專利名稱：果糖基氨基酸氧化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于試劑盒和傳感器中的果糖基氨基酸氧化酶(也稱作果糖基胺氧化酶)，所述試劑盒和傳感器用于測(cè)量糖化的蛋白，諸如糖化的白蛋白、果糖基肽、HbAlC和果糖基纈氨酸(FV)。更具體地，本發(fā)明涉及具有降低的氧化酶活性的突變型果糖基氨基酸氧化酶。
背景技術(shù)：
糖化的蛋白經(jīng)由蛋白上的氨基和糖的還原末端之間的共價(jià)鍵非酶促地產(chǎn)生，也稱作阿馬多里(Amadori)化合物。在血液中，葡萄糖會(huì)結(jié)合在血紅蛋白的β-鏈的N-端處的纈氨酸，生成糖化的血紅蛋白(糖血紅蛋白；HbAlc)。與正常健康個(gè)體相比，在遭受糖尿病的患者中，HbAlc與血紅蛋白的豐度比更高，且已知血液中HbAlc的濃度會(huì)反映過去幾周的血糖水平。因而，在糖尿病診斷的臨床試驗(yàn)中，和在遭受糖尿病的患者的血糖控制中，血液中HbAlc的濃度是非常重要的。使用對(duì)果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸具有特異性的酶，可以測(cè)量血液中的HbAlc濃度。已經(jīng)從不同種類的菌株中分離出果糖基氨基酸氧化酶，且已經(jīng)證實(shí)，使用這樣的酶，可以分析糖化的蛋白，諸如糖化的白蛋白、HbAlc和果糖基氨基酸(JP A 61-268, 178; JP A 61-280,297; JP A 03-155, 780; JP A 05-192, 193; JP A 07-289,253; JP A 08-154,672; JP A 2001-95598; JP A 2003-79386; JP A 2003-235585; Agric. Biol. Chem. , 53(1)，103-110，1989; Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338，1991; J. Biol. Chem. , 269 (44), 27297-27301，1994; App 1. Environ. Microbiol., 61(12)， 4487-4489，1995; BioscL Biotech. Biochem., 59(3)，487-491，1995; J. Biol. Chem. , 270(1)，218-224，1995; J. Biol. Chem. , 271(51)，32803-32809，1996;和7； Biol. Chem.，272 (6)，3437-3443，1997)。果糖基氨基酸氧化酶是一種FAD-依賴性的酶，該酶催化這樣的反應(yīng)其中氧化果糖基氨基酸，以產(chǎn)生2-酮-D-葡萄糖和對(duì)應(yīng)的氨基酸，并產(chǎn)生FAD的還原形式(FADH2)。 FADH2又將電子傳遞給電子受體，并轉(zhuǎn)化成它的氧化形式。在有氧存在下，F(xiàn)ADH2優(yōu)先將電子傳遞給氧分子，而不是人造電子受體(也稱作介質(zhì)或電子介質(zhì))。因而，當(dāng)通過含有介質(zhì)的果糖基氨基酸氧化酶測(cè)定果糖基氨基酸時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中的溶解氧水平會(huì)極大地影響測(cè)定結(jié)果。在使用人造電子受體的護(hù)理點(diǎn)檢驗(yàn)裝置對(duì)血液樣品的臨床試驗(yàn)中，這樣的缺點(diǎn)是特別顯著的。在采用人造電子介質(zhì)的酶?jìng)鞲衅鳁l帶中使用的酶理想地具有對(duì)氧的低活性。因此，本發(fā)明的目的是，提供一種酶，具體地是果糖基氨基酸氧化酶，其活性更少地受到溶解氧水平的影響。

發(fā)明內(nèi)容
概括地講，本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)能夠提供一種酶，具體地是果糖基氨基酸氧化酶， 其活性更少地受到溶解氧水平的影響。更具體地，這已經(jīng)如下實(shí)現(xiàn)降低在它的野生型形式主要顯示出氧化酶活性的酶的氧化酶活性，并優(yōu)選地，同時(shí)增加該酶的脫氫酶活性。如下面將更詳細(xì)地描述的，這已經(jīng)通過突變野生型酶來實(shí)現(xiàn)。發(fā)明人已經(jīng)制備了果糖基氨基酸氧化酶的不同突變體，并令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，特定類型的突變體會(huì)表現(xiàn)出降低的氧化酶活性，同時(shí)基本上保留脫氫酶活性，尤其是染料-介導(dǎo)的脫氫酶活性。本發(fā)明提供了突變型果糖基氨基酸氧化酶，其通過用選自Ala、Cys、W^MetJer 和Val的氨基酸殘基置換氨基酸殘基Asn而在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56 的對(duì)應(yīng)位置處被修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比降低的氧化酶活性，并優(yōu)選地具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脫氫酶活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的30%或更少的氧化酶活性，并優(yōu)選地也具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脫氫酶活性的50%或更多的脫氫酶活性。也優(yōu)選地，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脫氫酶活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有選自SEQ ID NO: 1-16的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的對(duì)應(yīng)位置處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、CyS、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。優(yōu)選地， 本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列，其中在位置56處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、CyS、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。更優(yōu)選地，在SEQ ID NO: 1的位置109-124處的氨基酸序列kr Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置換Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。也優(yōu)選地，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID N0: 2中所述的氨基酸序列，其中在位置47處的氨基酸殘基Asn 被選自Ala、CyS、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。也優(yōu)選地，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID N0: 3中所述的氨基酸序列，其中在位置52處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、CyS、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。也優(yōu)選地，本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID N0: 7中所述的氨基酸序列，其中在位置56處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。更優(yōu)選地，在SEQ ID N0: 7 的位置61-72處的氨基酸序列 lie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser 被下述序列置換:Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的突變型果糖基氨基酸氧化酶。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含本發(fā)明的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白的方法，所述方法包括使所述樣品接觸本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶，并測(cè)量被果糖基氨基酸氧化酶氧化的糖化蛋白的量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定HbAlc的方法，所述方法包括消化樣品中的HbAlc，以產(chǎn)生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸，使所述果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸接觸本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶，并測(cè)量氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸的量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定樣品中的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、HbAlc或果糖基六肽的裝置，所述裝置包含本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶，和電子傳遞介質(zhì)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定樣品中的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、HbAlc或果糖基六肽的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶，和電子傳遞介質(zhì)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種酶電極，其具有固定化在所述電極上的本發(fā)明
的果糖基氨基酸氧化酶。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、 HbAlc或果糖基六肽的酶?jìng)鞲衅?，所述酶?jìng)鞲衅靼景l(fā)明的酶電極作為工作電極。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置61-72處的氨基酸序列Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala被下述序列置換:Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser0在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-1 處的氨基酸序列kr Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置換:Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有在SEQ ID N0: 7中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID N0: 7的位置61-72處的氨基酸序列l(wèi)ie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser被下述序列置換:Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有在SEQ ID N0: 7中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-1 處的氨基酸序列Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala 被下述序列置換:Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu0


圖1顯示了在一些真核FAOD的N-端附近的氨基酸序列的比對(duì)。圖2顯示了果糖基氨基酸氧化酶的反應(yīng)系統(tǒng)。圖3顯示了純化的m-1 FAOD N47A突變體的氧化酶和脫氫酶活性。圖4顯示了粗的PnFPOX野生型和Asn56突變體的氧化酶和脫氫酶活性。圖5顯示了 PnFPOX Asn56突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。圖6顯示了純化的PnFPOX N56A突變體的氧化酶和脫氫酶活性。圖7顯示了純化的阿馬多里酶II野生型和N52A突變體的氧化酶和脫氫酶活性。圖8顯示了純化的阿馬多里酶II野生型和N52A突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。圖9顯示了使用具有PnFPOX N56A或野生型FAOD的電極測(cè)定FV濃度。
具體實(shí)施方式
已知果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)存在于多種真核和原核菌株中。表1顯示了迄今為止分離或預(yù)測(cè)的FAOD的一些實(shí)例。表1不同的FAOD
權(quán)利要求
1.一種突變型果糖基氨基酸氧化酶，其通過用選自Ala、CyS、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換氨基酸殘基Asn而在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的對(duì)應(yīng)位置處被修飾。
2.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比降低的氧化酶活性，且具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脫氫酶活性。
3.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的30%或更少的氧化酶活性，且具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脫氫酶活性的50%或更多的脫氫酶活性。
4.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有與野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脫氫酶活性。
5.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有選自SEQID NO: 1-12的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的對(duì)應(yīng)位置處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。
6.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQID NO: 1中所述的氨基酸序列，其中在位置56處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys, Phe, Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。
7.如權(quán)利要求6所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQID NO: 1的位置 109-124 處的氨基酸序列Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu 被下述序列置換Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。
8.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQID NO: 2中所述的氨基酸序列，其中在位置47處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys, Phe, Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。
9.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQID NO: 3中所述的氨基酸序列，其中在位置52處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys, Phe, Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。
10.如權(quán)利要求1所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQID N0: 7中所述的氨基酸序列，其中在位置56處的氨基酸殘基Asn被選自Ala、Cys, Phe, Met、Ser和Val的氨基酸殘基置換。
11.如權(quán)利要求10所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQID N0: 7的位置 61-72處的氨基酸序列 lie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser被下述序列置換:Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。
12.—種分離的多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的突變型果糖基氨基酸氧化酶。
13.—種載體，其包含如權(quán)利要求12所述的多核苷酸。
14.一種用如權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
15.一種用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白的方法，所述方法包括使所述樣品接觸如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的果糖基氨基酸氧化酶，并測(cè)量被果糖基氨基酸氧化酶氧化的糖化蛋白的量。
16.一種用于測(cè)定HbAlc的方法，所述方法包括消化樣品中的HbAlc，以產(chǎn)生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸，使所述果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸接觸如權(quán)利要求 1-11中任一項(xiàng)所述的果糖基氨基酸氧化酶，并測(cè)量氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸的量。
17.一種用于測(cè)定樣品中的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、HbAlc或果糖基六肽的裝置，所述裝置包含如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的果糖基氨基酸氧化酶，和電子傳遞介質(zhì)。
18.一種用于測(cè)定樣品中的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、HbAlc或果糖基六肽的試劑盒，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的果糖基氨基酸氧化酶，和電子傳遞介質(zhì)。
19.一種酶電極，其具有固定化在所述電極上的如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的果糖基氨基酸氧化酶。
20.一種用于測(cè)定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、HbAlc或果糖基六肽的酶?jìng)鞲衅鳎雒競(jìng)鞲衅靼鐧?quán)利要求19所述的酶電極作為工作電極。
21.具有在SEQID NO: 1中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在 SEQ ID NO: 1 的位置 61-72 處的氨基酸序列Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala 被下述序列置換:Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser0
22.具有在SEQID NO: 1中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在 SEQ ID NO: 1 的位置 109-124 處的氨基酸序列kr Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置換Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。
23.具有在SEQID NO: 7中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在 SEQ ID NO: 7 的位置 61-72 處的氨基酸序列l(wèi)ie Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser 被下述序列置換:Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。
24.具有在SEQID NO: 7中所述的氨基酸序列的突變型果糖基氨基酸氧化酶，其中在 SEQ ID NO: 1 的位置 109-126 處的氨基酸序列Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala被下述序列置換Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu0
全文摘要
公開了突變型果糖基氨基酸氧化酶，其在參與質(zhì)子傳遞系統(tǒng)的氨基酸殘基處被修飾。所述突變型果糖基氨基酸氧化酶具有降低的氧化酶活性，同時(shí)基本上保留它的脫氫酶活性。本發(fā)明也提供了用于測(cè)量糖化蛋白的測(cè)定裝置和測(cè)定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK102471763SQ201080034342
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者伊克布庫羅 K., 索德 K. 申請(qǐng)人:究極酵素國際股份有限公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司