(quán)利要求1的所述的果糖氨基酸氧化酶，其中含果糖賴氨酸的培養(yǎng)基含有經(jīng)100-150℃下葡萄糖與賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸在壓熱器中共同處理3-60分鐘而獲得的果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶，其中鐮刀菌屬的菌株可從亞麻尖孢鐮孢(IFO NO.5880)，甘薯尖孢鐮孢(IFO NO.4468)，瓜類尖孢鐮孢(IFONO.4471)，黃瓜尖孢鐮孢(IFO NO.6384)，蘋果尖孢鐮孢(IFO NO.7706)，芹尖孢鐮孢(9964)，松尖孢鐮孢(IFO NO.9971)和草霉尖孢鐮孢(IFO NO.31180)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的果糖氨基酸氧化酶，其特征在于具有以下理化特性1)能夠在有氧存在下催化阿瑪竇利(amadori)化合物氧化，產(chǎn)生α-酮醛、胺的衍生物和過氧化氫；2)在pH約4.0-13.0的范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定，其最佳pH為8.5；3)在溫度約20-50℃的范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定，其最佳溫度為30-35℃；以及4)通過Superdex 200pg凝膠過濾估計(jì)其分子量約為106,000(106KDa)。
6.一種如權(quán)利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶的生產(chǎn)方法，它包括在含任意保護(hù)的果糖氨基酸和/或糖化蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種霉菌。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中將一種能產(chǎn)生果糖氨基酸氧化酶的鐮刀菌屬菌株在一種含果糖賴氨酸和/或果糖Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并從所得培養(yǎng)物中回收果糖氨基酸氧化酶。
8.一種含阿瑪竇利化合物樣品中阿瑪竇利化合物的測(cè)定方法，包括將一種如權(quán)利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶接觸樣品和測(cè)其耗氧量或所產(chǎn)生的過氧化氫量。
9.如權(quán)利要求8所述的測(cè)定方法，其中樣品來源于活體，阿瑪竇利化合物的測(cè)定按樣品中糖化蛋白量和/或糖化率的測(cè)定或者果糖胺的測(cè)定進(jìn)行。
10.一種用于測(cè)定阿瑪竇利化合物的試劑或試劑盒，它包括如權(quán)利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑或試劑盒，它可用于測(cè)定來源于活體樣品中的糖化蛋白量和/或糖化率，或者果糖胺。
全文摘要
提供了一種來源于鐮刀菌屬，對(duì)果糖賴氨酸和果糖纈氨酸均有活性的新的果糖氨基酸氧化酶，一種生產(chǎn)此酶的方法，以及一種用此酶，測(cè)定阿瑪竇利化合物的方法，含此酶的試劑或試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1161374SQ9610730
公開日1997年10月8日 申請(qǐng)日期1996年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月3日
發(fā)明者加藤暢夫, 阪井康能, 谷吉樹, 酒井敏克, 石丸香 申請(qǐng)人:株式會(huì)社京都第一科學(xué)