專利名稱：果糖基氨基酸氧化酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的果糖基氨基酸氧化酶。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種來(lái)自青霉屬的新的果糖基氨基酸氧化酶、一種生產(chǎn)該酶的方法、一種使用該酶的amadori化合物的分析方法和一種含有該酶的試劑或試劑盒。
當(dāng)反應(yīng)性物質(zhì)(如具有氨基的蛋白質(zhì)，肽和氨基酸)與還原性糖(如具有醛基的醛糖)共存時(shí)，它們通過(guò)氨基和醛基發(fā)生非酶促且不可逆的化合，接著經(jīng)amadori重排形成amadori化合物。由于amadori化合物的產(chǎn)率是反應(yīng)物濃度，接觸時(shí)間，溫度和類似條件的函數(shù)，因此對(duì)樣品中amadori化合物的測(cè)定提供了有關(guān)該樣品的有用信息。一般含有amadori化合物的物質(zhì)的例子包括食品(如醬油)和體液(如血液)。
在活體內(nèi)，通過(guò)葡萄糖與各種氨基酸之間的糖化反應(yīng)形成果糖基胺。例如，血液中血紅蛋白和清蛋白的糖化產(chǎn)物分別稱為糖化血紅蛋白和糖化清蛋白。術(shù)語(yǔ)“果糖胺”涉及在堿性溶液中果糖基胺作為還原劑起作用的能力。由于血液中這些糖化衍生物的濃度反映了在一段特定的時(shí)期內(nèi)的平均血糖水平，因此它可用作診斷和控制糖尿病的明顯指標(biāo)。因此，在血液中測(cè)量amadori化合物的方法的建立在臨床上是有用的。
而且，可根據(jù)食品中amadori化合物的量估計(jì)保存的狀態(tài)和食品生產(chǎn)后的期限。因此，測(cè)量amadori化合物的方法對(duì)食品質(zhì)量的控制也有用。
正如上面舉例說(shuō)明的，amadori化合物試驗(yàn)在涉及醫(yī)藥和食品的寬范圍的領(lǐng)域中是有用的。
amadori化合物試驗(yàn)的例子包括利用高效液相色譜[Chromatogr.Sci.106579(1979)]，用附著有硼酸的固體物質(zhì)填充的柱[Clin.chem，282088-2094(1982)]，電泳[Clin.Chem.261598-1602(1980)]或抗原-抗體反應(yīng)[JJCLA 18620(1993)，J.Clin.Lab.Inst.Reag.1633-37(1993)]的方法，測(cè)量果糖胺總量的方法[Clin.chim.Acta12787-95(1982)]，用硫代巴比土酸氧化后的比色測(cè)定法[Clin.Chim.Acta 112197-204(1981)]，或類似方法。然而這些現(xiàn)存的方法需要昂貴的裝置并且未必足夠精確和快速。
在臨床試驗(yàn)和食品分析領(lǐng)域中，利用酶促過(guò)程的方法變得越來(lái)越普遍，這是因?yàn)?，由于酶的特?在底物、反應(yīng)、結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)等方面的特異性)，待分析物質(zhì)可被精確和快速選擇性地分析。
已提供的試驗(yàn)包含將氧化還原酶與amadori化合物反應(yīng)并測(cè)定氧的消耗或過(guò)氧化氫的產(chǎn)生作為amadori化合物總量的指標(biāo)(例如，日本專利(KOKOKU)5-33997和6-65300，日本專利公開(kāi)2-195900，3-155780，4-4874，5-192193，6-46846和7-289253)，而且已建議將糖化蛋白質(zhì)試驗(yàn)用于診斷糖尿病(日本專利公開(kāi)2-195899，2-195900，5-192193，6-46846和7-289253)。
由氧化還原酶催化的amadori化合物的分解可用下列反應(yīng)式代表
其中R1是醛糖殘基，R2是氨基酸，蛋白質(zhì)或肽殘基。
催化上面反應(yīng)的酶的例子如下1.來(lái)自棒狀桿菌屬(日本專利5-33997和6-65300)或曲霉屬(日本專利公開(kāi)3-155780)的果糖基氨基酸氧化酶；2.來(lái)自假絲酵母屬的果糖基胺去糖基酶(日本專利公開(kāi)6-46846)；3.來(lái)自青霉屬的果糖基氨基酸去糖基酶(日本專利公開(kāi)4-4874)；4.來(lái)自棒狀桿菌屬，鐮孢屬，支頂孢屬或德巴利氏酵母屬的酮胺氧化酶(日本專利公開(kāi)5-192193)；5.可根據(jù)J.Biol.Chem.，Vol.239，PP.3790-3796(1964)所述的方法制備烷基賴氨酸酶。
然而，涉及這些現(xiàn)存的酶的試驗(yàn)有缺陷。
例如，血液中糖尿病診斷的指標(biāo)有糖基化的清蛋白，糖基化的血紅蛋白和果糖胺。當(dāng)葡萄糖結(jié)合到蛋白質(zhì)分子賴氨酸殘基的ε-位時(shí)形成糖基化的白蛋白[J.Biol.Chem.，26113542-13545(1986)]。至于糖基化的血紅蛋白，葡萄糖也結(jié)合到β-鏈N端的纈氨酸上[J.Biol.Chem.2543892-3898(1979)]。因此，需要使用對(duì)果糖基纈氨酸及對(duì)果糖基賴氨酸具有高度特異性的酶來(lái)測(cè)定糖基化的蛋白質(zhì)以作糖尿病的有效指標(biāo)。然而，來(lái)自棒狀桿菌屬的酶不能作用于果糖基賴氨酸。至于來(lái)自曲霉屬的酶，它對(duì)糖基化蛋白質(zhì)或其水解產(chǎn)物的作用尚不清楚。盡管在日本專利公開(kāi)5-192193中描述的酮胺氧化酶與果糖基纈氨酸反應(yīng)，但它不能用于賴氨酸殘基結(jié)合到糖上的糖基化蛋白質(zhì)的精確分析。由于果糖基胺去糖基酶對(duì)二果糖基賴氨酸具有高度特異性，因此它不能用于對(duì)其中賴氨酸殘基在ε-位糖基化或纈氨酸殘基糖基化的物質(zhì)具有特異性的試驗(yàn)。另外，使用烷基賴氨酸酶的方法不可靠或不精確，因?yàn)樗f(shuō)的酶缺乏特異性且即使賴氨酸殘基結(jié)合到非糖部分上時(shí)也與物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。來(lái)自青霉屬的果糖基氨基酸去糖酶(日本專利公開(kāi)4-4874)與果糖基賴氨酸和果糖基丙氨酸都發(fā)生反應(yīng)。
如上所述，現(xiàn)存的酶末必給出對(duì)糖基化蛋白質(zhì)的精確分析方法，因此需要開(kāi)發(fā)對(duì)果糖基賴氨酸和果糖基纈氨基具有高度特異性的酶。
一般來(lái)說(shuō)，為了提高涉及酶促過(guò)程的試驗(yàn)的精確性和有用性，必須使用具有適用于給定試驗(yàn)之目的的催化活性的酶。因此，必須選擇考慮到了諸多因素(如待測(cè)物質(zhì)(即底物)樣品狀態(tài)，測(cè)量條件和類似因素)的合適的酶，以便精確并可重復(fù)地完成試驗(yàn)。為實(shí)現(xiàn)該目的，必須預(yù)先獲得許多酶，并弄清其活性，底物特異性，溫度穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性和類似特征。因此，必須形成越來(lái)越多的果糖基氨基酸氧化酶并弄清其特征。
為了提供對(duì)amadori化合物，特別是對(duì)糖基化的蛋白質(zhì)具有特異性的新果糖基氨酸氧化酶，本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究并發(fā)現(xiàn)可經(jīng)過(guò)在果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸存在的條件下培養(yǎng)青霉屬菌株來(lái)獲得目標(biāo)酶。
因此，本發(fā)明提供了一種新的果糖基氨基酸氧化酶，它經(jīng)在含有果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生果糖基氨基酸氧化酶的青霉屬菌株來(lái)產(chǎn)生。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，含有果糖基賴氨酸的培養(yǎng)基含有果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸，該培養(yǎng)基用于培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶的微生物，它經(jīng)在100到150℃下將葡萄糖與賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸一起用高壓鍋蒸煮3到60分鐘獲得的果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸(下文它可縮寫(xiě)成“FZL”)。正如下文所描述的，本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶意外地對(duì)果糖基纈氨酸和賴氨酸都具有特異性，并且具有對(duì)前者活性更高的特征。在本說(shuō)明書(shū)全文中，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“果糖基氨基酸氧化酶可縮寫(xiě)成”“FAOD”。
可經(jīng)在含果糖基賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生FAOD的青霉屬菌株來(lái)制備本發(fā)明的酶。
青霉屬菌株的例子包括微紫青霉S-3413(FERMBP-*****)，微紫青霉(IF No.4651，6581，7905)，草酸青霉(IFO No.5748)，爪哇青霉(IFONo.7994)，產(chǎn)黃青霉(IFO No.4897)和暗藍(lán)青霉(IFO No.5337)。
本發(fā)明的FAOD一般具有下列理化特征1)在氧存在的條件下，催化amadori化合物的氧化，產(chǎn)生α-酮醛，胺衍生物和過(guò)氧化氫；2)大約4.0到11.0的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適pH為7.5；3)在大約15到50℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度為25℃；4)當(dāng)用Superdex 200pg進(jìn)行凝膠過(guò)濾估測(cè)時(shí)分子量大約為38,700(38.7KDa)。
用于制備本發(fā)明的FAOD的果糖基賴氨酸和/或FZL可經(jīng)在100到150℃下用高壓鍋蒸煮0.01到50％(W/W)的葡萄糖與0.01到20％(W/W)賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸混合溶液3到60分鐘獲得。具體地說(shuō)，經(jīng)過(guò)在120℃下用高壓鍋蒸煮含200g葡萄糖和10gNα-Z-賴氨酸，總體積為1000ml的溶液20分鐘來(lái)制備。
可通過(guò)將以上述方式獲得的果糖基賴氨酸和/或FZL加入到任意一種常規(guī)培養(yǎng)基中獲得含果糖基賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基(下文稱為FZL培養(yǎng)基)，但也可經(jīng)在100到150℃下用高壓鍋蒸煮含0.01到50％(W/W)葡萄糖，0.01到20％(W/W)賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸，0.1％(W/W)K2HPO4，0.1％(W/W)NaH2PO4，0.05％(W/W)MgSO4·7H2O，0.01％(W/W)CaCl2·2H2O和0.2％(W/W)酵母提取物的混合物(優(yōu)選pH5.6至6.0)3到60分鐘的方法常規(guī)制備該培養(yǎng)基。
用于生產(chǎn)本發(fā)明的FAOD的培養(yǎng)基可以是人工合成的或天然的培養(yǎng)基，它是本領(lǐng)域常用的，含有碳源，氮源，無(wú)機(jī)物和其它營(yíng)養(yǎng)成份。碳源的例子包括葡萄糖，木糖，甘油和類似物；氮源的例子包括胨，酪蛋白消化物，酵母提取物，和類似物；無(wú)機(jī)物的例子包括鈉、鉀、鈣、錳、鎂、鈷和正常培養(yǎng)基中通常包含的類似物。
當(dāng)能產(chǎn)生本發(fā)明的FAOD的微生物在含果糖基賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，可將本發(fā)明的FAOD誘導(dǎo)到最高程度。優(yōu)選的培養(yǎng)基的例子包括含果糖基賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基(1.0％葡萄糖，0.5％果糖基賴氨酸，1.0％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.01％維生素的混合物)，其中果糖基賴氨酸和/或FZL用作唯-氮源，葡萄糖用作碳源。
特別優(yōu)選的培養(yǎng)基(pH5.6至6.0)含20g(2％)葡萄糖，10g(1％)果糖基賴氨酸和/或FZL，1.0g(0.1％)K2HPO4，1.0g(0.1％)NlaH2PO4，0.5g(0.05％)MgSO4·7H2O，0.1g(0.01％)CaCl2·2H2O和2.0g(0.2％)酵母提取物，總體積為1,000ml。
可經(jīng)過(guò)將果糖基賴氨酸和/或FZL加入任意常規(guī)培養(yǎng)基中或經(jīng)用高壓鍋蒸煮含葡萄糖及賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基來(lái)制備含果糖基賴氨酸和/或FZL的培養(yǎng)基。經(jīng)兩種方法的任-種獲得的培養(yǎng)基呈棕色，這是由于存在果糖基賴氨酸和/或FZL，因此稱為“FZL棕色培養(yǎng)基或GL(糖基化賴氨酸和/或糖基化Nα-Z-賴氨酸)棕色培養(yǎng)基”。
正常情況下，在溫度范圍為25到37℃，優(yōu)選為28℃，培養(yǎng)基pH范圍為4.0至8.0，優(yōu)選為5.5到6.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然而，根據(jù)各種因素(如微生物的狀態(tài))可變動(dòng)培養(yǎng)條件，且不限于上面描述的那些條件。例如，在所述條件下培養(yǎng)微紫青霉S-3414菌株20到48小時(shí)，優(yōu)選地為36小時(shí)時(shí)，在培養(yǎng)基中積累FAOD(見(jiàn)

圖1)。然后按常規(guī)方式處理所得的培養(yǎng)基以去掉核酸，細(xì)胞壁片段和類似物并產(chǎn)生酶制品。
由于正常情況下本發(fā)明的FAOD酶活性在細(xì)菌/真菌細(xì)胞中積累，因此，收獲培養(yǎng)物中的細(xì)胞并磨碎以提取該酶。
細(xì)胞的磨碎可以常規(guī)方式完成，例如，以機(jī)械磨碎法，用溶劑自身消化，凍融，超聲處理，擠壓或類似方法。
酶的分離和純化方法也是本領(lǐng)域已知的?？山M合已知方法(例如用硫酸銨鹽析，用諸如乙醇等的有機(jī)溶劑沉淀，離子交換色譜，疏水色譜，凝膠過(guò)濾，親和色譜和類似方法)來(lái)進(jìn)行分離和純化。
例如，經(jīng)過(guò)將所得的培養(yǎng)物進(jìn)行離心或抽吸過(guò)濾收獲菌絲，洗滌，懸浮于0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.5)，用Dino-Mill磨碎并離心。然后使用諸如硫酸銨分離和DEAE-Sephacel離子交換色譜來(lái)純化無(wú)細(xì)胞提取物的上清液。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，F(xiàn)AOD包括可從全部純化過(guò)程中獲得的任何含酶物質(zhì)和溶液而不論該酶的純度，包括培養(yǎng)基及具有催化上面定義的amadori化合物氧化的能力物質(zhì)或溶液。
另外，與FAOD酶促活性有關(guān)且保留該活性的任何FAOD片段均落在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@類片段對(duì)于達(dá)到本發(fā)明的目的也是有用的。
由此獲得的FAOD在糖尿病的診斷中測(cè)定amadori化合物(特別是糖基化的蛋白質(zhì))時(shí)是有用的。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)FAOD的方法，包含在含有糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生FAOD的青霉屬菌株，并從所得的培養(yǎng)物中回收FAOD。
微紫青霉S-3413(下文稱為S-3413菌株)是產(chǎn)生本發(fā)明的FAOD的菌株之一，它是本發(fā)明者從土壤中分離的一種新真菌。根據(jù)Udagawa Shunichi et al.，“KINRUI-ZUKAN”KOdan-Sha Scientific，1993的教導(dǎo)對(duì)該分離的真菌進(jìn)行了分類。其真菌學(xué)特征表示如下(1)不形成子囊世代。
(2)形成青霉頭。
(3)具有梨形瓶梗，在其頂端突然變窄形成較長(zhǎng)的細(xì)尖端。
(4)青霉頭分枝并不規(guī)則伸展。
(5)不形成菌核。
(6)分生孢子連鎖顯著伸展。
(7)在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)如下在Czapek瓊脂培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)。在恒溫箱中25℃培養(yǎng)10天時(shí)，菌株象羊毛一樣伸展，顏色呈淡黃或暗綠。還觀察到放射狀的深皺折。
S-3413菌株最初作為一種馴化的微生物保藏品(FERMP-14867，保藏日1994年3月14日)保藏于日本Tsukuba-shi，Ibaraki-ken“國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)”并按布達(dá)佩斯條約于1996年3月14日變?yōu)閲?guó)際保藏品(FERM BP-5475)。
本發(fā)明的FAOD具有下列特征1.正常誘導(dǎo)特征本發(fā)明的FAOD是由果糖基賴氨酸和/或FZL誘導(dǎo)的可誘導(dǎo)酶，且是經(jīng)在含果糖基賴氨酸和/或FZL作氮源，葡萄糖作碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生FAOD的青霉屬菌株來(lái)生產(chǎn)的。在經(jīng)高壓鍋蒸煮葡萄糖與賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的混合物獲得的Gl棕色培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)FAOD，而在含已單獨(dú)用高壓鍋蒸煮的葡萄糖和賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中不能誘導(dǎo)FaOD，這表明該酶對(duì)amadori化合物具有特異性。
2.反應(yīng)特異性和底物特異性。
本發(fā)明的FAOD在下面反應(yīng)中具有催化活性
其中R1是醛糖殘基，R2是氨基酸，蛋白質(zhì)或肽殘基。
在上面反應(yīng)式中，amadori化合物的分子式為R1-CO-CH2-NH-R2，其中R1是-OH，-(CH2)n-或-[CH(OH)]n-CH2OH(n是0到6的整數(shù))，R2是-CHR3-[CONHR3]mCOOH(R3是α氨基酸的側(cè)鏈殘基，m是1到480的整數(shù))，該化合物是優(yōu)選的底物。在這些化合物中，R3是選自賴氨酸，多聚賴氨酸，纈氨酸，天冬酰胺等的氨基酸的側(cè)鏈殘基，n是5到6，m是55或更小的化合物是更優(yōu)選的。
本發(fā)明的FAOD的底物特異性如下面表1所示。表1純化的FAOD的底物特異性底物濃度比活性Nα-果糖基Nα-Z-賴氨酸 1.67mM22.4果糖基纈氨酸 1.67mM100Nα-甲基-L-賴氨酸 1.67mMM.D*1FHSA*20.17％N.D.胰酶FHSA 0.17％0.5糖基血紅蛋白 0.17％M.D.胰酶糖基血紅蛋白 0.17％0.21)檢測(cè)不到2)果糖基人血清白蛋白從表1很明顯地看到，本發(fā)明的FAOD對(duì)FZL和果糖基纈氨酸兩者都具有高度特異性。
產(chǎn)生FAOD的青霉屬菌株的例子和FAOD的底物特異性如下面表2所示。
表2從生長(zhǎng)于FZL棕色培養(yǎng)基的青霉屬菌株中純化的FAOD的底物特異性比活性(10-2U/mg白質(zhì))保藏號(hào) 菌株果糖基果糖基Nα-Z-賴氨酸 纈氨酸FERM BP-5475 微紫青霉 S-3413 3.017.3IFO4651微紫青霉 0.30.5IFO6581微紫青霉 N.D.1)0.2IFO7905微紫青霉 0.30.5IFO5748草酸青霉 3.016.2IFO7994爪哇青霉 2.812.0IFO4897產(chǎn)黃青霉 1.811.3IFO5337暗藍(lán)青霉 6.121.91)檢測(cè)不到從表2中可明顯地看到，本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖基纈氨酸比對(duì)果糖基賴氨酸具有更大的活性，表明所說(shuō)的FAOD在對(duì)糖基化血紅蛋白的分析中有用。
3.pH和溫度條件pH條件的測(cè)定經(jīng)過(guò)將FAOD加入到0.1M乙酸(AC)，磷酸鉀緩沖液(K-P)，Tirs-HCl緩沖液或甘氨酸(Gly)-NaOH緩沖液(pH4.0至11.0)的混合物中，25℃下保溫10分鐘并在正常條件(25℃，pH8.0)下測(cè)量FAOD的活性來(lái)測(cè)定pH條件。
當(dāng)根據(jù)上面方法進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，本發(fā)明的FAOD在大約4.0到11.0的pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，優(yōu)選pH從6.0到9.0。最適pH是大約pH7.5(見(jiàn)圖2)。
溫度條件的測(cè)定經(jīng)過(guò)將FAOD加入到50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，溫度范圍從15到60℃的混合物中，在相同條件下將混合物保溫10分鐘并在正常條件下測(cè)定FAOD的活性來(lái)測(cè)定溫度條件。
本發(fā)明的FAOD在15到50℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，優(yōu)選的是15到45℃，更優(yōu)選的是大約15℃。在15到45℃有效地進(jìn)行酶反應(yīng)，優(yōu)選地在15到40℃，更優(yōu)選地為大約25℃(見(jiàn)圖3)。
4.滴定度的評(píng)價(jià)按如下方法進(jìn)行滴定(1)利用比色法測(cè)定產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的方法。
A.產(chǎn)率測(cè)量經(jīng)過(guò)將預(yù)先得到的果糖基纈氨酸(下文稱為FV)溶于蒸餾水來(lái)制備100mM的FV溶液。向100μl45mM4-氨基安替比林，100μl 60U/ml過(guò)氧化物酶，100μl60mM苯酚，1ml 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和50μl酶溶液的混合物中加蒸餾水至總體積為2.95ml。混合物在25℃下平衡并向其中加入50μl100mM的FV溶液，然后，在505nm處測(cè)量隨時(shí)間變化的吸光率。根據(jù)產(chǎn)生的苯醌色素的的分子吸光率(5.16×103M-1cm-1)計(jì)算每分鐘產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量(μmol)。取所得的值作為酶活性單位(U)。
B.終點(diǎn)法按與上面方法A所述相同的方式制備溶液并向其中加入底物溶液。30℃下培養(yǎng)30分鐘后，在505nm處測(cè)吸光度。參照使用標(biāo)準(zhǔn)過(guò)氧化氫溶液預(yù)先獲得的校準(zhǔn)曲線，根據(jù)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量評(píng)價(jià)酶活性。
(2)因酶反應(yīng)吸收的氧的測(cè)定方法向1ml 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和50μl酶溶液的混合物中加入蒸餾水以獲得總體積為3.0ml的溶液。將所得的溶液在Lank Brothers Co.生產(chǎn)的氧電極池中充電。在25℃下攪拌溶液使在該溫度下的溶氧達(dá)到平衡，向其中加入10μl 50mM FV。然后在記錄器上連續(xù)測(cè)量氧吸收以獲得起始速率。根據(jù)校準(zhǔn)曲線測(cè)定一分鐘的吸收氧總量，將它用作酶單位。
5.酶的抑制，活化和穩(wěn)定(1)金屬的影響向酶溶液中加入含溶于0.1M Tris-HCl緩沖液(PH8.0)且終濃度為1mM的待試金屬離子之溶液，30℃溫育5分鐘后，評(píng)價(jià)酶活性。結(jié)果如下表3所示。
表3金屬離子對(duì)微紫青霉S-3413FAOD活性的影響金屬(1mM) 比活性(％)無(wú) 100LiCl 88KCl 103NaCl100RbCl105CsCl103MgCl2103CaCl274MnCl2144FeSO4114CoSO413CuCl251ZnSO45.8AgNO35.7BaCl266HgCl22.1
FeCl3100從表3可明顯地看到，本發(fā)明的FAOD活性似乎被銅和鋇離子抑制且被鈷、鋅、銀和汞離子強(qiáng)烈抑制。
(2)各種抑制劑的影響以基本上類似于上面(1)所述的方式試驗(yàn)各種物質(zhì)的抑制效應(yīng)。在本試驗(yàn)中，對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)的終濃度是0.1mM，而其它是1mM。結(jié)果如表4所示。經(jīng)過(guò)將純化的FAOD在含0.1mM二硫蘇糖醇(DTT)的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中透析過(guò)夜并測(cè)量酶活性來(lái)檢測(cè)穩(wěn)定作用。
表4各種抑制劑對(duì)FAOD活性的影響試劑(1mM) 比活性(％)無(wú)100PCMB*10.69DTNB*213碘乙酸102疊氮化鈉 118α，α′-聯(lián)吡啶 105O-菲咯啉 111氨基脲103苯肼 0.17肼 12羥胺 18Deprenyl 107
氨基胍63EDTA*3109*1PCMB，對(duì)氯汞苯甲酸。
*2DTNB，5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)。
*3EDTA，乙二胺四乙酸。
從表4中可明顯地看到，F(xiàn)AOD的活性受PCMB，DTNB，肼，苯肼和羥胺的強(qiáng)烈抑制，表明SH和/或羰基在酶反應(yīng)中可以充當(dāng)重要角色。
經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)可穩(wěn)定酶，用于保存的優(yōu)選溶劑是含0.1mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)。
6.分子量當(dāng)在Superdex 200pg上凝膠過(guò)濾測(cè)定時(shí)，分子量是大約38,700(38.7KD)(見(jiàn)圖4)。
根據(jù)Davis的方法使用10％凝膠在40mA電泳3小時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)并用考馬斯亮藍(lán)G-250染色蛋白質(zhì)。當(dāng)在SDS-PAGE上測(cè)量時(shí)，使用以相同方式進(jìn)行包含磷酸化酶B，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳獲得的校準(zhǔn)曲線，得到FAOD亞單位的分子量是大約48,700(48.7KDa)，(見(jiàn)圖5)，這表明本發(fā)明的FAOD是單體。
7.與已知酶的比較將本發(fā)明的FAOD與來(lái)自各種微生物的已知果糖基氨基酸氧化酶進(jìn)行了比較。
表5來(lái)自各種微生物的果糖基氨基酸氧化酶的比較微生物微紫青霉 棒狀桿菌屬的種1)曲霉屬的種2)分子量 S-3413(凝膠過(guò)濾) 38,700 88,00083,000(SDS-PAGE) 48,700 44,00043,000輔酶 共價(jià)結(jié)合的FAD 非共價(jià)結(jié)合的FAD非共價(jià)結(jié)合的FAD底物特異性(U/mg量白質(zhì))(果糖基纈氨酸) 3.03)N.D.4)11.284)(果糖基賴氨酸) 17.37.0959.8最適pH7.5 8.3 7.7量適溫度(℃) 25 40 40以HS試劑滅活 滅活 未滅活滅活1).T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(1)，103-110(1989).
2).T.Horiuchi et al.Agric.Biol.Chem.，55(2)，333-338(1991).
3)對(duì)果糖基Nα-Z-賴氦酸的比活性4).對(duì)Nα-D-果糖基Nα-甲酰基賴氫酸的比活性如表5所顯示的在本發(fā)明的FAOD和來(lái)自兩種菌株的其它酶之間可看到下列區(qū)別(1)分子量本發(fā)明的FAOD是單體，而其它酶是二聚體。
(2)輔酶本發(fā)明的FAOD需要共價(jià)結(jié)合的FAD，而其它酶需要非共價(jià)結(jié)合的FAD。
(3)最適pH，最適溫度，和受SH試劑的抑制資料表明本發(fā)明的FAOD與其它酶明顯不同。
本發(fā)明的FAOD與來(lái)自青霉屬的果糖基氨基酸去糖基酶(日本專利公開(kāi)4-4874)之間的區(qū)別表示如下
(1)底物特異性果糖基氨基酸去糖基酶對(duì)果糖基賴氨酸和果糖基丙氨酸具有活性，而本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖基賴氨酸和果糖基纈氨酸具有活性，對(duì)果糖基纈氨酸的活性更高。
(2)誘導(dǎo)特異性果糖基氨基酸去糖基酶可在無(wú)果糖基氨基酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生，而本發(fā)明的FAOD經(jīng)在含果糖基賴氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)青霉屬菌株來(lái)誘導(dǎo)。
(3)制備過(guò)程經(jīng)在“棕色培養(yǎng)基”中培養(yǎng)青霉屬菌株有效制備本發(fā)明的FAOD。
正如上面所討論的，本發(fā)明的FAOD在amadori化合物試驗(yàn)中有用。因此，本發(fā)明提供了一種樣品中amadori化合物的分析方法，它包含將含有amadori化合物的樣品與本發(fā)明的FAOD接觸并測(cè)定消耗的氧總量或產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量。根據(jù)對(duì)糖基化蛋白質(zhì)和/或糖基化速率的測(cè)量或?qū)铙w樣品中果糖基胺的測(cè)定完成本發(fā)明的分析。
以下面反應(yīng)式評(píng)價(jià)FAOD的酶活性
其中R1是醛糖殘基，R2是氨基酸，蛋白質(zhì)或肽殘基。
至于待試樣品溶液，可使用任何含amadori化合物的溶液，例如，來(lái)自食品的樣品溶液(如醬油等)以及來(lái)自活體如血液(例如全血，血漿和血清)，尿或類似物的樣品溶液。
本發(fā)明的FAOD在合適的緩沖液中與含amadori化合物的樣品反應(yīng)。盡管根據(jù)所使用的酶和待測(cè)樣品的不同可變動(dòng)反應(yīng)混合物的適當(dāng)pH和溫度，但它們應(yīng)在上面限定的范圍內(nèi)，這就是說(shuō)pH從6.0到9.0，優(yōu)選的是7.5，溫度從15到45℃，優(yōu)選的是15到40℃。至于緩沖液，可使用磷酸鉀緩沖液。
試驗(yàn)中所用的FAOD總量一般是0.1單位/ml或更大，在終點(diǎn)法的情況下優(yōu)選1至100單位/ml。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可經(jīng)過(guò)下面所示的已知試驗(yàn)方法中的任意一種來(lái)完成對(duì)amadori化合物的測(cè)定。
(1)根據(jù)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量進(jìn)行測(cè)定根據(jù)過(guò)氧化氫的測(cè)定方法(如比色法或利用過(guò)氧化氫電極的方法)從產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量可估測(cè)樣品中amadori化合物的總量。然后根據(jù)表示過(guò)氧化氫總量和amadori化合物總量之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線估測(cè)樣品中amadori化合物的總量。具體地說(shuō)，除了FAOD總量是1單位/ml且待測(cè)樣品在測(cè)量產(chǎn)生的過(guò)氧化氫前被稀釋外?？捎门c“4滴定度評(píng)價(jià)”中所述相似的方法進(jìn)行估測(cè)。
至于過(guò)氧化氫的顯色系統(tǒng)，可使用任何因生色團(tuán)(如苯酚)和成色劑(如4-氨基安替比林3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)之間在過(guò)氧化物酶存在的條件下發(fā)生的氧化縮合而顯色的系統(tǒng)。生色團(tuán)的例子包括酚衍生物，苯胺衍生物和甲苯胺衍生物，例如N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-m-甲苯胺，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，2，4-二氯酚，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺。也可用在過(guò)氧化物酶存在的條件下經(jīng)氧化顯色的無(wú)色型顯色劑。這種“無(wú)色型顯色劑”是本領(lǐng)域中已知的，其例子包括鄰聯(lián)茴香胺，鄰聯(lián)甲苯胺，3，3-二氨基聯(lián)苯胺，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，N-羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)-聯(lián)苯胺，10-(羧基甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲基氨基)吩噻嗪和類似物。
(2)根據(jù)消耗的氧總量進(jìn)行的測(cè)定可使用表示消耗的氧總量與amadori化合物總量之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線從消耗的氧總量估測(cè)樣品中的amadori消耗的氧總量經(jīng)從反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的氧總量減去反應(yīng)完成時(shí)的氧總量來(lái)計(jì)算。具體地說(shuō)，除了FAOD總量是1單位/ml且在測(cè)量消耗的氧前適當(dāng)?shù)仡A(yù)先稀釋街加樣品外，可用與“4.滴定度評(píng)價(jià)”中描述的滴定相似的方法進(jìn)行測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法，可直接使用樣品溶液，但在某些情況下預(yù)先處理樣品(以便釋放在糖基化的蛋白質(zhì)中糖結(jié)合的賴氨酸和/或纈氨酸殘基)。可能是優(yōu)選的。
為達(dá)到該目的，用蛋白酶(酶法)或諸如鹽酸等的化學(xué)物質(zhì)(化學(xué)方法)處理樣品。優(yōu)選酶法，在這種情況下，在本發(fā)明的方法中可使用本領(lǐng)域已知的內(nèi)切型或外切型蛋白酶。內(nèi)切型蛋白酶的例子包括胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，蛋白酶K，木瓜蛋白酶，組織蛋白酶B，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶XIV，賴氨酰內(nèi)肽酶，proleser和波蘿蛋白酶F。外切型蛋白酶的例子包括氨基肽酶和羧基肽酶。酶處理的方法是已知的，例如，可按下面實(shí)施例的描述進(jìn)行胰酶處理。
如上所述，本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖基纈氨酸具有特異性，因此它在糖基化血紅蛋白試驗(yàn)中有用。另一方面，本發(fā)明的FAOD對(duì)糖基化蛋白質(zhì)中的果糖基賴氨酸具有特異性且在對(duì)糖尿病的診斷和治療中有用，該診斷和治療包含測(cè)量血液樣品中的糖基化蛋白質(zhì)。
當(dāng)試驗(yàn)血液(例如全血，血漿或血清)時(shí)，可使用來(lái)自活體的血液樣品或預(yù)處理(例如透折等)后的血液樣品。
而且，在本發(fā)明方法中使用的酶(例如FAOD，過(guò)氧化物酶，等等)可以液體狀態(tài)或固定于合適的固態(tài)支持物后使用。例如，可使用固定于顆粒上的酶填充的柱子以獲得用于試驗(yàn)糖基化的蛋白質(zhì)或類似物的裝置，該裝置在諸如必須精確和快速試驗(yàn)許多樣品的臨床檢查的常規(guī)試驗(yàn)中，可提高其效率。固定化酶在經(jīng)濟(jì)效益方面也具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗芍貜?fù)使用。
而且經(jīng)過(guò)將酶與顯色劑以合適的方式組合可提供一套試劑盒。該試劑盒在針對(duì)amadori化合物的臨床分析和食品分析中有用。
可用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行酶的固定化。例如，可用載體結(jié)合法，交聯(lián)法，包含法，復(fù)合法和類似方法進(jìn)行。載體的例子包括聚合物凝膠，微膠囊，瓊脂，藻酸鹽，角叉藻聚糖和類似物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵、物理吸附、生化親和等將酶結(jié)合到載體上。
當(dāng)使用固定化酶時(shí)，可在流動(dòng)或批量系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)。如上所述，固定化酶對(duì)血液樣品中糖基化蛋白質(zhì)的常規(guī)試驗(yàn)(臨床檢查)特別有用。當(dāng)臨床檢查用于糖尿病診斷時(shí)，作為糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果以糖基化蛋白質(zhì)的濃度或樣品中糖基化蛋白質(zhì)濃度與總蛋白質(zhì)濃度比率的糖基化率或果糖基胺的總量來(lái)表達(dá)。總蛋白質(zhì)濃度可用常規(guī)方式測(cè)定，例如，通過(guò)在280mm下測(cè)吸光率、Bradford法、Lowry法，bullet法，白蛋白自然熒光法或血紅蛋白吸附法。
本發(fā)明還提供了一種用于amadori化合物分析的試劑或試劑盒，它包含本發(fā)明的FAOD和pH最優(yōu)選的為6.0至9.0，更優(yōu)選地為7.5的緩沖液。當(dāng)固定FAOD時(shí)，固相支持物可選自聚合物凝膠和類似物，優(yōu)選的是藻酸。
至于終點(diǎn)分析，試劑通常有1至100單位/mlFAOD(對(duì)每一樣品)，和作為緩沖液的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)。
當(dāng)根據(jù)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫測(cè)定amadori化合物時(shí)，可使用上面在“(1)根據(jù)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量進(jìn)行測(cè)定”所述的任何因氧化縮合顯色的顯色系統(tǒng)，無(wú)色型顯色試劑和類似物。
用于本發(fā)明的amadori化合物分析的試劑可與合適的顯色試劑以及顏色標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)合以產(chǎn)生一套試劑盒，該試劑盒在初步診斷或檢查中有用。
上面所述的試劑或試劑盒用于測(cè)量糖基化蛋白質(zhì)的總量和/或糖基化率或測(cè)定活體樣品中的果糖基胺。
如上所述，本發(fā)明的FAOD對(duì)果糖基賴氨酸和果糖基纈氨酸都具有特異性，因此在開(kāi)發(fā)新的臨床分析方法和食品分析方法中有用，從而對(duì)糖尿病的診斷和食品的質(zhì)量控制有用。特別是期望它在糖尿病的診斷中有用，其中糖基化蛋白質(zhì)的總量和/或糖基化率或血液中果糖基胺的總量作為診斷或控制糖尿病的指標(biāo)。通過(guò)使用本發(fā)明的用于測(cè)定amadori化合物的試劑的試驗(yàn)方法精確和有效地測(cè)定糖基化蛋白質(zhì)(它有助于糖尿病的診斷或治療)現(xiàn)在是可能的。
圖1是表示培養(yǎng)時(shí)間與微紫青霉S-3414培養(yǎng)基中產(chǎn)生的FAOD總量之間的關(guān)系的圖示。
圖2是表示最適pH與溶劑中FAOD活性之間的關(guān)系的圖示。
圖3是表示最適溫度與溶劑中FAOD活性之間的關(guān)系的圖示。
圖4是表示了經(jīng)凝膠過(guò)濾在Superdex 200pg上測(cè)定的FAOD的分子量的圖示。
圖5是表示從微紫青霉S-3413純化的FAOD在SDS-PAGE上的遷移方式的照片。
圖6表示從微紫青霉S-3413純化的FAOD的吸收光譜。
圖7是表示糖基化血紅蛋白總量與FAOD作用所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量之間關(guān)系的圖示。
圖8是表示糖基化血紅蛋白總量與因FAOD作用產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量之間關(guān)系的圖示。
圖9是表示血紅蛋白Alc水平與因FAOD作用產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量之間關(guān)系的圖示。
下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地解釋本發(fā)明但不構(gòu)成對(duì)其范圍的限制。
實(shí)施例1微紫青霉S-3413的發(fā)酵和FAOD的純化1)發(fā)酵將微紫青霉S-3413(FERM BP-*****)接種到含0.5％FZL、1.0％葡萄糖、0.1％K2HPO4、0.1％NaH2PO4、0.05％MgSO4、0.01％CaCl2和0.2％酵母提取物的培養(yǎng)基(pH6.0，10L)中，用發(fā)酵罐在通氣(2L/分)和攪拌(500rpm)條件下28℃培養(yǎng)36小時(shí)。過(guò)濾培養(yǎng)物以收獲菌絲體。
2)粗提物的制備將菌絲體部分(濕重410g)懸浮于含0.1mM DTT的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5，800ml)中用Dino-Mill磨碎。磨碎的混合物在9,500rpm下離心20分鐘以獲得作為粗提物的上清液(無(wú)細(xì)胞提取物)，然后對(duì)其進(jìn)行純化。
3)純化向粗提物中加入硫酸銨至40％飽和狀態(tài)，將混合物在12,000rpm下離心10分鐘。向上清液中加入硫酸銨至75％飽和，攪拌并在12,000rpm下離心10分鐘。
將沉淀溶于含0.1mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)(下文稱為“緩沖液A”)中，溶液在緩沖液A中透析過(guò)液，其中更換透析溶劑2次。所得的酶溶液上樣到用緩沖液A平衡的DEAE-Sephacel柱(4.2×26cm)上。觀察用緩沖液A洗柱的餾分的活性，收集餾分并用以0至55％飽和范圍的硫酸銨分離。所得物質(zhì)吸附到用含25％硫酸銨的緩沖液A平衡的苯基-Sepharose6FF(低置換)柱(HR10/10)上。用相同緩沖液洗滌后，用25％到0％飽和的硫酸銨線性梯度洗脫柱子。合并活性餾分，用硫酸銨濃縮，在用含0.1M DTT的0.2M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡的Superdex 200pg柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾以產(chǎn)生70到100單位的純化酶制品。
用Superdex 200pg進(jìn)行凝膠過(guò)濾顯示根據(jù)圖4所示的校準(zhǔn)曲線得到分子量大約為38，7000(38.7KDa)。
使用純化的酶，根據(jù)Davis的方法，用10％凝膠在40mA下經(jīng)SDS-PAGE3小時(shí)并用考馬斯亮藍(lán)G-250染色蛋白質(zhì)來(lái)測(cè)定分子量。用以相同方式進(jìn)行的包括磷酸化酶B，牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的電泳制備的校準(zhǔn)曲線估測(cè)分子量。SDS-PAGE揭示了純化的酶亞基分子量是大約48,700(48.7KDa)(見(jiàn)圖5)。
純化酶的紫外吸收光譜在圖6中顯示它表明該酶是一種黃素酶。
而且實(shí)施例1中制備的FAOD顯示出與上面所述的酶活性、pH和濕度穩(wěn)定性、金屬和抑制劑影響等相聯(lián)系的相同值或物理化學(xué)特征。
實(shí)施例2糖基化血紅蛋白的測(cè)定1)樣品的制備按下面方法制備作為FAOD底物的樣品溶液。向溶于100μl蒸餾水的0至15mg糖基化血紅蛋白對(duì)照E(Sigma)的溶液中加入1ml鹽酸丙酮溶液(1NHCl/丙酮為1∶100)。將混合物在12000rpm下離心10分鐘，用500μl乙醚洗滌沉淀并在真空條件下濃縮至干燥。向殘余物中加入100μl8M的尿素。在沸水中加熱所得的混合物20分鐘，冷卻，與300μl 5.4U/ml胰酶混合，在37℃保溫3小時(shí)，在沸水中加熱5分鐘獲得樣品溶液。
2)活性的測(cè)定3mMN-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-雙(二甲基氨基)二苯基胺溶液 30μl過(guò)氧化物酶溶液(60單位/m；) 30μl0.1M tris-HCl緩沖液(pH8.0) 300μlFAOD溶液(25單位/ml) 5μl經(jīng)過(guò)用0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)稀釋實(shí)施例1中獲得的純化的FAOD制備FAOD溶液(25單位/ml)?；旌仙厦嫠械娜吭噭┖?，用蒸餾水將總體積調(diào)到1ml以產(chǎn)生FAOD反應(yīng)混合物。向FAOD反應(yīng)混合物中加入上面1)中獲得的作為底物的樣品溶液(150μl)?；旌衔镌?0℃保溫30分鐘后，在727nm下測(cè)吸光度以評(píng)價(jià)糖基化血紅蛋白與吸光度之間的關(guān)系。
3)結(jié)果結(jié)果在圖7中顯示，其中縱座標(biāo)表示與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量相對(duì)應(yīng)的727nm處的吸光度，橫坐標(biāo)表示糖基化血紅蛋白總量。圖7表明糖基化血紅蛋白總量與過(guò)氧化氫總量相關(guān)。
實(shí)施例3糖基化血紅蛋白的測(cè)定1)樣品的制備按下面方法制備作為FAOD底物的樣品溶液。向溶于200μl蒸餾水的30mg糖基化血紅蛋白對(duì)照E(Sigma)的溶液中加入1ml含8M尿素、0.2％EDTA二鈉和40μl2-巰基乙醇的570mM Tris-HCl緩沖液(pH8.8)，在氮?dú)庵袑⒒旌衔镬o置2小時(shí)。加入400μl1M的碘乙酸鈉后，混合物靜置30分鐘，接著再加入40μl的乙-巰基乙醇?；旌衔镌?.1M碳酸氫銨中透析，與10μl10mg/ml的TPCK-胰酶混合，37℃下培養(yǎng)3小時(shí)，在沸水中加熱5分鐘以獲得樣品溶液。
2)活性測(cè)定3mM N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)二苯基胺溶液 30μl過(guò)氧化物酶溶液(60單位/ml) 30μl0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0) 300μlFAOD溶液(25單位/ml) 10μl樣品 0到13.2mg經(jīng)過(guò)用0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)稀釋實(shí)施例1中獲得的純化的FAOD制備FAOD溶液(25單位/ml)。將上述全部試劑混合后，用蒸餾水將總體積調(diào)到900μl以獲得FAOD反應(yīng)混合物。將FAOD反應(yīng)混合物在30℃下保溫，30分鐘后在727mM下測(cè)吸光率以評(píng)價(jià)糖基化血紅蛋白與吸光率之間的關(guān)系。
3)結(jié)果結(jié)果如圖8所示，其中縱座標(biāo)表示與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量相對(duì)應(yīng)的727nm處的吸光度，橫坐標(biāo)表示糖基化的血紅蛋白總量。圖8表明糖基化血紅蛋白總量與過(guò)氧化氫總量相關(guān)。
實(shí)施例4血紅蛋白Alc水平的測(cè)量
1)樣品的制備按如下方法制備作為底物的樣品溶液。將血紅蛋白AO試劑(sigma Co.)溶于蒸餾水以產(chǎn)生2.3mM的溶液，使用自動(dòng)糖基化血紅蛋白測(cè)量裝置(Kyoto DaiichiKagaku Co.Ltd.)分離該溶液。收集含純化的血紅蛋白Alc和血紅蛋白AO的各餾分。經(jīng)過(guò)以不同比率混合這些餾分來(lái)制備具有0％至52.0％范圍的不同血紅蛋白Alc水平的作為底物的樣品溶液。
2)樣品的預(yù)處理250μg上面1)獲得的樣品溶液，5μl500U/ml的氨基肽酶和15μl1.0M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)加蒸餾水至200μl的混合物在30℃保溫30分鐘。加入200μl10％的三氯乙酸后，攪拌混合物，0℃靜置20分鐘，在12000rpm下離心10分鐘。用大約40μl 5N NaOH中和所得的上清液。
3)活性測(cè)定3mM N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)二苯基胺溶液 100μl過(guò)氧化物酶溶液(60單位/ml) 100μl0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0) 1000μlFAOD溶液(25單位/ml)15μl樣品 0到13.2mg經(jīng)過(guò)用0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)稀釋實(shí)施例1中獲得的純化的FAOD來(lái)制備FAOD溶液(16單位/ml)?；旌仙鲜鋈吭噭┖螅谜麴s水將總體積調(diào)到2.6ml以獲得FAOD反應(yīng)混合物。將FAOD反應(yīng)混合物在30℃保溫2分鐘。加入400μl上面2)中獲得的預(yù)先處理的底物后，將混合物再保溫30分鐘并用于727nm處測(cè)吸光度以評(píng)價(jià)底物血紅蛋白Alc水平和吸光率之間的關(guān)系。
4)結(jié)果結(jié)果如圖9所示，其中縱坐標(biāo)表示與產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量相對(duì)應(yīng)的727nm處的吸光率，橫坐標(biāo)表示血紅蛋白Alc水平。圖9表明血紅蛋白Alc水平與過(guò)氧化氫總量相關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種果糖基氨基酸氧化酶，它是經(jīng)過(guò)在含有果糖基賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生果糖基氨基酸氧化酶的青霉屬菌株產(chǎn)生的。
2.權(quán)利要求1的果糖基氨基酸氧化酶，其中含有果糖基賴氨酸的培養(yǎng)基含有能經(jīng)在100到150℃下將葡萄糖和賴氨酸和/或Nα-Z-賴氨酸一起用高壓鍋蒸煮3到60分鐘獲得的果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸。
3.權(quán)利要求的果糖基氨基酸氧化酶，它對(duì)果糖基纈氨酸和/或果糖基賴氨酸具有活性。
4.權(quán)利要求1的果糖基氨基酸氧化酶，其中的青霉屬菌株選自由微紫青霉S-3413(FERMBP-****)，微紫青霉(IFO No，4651，6581，7905)，草酸青霉(IFO No.5748)，爪哇青霉(IFO No.7994)，產(chǎn)黃青霉(IFO No.4897)和暗藍(lán)青霉(IFO No.5337)組成的組。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的果糖基氨基酸氧化酶，它具有下面理化特征1)在氧存在的條件下，催化amadori化合物的氧化，產(chǎn)生α-酮醛、胺衍生物和過(guò)氧化氫；2)在4.0到11.0的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適pH為7.5；3)在大約15到50℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度為25℃；4)當(dāng)用Superdex 200pg進(jìn)行凝膠過(guò)濾估測(cè)時(shí)，分子量為大約為38,700(38.7KDa)。
6.微紫青霉S-3413(FERM BP-5475)。
7.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1的果糖基氨基酸氧化酶的方法，該方法包括在含有選擇性保護(hù)的果糖基氨基酸和/或糖基化蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)青霉屬菌株。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在含果糖基賴氨酸和/或果糖基Nα-Z-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生果糖基氨基酸氧化酶的青霉屬菌株，并從所得的培養(yǎng)物中回收果糖基氨基酸氧化酶。
9.一種含amadori化合物的樣品中的amadori化合物的分析方法，該方法包括將所述樣品與權(quán)利要求1的果糖基氨基酸氧化酶接觸并測(cè)定消耗的氧總量或產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的樣品來(lái)自活體，根據(jù)對(duì)糖基化蛋白質(zhì)總量和/或糖基化率的測(cè)量或?qū)悠分泄腔返臏y(cè)定來(lái)分析amadori化合物。
11.一種用于分析amadori化合物的試劑或試劑盒，它包含權(quán)利要求1的果糖基氨基酸氧化酶。
12.權(quán)利要求11所要求的試劑或試劑盒，用于測(cè)量糖基化蛋白質(zhì)的總量和/或糖基化率或測(cè)定來(lái)自活體的樣品中的果糖胺。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種得自青霉屬的新的果糖基氨基酸氧化酶(它對(duì)果糖基賴氨酸和果糖基纈氨酸兩者都具有活性)。一種產(chǎn)生該酶的方法，一種使用該酶的amadori化合物的分析方法及一種含有該酶的試劑或試劑盒。
文檔編號(hào)C12N9/06GK1143111SQ9610720
公開(kāi)日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1996年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月11日
發(fā)明者加藤暢夫, 阪井康能, 谷吉樹(shù), 八木雅之, 船津文代 申請(qǐng)人:株式會(huì)社京都第一科學(xué)