專利名稱：：半纖維素酶在低熱焓飼料中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及飼養(yǎng)單胃動物的方法，更具體地說，涉及使用一種或多種半纖維素酶如甘露聚糖酶的方法，通過此方法可減少為得到或增加用含酶的低熱焓食物喂養(yǎng)的動物的體重增加(增重)所需的飼料。世界人口在持續(xù)增長，但用于糧食生產的土地卻是有限的。參見J.E.Cohen，Discover1742-47(1996)。為跟上不斷增長的糧食需要，需要對食物源的利用進行改進，以維持目前的生活水準。已提出的一種提高有效利用率的方案是使用酶來促進飼料的消化。參見Chesson，A.，Supplementaryenzymestoimprovetheutilizationofpigandpoultrydiets，pp71-89。該文收集在Haresign，W.andD.J.A.Cole(eds)，RecentAdvancesinAnimalNutrition-1987，Buttervorths，London中。酶助消化不僅可由每磅飼料得到更多的食用肉，而且還可減少牲口糞量和處理成本。對四類酶在動物飼料中的價值已在市場上得到明確的肯定。在含小麥、黑麥或黑小麥的食物中，加入木聚糖酶(內-1，4-β-D-木聚糖水解酶，E.C.3.2.1.8)已被證明是有益的。參見Pettersson等，BritishJournalofNutrition62139-49(1989)。在小麥、黑麥和大麥/黑麥雜交的黑小麥胚乳細胞壁中存在大量的非淀粉的多糖即阿拉伯木聚糖。阿拉伯木聚糖不被單胃動物消化，但可被微生物的木聚糖酶水解。廣泛應用于飼料中的酶的另一個例子是β-葡聚糖酶〔纖維素酶，內-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶E.C.3.2.1.4；或內-1，3-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶E.C.3.2.1.6〕，該酶被證明對含大麥和燕麥的食物尤其有益。參見Rotter等，NutritionRe-portInternational39107-120(1989)。除了會影響消化，葡聚糖還會引起濕粘性糞便，從而會誘使家禽胸部起皰。在實踐中，木聚糖酶和β-葡聚糖酶被同時施用，因為阿拉伯木聚糖和葡聚糖均存在于谷物之中。參見Pettersson等，AnimalProduction51201-20(1990)。能從植酸即肌醇六磷酸分裂出磷的酶的應用是酶在動物飼料中的有益應用的第三個例子。參見Simons等，BritishJournalofNu-trition64525-40(1990)。在單胃動物中，磷酸鹽不是在消化過程中由肌醇六磷酸釋放出來的，而是通過微生物作用，釋放在糞便中。在典型的飼料中，肌醇六磷酸的含量很高。由于含磷酸鹽的下水會引起附近的江湖海灣的季節(jié)性缺氧，已成為糞便處理過程中的一個問題。加入植酸酶可降低糞便中的磷酸鹽含量并大大減少往食物中添加磷酸鹽的需要。甘露聚糖酶是另一種已在以玉米和大豆為基料的食物中得到商業(yè)性應用的酶。用含甘露聚糖酶的食物飼養(yǎng)的單胃動物對得到或增加增重所需的飼料減少，就以玉米為基料的食物而言，這是未曾預料到的。在發(fā)現細菌的內-1，4-β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78，也稱為人內-1，4-β-甘露糖苷酶，參見McCleary，B.V.，β-D-Mannase，MethodsinEnzymology160596-609，1988)可提高玉米-大豆類食物的飼料效率以前，很少在用玉米-大豆類食物飼養(yǎng)的家禽或豬的飼料中使用酶。本文引作參考的美國專利No.5,429,828給出了一種通過在食物中添加半纖維素酶，尤其是甘露聚糖酶來改善含半纖維素的動物飼料的能量效率的方法。添加內-1，4-β-D-甘露聚糖酶在飼養(yǎng)效率上的正面效應對以玉米為基料的食物是未曾預料到的。在含混合交聯的葡聚糖的大麥和燕麥中，或在含阿拉伯木聚糖的小麥、黑麥和黑小麥中，抗營養(yǎng)聚合物占種子胚乳的很大部分。相反，在普通的以玉米為基料的食物中，只存在很少量的以1-4-β-D-甘露聚糖為基本成分的聚合物。在典型的以玉米為基料的食物中，半乳甘露聚糖的主要來源是大豆粉(主要是作為蛋白質源而添加的)。根據總糖量分析和非淀粉多糖百分比，大豆粉可含1.3％數量級的甘露聚糖。因此，包含30％大豆粉的食物僅含約0.4％甘露聚糖聚合物。由這很小百分比的食物的完全消化而產生的附加的能量并不能解釋在飼料換算和增重方面出現的顯著改善。在世界的許多地方，人們利用含低的可代謝能含量的食物口糧。在這些國家，并未用脂肪補充食物口糧。其結果，為利用低脂肪食物，需要提高能量效率。在發(fā)展中國家或發(fā)達國家里，出于健康方面的原因，補充的濃縮脂肪正被從食物中除去。另外，存在驚人數量的與為增加飼料的可代謝能(ME)含量而在食物口糧中添加濃縮脂肪有關聯的問題。(Rouse，R.H.，Fatquality，theconfusingworldoffeedfats，pp55-63InProceedingsofthe1994MarylandNutri-tionConference，March24-25，Baltimore，MD，UniversityofMarylandFeedIndustryCouncil，CollegePark，MD)?，F在已知道脂肪中的不飽和脂肪酸的氧化可導致過氧化物和自由基的形成。這反過來導致飼料營養(yǎng)成分和維生素的氧化。還有證據表明，高脂肪食物可導致雛雞產生心室障礙和/或腹水問題(Mullins，T.M.andW.W.Saylor，Effectsofahighfatdietongrowth，rightventricularhypertrophy，rightventricularfailure，andascitiesformationinbroilerchickens，Abstract25，pll，South-ernPoultryScienceSociety，16thAnnualMeeting，Jan16-17，1995，Atlanta，Georgia)。動物飼料脂肪的一些來源包括飯店的廢棄脂肪，這種廢脂肪已被部分氫化，從而產生可影響動物的生育力、脂肪酸代謝和飼料能量值的具有反式雙鍵的非天然脂肪酸(Rouse，見前)。另一個問題是市售的脂肪中的游離脂肪酸的存在可對生殖產生不利的影響并可能在雞內臟產生抗菌效果(Rouse，見上)?；旌现疽步洺１籔CBs、殺蟲劑殘留物、重金屬和來自棉籽油皂腳的棉酚污染(Rouse，見上)。飼料加工業(yè)主不得不對這些問題保持警惕。攝入的脂肪(和溶于其中的物質如PCB)可被直接摻入將其消費的動物的脂肪中并可能會存在重大的健康風險已是眾所周知的。另外，動物口糧中的脂肪會影響食用肉的口味。例如，雞的食物中加入1％以上的魚油會使雞肉或雞蛋產生明顯的魚類氣味。(Lesson，S.，andJ.D.Summers，Chapter2Ingredientevaluationanddietformula-tion，(In)CommercialPoultryNutrition，UniversityBooks，Guelph，Ontario，1991)。高脂肪含量(尤其是動物脂肪)對產品口味的影響是一些廠商開始密切關注的另一個問題。避免使用脂肪且仍能得到相同的生產率的能力具有普遍的意義。目前仍然存在對食品生產的更高效率的持續(xù)需求，并且，尋找解決方案的緊迫性正隨著時間而日益增加。使用為促進動物的高效生長而含數百分比的脂肪的高能食物由于脂肪或植物油的高成本、或在世界的一些人口最密集的地方(例如中國或印度)，可利用的動物脂肪的數量有限，而并非總是可能或可行的。在使用可利用的脂肪作為飼料中的能量方面，存在基本的低效率。例如，在化學和制皂工業(yè)，脂肪具有更大的使用價值。最后，存在一系列與在動物食物中摻入外源性濃縮脂肪有關聯的健康問題和難題。這些問題進一步表明，迫切需要保持高飼養(yǎng)效率的低脂肪、低熱量的動物飼養(yǎng)食物。因此，需要一種可提高單胃動物利用含低的可代謝能含量的飼養(yǎng)口糧的效率的方法。同樣地，需要一種可被單胃動物有效利用而不需要添加脂肪的食物口糧。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種提高單胃動物利用含低的可代謝能含量的飼養(yǎng)口糧的效率的方法。本發(fā)明的又一個目的在于提供可被單胃動物有效利用而不需要添加脂肪的飼養(yǎng)口糧。按照本發(fā)明的一個實施例，這些和其他目的通過提供一種包含下述組分的飼料組合物而達到(a)豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纖維素酶，其中，所述飼料組合物的總可代謝能含量小于3086千卡/公斤。本發(fā)明的另一個實施例是一種包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纖維素酶的飼料組合物，其中，所述飼料組合物的總可代謝能含量小于3086千卡/公斤。本發(fā)明的又一個實施例是一種包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的飼料組合物，其中，所述飼料組合物的總可代謝能含量小于3086千卡/公斤。本發(fā)明的又一個實施例是一種包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的飼料組合物，其中，所述飼料組合物的總可代謝能含量小于3086千卡/公斤且基本不含脂肪。本發(fā)明的又一個實施例是一種包含(a)大豆粉；(b)必需氨基酸和(c)甘露聚糖酶如內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的飼料組合物，其中，所述飼料組合物的總可代謝能含量小于3086千卡/公斤且含小于2％的總粗脂肪。圖1是本發(fā)明的應用內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的用于飼料加工的雙頭式泵的流程圖。圖2是本發(fā)明的以高至每小時50噸顆粒飼料的生產速度進行飼料生產的成功的酶應用例。任何半纖維素酶，包括任何甘露聚糖酶，更具體地說，內-1，4-β-D-甘露聚糖酶可用于本發(fā)明，所述內-1，4-β-D-甘露聚糖酶對減少為得到或增加消費低脂肪食物的動物的增重所需的飼料有效。作為一個例子，一個較佳的酶源是商品名為Hemicell的Bacilluslentus(ATCC5045)內-1，4-β-D-甘露聚糖酶(FodgeandAnderson，見上；Fodge，AndersonandPettey，見上)。當評價由酶產生的附加值時，“點”系統(tǒng)被經常使用，“點”系統(tǒng)是“體重”點(Pw)與“飼料轉換，FC”點(PFC)之和。FC由消費的飼料重量除以活重而算出。兩種點的定義如下PW＝(試驗體重-對照體重)/0.06磅(在45天)PFC＝(對照FC-試驗FC)/0.01用Hemicell在美國進行的絕大多數飼料試驗中，觀察到的雞的改善與FodgeAndAnderson(見上)報道的結果具有相等程度。在火雞和豬身上也觀察到類似結果(數據未顯示)。有時，由使用內-1，4-β-D-甘露聚糖酶而觀察到的改善會大大超出事先的預期。因此，由本發(fā)明者之一在中國的四個不同地方進行了試驗。參見Jia，J.R.，H.R.Zhang，Z.C.Liang，T.LiandF.R.Meng，Applicationofendo-1，4-β-mannanaseinFeedIndustry，ZhongguoSiliao(ChinaFeed)2419-21(1995)。計算四個試驗的結果的平均值，使用內-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，出現24.6點的改善。Jia等的數據歸納在表1中。對在中國的試驗中使用的食物和典型的美國食物之間出現的差異進行了檢查。根據這些差異，進行了一些精心控制的科學試驗以調查產生更大的β-甘露聚糖酶沖擊的原因。未預料到的結果是口糧的脂肪信號或千卡含量是增強內-1，4-β-D-甘露聚糖酶效果的關鍵，詳見下述。表1在中國的皺雞欄飼試驗中的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的效果(Jia，R.J.，等，1995)<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="586">地域受試雞數測試時間平均增重增重所需總點數飼料的減少PW+PFC北京2,00052日0.4720.1724.8山東青島2,40056日0.4190.3036.9江蘇連云港4,70029日0.2200.0912.7山東濰坊4,00049日0.4170.1723.9</table></tables>將甘露聚糖酶濃度調至1000MU/l，通過還原糖法加以確定。酶的濃度也可以確定，例如有粘度法或基于藍色染料的檢測方法。藍色染料法一般被用作監(jiān)測發(fā)酵進程的快速分析法，而還原糖法一般被用作最終產品和飼料樣品的質控分析法。最終產品具有的pH被調至7.0～7.5間，酶溶液由于150g/l氯化鈉的添加而對次級微生物生長呈現穩(wěn)定。在該形態(tài)中，酶非常穩(wěn)定且被保持在環(huán)境溫度中直至被用。宜用兩種方法將酶產物施用至飼料中。第一種方法是，用流化床式干燥器將酶以每磅100MU的濃度干燥至大豆渣上(20-80目，ArcherDanielsMidland公司)。干燥過的酶產物的最終含水量宜保持在8％以下。當配制飼料時，加入該產物并以1磅內-1，4-β-D-甘露聚糖酶干產物/2000磅飼料的比例摻合。在造粒過程中，當混合飼料勿需被加熱至高溫(例如小于160°F)時，一般使用該干產物法。目前在飼料生產上的一種趨勢是在飼料造粒機和/或飼料膨化機和擠出機中使用高溫。因此，在許多情況下，可將內-1，4-β-D-甘露聚糖酶液體產物以每噸100MU的比例噴至預成形的飼料顆粒上。在順顆粒冷卻機下來的飼料生產線的一個位置，宜于噴灑酶產物的區(qū)域正前方，用導管或管道中的整流錐或整流板將下落的飼料分布成一條寬的，但淺近縱深的物流。這樣，用雙頭式泵連續(xù)地以水稀釋約100ml液體內-1，4-β-D-甘露聚糖酶/噸飼料，并被用中壓以均勻型式通過噴嘴噴至下落的飼料流上?；蛘?，將稀釋的酶滴在旋轉的圓盤上，接著，圓盤用所謂旋轉式涂布法將酶噴至通過圓盤周圍的飼料幕上。第三種方法是將酶噴入通常在其他一些液體飼料成分如脂肪或霉菌抑制劑被施用后設置的顆?；旌涎b置中。在該工藝中，加至飼料中的水分的量并非很重要，這樣，酶被立即吸附，且添加的水分不會加速微生物生長或侵蝕顆粒結構。添加酶后，飼料通過一混合器以確保得到酶在飼料中的均勻分布。優(yōu)選能使飼料以均勻流速通過酶噴灑區(qū)的機器。在噴灑工藝的一最優(yōu)選的方式中，可使用得克薩斯州Milltron-ics公司生產的、用于根據飼料流速調節(jié)噴灑速度的流量計裝置或密西根州APEC(自動工藝設備公司)生產的旋轉式涂布裝置(Stem-ler，T.，Extendingfeedprocessingpastthepelletmill.FeedManagement454，1994)。在較佳的情況下，飼料中的酶含量宜在15％以下。施用超過100MU酶/噸飼料的目標量的酶是無害的。酶的應用模式和用于高溫飼料造粒機的設備的優(yōu)選方式的更詳細的描述將在下面的實施例3中給出。如上所述，進行了大量的使用內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的動物欄內試驗和全域試驗。在進行足夠的重復實驗以產生統(tǒng)計學上結果的情況下，以及酶被以合適水平均勻施用的情況下，以及其它常見的失誤如非均勻飼料被避免的情況下，數據證實，在飼料中摻入甘露聚糖酶可提高飼料效率。六個雞欄飼試驗的結果歸納在表2中。還對各種火雞和豬用各種飼料組合物在不同的地理位置進行了研究。如Jia等報道的在中國的試驗(參見表1)，試驗結果往往超過所預期的。檢查這些試驗中與平常的差異，導出了本發(fā)明。表2β-甘露聚糖酶在含有48％蛋白質的大豆粉的美國型食物中的效能改善<p>表3典型的美國雛雞口糧與Jia等在中國使用的食物中的主要組分的比較典型的美國雛雞口糧</tables>表3比較了典型的高度優(yōu)化的美國雛雞食物與Jia等1995年研究(表1)中所用飼料的組分。兩種食物均以玉米-大豆為基料，但存在一些差異。在中國食物中，很少或未加入濃縮脂肪，且ME(可代謝能)平均高于美國食物約6.3％。觀察到的另一件事是，中國食物使用含約44％蛋白質的大豆粉(SBM44)，而美國食物中使用含48％蛋白質的大豆粉(SBM48)。更高的蛋白質百分比意味著由大豆豆莢而來的豆粉中的纖維更少。由于大豆豆莢富含甘露聚糖(參見Whistler，R.L.andJ.Saarnio，Galatomannanfromsoybeanhulls，J.Am.Chem.Soc.796055-57)，算出的半乳甘露聚糖在兩種配方中的百分比平均多于中國食物約66％，盡管在兩種配方中均相當低。粗蛋白含量也類似，但中國食物中的賴氨酸量顯著高于國家科學研究委員會(NRC)的推薦值。表3中的美國食物均含有以摻合料為基準，超出NRC推薦值約4.7％的賴氨酸，而中國食物中的賴氨酸含量超出NRC推薦值約13.8％。通過周密設計、精心實施的雞生長欄飼試驗，在用內-1，4-β-D-甘露聚糖酶保持甘露聚糖含量低且恒定的條件下測定脂肪(高能食物，食物B)的效果。飼養(yǎng)試驗詳見下面的實施例1。飼養(yǎng)試驗(詳述于實施例2)中使用的食物歸納在表4中。在三個成長階段(前期、生長期、后期)的食物A中的脂肪均少于食物B約3％，但食物A多于中國典型的雛雞食物約85Kcal/kg。使兩種食物中的粗蛋白量保持相同，添加的大豆蛋白的水平非常接近。賴氨酸和其它必需氨基酸、維生素以及礦物的含量與實際接近一致。食物A中添加了更多的玉米以補償濃縮脂肪的去除。由于玉米成本遠低于脂肪，這樣做是有利的。各食物在有和無內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的條件下均進行了試驗。表4在實施例4的加控欄飼試驗中的食物的基本組分食物A關鍵成分前期生長期后期0-21日22-35日36-43玉米62.40％68.40％71.40％SBM4831.10％25.00％21.40％添加的脂肪0.73％1.10％1.86％組分NRC賴氨酸的％113％108％124％粗蛋白22.00％19.50％18.00％ME(Kcal/Kg)3,008.53,085.63,162.7食物B關鍵成分前期生長期后期0-21日22-35日36-43玉米58.60％64.60％67.60％SBM4831.70％25.60％22.00％添加的脂肪3.86％4.19％4.99％組分NRC賴氨酸的％109104121粗蛋白22.00％19.50％18.00％ME(Kcal/Kg)3,151.73,228.93,306.0</table></tables>酶在8欄中，每欄70只雞。試驗進行45天。試驗結果歸納在表5中。使用了兩種飼料，加入內-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，出現統(tǒng)計學上非常顯著(P＜0.05)的改善。但加入內-1，4-β-D-甘露聚糖酶后，食物A所出現的改善優(yōu)于食物B的二倍以上。當檢驗產生1磅雞活重所需的千卡時，食物B減少了40千卡/磅活重，而食物A減少了91。也許最重要的是不含酶的食物B與含酶的較低脂肪的食物A之間的比較。比較兩者，飼料轉換和體重未見統(tǒng)計學上的差異，但加β-甘露聚糖酶的食物A的千卡/磅活重減少了131。該數據顯示，如果按規(guī)定以100MU/噸的比例加入有效的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶，則可從食物中除去3％脂肪，降低約143Kcal/Kg的千卡含量而沒有效能的下降。由于目前工業(yè)上使用的濃縮脂肪成本高，使用食物A加酶的食物的經濟利益非常顯著。這令人驚異的結果是未曾預料到的。SBM44中的較高甘露聚糖含量是典型的美國食物和中國食物之間的顯著差異，它被認為會引起甘露聚糖酶對中國食物產生更大的沖擊。這些未曾預期的結果表明，脂肪也具有關鍵性的作用且內-1，4-β-D-甘露聚糖酶確實比先前發(fā)現的更多地改善了飼料的能級。為得到使用甘露聚糖酶后ME的千卡增加的全部利益，宜將必需氨基酸水平相應地調高以使它們不成為限制因素。表5內-1，4-β-D-甘露聚糖酶對具有不同能級的食物的效果的匯總表</tables>1考慮到雞的死亡，將死雞重量計入總重量對F/G進行校正2飼養(yǎng)改善點的定義見上述正文3具有不同文字上標的欄內數字經ANOY分析法和最小顯著差異法確定為具有統(tǒng)計學上差異(P＜0.05)本發(fā)明的飼料增補法并不限于內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的任一來源。其它可用于本法的甘露聚糖酶在從自然界分離后和通過傳統(tǒng)的、或本領域熟知的重組DNA技術生產后可容易地加以確定。甘露聚糖酶編碼基因已從數種來源中分離得到(Luthi，E.，N.B.Jas-mat，R.A.Grayling，D.R.LoveandP.L.Bergquist，Cloning，saquenceanalysis，andexpressioninEscherichiacoliofagenecod-ingforaβ-mannanasefromextremelythermophilicbacteriumCal-docellumsaccharolyticum，Appl.Environ.Microbiol.57694-700(1991)；Akino，T.，C.Kato，andK.Horikoshi，TwoBacillusβ-mannanaseshavingdifferentCOOHterminiareproducedinEs-cherichiacolicarryingpMAH5，Appl.Environ.Microbiol.553178-83(1989)。而且，可通過本領域熟知的“proteinengineering(蛋白質工程)”的技術對酶進行改進以供使用。通過變異改變DNA編碼序列，可改變蛋白質結構。例如，通過改變氨基酸序列中可在升高的溫度下使氧化性能、蛋白質分解性能降低或結構更穩(wěn)起的特定殘基，可改善甘露聚糖酶的穩(wěn)定性。在用X射線結晶學方法確定蛋白質的三維晶體結構后，這些結構變化可容易地預測到?；蛘?，可通過基因序列的針對特定區(qū)域，但隨機的誘變，以及隨后對所得變異酶進行所需改善性能篩選，來進行改善。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，使用熱穩(wěn)定性提高了的、可經受造粒、膨化或擠出過程中對飼料施加的蒸汽熱處理的甘露聚糖酶。在這種情形中，宜在造粒前將酶與其它飼料成分以干式直接摻合。可通過例如方法的組合來提高熱穩(wěn)定性。一種方法是以具有固有熱穩(wěn)定性的酶如從嗜熱性微生物分離得到的酶開始。但在40℃的專一活性必須足以如本方法中所述，供給約100MU/噸。第二種可選擇的方法是通過上述蛋白質工程或隨機變異區(qū)域定點誘變和對具有改善的性能的酶的選擇而提高嗜溫性酶的熱穩(wěn)定性。第三種可選擇的方法是將酶與穩(wěn)定劑和/或可阻止蒸汽滲透，但不會影響酶已有的在動物內臟中的溶解性和活性的添加涂料混合。已知一些糖如threalose可使蛋白質穩(wěn)定。參見Colaco，C.，S.Sen，M.Thangavelu，S.PinderandB.Roser，Extraordinarysta-bilityofenzymesdriedinthrehalosesimplifiedmolecularbiology，Bio/Technology101007-11(1992)；Roser，B.J.Protectionofproteinsandthelike，U.S.Patent4，891，319。也已知道一些化學品如環(huán)-2，3-二磷酸甘油酸酯(Seely，R.J.andD.E.Fahrney，Thecyclic-2，3-diphosphoglyceratefromMethanobacteriumther-moautotrophicumistheD-enantiomer，CurrentMicrobiol.1085-88，1984；Hensel，R.andH.Koning，Thermoadaptationofmethanogenicbacteriabyintracellularionconcentration，FEMSMicrobiol.Lett.4975-79，1988)和二肌醇1，1′-磷酸酯(Scholz，S.，J.Sonnenbichler，W.Schafer，andR.Hensel，Di-myo-inosi-tol-1，1′-phosphateanewinositolphosphateisolatedfromPyro-coccuswoesei，FEBS306239-242，1992)以及高濃度鹽(Bre-itung，J.，R.A.Schmitz，K.O.StetterandR.K.Thauer，N5，N10-methylenetetrahydromethanopterincyclohydrolasefromtheex-tremethermophileMethanopyrusKandleriincreaseofcatalyticef-ficiencyandthermostabilityinthepresenceofsalts，Arch.Microbi-ol.156517-524，1991)與一些極端嗜熱性微生物中的蛋白質的穩(wěn)定有關。因此，嗜熱性酶、穩(wěn)定化變異、穩(wěn)定劑或這些因子的組合可用于制備可經受在本發(fā)明一優(yōu)選方式中的飼料造粒過程中的加熱處理的甘露聚糖酶。甘露聚糖酶生產性微生物可容易地從自然界中通過選擇可在作為唯一碳源的以甘露聚糖為基料的樹膠中生長的微生物而選出。任何富含有機質的土壤均可成為這些微生物的良好的可能來源。例如，已知許多種樹木半纖維素含大量的甘露聚糖(Sjostrom，E.，Chap-ter3，WoodPolysaccharides，InWoodChemistry，FundamentalsandApplications，pp49-67，AcademicPress，NewYork，1981)。因此，存在腐敗的樹木的地方往往是甘露聚糖酶的富源。某些類型的農業(yè)區(qū)域也同樣可能是生產甘露聚糖酶的微生物的富源。例如，下述地方往往存在豐富的可生產內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的甘露聚糖降解微生物豆科作物、咖啡、椰子的生長或加工地方/椰肉干的加工地方、或已知是甘露聚糖富源的其它植物種的生長或加工的地方。內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的數種來源已有描述(McCleary，B.V.，β-D-Mannanase，MethodsinEnzymology160596-610，1988；)，它包括真菌(Johnson，K.G.，Exocellularβ-mannanasesfromhemicel-luloyticfungi，WorldJ.Microbiol.Biotechnol.6209-217，1990；Araujo，A.andO.P.Ward，Studiesonthegalactomannan-degradingenzymesproducedbySporotrichumcellulophilum，J.IndustrialMicrobiol.8229-236，1991；Kusakabe，I.，G.G.Park，N.Kumita，T.YasuiandK.Murakami，Specificityofβ-mannanasefromPenicilliumpurpurogenumforKonjacglucoman-nan，AgricBiol.Chem.52519-524，1988)、極端嗜熱生物(Luthietal.，1991，見上；Bicho，P.A.，T.A.Clark，K.Mack-ie，H.W.MorganandR.M.Daniel，Thecharacterizationofathermostableendo-β-1，4-mannanaseclonedfromCaldocellumsac-charolyticum，Appl.Microbiol.Biotechnol.36，337-343，1991)、超嗜熱生物(Adams，M.W.，andR.M.Kelly，EnzymesfromExtremeEnviroments，Chemical&amp;EngineeringNews，pp32-42，December18，1995)、鏈霉菌(Kusakabe，I.，R.Takahashi，β-mannanaseofStreptomyces，MethodsinEnzymology160611-614，1988；Takahashi，R.，I.Kusakabe，H.Kobayashi，K.Mu-rakami，A.MaekawaandT.Suzuki，PurificationandsomepropertiesofmannanasefromStreptomycessp.Agric.Biol.Chem.482189-2195，1984)、和枯草菌(Araujo，A.，andO.P.Ward，HemicellulasesofBacillusspeciespreliminarycomparativestudiesonporductionandpropertiesofmannanasesandgalac-tanases，J.Appl.Bacteriol.68253-261，1990Araujo，A.andO.P.Ward，MannanasecomponentsfromBacilluspumilus，Appl.Environ.Microbiol.561954-1956，1990；Akinoetal.，1989，見上；Akino.T.，N.NakamuraandK.Horikoshi，Characteriza-tionofthreeβ-mannanasesofanalkalophilicBacilhussp.，AgricBiol.Chem.52773-779，1988；Emietal.，1972，見上)。還有，由黑曲霉生產的甘露聚糖酶市場上有售(兩個例子是Solvey酶(半纖維素酶)和NovoNordisk(GamanaseTM)。一旦根據其在以甘露聚糖作為唯一碳源進行生長的能力而鑒定微生物群體為甘露聚糖酶的潛在性來源后，通過在置入了溶于熔化的瓊脂糖溶液中的藍色染料改性過的甘露聚糖的培養(yǎng)皿上的涂覆培養(yǎng)，可容易地鑒定分泌甘露聚糖酶的單獨微生物。待瓊脂糖固化后，甘露聚糖酶生產微生物產生由藍色染料標記過的甘露聚糖片段的快速擴散引起的明顯的透明區(qū)域。一旦鑒定后，使用包括均為本領域熟知的基因改良(Rowlands，R.T.，Industrialstrainimprovementmutagenesisandrandomscreeningprocedures，EnzymeMicrob.Technol.63-10，1984)和發(fā)酵技術在內的標準方法生產足夠試驗的酶。一旦鑒定了有用的甘露聚糖酶后，使用可包括基因克隆和表達在內的菌株改良以通過發(fā)酵法進一步改良酶生產。在某些情形，在接種和純化可生產甘露聚糖酶的單獨微生物種之前，克隆甘露聚糖酶也可能是更可取的。DNA可直接從天然源分離得到，克隆入例如大腸桿菌中的表達載體，然后篩選生產所需甘露聚糖酶的重組克隆(Robertson，D.E.，E.J.Mathur，R.V.Swanson，B.L.Marrs，andJ.M.Short，Thediscoveryofnewbiocatalystsfrommicrobialdiversity，SIMNews，463-8，1996)?？捎糜谠搼玫母事毒厶敲傅牧硪粋€來源來自植物源。由于甘露聚糖在種子中經常用作貯存聚合物，一些發(fā)芽種子如紫花苜蓿(Medicagosativa)或瓜爾豆(Cyamosistetragonolobus)是甘露聚糖酶的良好來源(McCleary，1988，見上)。使種子發(fā)芽，然后加工以產生酶的濃縮源。另外，可將完全發(fā)芽的種子磨成粉，以直接用于飼料。這時，種子在飼料中可有兩個用途，第一個是作為甘露聚糖酶源，第二個是作為蛋白質和碳水化合物源。然而，若發(fā)芽種子具有壓倒甘露聚糖酶效應的其它一些抗營養(yǎng)性能，則這類種子往往不會對本方法十分有用。也可以對植物進行基因工程操作以使植物的果實、種子、莖干或葉子產生甘露聚糖酶。作為可引用的無數例子中的一個，外源酶已在被大規(guī)模栽培的商用油籽植物油菜中被表達(vanRooijen，G.J.H.，andM.M.Moloney，Plantseedoil-bodiesascarriersforforeignproteins，Bio/Technology1372-77，1995)。植物基因工程是本領域熟知的另一個可能的甘露聚糖酶源，它可用于本發(fā)明的實踐。另一種在消化道中將甘露聚糖酶導入飼料中的方案和本發(fā)明的優(yōu)選方式是對動物(即豬、雞或火雞)進行遺傳改良，以使內-1，4-β-D-甘露聚糖酶在消化道中被合成。這可通過下述方法進行導入具有交替結構的甘露聚糖酶基因，這樣，使其受控于調節(jié)序列，調節(jié)序列一般調節(jié)另一種消化酶如一種進入消化道的蛋白酶的生產和/或引起分泌。通過使用編碼被分泌至消化道的不同部分中的酶的基因中的調節(jié)序列，可使甘露聚糖酶分泌定向至使其沖擊效果最優(yōu)化的不同部位。這種轉基因技術已被用于例如使基因動物乳腺的奶中產生異源蛋白質(Campbell，A.M.，Transgenictechnology，Bio-pharm928，1996；Velander，W.H.，J.L.Johnson，R.L.Page，C.G.Russell，A.Subramanian，T.D.Wilkins，F.C.Gwazdauskas，C.Pittius，W.N.Drohan，High-levelexpressionofaheterologousproteininthemilkoftransgenicswineusingthecDNAencodinghumanproteinC，Proc.Natl.Acad.Sci.8912003-12007，1992；Hansson，L.，M.Elund，A.Elund，T.Jo-hansson，S.L.Marklund，S.Fromm，M.Stromqvist，andJ.Tornell，Expressionandcharacterizationofbiologicallyactivehu-manextracellularsuperoxidedismutaseinmilkoftransgenicmice，J.Biol.Chem.2695358-63，1994)。與制造或導入消化道中的方法無關，本方法中的各甘露聚糖酶均需在動物飼養(yǎng)試驗中進行測試。這樣的測試最好按與實施例1和2中詳述的方法類似的方法進行。試驗中加入的酶的數量宜根據這里所用的pH和溫度確定，即使這些條件對被測試的酶而言并非最佳。然后，在每噸飼料中加入100MU酶。在本發(fā)明中，對本發(fā)明的展開過程中所用的技術的某些方面給出下列定義。甘露聚糖被認為是可被內-1，4-β-D-甘露聚糖酶部分或廣泛地降解的任何碳水化合物聚合物。因此，“甘露聚糖”一詞包括以β-1，4-D-甘露聚糖為基的聚合物，如在1，4-β-D-甘露聚糖聚合物主鏈上具有1，6交聯的半乳糖支鏈(或任何其它分支糖)的半乳甘露聚糖，或具有一些散開在主聚合物鏈上的1，4-β-D-葡萄糖殘基的葡甘露聚糖。根據該定義的甘露聚糖的一些實際例子包括瓜爾(Cyamop-sistetragonolobus)膠、剌槐豆膠、太卡棕櫚(象牙椰子)、干椰子仁甘露聚糖(椰子)、色利普粉甘露聚糖、咖啡甘露聚糖和稻子豆膠(Cera-toniasiliqua)甘露聚糖(Whistler，R.L.andC.L.Smart，Polysaccharidechemistry，Academicpress，1953)。半乳甘露聚糖非常廣泛地分布于自然界中。例如，半乳甘露聚糖存在于大多數，但非所有的豆科作物的胚乳中(WhistlerandSmart，1953，見上)。因此，就含大量的肯定存在胚乳甘露聚糖的任何豆粉的任何飼料而言，添加有效甘露聚糖酶的有益效果是預料到的。在本發(fā)明中，內-1，4-β-D-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)也用其它名稱描述，例如用甘露聚糖內-1，4-β-D-甘露糖苷酶或簡便地用胞內甘露聚糖酶、甘露聚糖酶或半纖維素酶。用于動物飼料應用的有效甘露聚糖酶被定義為一種可酶促降低刺槐豆膠或瓜爾膠溶液的粘性并對在使用首先由Fodge和Anderson(FodgeandAnderson，見上，U.S.Patent5,429,828)描述的以玉米/豆粉(例如大豆粉)為基料的食物進行的科學控制的飼養(yǎng)試驗中提高飼料轉移效率的酶制劑(純品或粗品)。大豆粉是目前廣泛使用的商品并主要用作動物飼料的蛋白質源。大豆粉經過大豆油的萃取和脫去絕大部分豆殼后，富含蛋白質，目前是高度優(yōu)化的動物飼料中的主要甘露聚糖源。適用于本發(fā)明的大豆粉一般含44％粗蛋白(稱為SBM44)或48％粗蛋白(稱為SBM48)。就含其它甘露聚糖源，尤其是含來自其它豆科植物如豌豆、菜豆、兵豆、苜蓿及其它的甘露聚糖源的食物而言，甘露聚糖酶效應與低食物ME能量對飼養(yǎng)改善的正的相互作用是預料到的。本發(fā)明中使用的“豆科(legumeplantfamily)”一詞是用于表示Leguminosae或Fabaceae科的通用名，英文中也常稱作pulsefamily(豆科)。該科中的許多植物如大豆，富含優(yōu)質蛋白，它們的胚乳中存在甘露聚糖(WhistlerandSmart，1953，見上)。許多豆科植物是理想的飼料成分，通過本發(fā)明的運用，其價值得到進一步地提高。在本發(fā)明中，內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的單位可通過本文描述的測定法得到。甘露聚糖酶的有效劑量相當于100,000,000單位(100MU)/噸飼料。Hemicell是適用于本發(fā)明的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶的注冊商標，但任何其它有效的甘露聚糖酶也可用于本發(fā)明。可代謝能(ME)是可被動物消化的飼料中的熱能含量(以千卡/公斤計)。對一給定飼料成分而言，可代謝能隨消費該成分的動物種類而異。常見飼料成分的大致的ME值已有發(fā)表(Dale，N.，Ingre-dientanalysistable1995Edition，Feedstuffs6724-39，1995)。當配制營養(yǎng)平衡的食物時，以及當由于飼料成分的價格和市場供給情況變化而以最低成本重新調配時，動物營養(yǎng)學家將會利用上述信息。在本發(fā)明中，飼料可代謝能由《Feedstuffs》雜志中的《成分分析表》(Dale，1995，見上)或其最新版中確定含量的各成分產生的可代謝能(ME)之和確定。對本發(fā)明而言，NRC必需氨基酸要求如《Feedstuffs》就豬(Easter，R.A.，J.Odle，G.R.HollisandD.H.Baker，Dietarynutrientallowancesforswine，Feedstuffs，6740-46，1995)和家禽(Waldroup，P.W.，Dietarynutrientallowancesforpoultry，Feedstuffs6769-76，1995)發(fā)表的文獻所描述的。上述要求在該文獻中以術語“每單位食物的可代謝能含量所要求的氨基酸量”來確定。在本發(fā)明中，術語“轉基因操作”的定義為通過重組DNA的應用，在動物體內生產蛋白質。重組DNA的定義為DNA(不論其是從天然源分離得到的，還是完全化學合成的)在體外操作，然后為了其后的表達，將其導入生物內。變異在本發(fā)明中的定義為通過針對特定區(qū)域、針對特定部位或隨機的變異來改變基因的DNA序列。內-1，4-β-D-甘露聚糖酶可用任何已知的方法，例如用還原糖測定法方便地制成。在典型的還原糖測定法中，下列物質被使用3，5-二硝基水楊酸(DNS)，Aldrich，＞98％純苯酚-試劑級四水(合)酒石酸鉀鈉——試劑級氫氧化鈉(NaOH)鹽酸(HCl)亞硫酸鈉(無水)剌槐豆膠(Sigma公司，#G0753)三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液D-(+)-甘露糖，試劑級(Sigma公司，#M-4625)四環(huán)素-HCl40℃水浴沸水浴Sorvall臺式離心機微量離心機(例如Eppindorph，1.5ml塑料管)旋轉式混合器分光光度計(用于在550nm讀數)pH儀16×100mm玻璃管13×100mm玻璃管磁力攪拌棒和磁力攪拌/加熱板燒杯、量杯、貯存瓶、分析天平帶一次性槍頭的可變式移液管裝置(1ml)250ml擋板搖瓶(Bellco公司)平臺式搖瓶機(NewBrunswickScientific公司)試劑二硝基水楊酸(DNS)可用作試劑。為制備1升穩(wěn)定的儲液，將下列成分溶于水中。NaOH10g(先加)DNS10g苯酚2g四水合酒石酸鉀鈉200g使用前，使溶液放置1日并在黑暗中保存。工作液應通過往儲液中加入0.5克/千無水亞硫酸鈉來制備。底物刺槐豆膠(LBG)可通過室溫下將LBG緩緩加至50mMTris緩沖液(pH7.5)的快速攪拌液中而制成5克/升懸浮液。將粉末分散后，加熱懸浮液至沸騰并在攪拌下于加熱攪拌板上慢慢煮1小時以得到非常均勻的、充分水合的凝膠。確認溶液中無未水合的凝膠的小團塊存在。若有小團塊存在，重新以更慢的速度往Tris緩沖液中加入LBG。冷卻所得溶液至室溫并將其調整至所需的最終體積以得到5克/升LBG。往樹脂溶液中添加作為防腐劑的四環(huán)素鹽酸鹽(30mg/ml)。不用時，在4℃貯存。貯存后，使用前應充分混合。標準液和標準曲線可通過制備一系列濃度在0.1～0.5克/升的溶于水的D-(+)-甘露聚糖標準液而得到。在13×100mm玻璃管中加入含1.5mlDNS工作液和0.6ml各甘露糖標準液(一式兩份或三份)。在1.5mlDNS工作液中加入0.6ml水作為反應空白以使分光光度計歸零。在沸水浴中加熱5分鐘，冷卻至環(huán)境溫度并讀出在550nm的吸光度。期望的結果是一條在0.25×1.7O.D.單位間的線性劑量反應線。〔注在酶分析法(下述)中，由于底物的限制，僅出現在0.25-1.2O.D.間的數據被用于計算，超出上述范圍，酶反應呈非線性〕。僅從曲線的線性部分計算標準曲線的斜率(550/克/升甘露糖)。該標準曲線隨所得DNS試劑的批次而異。若預計將進行許多測試，購買時最好買大批量的DNS。典型的標準曲線如附圖所示。該曲線的斜率等于4.706O.D./克/升甘露糖。通過以20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)稀釋液體樣品至約100,000U/l(0.1MU/l)來制備樣品。為最精確計，首先確定酶液的密度，然后使用分析天平以非常精確地通過重量來進行稀釋。在測試前，萃取動物飼料的固體樣品。加入10克固體酶載體至在250ml非擋板式搖瓶中的100ml水中，并在室溫下以200rpm混合30分鐘。將萃取液的一部分移至Eppindorph離心管中并離心(10,000-12,000RPM)2分鐘。取出部分透明的上清液并用20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)稀釋至約0.1MU/l供測試。在酶測試中，所有測試宜在試驗的各稀釋水平進行二或三次。稱取4克LBG底物至16×100mm玻璃管中并用水浴加熱至40℃〔注由于LBG溶液的粘性使其難以被移液，因此，稱重是最精確的〕。加入0.8ml酶溶液，用旋轉式混合器劇烈混合，重新置入40℃水浴中，開始計時。用水代替酶溶液作為對照，以使分光光度計調整歸零。酶反應約每5分鐘混合并就在取樣之前立即混合。在12、18和24分鐘時，取出0.6ml反應液并加至13×100mm玻璃管內的1.5mlDNS工作試劑中。立刻振蕩以停止反應。置入沸水浴中整5分鐘。冷卻至室溫，用臺式離心機以2700RPM離心10分鐘，讀出上清液在550nm的光密度(O.D.)。使用在測試的線性范圍(0.25-1.2O.D.550)中的讀數，以O.D./min算出酶率(enzymerate)。甘露聚糖酶(半纖維素酶)的chemGen(化學基因)單位具有由粘度法原始確定的任意的定義。單位的大小根據某些效能特性而選擇，且沒有轉換因子則不能直接與其它測試法比較。當將粘度法與此處描述的還原糖法聯系起來時，1CG單位(U)由LBG產生0.574微克還原糖/分。因此1CGMU產生0.574克還原糖/分。在實際中，可用下法計算。就內-1，4-β-D甘露聚糖酶(液體)而言MU/l(在測試溶液中)×稀釋因子＝MU/l(原液)就內-1，4-β-甘露聚糖酶(不加水的)而言MU/l(在測試液中)×稀釋因子＝MU/l(原萃取液)MU/l(原萃取液)×0.1l/0.01kg＝MU/kg內-1，4-β-D-甘露聚糖酶還可通過糖度法得到。本法是一種非常敏感的水解刺槐豆膠的內甘露糖苷鍵的甘露糖酶型活性的測試法。底物粘度中的相應還原是用校準粘度計測量的且被用于計算由ChemGen(CG單位)定義的活性單位。當需測量的活性很低或需要很高的精確性時，可使用該測試法。然而，操作手續(xù)較花時間。宜使用下列裝置和材料粘度計使用規(guī)格100的校準Cannon-Fenake型粘度計或其等同物。一種合適的粘度計是伊利諾斯州ScientificProducts公司生產的商品目錄號為No.2885-100的粘度計。玻璃水浴使用保持在40±0.1℃的恒溫玻璃水浴，一種合適的水浴是ScientificProducts公司生產的商品目錄號為No.3520-10的水浴。兩個電子計時器pH儀燒杯，量杯(1000ml，500ml)NaOH，HCl甘油(試劑級)磁力混合器/加熱板和磁力攪拌棒10ml移液吸管，2.0ml移液吸管帶一次性槍頭的1.0ml移液槍(例如Pipettman，RaininIustrumets公司)帶一次性槍頭的0.1ml移液槍(例如Pipettman，RaininIustrumets公司)分析天平18×150mm玻璃管抽吸裝置(為使用移液吸管而設計的)試管旋轉式混合器鋁箔宜在粘度測試法中使用下列試劑和溶液A.刺槐豆膠(LBG)可使用Sigma公司生產的粉狀剌槐豆膠。剌槐豆膠的粘度會附著時間升高。為使結果精確，底物應至少每月重新配制一次。為得到很好的底物，TS(見下述)應大于110秒。室溫下將LBG緩慢加至去離子水的快速攪拌液中，制成2克/升(0.2％)的LBG。將2克LBG非常緩慢地加至約900ml去離子水中并在攪拌板上迅速混合。等粉末充分分散后，緩慢加熱懸浮液至沸騰并在加熱攪拌板上慢慢煮并連續(xù)快速混合1小時或更長時間以得到非常均勻、充分水合的凝膠。確保溶液中無未水合凝膠的小團塊存在。若有，重新配制，將LBG更緩慢地加至水溶液中。冷卻至室溫并通過定量移至1000ml量杯中，用水稀釋和混合來調節(jié)溶液至所需的最終體積。貯存后，用前充分混合。最終溶液的pH應與pH6接近。B.甘氨酸緩沖液，2M(pH9.0)將75克甘氨酸溶于450ml去離子水中，連續(xù)攪拌下加入5N至pH計測得pH為9.0±0.05。定量移至500ml量杯中并用水稀釋。確認最終溶液中的pH為9.0。C.樣品配制液配制樣品在去離子水中的溶液，使0.5ml最終溶液在下述步驟中的特定條件下產生0.035-0.045/min間的相對流度(FR)的變化。這與在樣品的約1850-2400CGU/l范圍的活性相一致。超出該活性范圍，則測試的線性不能保證。對水溶液中的液體樣品，用水稀釋并用分析天平測量酶和添加的水以使精確度達到最佳。對由固體萃取的試樣，離心或過濾以除去會阻塞粘度計細孔的固體。為進行操作和計算，通過儀器抽入大量洗滌液(若需要除去粘附的殘留物)，再抽入水，并將預先校準的粘度計精確地以垂直位置置入70℃的玻璃水浴中，以徹底地清洗粘度計。在每次測量后均需進行上述步驟。測定TW將20ml去離子水吸移至粘度計貯液器中，并靜置數分鐘以使溫度平衡。將水抽提至粘度計中，使其高過頂標。讓溶液回流，當水的凹面下落通過第二標記時停止計時。重復測量數次。將平均時間定為TW(水溢出時間)。測定TS和對照率(controlrate)將10mlLBG底物置入一18×150mm玻璃管中，加入2ml2.0M甘氨酸緩沖液(pH9.0)，混合，用鋁箔封蓋并置入70℃水中數分鐘以加熱。加入0.5ml水，用旋轉式混合器迅速混合，并立即啟動第一計時器。將10ml溶液吸移至粘度計貯液器中，靜置片刻以進行平衡，然后抽提溶液，并用第二計時器確定溢出時間，這即是TS(以秒記錄)。每次測定TS，當溶液的凹面下落通過頂標時在第一計時器上記錄經過的時間(TR，反應時間，以數字分鐘記錄)。在理想的情況下，TS將無變化，顯示粘度無對照損失，在這種情況下，計算所用的TS應為各次測定的平均值。然而在某些情況下，存在本底率(BackgroundRate)。就本底率而言，底物溢出值被當作用相應的TR值計算的TT以計算下述的本底率。開始后測得的第一溢出時間被用作此本底率計算中的TS。某些批次的底物可能被少量的甘露聚糖酶型活性污染。若測得大于500U/l或初始TS小于110秒，最好制備新的底物溶液。酶率(EuxymeRate)將10mlLBG底物置入18×150mm玻璃管中，加入2ml2.0M甘氨酸緩沖液(pH9.0)，混合并置入70℃水中數分鐘以加熱。用鋁箔封口以防止用前水分蒸發(fā)。加入0.5ml酶稀釋液，用旋轉式混合器迅速混合并立即啟動第一計時器以測定TR值。將10ml溶液吸移至粘度計貯液器中，靜置片刻以平衡，然后抽提溶液。當溶液的凹面通過頂標時，用第一計時器記錄TR并用第二計時器開始測定溢出時間，這即是TT。立即重新抽提溶液至溶液高過頂標，以便在第二TR得到TT。繼續(xù)重復測量直至在最后一次TR測量后時間經過約15分鐘。推薦至少應有4個時間點。為進行所需的計算，數據被用于計算相對流度(FR)和歸一化的反應時間(TN)(為TR加相應的溢出時間的半值)。計算按下式進行FR＝TS-TW)/(TR-TW)和TN＝0.5(TT/60s/min)+TR＝(TT/120)+TR將相對流度(FR)作為縱坐標對作為橫坐標的四個反應時間(TN)進行標繪。應得到一直線。線的斜率與每分鐘相對流度的變化(FR/min)一致并且與酶的濃度相一致。使用通過一系列點得出的斜率較使用單一的相對流度值是更好的酶的判斷依據。理想的是，相對流度變化應為約0.04/min。若反應中存在本底底物降解，曲線圖的起始部分將是非線性的。使用標繪線變成線性后的數據來確定斜率。我們一般使用Lotus總分析表程序進行標繪和計算曲線斜率的最佳擬合以及進行為得到單位所必需的其它計算。加入反應中的0.5ml樣品的CG單位(U)/升的定義為CGU/l＝9.397×104×FR/min因素，原樣品酶濃度可按下式計算CGU/l(原樣品)＝1(CGU/l-底物對照U/l)×稀釋因子內-1，4-β-D-甘露聚糖酶還可用藍色染料測試法測試。按照該測試法，宜使用生產RBB(remizol亮藍)的方法(Meth-odsinEnzymology160538，1988)制備酶底物，其中，木聚糖被用來將RBB藍色染料結合至剌槐豆膠上?？赏ㄟ^加入0.7％剌槐豆膠(LBG)和0.07％染料至初始反應中而對上述方法進行改良。另外，在乙酸鈉和氫氧化鈉的存在下與RBB反應后，染色了的樹膠溶液在乙醇沉淀前通過滲析來除去鹽。這便于沉淀后的刺槐豆膠的再懸浮。與木聚糖法中使用的2倍體積的冰相比，在室溫下使用1倍體積的乙醇更可使染料結合的樹膠沉淀。通過將干粉緩慢加入迅速攪拌中的緩沖液中，使3.5克RBB-LBG溶解于1升50mMTris-HCl(pH7.5)中。在攪拌下加熱至沸騰，然后在121高壓加熱20分鐘，接著冷卻至室溫。離心以除去未溶解的物質。將上清液傾入合適的試管中，然后再次高壓滅菌。若無微生物污染被導入瓶中，該溶液在至少6個月期間是穩(wěn)定的。當以70％乙醇為對照進行讀數時，測試中的空白試劑(見下述)的光密度(O.D.)值應小于0.15。若該O.D.較高，舍棄此RBB-LBG試劑。測試方案A.用未氯化的水制備合適的樣品稀釋液和標準液。為得到標準曲線，用預先用還原糖法測定的酶標準液制備約1.5、2.0和2.5MU/l的稀釋液。應稀釋所測樣品以使活性位于1.5-2.5MU/l的范圍內。為得到最佳結果，用量杯和分析天平準確測定所需添加的酶溶液的量來制備稀釋液。B.將0.54mlRBB-LBG試劑加入1.5ml微型離心管中，并將該管置于40℃水浴中至少10分鐘。C.加入20μl酶并旋轉混合以啟動反應。孵育各樣品10分鐘整。為得到最佳結果，樣品應測試兩次。D.加入0.9ml無水乙醇(試劑乙醇)并充分混合以終止反應。在室溫下靜置該試管至少10分鐘。E.用離心機以8-12,000RPM離心試管3分鐘。F.用20μl水代替酶以使分光光度計調整歸零，用反應空白當作上述試樣，讀出在590nm的光密度。G.相對于稀釋的標準液的活性(MU/l)，標繪用該標準液測得的在590nm的OD值，得出斜率。計算樣品活性(MU/l)＝OD590nm×斜率×試樣稀釋因子下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1雞生長欄飼試驗法使用馬里蘭州ConAgraHatchery公司提供的商用雛雞(雌雄各半，Peterson×ArborAcres)，每欄70只，飼養(yǎng)1-45日，在小雞出殼日將其送至試驗處。所有小雞均在孵化場接種疫苗并作為正常處理。在第1日使用大小為5×12英尺的飼養(yǎng)欄，密度為每只雞占0.75平方英尺。建筑物為木頭/爐渣磚結構，用強制空氣加熱(第一周加上加熱燈)和白熾照明的方式加熱。每日監(jiān)測溫度并在開始3日保持溫度在92°F然后每日降低1°F至達到70°F并保持至試驗結束。時間延遲地平均每10分鐘啟動鼓風機1-4分鐘，促進空氣交換。試驗是在馬里蘭州東海岸從1995年10月31日進行至1996年12月15日。按典型的家禽工業(yè)和商品規(guī)格的已知要求制備飼料。用于整個試驗的飼料均進行混合并在約175°F造粒。實驗中使用的飼料均同時制備并滿足或超過由國家科學研究委員會制定的營養(yǎng)要求(Nu-trientRequirementsofPoultry，9thRevisedEdition，U.S.Nation-alResearchCouncil，1994)。采取部分控制混合，通過均勻噴射液體濃縮物，進行酶添加。供0至第21日使用的前期飼料為碎顆粒。生長期和后期飼料是以整粒形式使用的。最初孵化25只小雞并稱重。測出平均體重并求出平均值上下5克的范圍。隨機選出體重在該范圍內的小雞并分成每欄70只。實驗中，共使用3,840只雞(雌雄各半)。在研究過程中，每日三次監(jiān)測各欄。更具體地說，監(jiān)測食物和水的供給情況、溫度保持以及小雞和褥草的總體條件。在實驗的最初7天，用分別以它們各自的食物飼養(yǎng)并隨機選出的一群小雞中的小雞替換死亡的小雞。對用于各不同處理的8個飼養(yǎng)欄的建筑物全面進行隨機化以消除由建筑物中的飼養(yǎng)欄的物理位置引起的任何可能的偏差。在試驗過程中收集下列數據1.在第21日和第45日的各個體重。2.以飼料/增重之比算出飼養(yǎng)效率。增重為活雞體重和任何死雞的死亡時的體重之和。將已知數量的飼料加至各欄并減去在對雞秤重時欄內留存的任何未被食去的飼料的重量，測出飼料重量。3.死亡分析包括總死亡率以及死亡日。4.就第21日和第45日的各個體重算出標準誤差和變異系數。5.雞的其它觀察包括觀察雞的羽毛、物理外表和用Minolta色度計觀察皮膚色素。表6欄飼試驗體重數據，第1-45日平均欄體重(磅<p>在死亡率、羽毛、物理外表或皮膚色素方面，未觀察到各組之間存在任何顯著差異。結果歸納在上面表5中，食物配方的詳細內容顯示在實施例5(表8)中。詳細數據在下面的表6和表7中給出。表7欄飼試驗飼料轉換數據就雞死亡校正過的第1-45日飼料/增重</tables>在表6和表7中，對處理組指定如下T1＝3229千卡/公斤，無酶T2＝3229千卡/公斤，加酶T3＝3085千卡/公斤，無酶T4＝3085千卡/公斤，加酶實施例2在評定食物能量與甘露聚糖酶的相互作用的欄飼試驗中使用的食物的詳細內容表8提供了此處所述欄飼試驗中使用的食物的詳細描述。各成分均是動物營養(yǎng)領域的任何技術人員很熟悉的東西。在第0-21日使用前期飼料，在第22-35日使用生長期飼料，在第36-45日使用后期飼料。表8在評定能級效果的欄飼試驗中使用的食物的詳細描述實施例3用于在家禽飼料粉碎機中將酶施用至飼料顆粒上的噴灑系統(tǒng)在許多情況下，若在顆粒成型過程中使用超高溫，則將酶噴灑在預成型的飼料顆粒上可能較適宜。在某些位置，在顆粒成形過程中使用蒸煮飼料所需的加熱時間和溫度，這樣，絕大多數在本法中有效的酶將變性。圖1顯示用于用酶涂布飼料的泵送系統(tǒng)的流程圖。泵是雙頭式隔膜泵(duriron#E2＝(16)(07)115-68A31)，它被用于以約9∶1的比例將水和內1，4-β-D-甘露聚糖酶泵送至共用出口?；旌衔锪鬟^脈沖阻尼器(Blach#A301N)，當泵停止時，使用電磁閥(Asco#EF8210G87)以阻止水流動。流量計可用來肉眼觀察液體流速和用水稀釋的酶溶液的顏色?？烧{式壓力開關(Omega#PSW121)被用來探測任何管線阻塞和當壓力超過設定時，進行自動關閉。所用設定視酶出口相對于泵的高度而定，一般略大于由頭高產生的壓力。閥門被設置來進行液體取樣和泵頭的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶一側的啟動。用水壓調節(jié)器將生活用水水壓降至泵前的15磅/平方英寸。可用空氣調節(jié)器對內-1，4-β-D-甘露聚糖酶貯存罐或貯存桶增壓以防止泵起動的損失。貯存罐中的混合液的濃度設為1000MU/l，在每噸飼料中加入100MU酶。用行程長度調節(jié)器將泵另一側的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶流量調節(jié)至900ml/噸。上述流量通過測量酶濃縮物離開貯存桶或貯存罐的流量而進行檢驗。這樣，用水稀釋后，將1升稀釋過的液體酶加入每噸飼料中而僅增加約0.1％水分。在較佳實施方案中，通過現有的APEC(密西根州AutomatedProcessEquipment公司)制造的稱為旋轉涂布機的粉碎機中的脂肪涂布設備將酶加至飼料中。一般，將酶用管道輸送至與脂肪落在旋轉盤上相同的位置，其中，所述的旋轉盤將脂肪分散至以均一的速度在旋轉盤周圍下落的飼料薄幕上。脂肪涂布設備通常在粉碎機的頂部。高度變化在含稀釋酶的管道中產生足夠的壓力以正確地安裝用于正常運轉的泵逆止閥。來自粉碎機中的計算機的信號通過壓力開關的常閉側傳至馬達啟動器、領示燈和電磁閥。因此，當粉碎機開始制造飼料時，泵送系統(tǒng)自動啟動，除非出現超壓情況。在將飼料裝入貯藏庫或貨車時，進行取樣，以檢驗酶含量。所用的測試法如上所述，在本領域是已知的。當平均酶含量為100MU/噸，變異系數(CV)小于15％時，即獲得了應用的成功。圖2顯示在一可生產高至50噸顆粒飼料/小時的飼料粉碎機上成功地進行數星期的酶應用的例子。權利要求1.一種飼料組合物，包括(a)豆粉；(b)必需氨基酸和(c)半纖維素酶，其中，所述飼料組合物具有小于3086千卡/公斤的總平均可代謝能含量。2.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，所述豆粉為大豆粉。3.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，所述半纖維素酶是甘露聚糖酶。4.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，所述甘露聚糖酶是保藏號為ATCC55045的Bacilluslentus生產的內-1，4-β-D-甘露聚糖酶。5.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，所述飼料組合物基本上不含濃縮脂肪。6.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，添加的總脂肪含量小于2％。7.如權利要求1所述的飼料組合物，其特征在于，添加的總脂肪含量小于1％。全文摘要一種提高單胃動物利用低熱量食料的效率的方法。通過在不補充脂肪或含低脂肪量的食料中添加半纖維素酶如甘露聚糖酶來提高單胃動物利用該食料的效率。文檔編號A23L1/03GK1169251SQ9610712公開日1998年1月7日申請日期1996年6月21日優(yōu)先權日1996年5月3日發(fā)明者道格拉斯·W·福吉,H·Y·肖申請人:開姆根有限公司