專利名稱：生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有由假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物產(chǎn)生并能代謝咖啡堿之咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段；用含所說(shuō)的DNA片段之重組DNA轉(zhuǎn)化而得到的新的假單胞菌屬的菌株；以及產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法。
3-甲基-7-烷基黃嘌呤是一種重要的用于制備成藥的中間產(chǎn)品。例如，3，7-二甲基黃嘌呤(可可堿)是1-(5-氧代己基)-3，7-二甲基黃嘌呤(Pentoxyfyl line)的重要中間產(chǎn)品，3-甲基-7-丙基黃嘌呤是1-(5-氧代己基)-3-甲基-7-丙基黃嘌呤(Propentophyl line)的重要中間產(chǎn)物。
可按常規(guī)方法從可可豆中提取得到3，7-二甲基黃嘌呤，或者也可從3-甲脲合成得到。
通常是按JP-BP-52-33120(術(shù)語(yǔ)“JP-B”在這里是指“已審查的日本專利公開(kāi)”)中所述，將5-氧代己基基團(tuán)引入3-甲基-7-丙基黃嘌呤中來(lái)合成可用作治療腦血管病之藥物的Propentophylline。可通過(guò)各種化學(xué)方法合成起始材料3-甲基-7-丙基黃嘌呤。這種方法的一個(gè)典型例子是包括用堿處理1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤，以得到4-甲基氨基-5-甲基氨甲酰-1-丙基咪唑，后者與脲反應(yīng)得到N-甲基-N-(5-甲基氨基酰-1-丙基咪唑-4-基)脲，然后按JP-A-1-1 80883(術(shù)語(yǔ)“JP-A”在這里是指“未審查的已
公開(kāi)日本專利申請(qǐng)”)所術(shù)方法使之環(huán)化。但這些已知的化學(xué)合成方法在其工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中有許多問(wèn)題，包括需要使用非常復(fù)雜的步驟。因此，期望開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)單的合成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法。
另外，已研究了合成3，7-二甲基黃嘌呤的微生物技術(shù)。例如，Hoope-Seyler′s Z.Physiolo.Chem.，Vol.358，P.807(1977)，JP-B-4-12117和EP-A-0509834中提出使用能同化咖啡堿的微生物或其突變菌株，將1，3，7-三甲基黃嘌呤(咖啡堿)轉(zhuǎn)化成3，7-二甲基黃嘌呤。
然而，除3，7-二甲基黃嘌呤外，微生物合成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法是未知的。另外，從轉(zhuǎn)化效率等角度看，合成3，7-二甲基黃嘌呤的已知微生物方法仍不能令人滿意地進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
鑒于上述情況，本發(fā)明廣泛地研究了能夠使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤位點(diǎn)特異性地脫甲基的微生物，并出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)以前由本發(fā)明人從自然界分離的一個(gè)假單胞菌屬的菌株當(dāng)培養(yǎng)在含1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的培養(yǎng)基中時(shí)，能同化咖啡堿而在培養(yǎng)基中產(chǎn)生相應(yīng)的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發(fā)明人原先通過(guò)將從土壤中分離的同化咖啡堿的微生物突變而得到組成型的代謝咖啡堿的突變菌株，又進(jìn)一步突變?cè)撐⑸锸怪笔Я羁煽蓧A脫甲基而成為7-甲基黃嘌呤的能力，從而得到其雙突變的菌株(見(jiàn)EP-A-0509834)。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，上述雙突變菌株比從自然界分離的親代菌株有更強(qiáng)的將相應(yīng)1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力。
如果在由上述微生物完成的咖啡堿代謝途徑的第一個(gè)步驟能更有效地進(jìn)行，使從相應(yīng)1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力得到進(jìn)一步地提高。為此，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，以期提高已知可催化該反應(yīng)的咖啡堿脫甲基酶的活性。結(jié)果，他們成功地克隆了此前尚不明了其蛋白質(zhì)知識(shí)的咖啡堿脫甲基酶的基因。已基于這些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了(1)一種分離并純化的DNA片段，其含有衍生子假單胞菌屬之細(xì)菌的咖啡堿脫甲基酶基因；(2)根據(jù)上述(1)的DNA片段，它是由

圖1中所示的限制性核酸內(nèi)切酶裂解圖譜限定的(3)根據(jù)上述(2)的DNA片段，其中由SEQ ID NO1表示位于AccI位點(diǎn)和NdeI位點(diǎn)間的堿基序列，其含有咖啡堿脫甲基酶基因；(4)一種分離并純化的DNA片段，其含有編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的堿基序列；(5)將上述(1)或(4)的DNA片段整合到其載體中所得到的重組DNA；(6)包括用上述(5)的重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主的假單胞菌菌屬的新的細(xì)菌菌株；(7)上述(6)的假單胞菌菌屬的新的細(xì)菌菌株，其中宿主是臭味假單胞桿菌(Pseudomonas putida)以及(8)上述(7)的假單胞菌菌屬的新的細(xì)菌菌株，其中宿主是臭味假單胞菌IF-3-9C-21。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法，該方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用含有咖啡堿脫甲基酶基因的重組DNA轉(zhuǎn)化的微生物，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生相應(yīng)的3-甲基-7-烷基黃嘌呤并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法，該方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠?qū)?，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬的微生物或由之衍生的突變體，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生3-甲基-7-丙基黃嘌呤并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
圖1是含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段的限制性核酸內(nèi)切酶裂解圖譜。
圖2是圖解顯示在小罐中的培養(yǎng)進(jìn)程。圖中，分別以白圈代表臭味假單胞桿菌IF-3-9C-21/pCA32A生產(chǎn)可可堿的情況；白三角代表臭味假單胞桿菌IF-3-9C-21產(chǎn)生可可堿的情況；黑圈代表臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A產(chǎn)生3-甲基-7-丙基黃嘌呤的情況，黑三角代表臭味假單胞菌IF-3-9C-21產(chǎn)生3-甲基-7-丙基黃嘌呤的情況。
可用于本發(fā)明的微生物包括能將通式(I)代表1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤 (——其中R代表直鏈或支鏈的烷基基團(tuán)——)轉(zhuǎn)化成式(II)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤 (——其中R的定義同上——)的微生物。
本發(fā)明中，上述通式(I)和(II)的R優(yōu)選是C1-C4烷基基團(tuán)。
上述微生物包括屬于假單胞菌屬的細(xì)菌和由之衍生的突變體。特定例子是從土壤中分離并在EP-A-0509834中描述的臭味假單胞菌IF-3(已按布達(dá)佩斯條約以FERM BP-3824為登記號(hào)保藏)；以及在JP-B-4-12117中描述的假單胞菌菌種188-1(已按布達(dá)佩斯條約以FERM P-7073，F(xiàn)ERM BP-4282為登記號(hào)保藏)。
根據(jù)本發(fā)明人的研究，假單胞菌188-1(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，以保藏登記號(hào)FERM P-7073，F(xiàn)ERM BP-4282保藏)被鑒定為如下文描述的洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)。下文中將假單胞菌188-1(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，以FERM P-7073，F(xiàn)ERM BP-4282為保藏登記號(hào)保藏)稱為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)FERMBP-4282。
可按已知方法對(duì)上述菌株進(jìn)行突變處理以得到突變菌株，如用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(下文簡(jiǎn)稱為NTG)作為誘變劑進(jìn)行化學(xué)處理。另外，也可用2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶，甲磺酸乙酯，硫酸二甲酯，丫啶黃，丫啶桔黃(Acridine Orange)，肼，4-硝基喹啉-N-氧化物、氯化錳等作誘變劑。可使用紫外光照射或X射線、γ射線等放射活性照射等物理方法誘導(dǎo)突變(參見(jiàn)TheMolecular Basis of Mutation，John W.Drake(1970)，Holden-Day.Inc.and General Genetics(第2版)，W.H.FREEMAN ANDCOMPANY)。
可用已知方法分離突變菌株，如包括首先培養(yǎng)已經(jīng)受突變處理的微生物，然后檢查各菌落發(fā)生突變情況的直接方法；按上述方法進(jìn)行改進(jìn)的復(fù)制方法；使用青霉素等抗生素的凝聚方法；以及適當(dāng)聯(lián)合使用上述方法。
本發(fā)明中，采用下述實(shí)驗(yàn)程序選擇出能將1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-烷基黃嘌呤的菌株。從土壤中分離大約100個(gè)有咖啡堿抗性并能夠在含有1.0％Bacto-胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.5％氯化鈉和2.0％咖啡堿的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，分別接種于含有0.3％咖啡堿，0.3％硫酸銨，0.5％二代磷酸鉀，0.1％氯化鈉和0.2％硫酸鎂的瓊脂培養(yǎng)基(pH＝7.0)上并于30℃下培養(yǎng)3天，然后選擇生長(zhǎng)良好的菌株。
臭味假單胞菌IF-3和洋蔥假單胞菌FERMBP-4282的菌學(xué)性質(zhì)如下所述。按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of the Identification of Medical Bacteria(MIMB)，Identificaton of Microorganisms和Academic Society PressCenter，Japan出版的Classification and Identification ofMicroorganisms.Vol.II所述方法檢驗(yàn)這些細(xì)菌菌學(xué)性質(zhì)。
臭味假單胞菌IF-3a.形態(tài)學(xué)特征1)革蘭氏染色陰性2)細(xì)胞的形狀和大小桿狀，約0.8×2-3tm3)運(yùn)動(dòng)性陽(yáng)性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學(xué)性質(zhì)1)0-F試驗(yàn)(Hugh-Leifson方法)需氧產(chǎn)酸2)溶血陽(yáng)性3)對(duì)氧的反應(yīng)需氧4)由糖產(chǎn)酸D-葡萄糖+D-木糖 +甘露糖醇-乳糖-蔗糖-
D-麥芽糖-D-果糖 -L-阿拉伯糖 +棉子糖 -菊粉-水楊苷 -瓊脂糖 -D-山梨糖醇 -D-半乳糖+甘油-5)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性6)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性7)在Mac Conkey氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)陽(yáng)性8)在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)陽(yáng)性9)DBH水解陰性10)PHB積聚陰性11)檸檬酸利用陽(yáng)性12)脲分解陰性13)硝酸鹽還原陽(yáng)性14)脫氮反應(yīng)陰性15)熱抗性(60℃×30分鐘)無(wú)抗性16)生長(zhǎng)溫度5℃生長(zhǎng)25℃生長(zhǎng)
37℃生長(zhǎng)42℃不生長(zhǎng)17)明膠水解陰性18)石蕊汁反應(yīng)陽(yáng)性19)淀粉水解陰性20)酪蛋白水解陰性21)聚集素酶反應(yīng)陰性22)賴氨酸脫羧陰性23)精氨酸二氫化酶陽(yáng)性24)鳥氨酸脫羧陰性25)七葉苷水解陰性26)NaCl抗性對(duì)0％NaCl有抗性對(duì)4％NaCl有抗性對(duì)6％NaCl無(wú)抗性對(duì)7％NaCl無(wú)抗性27)酰胺酶陰性28)葡糖酸氧化陰性29)DNA酶存在陰性30)色素產(chǎn)生在King A培養(yǎng)基中陰性在King B培養(yǎng)基中陽(yáng)性31)TW-80水解陰性32)在NAC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)陽(yáng)性
33)瓊脂水解陰性34)從蔗糖產(chǎn)生果聚糖陰性35)苯丙氨酸脫氨基陰性36)在甲烯蘭乳中生長(zhǎng)甲烯蘭減少陽(yáng)性甲烯蘭凝結(jié)陰性胨化陰性37)來(lái)自TSI的酸陰性/陰性38)在TSI培養(yǎng)基中產(chǎn)生硫化氫陰性39)馬尿酸鈉水解陽(yáng)性40)MR試驗(yàn)陰性41)VP試驗(yàn)陰性基于上述菌學(xué)性質(zhì)，按照Presumptive Identification和Berger′s Manual of Systematic Bacteriology指導(dǎo)手冊(cè)來(lái)鑒別該菌株。鑒于鞭毛數(shù)目、于42℃下生長(zhǎng)、水解明膠和TW-80、由海藻糖和甘露糖醇產(chǎn)酸等檢驗(yàn)結(jié)果，將該菌株鑒定為臭味假單胞菌并命名為臭味假單胞菌IF-3。已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，將該菌株保藏在National Institute of Bioscience and Humantechnology，Agencyof Industrial Science & Technology，MITI，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken 305，Japan，其保藏登記號(hào)為FERM BP-3824。
洋蔥假單胞菌BP-4282a.形態(tài)學(xué)特征1)革蘭氏染色陰性2)細(xì)胞的形狀和大小短桿狀，約0.7-0.8×1.0-1.3μm3)運(yùn)動(dòng)性陽(yáng)性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學(xué)性質(zhì)1)O-F試驗(yàn)(Hugh-Leifson法)需氧產(chǎn)酸2)對(duì)氧的反應(yīng)嚴(yán)格好氧3)由糖產(chǎn)酸L-阿拉伯糖+D-木糖+D-葡萄糖 +D-甘露糖 +D-果糖+D-半乳糖 +麥芽糖+蔗糖 +乳糖 -海藻糖-D-山梨糖醇+D-甘露糖醇+甘油 +
肌醇 -4)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)弱陽(yáng)性5)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性6)檸檬酸利用(在Koser′s培養(yǎng)基和Chri stensen′s培養(yǎng)基中)陽(yáng)性7)硝酸鹽還原陽(yáng)性8)熱抗性(60℃×30分鐘)無(wú)抗性9)生長(zhǎng)溫度于9-41℃生長(zhǎng)10)明膠水解陰性11)石蕊汁反應(yīng)陰性12)淀粉水解陰性13)賴氨酸脫羧陽(yáng)性14)精氨酸二水解酶陰性15)鳥氨酸脫羧陰性16)酰胺酶陽(yáng)性17)葡糖酸氧化陽(yáng)性18)色素產(chǎn)生在King A培養(yǎng)基中陰性在King B培養(yǎng)基中陰性19)MR試驗(yàn)陰性20)VP試驗(yàn)陰性基于上述菌學(xué)性質(zhì)，按照Bergey′s Manual of SystematicBacteriology的描述鑒別該菌株。鑒于其為革蘭氏陰性菌，桿狀，靠極性鞭毛有運(yùn)動(dòng)性、需氧性質(zhì)、氧化酶陽(yáng)性及可由葡萄糖產(chǎn)酸等檢驗(yàn)結(jié)果，而將該菌株分類為假單胞菌屬的細(xì)菌。該菌株最初定名為假單胞菌SP.188-1，并已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human-technology，Agency ofIndustrial Sciency & Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號(hào)為FERMP-7073(FERM BP-4282)。
基于上述研究結(jié)果，又因其呈現(xiàn)陰性烏氨酸脫羧酶活性，陽(yáng)性賴氨酸脫羧酶活性，陽(yáng)性葡糖酸氧化酶活性，陽(yáng)性酰胺酶活性，陰性精氨酸二水解酶活性及于41℃下生長(zhǎng)等生理學(xué)性質(zhì)，故將其鑒定為洋蔥假單胞菌種。
另外，本發(fā)明人已從臭味假單胞菌IF-3親代菌株得到了突變體臭味假單胞菌IF-3-9C-21。菌株IF-3-9C-21能夠組成型地將咖啡堿轉(zhuǎn)化成可可堿，但不能將可可堿轉(zhuǎn)化成7-甲基黃嘌呤。該菌株已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定保藏在National Institute of Bioscienceand Human-technology，Agence of Industrial Science &Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號(hào)為FERM BP-3825。
據(jù)認(rèn)為，由假單胞菌屬細(xì)菌完成的咖啡堿代謝是按下述步驟進(jìn)行的(見(jiàn)Hoope-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，Vol.358，PP.807-817(1987))
咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤)↓ 步驟1可可堿(3，7-二甲基黃嘌呤)↓ 步驟27-甲基黃嘌呤↓ 步驟3黃嘌呤步驟1，2和3中，據(jù)認(rèn)為酶可分別特異地釋放1，3或7位上的甲基基團(tuán)。但在尚不了解這些酶的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、氨基酸組成等蛋白質(zhì)學(xué)性質(zhì)的情況下，尚不能從蛋白質(zhì)學(xué)上證實(shí)其存在。
為了提高上述微生物中咖啡堿脫甲基酶的活性，本發(fā)明人成功地進(jìn)行了克隆咖啡堿脫甲基酶基因的嘗試。
可基本上通過(guò)下述步驟得到本發(fā)明的DNA片段、重組DNA及轉(zhuǎn)化的微生物。(1)制備用于咖啡堿脫甲基酶基因克隆的宿主。對(duì)能夠代謝咖啡堿的臭味假單胞菌IF-3-9C進(jìn)行突變處理，并分離到能同化可可堿但不能同化咖啡堿的菌株(臭味假單胞菌IF-3-19)。(2)從臭味假單胞菌IF-3(已按布達(dá)佩斯條約以保藏登記號(hào)FERMBP-3824保藏)中提取總DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?如HindIII)進(jìn)行部份裂解。(3)在HindIII識(shí)別位點(diǎn)處將(2)中得到的DNA片段插入并連接到pNI20C中，以提供重組DNA。(4)用(3)中得到的重組DNA轉(zhuǎn)化(1)中得到的臭味假單胞菌IF-3-19，以提供恢復(fù)了咖啡堿同化能力的重組體菌株。(5)再克隆重組DNA，并測(cè)定此DNA片段的堿基序列，以鑒定咖啡堿脫甲基酶的編碼區(qū)。(6)將含有咖啡堿脫甲基酶之整個(gè)編碼區(qū)的適當(dāng)大小的DNA片段(假定含有基因之啟動(dòng)子、終止子等的片段)整合到載體(pNI107一種已知具有轉(zhuǎn)化假單胞菌屬細(xì)菌之能力的載體)中，以得到重組DNA。(7)使用(6)中得到的重組DNA轉(zhuǎn)化臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達(dá)佩斯條約作為FERM BP-3825保藏)。(8)進(jìn)一步證實(shí)(7)中得到的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤成為3-甲基-7-烷基黃嘌呤的能力。
可按照基因工程領(lǐng)域中使用的已知的常規(guī)方法，如Maniatis等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory(1989))所述的方法，很容易地完成上述重組DNA實(shí)驗(yàn)?？蓮纳虡I(yè)途徑得到用于該實(shí)驗(yàn)的所有的酶和試劑。除特別指出者外，只要使用為制備特定產(chǎn)品所規(guī)定的條件即可完全實(shí)現(xiàn)預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br> 例如，用于上述(2)中的DNA來(lái)源包括臭味假單胞菌IF-3(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，作為FERM BP-3824保藏)和亮黃假單胞菌(Pseudomonas flavida IF-4)(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定作為FERMP-10865，F(xiàn)ERM BP-4281保藏)。
亮黃假單胞菌的菌學(xué)性質(zhì)如下所述。這些菌學(xué)性質(zhì)是按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of theIdentification of Medical Bacteria(MIMB)，Ideantificationof Microorganisms，和Academic Society Press Center，Japan出版的Classification and Identification of Microorganisms，Vol.II檢驗(yàn)的。
亮黃假單胞菌IF-4a.形態(tài)學(xué)特征1)革蘭氏染色陰性2)細(xì)胞的形狀和大小短桿狀，約0.7-1.1×1.1-2.5μm3)運(yùn)動(dòng)性陽(yáng)性4)鞭毛＞15)孢子形成陰性b.生理學(xué)性質(zhì)1)O-F試驗(yàn)(Hugh-Leifson法)需氧產(chǎn)酸2)對(duì)氧的反應(yīng)好氧3)由糖產(chǎn)酸D-葡萄糖+D-木糖 +甘露糖醇-乳糖-蔗糖-麥芽糖 -海藻糖 -
D-果糖+4)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性5)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)陰性6)在Mac Conkeys培養(yǎng)基上生長(zhǎng)陽(yáng)性7)在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)陽(yáng)性8)檸檬酸利用陽(yáng)性9)脲分解陰性10)硝酸鹽還原陰性11)脫氮反應(yīng)陰性12)長(zhǎng)生溫度5℃生長(zhǎng)41℃不生長(zhǎng)13)明膠水解陽(yáng)性14)石蕊汁反應(yīng)堿性15)淀粉水解陰性16)酪蛋白水解陰性17)凝集素酶反應(yīng)陰性18)賴氨酸脫羧陰性19)精氨酸二水解酶陽(yáng)性20)鳥氨酸脫羧陰性21)七葉苷水解陰性22)NaCl抗性對(duì)6％NaCl有抗性23)酰胺酶陰性
24)葡糖酸氧化陽(yáng)性25)DNA酶陰性26)色素產(chǎn)生在Trypto Soy-瓊脂培養(yǎng)基中陽(yáng)性在King B培養(yǎng)基中陽(yáng)性27)TW-80水解陰性28)在NAC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)陽(yáng)性29)瓊脂水解陰性30)從蔗糖產(chǎn)生果聚糖陰性31)苯丙氨酸脫氨基陰性32)來(lái)自TSI的酸陰性/陰性33)MP試驗(yàn)陰性34)VP試驗(yàn)陰性按照Presumptive Identification和Bergey′s Manual ofSystematic Bacterioloy中提供的分類原則，基于上述菌學(xué)性質(zhì)確定菌株的類型。根據(jù)這一分析，該菌株顯然屬于假單胞菌屬。但根據(jù)菌種鑒定情況，判定該菌株并不屬于任何已知的菌種，因?yàn)樵谒谐Ｒ?guī)鑒定手冊(cè)中部沒(méi)有涉及這一菌株的性質(zhì)，而且它還具有新的質(zhì)粒pNI10和pNI20?；谄浔砻婀鉂啥页庶S顏色而將該菌株定名為亮黃假單胞菌(Pseudomonas flavida)IF-4。該菌株已保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science & Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登記號(hào)為FERM P-10865(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，所給保藏號(hào)為FERMBP-4281)。
可按Saito氏方法(參見(jiàn)Biochem.Biophys.Acta.，Vol.72，PP.619-629(1963))從細(xì)菌中提取總DNA。
可按常規(guī)雙脫氧方法(參見(jiàn)Proc.Nati.Acad.Sci.，USA，Vol.73，PP.5463(1977)測(cè)定(5)中所得DNA的序列。
可用來(lái)轉(zhuǎn)化(3)和(6)中所得臭味假單胞菌的載體包括質(zhì)粒pNI107和pNI20C參見(jiàn)JP-A-3-67590，JP-A-3-67591，以及Journal of Biochemistry，Vol.110 pp.614-621(1991)。
可按照Bagdasari an等人(參見(jiàn)Gene，Vol.16，pp.237(1981))所述方法轉(zhuǎn)化臭味假單胞菌(步驟(7))。
可使用適當(dāng)載體，以臭味假單胞菌以外的其他微生物作為宿主。例如，可使用J.Biochem.Vol110，PP.614-621(1991)中所述的假單胞菌屬的其他種微生物。
在根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的過(guò)程中，最好使用上述微生物及其轉(zhuǎn)化體。具體地說(shuō)，最好使用臭味假單胞菌IF-3的突變體，特別是臭味假單胞菌IF-3-9C-21及其轉(zhuǎn)化體。
只要微生物能在其中生長(zhǎng)，可用任何一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)該菌株。培養(yǎng)基可以是含有常規(guī)成份，如除1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤以外的各種碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽以及必要時(shí)還含有其他營(yíng)養(yǎng)素和輔助成分(如pH調(diào)節(jié)劑、乳化劑、消泡劑等)的天然或合成培養(yǎng)基。除1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤以外的適當(dāng)碳源包括糖如葡萄糖、木糖及阿糖糖醇如甘油和山梨糖醇；以及有機(jī)酸如檸檬酸和延胡索酸。適當(dāng)?shù)牡窗o(wú)機(jī)氮源如銨鹽和硝酸鹽，以及有機(jī)氮源如肉羹、酵母浸膏、胰蛋白胨和caltivator。適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽包括磷酸鉀，氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉及硫酸亞鐵。
對(duì)培養(yǎng)基中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的濃度沒(méi)有特殊限制，并可根據(jù)預(yù)期之3-甲基-7-烷基黃嘌呤產(chǎn)率和培養(yǎng)條件及經(jīng)濟(jì)效益來(lái)確定。濃度范圍一般為0.1-10％，且較好是0.5-5.0％。培養(yǎng)可在10至40℃且pH約4.5至9.0，較好在20至30℃且pH約6.5至7.5條件下進(jìn)行約5至72小時(shí)。連續(xù)提供含例如葡萄糖和木糖的碳源，以及如肉羹、醇母浸膏和谷氨酸鈉的氮源的培養(yǎng)基，同時(shí)控制培養(yǎng)基中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的濃度，以連續(xù)發(fā)生1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤向相應(yīng)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的轉(zhuǎn)化(分批進(jìn)料培養(yǎng))。其中1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤可作為固體物或水溶液加入。
必要時(shí)可加入用于加速培養(yǎng)物中3-甲基-7-烷基黃嘌呤積聚的反應(yīng)加速劑。這類反應(yīng)加速劑的適當(dāng)例子包括單甲基黃嘌呤，金屬離子(如鎳離子或鋅離子)，咖啡堿及可可堿，但可根據(jù)培養(yǎng)物中所用菌株的不同而選用不同類型的加速劑。
在實(shí)施本發(fā)明中，產(chǎn)物可以得自如上述培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)物本身及培養(yǎng)物產(chǎn)物，如微生物細(xì)胞、培養(yǎng)物濾液、破碎的細(xì)胞、凍干的細(xì)胞、用乙醇、甲苯或乙酸乙酯等溶劑提取的細(xì)胞提取物，以及固定化細(xì)胞。
當(dāng)1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤與培養(yǎng)物或含水介質(zhì)中的培養(yǎng)物產(chǎn)物接觸時(shí)即可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。在反應(yīng)系統(tǒng)中，即在濃度超過(guò)其溶解度時(shí)，1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤可以懸浮狀態(tài)存在?？稍诜峙M(jìn)料系統(tǒng)或在使用柱子的連續(xù)進(jìn)料系統(tǒng)中使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤與培養(yǎng)物或培養(yǎng)物產(chǎn)物接觸。
在上述條件下用通氣方法攪拌培養(yǎng)物或培養(yǎng)物產(chǎn)物與1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的混合物5至80小時(shí)，以在通氣條件下連續(xù)發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？梢猿Ｒ?guī)方法從反應(yīng)混合物中回收如此產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。即必要時(shí)于離心分離后，用堿處理反應(yīng)混合物，用有機(jī)溶劑除去雜質(zhì)，然后調(diào)pH以得到3-甲基-7-烷基黃嘌呤沉淀物。
現(xiàn)借助參考實(shí)施例和實(shí)施例更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，但應(yīng)明確的是這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
參考實(shí)施例11，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的合成將600g茶堿(1，3-二甲基黃嘌呤)( Katayama KagakuKogyo K.K.的產(chǎn)品)溶解在1800ml含有263.4g氫氧化鉀的水溶液中，并于減壓條件下將溶液蒸發(fā)至干以制得茶堿的鉀鹽。將所得鹽懸浮于3600ml二甲基甲酰胺中，向其中加入436.5ml丙基溴，然后于攪拌同時(shí)90℃加熱8小時(shí)。減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺，并向殘留物中加入1800ml二氯甲烷。用300ml部分的1N氫氧化鉀水溶液將混合物洗三次，再用300ml水洗一次并在54g無(wú)水硫酸鎂上干燥之。過(guò)濾除去干燥劑，于減壓下然后于真空下干燥母液(85℃，5小時(shí))，得到657g(產(chǎn)率88.8％)1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤。
參考實(shí)施例2臭味假單胞菌IF-3-9C-21的制備將臭味假單胞菌IF-3(FERM BP-3824)培養(yǎng)在TY培養(yǎng)基(Difco Co.產(chǎn)品；含有1.0％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)中達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集微生物細(xì)胞，洗滌后懸浮于5ml50mM Tris-馬來(lái)酸鹽緩沖液(pH＝6.0)中。
向細(xì)胞懸浮液內(nèi)加入NTG至濃度為100μg/ml，并將懸浮液于30℃下放置30分鐘。經(jīng)NTG處理后，用0.9％氯化鈉水溶液將細(xì)胞洗兩次，懸將于TY培養(yǎng)基中，然后于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，用0.9％氯化鈉水溶液洗兩次，并于30℃下在5ml咖啡堿基本培養(yǎng)基(0.3％硫酸銨，0.5％二代磷酸鉀，0.1％氯化鈉，0.2％七水合硫酸鎂和0.1％咖啡堿；pH＝7.0)中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。稀釋所得培養(yǎng)物并平鋪于咖啡堿基本瓊脂培養(yǎng)基(0.3％硫酸銨，0.5％二代磷酸鉀，0.1％氯化鈉，0.2％七水合硫酸鎂，0.1％咖啡堿和1.5 ％瓊脂；pH＝7.0)。于30℃培養(yǎng)2天后，篩選呈現(xiàn)極好生長(zhǎng)狀態(tài)之菌株的菌落。
將如此得到的各突變菌株按種于LKC培養(yǎng)基(1.0％Bacto-胰化胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.5％氯化鈉，0.5％二代磷酸鉀和0.1％咖啡堿；pH＝7.0)中。30℃培養(yǎng)8小時(shí)后測(cè)定培養(yǎng)基中的咖啡堿濃度。分離與親代菌株相比顯示出使咖啡堿有較大程度減少的菌株，即為咖啡堿代謝中的組成型突變菌株，將其稱為菌株9C。
以上述同樣方法用NTG處理菌株9C。在含有0.3％可可堿、如上述咖啡堿基本培養(yǎng)基中相同之無(wú)機(jī)鹽及300μg/ml羧芐青霉素的可可堿基本培養(yǎng)基中將收集并洗過(guò)的微生物細(xì)胞于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用0.9％氯化鈉水溶液將細(xì)胞洗兩次，稀釋并平鋪于LT-瓊脂培養(yǎng)基(1.0％ Bacto-胰化胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.3％可可堿和1.5％瓊脂；pH＝6.8)中，然后于30℃下培養(yǎng)2天以形成菌落。得到25個(gè)并不分解菌落周圍之可可堿的菌落。
檢驗(yàn)已分離之菌株同化咖啡堿、可可堿和7-甲基黃嘌呤的性質(zhì)，分離只同化7-甲基黃嘌呤的菌株并定名為臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定以FERM BP-3825保藏登記號(hào)保藏)。臭味假單胞菌IF-3-9C-21菌株是組成性地同化咖啡堿但不能將可可堿轉(zhuǎn)化成7-甲基黃嘌令的雙突變菌株。
實(shí)施例1將臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定以FERMBP-3825保藏登記號(hào)保藏)接種到75ml含如參考實(shí)施例1中制備的1.0％1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤、1.0％Bacto-胰化胨、0.5％Bacto-酵母浸膏和1.0％二代磷酸鉀(pH＝6.7)的培養(yǎng)基(在500ml Sakaguchi培養(yǎng)瓶中)內(nèi)。 0℃預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜后，將1％等份的培養(yǎng)液分別接種到加在Sakaguchi培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的75ml上述的同樣培養(yǎng)基中。在120rpm攪拌下于30℃培養(yǎng)18小時(shí)。
將檢測(cè)的1700ml合并的培養(yǎng)物以10,000rpm離心15分鐘。用鹽酸將上清液調(diào)到pH6.0，于減壓下濃縮，并于5℃下放置過(guò)夜。將沉淀的結(jié)晶體懸浮在450ml純化水中，向其中加入25.2g氫氧化鉀，再加入約600ml二氯甲烷，并分離出約400ml含水層。向含水層中加入鹽酸以沉淀出結(jié)晶物，然后離心(12,000rpm×15分鐘)回收固體物。將固體物懸浮在約100ml水中并再次離心。將回收的固體物與大約80ml乙醇混合，然后于50℃減壓干燥，以得到重1.18g的制劑。
按下述方法分析一等份制劑以確定結(jié)構(gòu)。(a)制劑的乙基化將0.2g等份的制劑溶解在1.7ml 1N氫氧化鉀水溶液中，然后于減壓下蒸發(fā)至干。將殘留物懸浮在1.5ml二甲基甲酰胺中，并邊攪拌邊向其中加入0.22ml乙基溴。于90℃將混合物加熱5小時(shí)，同時(shí)進(jìn)行攪拌。
減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺。將殘留物溶解在30ml二氯甲烷中，用每份20ml 1N氫氧化鉀水溶液洗兩次并用20ml水洗一次，通過(guò)無(wú)水硫酸鎂干燥，再于減壓下干燥以除去二氯甲烷，最后在真空中干燥得到0.2g(產(chǎn)率88.1％)乙基化的制劑。(b)1-乙基-3，7-二甲基黃嘌呤的制備將0.9克可可堿(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.的產(chǎn)品)溶解于7.5ml 1N氫氧化鉀水溶液中，然后于減壓下干燥。將殘留物懸浮在6ml二甲基甲酰胺中，并邊攪拌邊向其中加入0.6ml乙基溴，然后在攪拌的同時(shí)于90℃加熱8小時(shí)。
減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺，將殘留物溶解在50ml二氯甲烷中，用1N氫氧化鉀水溶液洗兩次(每次30ml)，再用水(30ml)洗一次，在無(wú)水硫酸鎂上干燥，再于減壓下干燥以除去二氯甲烷，最后真空干燥得到0.86克(產(chǎn)率83％)的1-乙基-3，7-二甲基黃嘌呤。
將(a)中制得的乙基化制劑(下文中用(4)代表)的N-取代基的13C-NMR圖譜與咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤(下文中用(1)代表)，以及(b)中制得的1-乙基-3 ， 7-二甲基黃嘌呤(下文中用(2)代表)和參考實(shí)施例1中制得的1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤(下文中用(3)代表)的相應(yīng)圖譜相比較。即比較(1)、(2)和(3)之N-甲基基團(tuán)的13C＝NMR圖譜后，確定1-、3-和7-位上之N-甲基基團(tuán)(下文中分別稱為N1-甲基、N3-甲基和N7-甲基)的化學(xué)轉(zhuǎn)變(ppm)如下所示N1-甲基27.72ppmN3-甲基29.37-29.54ppmN7-甲基33.35-33.40ppm然后，將(3)之N1-甲基和N3-甲基的化學(xué)轉(zhuǎn)變(分別為27.72ppm和29.48 ppm)與(4)之N-甲基基團(tuán)的化學(xué)轉(zhuǎn)變(29.43ppm)相比較，證明該制劑的化合物是通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化釋放N1-甲基基團(tuán)后由(3)衍生的化合物，即3-甲基-7-烷基黃嘌呤。如上確定的化學(xué)轉(zhuǎn)變的結(jié)果示于下表1中。
表11，3，7-三 1-乙基-3，7- 1，3-二甲基-7 乙基化測(cè)定 甲基黃嘌呤 二甲基黃嘌呤 丙基黃嘌呤的制劑CH3CH2CH2(N7) 10.62 10.62CH3CH2(N1) 13.16 13.06CH3CH2CH2(N7) 23.97 23.97CH3(N1) 27.72 27.72CH3(N3) 29.54 29.37 29.48 29.43CH3(N7) 33.40 33.35CH3CH2(N1) 36.1 936.30CH3CH2CH2(N7) 48.57 48.57在下述條件下進(jìn)行13C-NMR圖譜檢測(cè)樣品溶液將70mg(1)或100mg(2)、(3)或(4)加在0.5mlCDCl3中儀器Japan Electron Optics Lab.Co.，Ltd.制造的JNM-FX60Q型核磁共振儀標(biāo)準(zhǔn)CDCl3的化學(xué)轉(zhuǎn)變，77.1ppm實(shí)施例2將洋蔥假單胞菌FERM BP-4282接種到與實(shí)施例1中所用的有相同成分并且還含有0.01％7-甲基黃嘌呤或0.1％可可堿的培養(yǎng)基中。30℃預(yù)保溫過(guò)夜后，將1％等份的培養(yǎng)液分別接種到加在Sakaguchi培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的75ml相同培養(yǎng)基中。于30℃用120rpm攪拌培養(yǎng)18小時(shí)。
使用Toso Co.，Ltd.制造的層析儀以高效液相層析法(HPLC)分析結(jié)合的培養(yǎng)物。結(jié)果，進(jìn)一步證明同樣滯留時(shí)間的峰即為用實(shí)施例1中得到的3-甲基-7-丙基黃嘌呤(制劑)所觀察到的峰，此表明培養(yǎng)物中有3-甲基-7-丙基黃嘌呤積聚。在下述條件下進(jìn)行HPLC柱ODS-80TM(Toso Co.，Ltd.制造)流動(dòng)相含有17％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液流速1ml/分鐘實(shí)施例3按實(shí)施例2所述的同樣方法，將溴味假單胞菌IF-3(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定以登記號(hào)FERM BP-3824保藏)于30℃預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜，并將1％等份的培養(yǎng)液分別接種到75ml同樣培養(yǎng)基(加在Sakaguchi培養(yǎng)瓶?jī)?nèi))中。于30℃培養(yǎng)18小時(shí)，同時(shí)以120rpm攪拌。
在實(shí)施例2的同樣條件下對(duì)合并的培養(yǎng)物進(jìn)行HPLC分析的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)3-甲基-7-丙基黃嘌呤的生成。
實(shí)施例4
以實(shí)施例1所述的同樣方法培養(yǎng)臭味假單胞菌IF-3-9C-21(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定以登記號(hào)FERM BP-3825保藏)，但不同的是培養(yǎng)基成分中去掉了1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤。將所得培養(yǎng)液與1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤混合，并在實(shí)施例2所述的同樣條件下用HPLC法分析混合物。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了3-甲基-7-丙基黃嘌呤的產(chǎn)生。
實(shí)施例5分離來(lái)源于咖啡堿代謝菌的咖啡堿脫甲基酶基因(1)咖啡堿脫甲基酶缺陷突變體的制備在TY培養(yǎng)基(1.0％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)中培養(yǎng)具有組成性地同化咖啡堿能力并得自親代菌株IF-3(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定作為FERM BP-3824號(hào)菌株保藏)的臭味假單胞菌突變菌抹IF-3-9C，使之生長(zhǎng)到對(duì)期生長(zhǎng)期。離心收集微生物細(xì)胞，洗滌，并懸浮在5ml 50mM Tris-馬來(lái)酸鹽緩沖液(pH-6.0)中。
向細(xì)胞懸將液中加入NTG至終濃度為100μg/ml，并將懸浮液在30℃放置30分鐘。經(jīng)NTG處理后，用0.9％氯化鈉水溶液洗細(xì)胞兩次.然后在已加入了終濃度為500μg/ml的羧芐青霉素的咖啡堿基本培養(yǎng)基(0.3％咖啡堿，0.3％硫酸銨，0.5％二代磷酸鉀，0.1％氯化鈉和0.2％七水合硫酸鎂；pH＝7.0)中30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用0.9％氯化鈉水溶液將收集的細(xì)胞洗兩次。
將洗過(guò)的細(xì)胞懸浮在1ml 0.9％氯化鈉水溶液中，適當(dāng)稀釋并平鋪在LT-瓊脂培養(yǎng)基(1％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)上。在LT-瓊脂培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)1天后，將菌落影印在咖啡堿基本培養(yǎng)基上。30℃培養(yǎng)2天后，檢查在咖啡堿基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)不好之菌株同化咖啡堿、可可堿及7-甲基黃嘌呤的能力，并得到可同化可可堿和7-甲基黃嘌呤但不同化咖啡堿的突變菌株IF-3-19。
臭味假單胞菌IF-3-19是不能將咖啡堿轉(zhuǎn)化成可可堿的突變菌株，即咖啡堿脫甲基酶缺陷型突變株。(2)克隆咖啡堿脫甲基酶基因按Saito和Miura所述方法(參見(jiàn)Biochem.Biophys.Acta，Vol.72，PP.619-629(1963))制備臭味假單胞菌IF-3(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定作為FERM BP-3824號(hào)菌株保藏)或亮黃假單胞菌IF-4(已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定作為FERM P-10865，F(xiàn)ERM BP-4281號(hào)菌株保藏)的總DNA。用Hind III切割所得總DNA得到DNA片段(約1μg)。使用T4 DNA連接酶將已切割的片段連接到已用HindIII消化并已去磷酸化的克隆載體pNI20C(約2μg)上。
用所得重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化咖啡堿脫甲基酶缺陷型臭味假單胞菌IF-3-19，并將其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的咖啡堿基本瓊脂培養(yǎng)基上。
30℃培養(yǎng)2天后，得到4個(gè)含有源于具味假單胞菌IF-3之基因的轉(zhuǎn)化體菌株和3個(gè)含有源于亮黃假單胞菌IF-4之基因的轉(zhuǎn)化體菌株。
從各轉(zhuǎn)化體菌株制備質(zhì)粒并用HindIII消化。經(jīng)瓊脂糖凍凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)酶裂解圖形。表明所有這些菌株都共同具有如圖1中所示的用HindIII切割的來(lái)自2.4kb和4.3kb DNA片段的DNA片段。
(3)再克隆咖啡堿脫甲基酶基因并確定其位置將(2)中制得的質(zhì)粒之一定名為pTF1。用不同的限制性酶切割pTF1并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，以制得包括圖1所示的被插入的6.7Kb DNA片段的限制性核酸內(nèi)切酶酶切圖。為了確定存在于該片段中的咖啡堿脫甲基酶編碼區(qū)，然后將用限制性酶消化的各不同的DNA片段插入并連接到pNI107中以制備重組DNA，并用該重組DNA轉(zhuǎn)化臭味假單胞菌IF-3-19。結(jié)果得到用AccI和NdeI切下的并使IF-3-19恢復(fù)了咖啡堿同化性質(zhì)的約1.7Kb DNA片段。將攜帶該DNA片段的質(zhì)粒稱為pCA32A。(4)進(jìn)一步證實(shí)存在于pCA32A中的咖啡堿脫甲基酶基因?yàn)榱俗C實(shí)上述直到(3)的步驟中制得的插入到pCA32A中的DNA片段編碼咖啡堿脫氫酶這一事實(shí)，將pCA32A引入沒(méi)有同化咖啡堿之性質(zhì)的臭味假單胞菌ATCC8209中，并檢驗(yàn)所得重組體是否能將咖啡堿轉(zhuǎn)化成可可堿。具體方法如下所述。
將上述(3)中制得的pCA32A引入沒(méi)有咖啡堿同化作用即沒(méi)有能力同化咖啡堿、可可堿和7-甲基黃嘌呤中任何一種物質(zhì)的臭味假單胞菌ATCC8209中，得到轉(zhuǎn)化體8209/pCA32A。
將所得各轉(zhuǎn)化體菌株分別接種到5ml TYKG培養(yǎng)基(1.5％Bacto-胰化胨、0.75％Bacto-酵母浸膏、0.5％二代磷酸鉀、0.2％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素；pH＝6.7)中并于30℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。取0.5ml等分的培養(yǎng)液接種于分別加在10個(gè)500ml Sakaguchi培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的50ml TYKG培養(yǎng)基中，然后于30℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
合并所得培養(yǎng)物(500ml)并以7,000rpm離心10分鐘。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗滌如此收集的微生物細(xì)胞，并懸浮于30ml同樣緩沖液中。
向細(xì)胞懸浮液(0.5ml)內(nèi)加入105μl100mM咖啡堿水溶液，210μl50mM NADH水溶液、50μl0.8M磷酸鈉緩沖液和1135ml水，并使此系統(tǒng)于25℃反應(yīng)16小時(shí)。將475μl等份的反應(yīng)混合物加至25μl50％三氯乙酸水溶液中以終止反應(yīng)。離心該混合物，于下述條件下經(jīng)HPLC測(cè)定上清液中的咖啡堿和可可堿含量，以估計(jì)咖啡堿脫甲基酶活性。所得結(jié)果示于表2中。
柱ODS-80TM，TOSO Co.，Ltd.制造流動(dòng)相含17％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液流速1ml/分鐘檢測(cè)272nm
表2反應(yīng)時(shí)間0小時(shí) 17小時(shí)轉(zhuǎn)化體菌株咖啡堿可可堿咖啡堿可可堿(mg/ml)(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)臭味假單胞菌 0.94 0 0.94 0ATCC 8209/pNI107臭味假單胞菌 0.938 0 0.763 0.160ATCC8209/pCA32A如表2中所示，已被質(zhì)粒載體pNI107轉(zhuǎn)化的菌株不產(chǎn)生可可堿，而帶有pCA32A的ATCC8209的轉(zhuǎn)化體則可轉(zhuǎn)化18.6％的咖啡堿底物以產(chǎn)生0.16克/升可可堿。這些結(jié)果證明被插入的pCA32A的DNA片段含有咖啡堿脫甲基酶基因。(5)測(cè)定咖啡堿脫甲基酶基因的序列按照Sanger方法測(cè)定已插入至pCA32A中之約1.7Kb的AccI-NdeI DNA片段的堿基序列。更具體地說(shuō)，用Klenow片段將已用AccI和NdeI切割DNA片段的末端修成平端并在SmaI只別位點(diǎn)處插入pUC118中，以得到插入方向上有所不同的質(zhì)粒118A和118B。
借助Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn)的缺失藥盒從所得質(zhì)粒中逐步缺失被插入的DNA，以制備不同質(zhì)粒。借助Applied BiosystemsCo.生產(chǎn)的序列藥盒，使用各缺失質(zhì)粒作模板合成互補(bǔ)DNA。用DNA序列儀讀出堿基序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上述DNA片段中只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架。
在SEQ ID NO1中，顯示了包含有咖啡堿脫甲基酶基因之DNA的AccI和NdeI間的DNA堿基序列(1686bp)。在堿基各三聯(lián)子下方還示出了推測(cè)的咖啡堿脫甲基酶的氨基酸序列。
實(shí)施例6用pCA32A轉(zhuǎn)化體從1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤用pCA32A轉(zhuǎn)化臭味假單胞菌I F-3-9C-21(已按布達(dá)佩斯條約作為FERM BP-3825號(hào)樣品保藏)，以得到臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A。
將臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A接種到75ml含0.5％肉浸膏(由Kyokuto Seiyaku Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))，0.3％MeastPIG(由Asahi Breweries，Ltd.生產(chǎn))和0.3％二代磷酸鉀的培養(yǎng)基中(在500ml Sakaguchi培養(yǎng)瓶?jī)?nèi))，并于20℃下預(yù)培養(yǎng)16小時(shí)。在5升小罐內(nèi)放入2升上述培養(yǎng)基，并向其中加入0.5％1，3-二甲基-7-乙基黃嘌呤，1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤或1，2-二甲基-7-丁基黃嘌呤。將1％預(yù)培養(yǎng)液接種到已制備的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)24-48小時(shí)，其中前7小時(shí)溫度控制在30℃，然后于25℃下以1V.V.m通氣量繼續(xù)培養(yǎng)，此期間借助帶有6個(gè)葉片的扁平型葉輪攪拌器以600rpm進(jìn)行攪拌。從培養(yǎng)開(kāi)始4小時(shí)后，將培養(yǎng)物的pH控制在6.6和6.8之間并開(kāi)始供應(yīng)有下列組成的培養(yǎng)基。
待進(jìn)料的培養(yǎng)基組成葡萄糖17％谷氨酸鈉 2％肉浸膏4％Meast PIG 4％如下列表3所示，在各培養(yǎng)物中測(cè)得有相應(yīng)1-脫甲基化合物的產(chǎn)生。
表3底物 底物濃度培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)物 產(chǎn)物濃度(mg/ml) (小時(shí)) (mg/ml)1，3-二甲基-7-5.2024 3-二甲基-7-4.85乙基黃嘌呤 乙基黃嘌呤1，3-二甲基-7-5.2624 3-甲基-7- 4.98丙基黃嘌呤 丙基黃嘌呤1，3-二甲基-7-4.2048 3-甲基-7- 1.80丁基黃嘌呤 丁基黃嘌呤實(shí)施例7用臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A將咖啡堿轉(zhuǎn)化成可可堿并將1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤將臭味假單胞菌IF-3-9C-21和臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A分別在75ml含有0.5％肉浸膏、0.3％Meast PIG和0.3％二代磷酸鉀的培養(yǎng)基(pH6.7)(在500ml Sakaguchi培養(yǎng)瓶)中30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。其中用于轉(zhuǎn)化體菌株的培養(yǎng)基還另外含有25μg/ml卡那霉素。
將1％所得預(yù)培養(yǎng)物接種到3升含0.5％肉浸膏、0.1％葡萄糖和0.3％Meast PIG并且另外還含有0.5％咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的培養(yǎng)基中，并在控制的溫度下培養(yǎng)50小時(shí)，前7小時(shí)溫度控制在30℃，然后于25℃及1V.V.m通氣條件下培養(yǎng)，同時(shí)借助帶有6個(gè)葉片的扁平型葉輪攪拌器以600rpm攪拌之。從培養(yǎng)開(kāi)始4小時(shí)后將培養(yǎng)物的pH控制在6.6和6.8之前，并從同一時(shí)間點(diǎn)以12ml/小時(shí)的速率開(kāi)始供入含有25％葡萄糖、6％肉浸膏、6％Meast P1G、3％谷氨酸鈉和1.0％咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的培養(yǎng)基。
定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)物中咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤的濃度，并適當(dāng)加入這些底物以便將各自的濃度控制在0.5和2.5mg/ml之間。
如此使1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)果示于圖2中。可以看出，在使用名底物(咖啡堿或1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤)的反應(yīng)中，帶有pCA32A的轉(zhuǎn)化體菌株即臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A能夠以2至4倍于臭味假單胞菌IF-3-9C-21的產(chǎn)生量產(chǎn)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(分別為可可堿或3-甲基-7-丙基黃嘌呤)。
測(cè)定培養(yǎng)結(jié)束時(shí)底物和產(chǎn)物的量。結(jié)果可見(jiàn)，在使用臭味假單胞菌IF-3-9C-21/pCA32A并以咖啡堿作底物的系統(tǒng)中，在長(zhǎng)達(dá)50小時(shí)時(shí)間所加咖啡堿的積聚量為535克，而隨著產(chǎn)生414克可可堿所余咖啡堿的殘留量為90克，表明咖啡堿轉(zhuǎn)化為可可堿的轉(zhuǎn)化率為98.9％。而在使用同樣菌株并以1，2-二甲基-7-丙基黃嘌呤作為底物的系統(tǒng)中，在長(zhǎng)達(dá)50小時(shí)時(shí)間里所加底物的積聚量為390克，而隨著產(chǎn)生262克3-甲基-7-丙基黃嘌呤，所余殘留底物的量為63克，此表明1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為3-甲基-7-丙基黃嘌呤的轉(zhuǎn)化率為97％。
根據(jù)本發(fā)明，可在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物或其突變體，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積聚3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從培養(yǎng)物中回收該產(chǎn)物，從而有效地并以低成本制得作為成藥之重要中間產(chǎn)物的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
本發(fā)明提供了含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段，基于該DNA片段有可能提供具有增加了在1位上催化咖啡堿脫甲基之咖啡堿脫甲基酶活性的新的臭味假單胞菌菌株。使用該新的臭味假單胞菌菌株即有可能以進(jìn)-步提高的效率從相應(yīng)的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
雖然本文已對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)描述并給出了特定實(shí)施例，但顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明糖神和范圍的前提下對(duì)本發(fā)明作出各種改變和改動(dòng)。
序列-覽表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Yoshinao，KoideSeiji，NakaneYutaka，Imai(ii)發(fā)明名稱含有咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段和生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的微生物方法(iii)序列數(shù)2(iv)通信地址(A)地址SUGHRUE，MION，ZTNN，MACPEAK & SEAS(B)街道2100 Pennsylvania Avenue(C)城市N.W.
(D)州Washington，D.C.
(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵編20037-3202(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)基質(zhì)類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC相容性(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.O，Version#1.25(vi)目前申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朖P4-154380(B)申請(qǐng)日20，5，1992(viii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朖P 4-312954(B)申請(qǐng)日27，10，1992(ix)電信資料(A)電話202-293-7060(B)傳真202-293-7860(C)電傳6491103(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1686堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙股(D)結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位476..1528
(xi)序列描述SEQ ID NO1GTAGACTGTC TTTACGCCCC GCACATTCTC TATCGTAAAA ATTTCCACGC TGAGCCCACG 60CTAATTTAAT CAAGTCTCAT TCAACTGAGC CGCACAGCCG CGTGTCATTG AGTGATCACC120GGCAGTAACA TTTTACGGCT GAGCGGCTTG CAGCAATGTT TCTTTTATGC ACCAAACTCG180CCCACCTAAT GCACTAAATC GAACCATTAA AAACTTAGCT AATACTCTAA AATCTATTGG240ATTTGACCAC TTACATTTTT AACCGTCCAG AGCCTATCCG AAGTTGACAC GCGGGTCAGA300AATGGCCTAT TTTTTCTTTG TGTACCAGAT GATAAATCTG ATGTACCAGC CGTATGATTG360GCGTAAATAC ACCATTACCA AGTGTTTACC CTTTCTATGA GTAGATGTAG GAGACAGGGC420ACTCAGCTGA GTTGAGTGTT CATACATAAC AACGTCATCC ACAAAGGCTA CATACATG 478Met1GAA CAG ACA ATC AAT AAC AAC GAT CGC GAG TAC CTT CGG CAC TTT TGG 526Glu Gln Thr Ile Asn Asn Asn Asp Arg Glu Tyr Leu Arg His Phe Trp5 10 15CAT CCC GTC TGT ACA GTG ACA GAA CTG GAA AAG GCC CAC CCC TCC AGC 574His Pro Val Cys Thr Val Thr Glu Leu Glu Lys Ala His Pro Ser Ser20 25 30CTA GGC CCA ATA GGG GTG AAG CTT CTA AAT GAG CAA TTG GTT GTT GCT 622Leu Gly Pro Ile Gly Val Lys Leu Leu Asn Glu Gln Leu Val Val Ala35 40 45AAA CTT AGT GGC CAA TAC GTC GCA ATG CAT GAT CGC TGC GCA CAT CGG 670Lys Leu Ser Gly Gln Tyr Val Ala Met Mis Asp Arg Cys Ala His Arg50 55 60 65TCG GCA AAG CTC TCC CTG GGC ACC ATC GCT AAT GAT CGA CTG CAA TGC 718Ser Ala Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Asn Asp Arg Leu Gln Cys70 75 80CCT TAT CAT GGG TGG CAG TAC GAC ACG GAA GGT GCA TGT AAA CTA GTG 766Pro Tyr His Gly Trp Gln Tyr Asp Thr Glu Gly Ala Cys Lys Leu Val85 90 95CCG GCG TGC CCC AAC AGC CCC ATT CCT AAT CGA GCT AAA GTT CAG CGA 814Pro Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Pro Asn Arg Ala Lys Val Gln Arg100 105 110TTC GAT TGT GAA GAG CGG TAC GGT CTG ATT TGG GTA AGG CTG GAC TCA862Phe Asp Cys Glu Glu Arg Tyr Gly Leu Ile Trp Val Arg Leu Asp Ser115 120 125AGT TAT GCT TGC ACT GAG ATC CCA TAC TTC AGT GCA GCA AGC GAT CCG910Ser Tyr Ala Cys Thr Glu Ile Pro Tyr Phe Ser Ala Ala Ser Asp Pro130 135 140 145AAA CTT CGA GTC GTG ATC CAA GAA CCC TAT TGG TGG AAC GCA ACA GCA 958Lys Leu Arg Val Val Ile Gln Glu Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Thr Ala150 155 160GAG CGA CGT TGG GAA AAC TTT ACA GAC TTT TCC CAT TTT GCG TTT ATC1006Glu Arg Arg Trp Glu Asn Phe Thr Asp Phe Ser His Phe Ala Phe Ile165 170 175CAC CCT GGC ACG CTG TTT GAT CCT AAC AAC GCG GAA CCG CCG ATC GTA1054His Pro Gly Thr Leu Phe Asp Pro Asn Asn Ala Glu Pro Pro Ile Val180185 190A~ 1CCG ATG GAT CGT TTT AAT GGC CAA TTC CGT TTC GTT TAC GAT ACC CCG1102Pro Met Asp Arg Phe Asn Gly Gln Phe Arg Phe Val Tyr Asp Thr Pro195 200 205GAA GAT ATG GCC GTT CCA GAT CAA GCC CCA ATT GGG TCG TTC TCT TAT1150Glu Asp Met Ala Val Pro Asp Gln Ala Pro Ile Gly Ser Phe Ser Tyr210 215 220 225ACC TGC AGC ATG CCC TTC GCT ATC AAT CTG GAA GTC GCT AAG TAC TCA1198Thr Cys Ser Met Pro Phe Ala Ile Asn Leu Glu Val Ala Lys Tyr Ser230 235 240AGC AAT TCA TTG CAT GTG CTT TTC AAC GTG TCA TGC CCA GTT GAC GAT1246Ser Asn Ser Leu His Val Leu Phe Asn Val Sar Cys Pro Val Asp Asp245 250 255AGC ACT ACC AAG AAC TTC TTG CTG TTC GCA AGG GAG CAG GCT GAC GAT1294Ser Thr Thr Lys Asn Phe Leu Leu Phe Ala Arg Glu Gln Ala Asp Asp260 265 270TCA GAT TAT CTT CAC ATT GCA TTT AAT GAT TTA GTC TTT GCT GAA GAT1342Ser Asp Tyr Leu His Ile Ala Phe Asn Asp Leu Val Phe Ala Glu Asp275 280 285AAG CCT GTG ATC GAG TCT CAA TGG CCG AAG GAT GCT CCG GCT GAT GAA 1390Lys Pro Val Ile Glu Ser Gln Trp Pro Lys Asp Ala Pro Ala Asp Glu290 295 300 305GTT TCG GTT GTC GCG GAT AAA GTC TCG ATC CAG TAT AGA AAA TGG CTG 1438Val Ser Val Val Ala Asp Lys Val Ser Ile Gln Tyr Arg Lys Trp Leu310 315 320CGG GAA CTG AAA GAG GCC CAT CAA GAC GGT GCT CAG GCT TTC CGT AGT 1486Arg Glu Leu Lys Glu Ala His Gln Asp Gly Ala Gln Ala Phe Arg Ser325 330 335GCG TTG CTG GAC TCC GTG ATC GAG AGC GAT CGA AGC TAC ACC1528Ala Leu Leu Asp Ser Val Ile Glu Ser Asp Arg Ser Tyr Thr340 345 350TAACATTTGC GTATGAGGGT GGCGCACTGC GCCTTTTTTT TTAGGGTCAA AAAAAGACGG 1588CCTCCTAGGA GGCCGTAAAC TCGCTACGTC CAACTCGTAT TAGGGCTTCT TGAATGAATA 1648GACAGCCAAT TTGTTCCCGT CGAGATCGCG CACATATG 1686(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度351個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Gln Thr Ile Asn Asn Asn Asp Arg Glu Tyr Leu Arg His Phe1 5 10 15Trp His Pro Val Cys Thr Val Thr Glu Leu Glu Lys Ala His Pro Ser20 25 30Ser Leu Gly Pro Ile Gly Val Lys Leu Leu Asn Glu Gln Leu Val Val35 40 45Ala Lys Leu Ser Gly Gln Tyr Val Ala Met His Asp Arg Cys Ala His50 55 60Arg Ser Ala Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Asn Asp Arg Leu Gln65 70 75 80Cys Pro Tyr His Gly Trp Gln Tyr Asp Thr Glu Gly Ala Cys Lys Leu85 90 95Val Pro Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Pro Asn Arg Ala Lys Val Gln100 105 110Arg Phe Asp Cys Glu Glu Arg Tyr Gly Leu Ile Trp Val Arg Leu Asp115 120 125Ser Ser Tyr Ala Cys Thr Glu Ile Pro Tyr Phe Ser Ala Ala Ser Asp130 135 140Pro Lys Leu Arg Val Val Ile Gln Glu Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Thr145 150 155 160Ala Glu Arg Arg Trp Glu Asn Phe Thr Asp Phe Ser His Phe Ala Phe165 170 175Ile His Pro Gly Thr Leu Phe Asp Pro Asn Asn Ala Glu Pro Pro Ile180 l85 190Val Pro Met Asp Arg Phe Asn Gly Gln Phe Arg Phe Val Tyr Asp Thr195 200 205Pro Glu Asp Met Ala Val Pro Asp Gln Ala Pro Ile Gly Ser Phe Ser210 215 220Tyr Thr Cys Ser Met Pro Phe Ala Ile Asn Leu Glu Val Ala Lys Tyr225 230 235 240Ser Ser Asn Ser Leu His Val Leu Phe Asn Val Ser Cys Pro Val Asp245 250 255Asp Ser Thr Thr Lys Asn Phe Leu Leu Phe Ala Arg Glu Gln Ala Asp260 265 270Asp Ser Asp Tyr Leu His Ile Ala Phe Asn Asp Leu Val Phe Ala Glu275 280 285Asp Lys Pro Val Ile Glu Ser Gln Trp Pro Lys Asp Ala Pro Ala Asp290 295 300Glu Val Ser Val Val Ala Asp Lys Val Ser Ile Gln Tyr Arg Lys Trp305 310 315 320Leu Arg Glu Leu Lys Glu Ala His Gln Asp Gly Ala Gln Ala Phe Arg325 330 335Ser Ala Leu Leu Asp Ser Val Ile Glu Ser Asp Arg Ser Tyr Thr340 345 350
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)由式(II)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法，——其中R代表直鏈或分支鏈烷基基團(tuán)—— 該方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤 ——其中R定義同上——的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主的假單胞菌屬轉(zhuǎn)化體，以培養(yǎng)物中產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
2.生產(chǎn)由式(II)代表的3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法 ——其中R代表直鏈或分支鏈烷基基團(tuán)——，該方法包括使由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤 ——其中R的定義同上——與用重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主的假單胞菌屬的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物、微生物細(xì)胞或其經(jīng)處理的產(chǎn)物接觸，以產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從反應(yīng)混合物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中R是C1-C4烷基基團(tuán)。
4.生產(chǎn)由式(II)代表的3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法， 該方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤 的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠?qū)?，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬的微生物或其突變體，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生式(II)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的式(II)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
5.生產(chǎn)由式(II)代表的3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法， 該方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤 與能夠?qū)?，3-二甲基-7-丙基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成3-甲基-7-丙基黃嘌呤的假單胞菌屬微生物的培養(yǎng)物、微生物細(xì)胞或其經(jīng)處理的產(chǎn)物接觸，以產(chǎn)生式(II)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤，并從反應(yīng)混合物中回收所產(chǎn)生的式(II)的3-甲基-7-丙基黃嘌呤。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所說(shuō)的微生物是臭味假單胞菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的微生物是臭味假單胞菌IF-3-9C-21(FERMBP-3825)。
全文摘要
公開(kāi)了含有由屬于假單胞菌屬并能同化咖啡堿的微生物產(chǎn)生的咖啡堿脫甲基酶基因的DNA片段以及生產(chǎn)3-甲基-7-烷基黃嘌呤的方法，所說(shuō)的方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黃嘌呤的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用其中已整合了上述DNA片段的重組DNA轉(zhuǎn)化的假單胞菌屬的新細(xì)菌菌株，以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生3-甲基-7-烷基黃嘌呤，并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的3-甲基-7-烷基黃嘌呤，本文還公開(kāi)了生產(chǎn)3-甲基-7-丙基黃嘌呤的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1143115SQ9610684
公開(kāi)日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月20日
發(fā)明者小出芳直, 今井豐, 中根誠(chéng)治 申請(qǐng)人:天野制藥株式會(huì)社