專利名稱：：1,3,7,9-四甲基尿酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域嘌呤生物堿類化合物的制備方法，具體涉及一種從天然植物制備1,3,7,9-四甲基尿酸的方法。
背景技術(shù)：
：1,3，7，9-四甲基尿酸(1，3,7,9-tetramethyluricacid,theacrine)屬于嘌呤生物堿類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式為植物中的嘌呤類生物堿最為人熟知的是黃嘌呤的三種甲基衍生物，即咖啡堿(1，3,7-三甲基黃嘌呤)、可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)和茶堿(1，3-二甲基黃嘌呤)。該類物質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等方面都具有廣泛的生理活性。關(guān)于1,3，7，9-四甲基尿酸的活性，據(jù)文獻(xiàn)(LylesMB，CameronIL.CaffeineandotherxanthinesascytochemicalblockersandremoversofheterocyclicDNAintercalatorsfromchromatin.Ce//5fo//W,2002,26:145-154)報(bào)道1,3,7，9-四甲基尿酸能與雜環(huán)類誘變劑和致癌物結(jié)合起抗誘變作用；另有文獻(xiàn)(Xu，etal.Theacrine，aspecialpurinealkaloidwithsedativeandhypnoticpropertiesfromC畫膨//。ow纖z'cavar'.A:wc/zainmice.J爿57'awAto/Vodies，2007，7:665-672)報(bào)道1,3，7，9-四甲基尿酸也具有中樞神經(jīng)藥理方面的活性，但與咖啡堿興奮神經(jīng)的作用相反，1，3，7，9-四甲基尿酸在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用。1，3,7，9-四甲基尿酸的化學(xué)合成方法存在反應(yīng)底物昂貴、收率低、反應(yīng)過程中易爆炸等缺點(diǎn)，而植物苦茶中含較高量的1,3,7,9-四甲基尿酸，是制備1,3，7,9-四甲基尿酸的一個(gè)理想的低成本天然植物資源。在文獻(xiàn)(葉創(chuàng)興，等.苦茶C.ow^m'cavar.bc/zaChangetWang的嘌呤生物堿.中山大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，38(5):82—86)中公開了一種從苦茶中分離得到1，3，7，9-四甲基尿酸的方法。其公開的方法是將苦茶芽葉隔水蒸青烘干后先用熱水浸提，再用氯仿萃取，最后進(jìn)行硅膠柱層析，用乙酸乙酯洗脫得到1，3，7，9-四甲基尿酸。其方法存在收率較低，成本較高的問題。中國發(fā)明專利ZL200410077237.6公開了一種用苦茶芽葉為原料，經(jīng)過溶劑提取、氯仿萃取或聚酰胺柱層析、反相色譜分離制備1,3,7，9-四甲基尿酸的方法。該方法仍是用苦茶穿葉為原料，其原料中1,3，7，9-四甲基尿酸的含量為1.58%，咖啡堿含量為0.94%，可可堿含量為0.22%，1,3，7,9-四甲基尿酸與咖啡堿均易溶于氯仿，因此萃取后必需采用有效的分離手段才能得到高純度的1，3，7,9-四甲基尿酸。該發(fā)明雖然產(chǎn)物純度高，但苦茶芽葉原料在實(shí)驗(yàn)前需要蒸青處理，最后采用ODS柱層析分離，工藝成本高，步驟繁瑣，溶劑耗量大而且費(fèi)時(shí)，同樣難以實(shí)施工業(yè)化生產(chǎn)。為此，有必要尋找更好的植物資源和適用于工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用植物原料制備1,3,7,9-四甲基尿酸的方法。本發(fā)明所述制備l，3,7，9-四甲基尿酸的方法，是用苦茶(Came/^w^m/cavar.ybc/w)的果實(shí)為原料，用水提取，提取液用氯仿或二氯甲烷萃取，回收氯仿或二氯甲烷后用甲醇或體積百分濃度為50100%的乙醇溶液作溶劑重結(jié)晶，即可得到純度達(dá)99%以上的1，3，7,9-四甲基尿酸，具體步驟如下步驟一、苦茶果實(shí)提取液的制備苦茶果實(shí)干燥后粉碎，稱取苦茶果實(shí)的粗粉，每次加入615倍量的水煎煮12小時(shí)，過濾，共提取13次，合并提取液；或在加入615倍量的水后先于頻率為2080kHz超聲波下提取1030分鐘后再煎煮12小時(shí)，過濾，再加入615倍量的水，煎煮提取12次，合并提取液；或在超聲頻率2080kHz，溫度5085'C下超聲提取3060分鐘，過濾，共重復(fù)提取l3次，合并提取液，提取液濃縮至相當(dāng)于苦茶果實(shí)粗粉重量的35倍量體積，得苦茶果實(shí)提取液；步驟二、1，3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備將苦茶果實(shí)提取液每次以等體積的氯仿或二氯甲烷萃取23次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得淺黃色粉末狀固體，為1,3，7，9-四甲基尿酸粗品，純度大于90%;步驟三、1,3,7，9-四甲基尿酸純品的制備將粗品用甲醇或體積百分濃度為50100%的乙醇溶液作溶劑重結(jié)晶，該結(jié)晶為1,3,7,9-四甲基尿酸，純度大于99%。我們在對野生苦茶和栽培苦茶的不同部位的嘌呤生物堿采用高效液相色譜法進(jìn)行分析研究中，發(fā)現(xiàn)苦茶果實(shí)中的嘌呤生物堿組成與芽葉中的嘌呤生物堿組成有很大差異，果實(shí)中1，3，7，9-四甲基尿酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于咖啡堿和可可堿。在野生苦茶的芽葉中，1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為1.5%，咖啡堿和可可堿的含量分別為1.76%和0.15%(見附圖1A);野生苦茶的果皮中1，3，7,9-四甲基尿酸的含量高達(dá)1.72.1%，但未檢測到咖啡堿和可可堿(見附圖1B);野生苦茶的種子中1，3，7,9-四甲基尿酸的含量為0.32%，此外還含有0.033%的咖啡堿和0.036%的可可堿(見附圖1C)。在栽培苦茶的芽葉中，1,3，7,9-四甲基尿酸含量為1.8%,咖啡堿和可可堿的含量為1.63%和0.073%(見附圖2A);栽培苦茶的果皮中1，3，7，9-四甲基尿酸的含量比野生苦茶的果皮稍低，為0.61.6%，另外僅含有微量的咖啡堿(0.052%)和可可堿(0.042Q/O(見附圖2B);栽培苦茶的種子中1,3,7，9-四甲基尿酸的含量為0.69%，此外還含有0.059%的咖啡堿和0.061%的可可堿(見附圖2C)。從上述分析可見，苦茶的果實(shí)與芽葉相比同樣具有較高含量的1，3,7,9-四甲基尿酸，卻僅含微量的咖啡堿和可可堿，這為果實(shí)作為制備1,3,7,9-四甲基尿酸的原料以及簡化制備方法提供了依據(jù)。在苦茶的果皮中1，3，7，9-四甲基尿酸的含量高于在種子中的含量，所以本發(fā)明的制備方法以苦茶(C"me///"ow"/m'cavar.A:wc/w)果實(shí)的果皮為原料更佳。為了提高收率，粗品的重結(jié)晶是關(guān)鍵步驟，為此在制備1,3,7，9-四甲基尿酸純品方法的步驟三，重結(jié)晶時(shí)所采用的溶劑優(yōu)選為70%乙醇(V/V)，即粗品用48倍量的70%乙醇溶液(V/V)進(jìn)行重結(jié)晶。本發(fā)明的有益效果1、茶樹植物中一般最常用的部位是葉，即使果實(shí)成熟后采收種子，其果皮往往廢棄或作燃料，未作更有經(jīng)濟(jì)意義的利用，本發(fā)明采用苦茶的果皮作為原料提取1，3，7,9-四甲基尿酸，具有"廢物"利用的優(yōu)點(diǎn)；2、采用苦茶的果實(shí)為原料，其中的嘌呤生物堿主要為l，3,7，9-四甲基尿酸，僅含極少量的咖啡堿和可可堿，由于化學(xué)成分組成較簡單，工藝流程只需采用常規(guī)的熱水提取、萃取、重結(jié)晶等步驟，操作簡單、溶劑用量少，具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3、通過對提取和重結(jié)晶方法條件的優(yōu)化，在此工藝下制備l,3,7,9-四甲基尿酸的純度高，收率高。附圖1野生苦茶芽葉(A)、果皮(B)和種子(C)的HPLC色譜圖(檢測波長278nm)圖中峰1為可可堿，峰2為1，3，7,9-四甲基尿酸，峰3為咖啡堿附圖2栽培苦茶芽葉(A)、果皮(B)和種子(C)的HPLC色譜圖(檢測波長278nm)圖中峰1為可可堿，峰2為1，3，7,9-四甲基尿酸，峰3為咖啡堿下面通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果。但本發(fā)明的內(nèi)容不局限于實(shí)施例。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶(0^^//^0^"附/<^￥&1".^^/^)果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉1000g，加入10000mL的水室溫下超聲(20kHz)提取30min，然后加熱煎煮1h，過濾，濾渣加8000mL的水加熱煎煮1h，合并兩次提取液，減壓濃縮約5000mL，得苦茶果皮提取液。二、1，3,7,9-四甲基尿酸粗品的制備將上述提取液每次用5000mL氯仿萃取，共萃取3次，合并氯仿萃取液，回收氯仿至干，得淺黃色粉末狀固體17.2g，HPLC法測得其中1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為96.01%。三、1,3，7，9-四甲基尿酸純品的制備取粗品6g分為6份，每份1g，分別用甲醇、無水乙醇、90%乙醇(v/v)、70%乙醇(v/v)、50%乙醇(v/v)以及純水進(jìn)行重結(jié)晶，溶劑用量、結(jié)晶收率及純度結(jié)果如表1所示。表l不同結(jié)晶溶劑重結(jié)晶收率和純度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)晶產(chǎn)品經(jīng)熔點(diǎn)、紫外、核磁共振氫譜和碳譜、質(zhì)譜分析測定，并與標(biāo)準(zhǔn)品或文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對照，確證為1，3，7，9-四甲基尿酸。1)熔點(diǎn)228°C;2)紫外圖譜在202nm、239nm、294nm處有最大吸收峰；3)核磁共振氫譜S(ppm,500MHz，CDC13，TMS)為3.39(s，3H)，3.59(s,3H)，3.64(s,3H)，3.74(s，3H);4)核磁共振碳譜S(ppm,125MHz，CDC13，TMS)為153.4，151.7，150.5(C=0);99.3，96,1(C=C);31.7，30.6，29.4，28,3(N—CH3);5)質(zhì)譜(ESI-MS):[M+H]+為m/z225，主要碎片離子為m/z209，195，181，167，139。純度分析的HPLC條件Waters1525高效液相色譜儀，Waters2996二極管陣列檢測器，Waters717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower色譜工作站軟件；色譜柱為PhenomenexGeminiCig柱(250mmx4.6mm,5(jm)，保護(hù)柱為PhenomenexC18柱(4mmx3.0mm,5(xm);流動(dòng)相A為甲醇，B為水，A:B的組成比從5:95(0min)線形上升為95:5(60min);進(jìn)樣量10pL;流速lmL/min;DAD掃描波長范圍200400nm。實(shí)施例2:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入1500mL的水室溫下超聲(80kHz)提取10min，然后加熱煎煮2h，過濾，濾液減壓濃縮至400mL，得苦茶果皮提取液。二、1，3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備將上述提取液每次用500mL二氯甲烷萃取，共萃取3次，合并萃取液，回收二氯甲垸至干，得淺黃色粉末狀固體1.65g，HPLC法測得其中1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為96.27%。三、1,3,7,9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.43g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.43%(以原料粗粉計(jì))，1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為99.62%。實(shí)施例3:采用中山大學(xué)茶園中無性扦插繁殖的栽培苦茶果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)采摘后，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入1000mL的水室溫下超聲(40kHz)提取30min，然后加熱煎煮1h，過濾，共重復(fù)煎煮2次，合并提取液，減壓濃縮至500mL，得苦茶果皮提取液。二、1，3,7,9-四甲基尿酸粗品的制備將上述提取液每次用500ml氯仿萃取，共萃取2次，合并氯仿萃取液，回收氯仿至干，得淺黃色粉末狀固體1.45g，HPLC法測得其中1,3,7，9-四甲基尿酸的含量為94.34%。三、1，3，7，9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.22g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.22%(以原料粗粉計(jì))，1,3，7，9-四甲基尿酸的含量為99.31%。實(shí)施例4:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶(Cawe/Z/aowam/cavar.^/c/w)果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入600mL的水加熱煎煮1.5h，過濾，共重復(fù)提取3次，合并提取液，減壓濃縮至300mL，得苦茶果皮提取液。二、1，3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備同實(shí)施例l，得到1.56g粗品，1,3,7，9-四甲基尿酸的含量為95.61o丄三、1，3，7，9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.37g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.37o%(以原料粗粉計(jì))，1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為99.36%。實(shí)施例5:采甩云南原產(chǎn)地的野生苦茶果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入600mL的水作溶劑，在85"C下進(jìn)行超聲(80kHz)提取30min，過濾，再重復(fù)超聲提取2次；合并提取液，減壓濃縮至400mL，得苦茶果皮提取液。二、1,3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備同實(shí)施例l，得到1.53g粗品，1，3，7,9-四甲基尿酸的含量為95.28%。三、1，3,7,9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.33g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.33%(以原料粗粉計(jì))，1，3，7，9-四甲基尿酸的含量為99.24%。實(shí)施例6:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入1500mL的水作溶劑，在50。C下進(jìn)行超聲(20kHz)提取60min，過濾，濾液減壓濃縮至300mL，得苦茶果皮提取液。二、1,3,7,9-四甲基尿酸粗品的制備同實(shí)施例l，得到1.49g粗品，1，3,7,9-四甲基尿酸的含量為94.41%。三、1,3,7，9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.28g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.28%(以原料粗粉計(jì))，1,3，7,9-四甲基尿酸的含量為99.27%。實(shí)施例7:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶果皮為原料一、苦茶果皮提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后取出種子并將果皮粉碎；稱取苦茶果皮粗粉100g，加入1000mL的水作溶劑，在85'C下進(jìn)行超聲(40kHz)提取45min，過濾，再重復(fù)超聲提取一次；合并提取液，減壓濃縮至500mL，得苦茶果皮提取液。二、1,3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備同實(shí)施例l，得到1.56g粗品，1，3,7,9-四甲基尿酸的含量為94.76。％。三、1，3,7，9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到1.36g產(chǎn)品，計(jì)算得率為1.36%(以原料粗粉計(jì))，1，3，7，9-四甲基尿酸的含量為99.48%。實(shí)施例8:采用云南原產(chǎn)地的野生苦茶(Came〃/aowam/cavar.^c/2")果實(shí)為原料一、苦茶果實(shí)提取液的制備苦茶果實(shí)于云南省原產(chǎn)地的野生苦茶茶樹上采得，干燥后粉碎；稱取苦茶果實(shí)粗粉100g，加入1500mL的水室溫下超聲(40kHz)提取10min，然后加熱煎煮lh，過濾，共重復(fù)提取2次，合并提取液，減壓濃縮至500mL，得苦茶果實(shí)提取液。二、1，3,7,9-四甲基尿酸粗品的制備同實(shí)施例l，得到0.87g粗品，1,3,7，9-四甲基尿酸的含量為92.17%。三、1,3,7,9-四甲基尿酸的制備將上述粗品用5倍量70%乙醇重結(jié)晶，得到0.73g產(chǎn)品，計(jì)算得率為0.73%(以原料粗粉計(jì))，1,3,7,9-四甲基尿酸的含量為99.12°%。權(quán)利要求1、一種制備1，3，7，9-四甲基尿酸的方法，其特征是用苦茶(Camelliaassamicavar.kucha)的果實(shí)為原料，用水提取，提取液用氯仿或二氯甲烷萃取，回收氯仿或二氯甲烷后用甲醇或體積百分濃度為50～100％的乙醇溶液作溶劑重結(jié)晶，即可得到純度達(dá)99％以上的1，3，7，9-四甲基尿酸，具體步驟如下步驟一、苦茶果實(shí)提取液的制備苦茶果實(shí)干燥后粉碎，稱取苦茶果實(shí)的粗粉，每次加入6～15倍量的水煎煮1～2小時(shí)，過濾，共提取1～3次，合并提取液；或在加入6～15倍量的水后先于頻率為20～80kHz超聲波下提取10～30分鐘后再煎煮1～2小時(shí)，過濾，再加入6～15倍量的水，煎煮提取1～2次，合并提取液；或在超聲頻率20～80kHz，溫度50～85℃下超聲提取30～60分鐘，過濾，共重復(fù)提取1～3次，合并提取液，提取液濃縮至相當(dāng)于苦茶果實(shí)粗粉重量的3～5倍量體積，得苦茶果實(shí)提取液；步驟二、1，3，7，9-四甲基尿酸粗品的制備將苦茶果實(shí)提取液每次以等體積的氯仿或二氯甲烷萃取2～3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得淺黃色粉末狀固體，為1，3，7，9-四甲基尿酸粗品，純度大于90％；步驟三、1，3，7，9-四甲基尿酸純品的制備將粗品用甲醇或體積百分濃度為50～100％的乙醇溶液作溶劑重結(jié)晶，該結(jié)晶為1，3，7，9-四甲基尿酸，純度大于99％。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備l，3，7,9-四甲基尿酸的方法，其特征在于原料為苦茶果實(shí)的果皮。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備1,3,7，9-四甲基尿酸的方法，其特征在于步驟三、1，3,7,9-四甲基尿酸純品的制備，粗品用體積百分濃度為70%的乙醇溶液進(jìn)行重結(jié)晶。全文摘要1，3，7，9-四甲基尿酸的制備方法，涉及化學(xué)領(lǐng)域嘌呤生物堿類化合物的制備方法。具體是用苦茶(Camelliaassamicavar.kucha)的果實(shí)為原料，用水提取，提取液用氯仿或二氯甲烷萃取，回收氯仿或二氯甲烷后用體積百分濃度為50～100％的乙醇溶液，或甲醇作溶劑重結(jié)晶，即可得到純度達(dá)99％以上的1，3，7，9-四甲基尿酸。本發(fā)明的有益效果1.具有“廢物”利用的優(yōu)點(diǎn)；2.工藝流程簡單、溶劑用量少，具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；3.產(chǎn)品純度高，收率高。文檔編號(hào)A61K36/185GK101289448SQ20081002887公開日2008年10月22日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者盧嘉麗,葉創(chuàng)興,杜麗麗,王冬梅,石祥剛,鄭新強(qiáng)申請人:中山大學(xué)