專利名稱：來(lái)源于豬的斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合癥病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及病毒。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及從表現(xiàn)斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合癥(PMWS)的豬體內(nèi)分離出來(lái)的新的豬環(huán)狀病毒(PCV)的分離和鑒定。
豬環(huán)狀病毒(PCV)對(duì)豬造成廣泛影響，且具有高度傳染性。最初檢測(cè)到的PCV認(rèn)為是豬腎(PK15)細(xì)胞系的非致細(xì)胞病變性污染物。目前已經(jīng)將PCV分類為一種新的病毒家族環(huán)狀病毒科。這些病毒很小，無(wú)包膜物質(zhì)，具有單鏈環(huán)DNA基因組。
已經(jīng)在一定范圍的動(dòng)物種類中鑒定了多種環(huán)狀病毒，包括PCV、雞貧血病毒(CAV)、鸚鵡的喙和羽毛病病毒(BFDV)，植物病毒包括三葉草地下阻礙生長(zhǎng)病毒(SCSV)、椰子葉腐爛病毒(CFDV)和香蕉串頂端病毒(BBTV)。對(duì)于目前認(rèn)識(shí)的環(huán)狀病毒，看來(lái)似乎不存在DNA序列同源性或共同的抗原決定簇。Todd等(1991)Arch.Virol.117:129-135。
已經(jīng)顯示環(huán)狀病毒家族的成員導(dǎo)致貧血、免疫缺陷相關(guān)疾病，并且在體外感染巨噬細(xì)胞。也就是最近發(fā)現(xiàn)PCV涉及PMWS。參見(jiàn)，例如，Ellis等(1998)加拿大獸醫(yī)雜志(Can.Vet.J.)39:44-51和Gopi等(1997)加拿大獸醫(yī)雜志38:385-386。然而，由于PCV在豬群中普遍存在，對(duì)PCV與PMWS的病因?qū)W關(guān)系提出了質(zhì)疑。另外，用來(lái)源于污染PK15細(xì)胞培養(yǎng)物的PCV接種物對(duì)豬進(jìn)行的試驗(yàn)性感染沒(méi)有引起臨床疾病。參見(jiàn)，例如，Tischer等(1986)Arch.Virol.91:271-276。
豬的感染物質(zhì)，尤其是病毒，不僅深重影響著畜牧業(yè)，而且由于應(yīng)用豬器官對(duì)人進(jìn)行異種移植的興趣不斷增長(zhǎng)，故給人帶來(lái)潛在的公共健康危險(xiǎn)。以前診斷PMWS病一直基于組織病理學(xué)檢查。因此，有必要改善診斷PMWS-相關(guān)病原存在的方法，以及預(yù)防PMWS病。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明基于一種新病毒的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中該病毒被稱為“PCVⅡ型”或“PCVⅡ”，其從受PMWS侵襲的豬崽的勻漿組織中分離出來(lái)。該病毒的特征在于它與從持續(xù)感染的PK15細(xì)胞中得到的非致病性豬環(huán)狀病毒(本發(fā)明中稱為“PCVⅠ型”或“PCVⅠ”)具有共同的特征?？寺×诵翽CV變異體的全長(zhǎng)DNA基因組，PCVⅡ412，以及其它幾種PCVⅡ分離體，并對(duì)它們進(jìn)行了測(cè)序。這些DNA序列的片段可以用作探針診斷臨床樣品中是否存在該病毒，以及分離該病毒的其它天然存在的變異體。PCVⅡ基因組序列的明了也使病毒基因組開(kāi)放讀碼框中編碼各種蛋白質(zhì)的多肽序列得以利用，使制備這些肽或其片段成為可能，而這些肽或其片段可用作診斷試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)品或試劑和用作疫苗的成分。還可以由這些蛋白質(zhì)生產(chǎn)保護(hù)性抗體，可以制備單克隆或多克隆形式的抗體。
因此全PCVⅡ序列的提供使下述多肽的設(shè)計(jì)和構(gòu)建成為可能，所述多肽可以用作疫苗或診斷試劑，或者用作制備用于抗PMWS主動(dòng)免疫治療的單克隆抗體(Mab)制劑的中間體，或者用作制備用于診斷試劑的抗體的中間體。
因此，一方面本發(fā)明涉及用于制備PCVⅡ診斷試劑和疫苗的來(lái)源于PCVⅡ基因組的多核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施例中，多核苷酸能夠選擇性地與PCVⅡ核苷酸序列雜交，并且含有來(lái)源于或互補(bǔ)于圖4A-4C(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和24)描述的PCVⅡ序列的至少大約8個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸編碼一種免疫原PCVⅡ多肽，其與選自來(lái)源于(a)ORF 1(SEQID NO:3)、(b)ORF 2(SEQ ID NO:9)、(c)ORF 3(SEQ IDNO:7)、(d)ORF 4(SEQ ID NO:20)、(e)ORF 5(SEQ ID NO:21)、(f)ORF 6(SEQ ID NO:5)、和(g)含有至少約5個(gè)氨基酸的(a)-(f)的免疫原性片段多肽之一的多肽具有至少約85％的等同性。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，多核苷酸編碼ORF 6(SEQID NO:5)的多肽，或其免疫原片段。
因此本發(fā)明涉及應(yīng)用這些多核苷酸序列或其部分作為寡核苷酸探針，用于制備能夠作為診斷試劑或疫苗抗原的肽，以及用于診斷和治療疾病的多克隆和單克隆抗體。
本發(fā)明的其它方面包括表達(dá)系統(tǒng)，其能夠?qū)崿F(xiàn)由來(lái)源于全基因組序列編碼的所需蛋白質(zhì)的生產(chǎn)；含有該系統(tǒng)或其部分的重組載體；用該載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)；以及由該蛋白質(zhì)制備的疫苗。另外，本發(fā)明涉及由基因組編碼的代表表位的肽序列，以及共價(jià)連接與標(biāo)記或載體蛋白質(zhì)的該序列。本發(fā)明還包括PCVⅡ基因組的各種ORF，以及由這些ORF編碼的蛋白質(zhì)，和其片段。
本發(fā)明還涉及制備多肽組合物例如疫苗和免疫診斷組合物、以及免疫球蛋白的方法，還涉及免疫分析法和含有引物、探針、多肽、和/或免疫球蛋白的分析試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物樣品中PCVⅡ抗體的方法，包括(a)提取生物樣品；(b)將生物樣品與上述免疫原PCVⅡ多肽在使PCVⅡ抗體(如果存在于生物樣品中)結(jié)合PCVⅡ多肽的條件下反應(yīng)，以形成抗體/抗原復(fù)合物；和(c)檢測(cè)是否存在該復(fù)合物，由此檢測(cè)樣品中存在或缺乏PCVⅡ抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物樣品中PCVⅡ同源序列的核酸雜交分析，包括(a)將生物樣品與權(quán)利要求1的多核苷酸在促進(jìn)多核苷酸和存在于生物樣品中PCVⅡ核酸之間形成核酸復(fù)合物的條件下保溫；和(b)檢測(cè)含有多核苷酸的復(fù)合物。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的下列詳細(xì)描述后，將會(huì)更完全地理解本發(fā)明的上述和其它方面和特征。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是PCVⅡ412的示意圖，顯示開(kāi)放讀碼框的定位。
圖2A-2C描述了PCVⅡ412基因組的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。兩條鏈均被顯示。也顯示了如所示ORF 1(SEQ ID NO:3)；ORF 2(SEQ ID NO:9)；ORF 3(SEQ ID NO:7)；ORF 4(SEQ IDNO:20)；ORF 5(SEQ ID NO:21)；ORF 6(SEQ ID NO:5)的各種ORF對(duì)應(yīng)的翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列。
圖3A-3D是來(lái)源于PCVⅡ412開(kāi)放讀碼框與從PK15細(xì)胞中分離出的PCVⅠ相應(yīng)開(kāi)放讀碼框的氨基酸序列比較。圖3A顯示PCVⅡ412ORF 1(上線，SEQ ID NO:3)與PCVⅠ的相應(yīng)ORF(下線，SEQ IDNO:4)的氨基酸序列比較。圖3B顯示PCVⅡ412的ORF 6(上線，SEQ ID NO:5)與PCVⅠ的相應(yīng)ORF(下線，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列比較。圖3C顯示PCVⅡ412的ORF 3(上線，SEQ ID NO:7)與PCVⅠ的相應(yīng)ORF(下線，SEQ ID NO:8)的氨基酸序列比較。圖3D顯示PCVⅡ412的ORF2(上線，SEQ ID NO:9)與PCVⅠ的相應(yīng)ORF(下線，SEQ ID NO:10)的氨基酸序列比較。
圖4A-4D是各種PCV分離體的核苷酸序列來(lái)源于PK15細(xì)胞的PCVⅠ(SEQ ID NO:2):PCVⅡ412(SEQ ID NO:1):PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11):PCVⅡB9(SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:24)。
圖5顯示用于檢測(cè)PCV感染的多重PCR結(jié)果。該分析即鑒定了PCV感染，又鑒別了存在的PCVⅠ和PCVⅡ。1道是分子量標(biāo)記。2-4道依次是PCVⅡ?qū)φ铡CVⅠ對(duì)照和陰性對(duì)照。5-13道是從PMWS-感染畜群的豬崽體內(nèi)收集的血樣。
圖6顯示對(duì)來(lái)源于PMWS-感染豬崽的各種組織樣品進(jìn)行的多重PCR的結(jié)果。1道兩排是分子量標(biāo)記。2道上排是陽(yáng)性PCVⅡ?qū)φ?，?道是陰性對(duì)照。其余道是從PMWS-感染豬崽中收集的各種組織樣品。
詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用，除非另有說(shuō)明，分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、和免疫學(xué)的常規(guī)方法，它們均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些方法在文獻(xiàn)中有充分描述。參見(jiàn)，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆試驗(yàn)室指南，第Ⅰ、Ⅱ和Ⅱ卷，第二版(1989)；DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover編，1985)寡核苷酸合成(M.J.Gait編，1984)核酸雜交(B.D.Hames和S.J.Higgins編，1984)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.K.Freshney編，1986)；固定化細(xì)胞和酶(IRL出版社，1986)；Perbal,B.，分子克隆操作指南(1984)；系列，酶學(xué)方法(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press,Inc.)；和試驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，第Ⅰ-Ⅳ卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986,Blackwell Xcientific Publications)。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于如所指的具體DNA、多肽序列或處理參數(shù)，當(dāng)然可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明使用的專有名詞目的僅在于描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，不是意圖限制。
必須注意到，如本說(shuō)明書和后附的權(quán)利要求中用到的，單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文已經(jīng)清楚地有相反指示。因此，例如，提及的“一種抗原(an antigen)”包括兩種或多種抗原的混合物。提及的“一種賦形劑(an excipient)”包括兩種或多種賦形劑的混合，等等。
全文使用下列氨基酸簡(jiǎn)寫丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)
組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys(K)蛋氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)纈氨酸Val(V)A．定義除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明涉及領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然一些類似于或等同于本發(fā)明所述的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐，但優(yōu)選的材料和方法是本文描述的那些。
在描述本發(fā)明時(shí)，將用到下列術(shù)語(yǔ)，試圖如下所述定義它們。
術(shù)語(yǔ)“PCVⅡ蛋白”“PMWS蛋白”或編碼它們的核苷酸序列，應(yīng)當(dāng)分別是這樣的蛋白質(zhì)或核苷酸序列，它們來(lái)源于本發(fā)明所述的新的PCVⅡ分離體。幾種PCVⅡ分離體的核苷酸序列在圖4A-4B中顯示，對(duì)應(yīng)的六種被鑒定的PCVⅡORF的氨基酸序列在圖2A-2C中顯示。然而，本發(fā)明定義的PCVⅡ或PMWS蛋白、或編碼它們的基因不限于上述序列。
另外，如本發(fā)明中用到的，“來(lái)源于”PCVⅡ基因組或其互補(bǔ)物的核苷酸序列指為期望目的保留例舉多核苷酸的基本特性，代表其來(lái)源全序列的一部分的序列。一種具體的，但非限定的該衍生物的例子由這樣一種序列代表，其編碼相同或基本相同氨基酸序列，但因?yàn)槊艽a簡(jiǎn)并性，使用不同的具體密碼；另一個(gè)例子是與病毒DNA互補(bǔ)的序列。診斷試驗(yàn)中使用的探針或寡核苷酸必須保留所示序列的互補(bǔ)性，但可以比全序列短或可以刪除其一部分。然而，對(duì)于操作或表達(dá)應(yīng)用，通常需要改變核苷酸，以產(chǎn)生或刪除限制性位點(diǎn)，提供加工位點(diǎn)，或以不產(chǎn)生不利效果功能的方式改變編碼的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”和“多核苷酸”均指核糖核酸和脫氧核糖核酸序列，包括基因組鏈和其互補(bǔ)序列。
因此“來(lái)源于”含有PCVⅡ分離體基因組的核苷酸序列的序列指其包括基因組核苷酸序列相應(yīng)(或它互補(bǔ)鏈)區(qū)的序列，或用與該期望用途相同領(lǐng)域的已知方法改進(jìn)的所述序列區(qū)段的組合。當(dāng)然，這些序列不一定是物理來(lái)源于所述基因的核苷酸序列，而是指這樣的多核苷酸，即通過(guò)基于由其來(lái)源區(qū)段中的堿基序列提供的信息的任何方式產(chǎn)生的多核苷酸。例如，典型DNA序列“來(lái)源”的區(qū)段包括編碼特異表位的區(qū)段。同樣地，“來(lái)源于”PCVⅡORF的肽指基本上等同于這些多肽或其部分的氨基酸序列，并具有與該部分具有同樣生物學(xué)特性的氨基酸序列。
而且，衍生的蛋白質(zhì)或核苷酸序列不一定物理來(lái)源于上述基因，而可以通過(guò)任何方式產(chǎn)生，包括例如，基于本發(fā)明提供的信息化學(xué)合成、分離(例如，從PCVⅡ分離體)或通過(guò)重組生產(chǎn)。另外，該術(shù)語(yǔ)意在指與該基因編碼的連續(xù)氨基酸序列基本上具有氨基酸序列同源性(如下文的定義)，并表現(xiàn)免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)。
因此，該術(shù)語(yǔ)意指全長(zhǎng)序列、以及免疫原性的、截短的和部分序列，以及該蛋白質(zhì)的活性類似物或前體形式。該術(shù)語(yǔ)還包括該具體基因的核苷酸片段，包括該基因的至少約8個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，更優(yōu)選至少約25到50或75或更多的連續(xù)堿基對(duì)。該片段用作下面將要充分探討的診斷方法，和重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的探針。
該術(shù)語(yǔ)還包括天然形式的蛋白質(zhì)，或制劑模式的堿性或酸性附加鹽形式。該酸性附加鹽可以涉及游離氨基，堿性鹽可以通過(guò)游離羧基形成。下面將進(jìn)一步探討藥物可接受的堿性或酸性附加鹽。另外，可以將蛋白質(zhì)與其它生物材料，例如脂類和糖組合，或通過(guò)側(cè)鏈修飾，例如氨基的乙?；⒘u基側(cè)鏈的磷酸酯化、巰基的氧化、氨基酸殘基的糖化，以及其它對(duì)被編碼的一級(jí)序列的修飾，來(lái)改進(jìn)該蛋白質(zhì)。
因此該術(shù)語(yǔ)意指該序列的缺失、添加和取代，只要該多肽能夠發(fā)揮功能，產(chǎn)生本發(fā)明所述的免疫應(yīng)答。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的取代通常是本質(zhì)上保守的，即，在一族氨基酸之間發(fā)生的取代。例如，通常將氨基酸分成四族(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸氨；(2)堿性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(2)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)無(wú)電荷極性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有時(shí)被分類為芳香氨基酸。例如，可以理所當(dāng)然地預(yù)測(cè)這樣的分離取代亮氨酸到異亮氨酸或纈氨酸，反之亦然；天冬氨酸到谷氨酸，或相反；蘇氨酸到絲氨酸或相反；或者用類似的結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸進(jìn)行的氨基酸保守取代將不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重大影響。與參照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但含有少量氨基酸取代的蛋白質(zhì)基本上不會(huì)影響蛋白質(zhì)的免疫原性，因此該蛋白質(zhì)在參照多肽的定義范圍內(nèi)。
“開(kāi)放讀碼框”或“ORF”是編碼一種多肽的多核苷酸序列區(qū)域。
至于“斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合癥”或“PMWS”指一種脊椎動(dòng)物，特別是豬的疾病，其臨床特征在于體重逐漸減輕、呼吸急促、呼吸困難和黃疸。其病理改變包括淋巴細(xì)胞到肉芽腫的間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)病，和，不常發(fā)生的淋巴細(xì)胞到肉芽腫的肝炎和腎炎。參見(jiàn)，例如，Clark,E.G.,Am.Assoc.Swine Pract.1997:499-501；和Harding,J.Am.Assoc.Swine Pract.1997:503。
“分離”的核酸分子是從自然界中發(fā)現(xiàn)該分子的完整生物體中分離或分泌出的核酸分子；或缺失通常與其天然形式相關(guān)的全部或部分序列的核酸分子；或這樣一種序列，它天然存在，但具有與此相關(guān)的異源序列(如下定義)。
術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”意指含有抗原的任何藥物組合物，該組合物可以用于預(yù)防或治療受體的疾病或病癥。因此該術(shù)語(yǔ)包括如下所述的兩種亞單位疫苗，以及含有完全殺死、減毒或滅活的微生物。
至于“亞單位疫苗組合物”指含有至少一種免疫原性多肽，但不是所有抗原，來(lái)源于或同源于來(lái)自相關(guān)病原體抗原的組合物。該組合物基本上無(wú)完整病原體細(xì)胞或顆粒，或者細(xì)胞或顆粒的溶解物。因此，“亞單位疫苗組合物”由來(lái)自病原體的至少部分純化(優(yōu)選基本上純化)的免疫原性多肽，或者其重組類似物制備。亞單位疫苗組合物可以包括亞單位抗原或基本上沒(méi)有來(lái)自病原體的其它抗原或多肽的相關(guān)抗原。
術(shù)語(yǔ)“表位”指特異于B細(xì)胞和/或T細(xì)胞應(yīng)答的抗原或半抗原上的位點(diǎn)。該術(shù)語(yǔ)還可以與“抗原決定簇”或“抗原決定位點(diǎn)”相互替換。可以用顯示一種抗體阻斷另一種抗體結(jié)合目標(biāo)抗原能力的簡(jiǎn)單的免疫分析法鑒定識(shí)別相同表位的抗體。
對(duì)一種組合物或疫苗的“免疫應(yīng)答”指在宿主體內(nèi)形成細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的對(duì)相關(guān)組合物或疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。通常，“免疫應(yīng)答”包括但不限于一種或多種下列作用特異性地對(duì)包括相關(guān)組合物或疫苗的一種或多種抗原產(chǎn)生抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞、和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞。優(yōu)選，宿主將表現(xiàn)治療性或保護(hù)性免疫應(yīng)答，以至于對(duì)新感染的抗性將被增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重度將被降低。該保護(hù)作用將通過(guò)感染的宿主通常表現(xiàn)癥狀的降低或缺乏，感染宿主較短的恢復(fù)時(shí)間和/或較低的病毒效價(jià)證明。
術(shù)語(yǔ)“免疫原性”蛋白質(zhì)或多肽指誘導(dǎo)上述免疫應(yīng)答的氨基酸序列。本發(fā)明提到的“免疫原性”蛋白質(zhì)或多肽包括蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列、其類似物、或其免疫原性片段?！懊庖咴云巍敝赴ㄒ环N或多種表位，因此能夠誘導(dǎo)上述免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)片段。該片段可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的很多表位作圖技術(shù)鑒定。參見(jiàn)，例如，分子生物學(xué)方法中的表位作圖方案，第66卷(Glenn E.Moris，編，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，可以通過(guò)例如，在固相支持物上同時(shí)合成大量肽，該肽對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)分子的一部分，使肽與抗體反應(yīng)而肽仍然貼附于支持物，來(lái)確定線型表位。該技術(shù)是本領(lǐng)域已知技術(shù)，描述于例如美國(guó)專利4,708,871；Geysen等(1984)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展81:3998-4002；Geysen等(1986)分子免疫學(xué)23:709-715。同樣，可以通過(guò)確定氨基酸的空間構(gòu)象，例如，通過(guò)X-射線晶體學(xué)和2-維核磁共振簡(jiǎn)單地鑒定構(gòu)象表位。參見(jiàn)，例如，表位作圖方案，同上。
上述概念還包括合成抗原，例如，多表位、旁側(cè)表位、核其它重組的或合成的衍生抗原。參見(jiàn)，例如，Bergmann等(1993)歐洲免疫學(xué)雜志23:2777-2781；Bergmann等(1996)免疫學(xué)雜志157:3242-3249；Suhrbier,A(1997)免疫和細(xì)胞生物學(xué)75:402-408；Gardner等(1998)第12屆世界AIDS會(huì)議，Geneva,Switzerland，1998年6月28日-7月3日。
用于本發(fā)明目的的免疫原性片段通常該分子包括至少約3個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約10-15個(gè)氨基酸，更優(yōu)選25或更多氨基酸。對(duì)于該片段的長(zhǎng)度沒(méi)有嚴(yán)格的上限，其可以包括幾乎全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列，或甚至含有兩種或多種蛋白質(zhì)表位的融合蛋白質(zhì)。
“天然”蛋白質(zhì)或多肽指從蛋白質(zhì)自然發(fā)生的來(lái)源分離出來(lái)的蛋白質(zhì)或多肽?！爸亟M”多肽指通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的多肽；即，從用編碼所需多肽的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中制備的多肽。“合成”多肽是通過(guò)哈合成制備的多肽。
“載體”是一種復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體、或粘粒，其中另一種DNA片段可以貼附于其上，以使貼附片段發(fā)生復(fù)制。
DNA“編碼序列”或“核苷酸序列編碼”的特定蛋白質(zhì)是在體外或體內(nèi)處于適當(dāng)調(diào)控元件的控制之下被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的界限通過(guò)5′(氨基)末端的起始密碼和3′(羧基)末端的翻譯終止密碼確定。編碼序列可以包括但不限于，原核細(xì)胞序列、來(lái)自真核細(xì)胞mRNA的cDNA、來(lái)自真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物)的基因組DNA序列，以及合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常定位于編碼序列的3′端。
DNA“控制元件”指啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強(qiáng)子等的總稱，其總體提供編碼序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。不是所有這些控制序列都必須總是存在于重組載體中，只要所需的基因能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯即可。
“有效地連接”指元件的排列，其中所述成分如此布局以至能發(fā)揮它們的常規(guī)功能。因此，控制元件有效地連接于編碼序列能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)?？刂圃槐嘏c編碼序列相鄰，只要它們發(fā)揮指導(dǎo)其表達(dá)的功能。因此，例如，啟動(dòng)子和編碼序列之間可以插入不翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列，啟動(dòng)子仍然能夠認(rèn)為是“有效地連接”于編碼序列。
控制元件，例如啟動(dòng)子，“指導(dǎo)編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄”，其中RNA聚合酶將結(jié)合啟動(dòng)子，編碼序列將被轉(zhuǎn)錄成mRNA，其然后翻譯成由編碼序列編碼的多肽。
“宿主細(xì)胞”是被外源核酸分子轉(zhuǎn)化的，或能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
當(dāng)該外源DNA被導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)部，則細(xì)胞被外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以，也可以不整合(共價(jià)連接)到構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。例如，在原核細(xì)胞和酵母中，外源DNA可以保留在游離基因元件(例如質(zhì)粒)上。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞是一種外源DNA已經(jīng)整合到染色體上，以至其經(jīng)染色體復(fù)制被遺傳到子代細(xì)胞中的細(xì)胞。這種穩(wěn)定性通過(guò)真核細(xì)胞建立包括含有外源DNA的子代細(xì)胞群的細(xì)胞系或集落的能力證明。
“同源性”指兩種多核苷酸或兩種多肽之間的等同百分率。當(dāng)兩種DNA，或兩種多肽序列在分子的指定長(zhǎng)度之間表現(xiàn)至少約80-85％、優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95-98％序列等同性時(shí)，則二者彼此“基本上同源”。如本發(fā)明提到的，基本上同源還指與特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
可以通過(guò)直接比較兩種分子之間的經(jīng)排列序列后的序列信息，計(jì)錄兩種排列序列之間完全匹配的數(shù)目，除以較短序列的長(zhǎng)度，得到的結(jié)果再乘以100。方便提供的計(jì)算機(jī)程序可以用于輔助分析，例如ALIGN,Dayhoff,M.O.(蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集，M.O.Dayhoff編，5增刊，3:353-358，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基因，Washington,DC)，其對(duì)Smith和Waterman((1981)，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in Appl.Math.)2:482-489)的用于肽分析的局部同源性運(yùn)算法則進(jìn)行了改編。確定核苷酸序列等同性的程序在Wisconsin序列分析包，8版(來(lái)自Genetics Computer Group,Madison,WI)中提供，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，也依賴于Smith和Waterman運(yùn)算法則。這些程序應(yīng)用生產(chǎn)商推薦的和在上面指出的Wisconsin序列分析包中描述的缺省參數(shù)，易于使用。
或者，可以通過(guò)在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下使多核苷酸雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化，確定消化片段的大小來(lái)確定同源性。基本上同源的DNA序列可以在Southern雜交試驗(yàn)中，在，例如，該特定系統(tǒng)定義的嚴(yán)緊條件下，鑒定。確定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)技術(shù)范圍內(nèi)。參見(jiàn)例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸雜交，同上。
如果兩種核酸片段能夠與PCVⅡ核酸或其變異體特異性雜交(例如，與PCVⅡ核酸雜交但不與來(lái)自環(huán)狀病毒家族其它成員的多核苷酸雜交)，或特異性引導(dǎo)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ⅰ)在如，例如，Sambrook等(同上)和核酸雜交(同上)中所述的典型雜交和清洗條件下；(ⅱ)應(yīng)用降低嚴(yán)緊度的清洗條件下，該條件允許最多約25-30％堿基對(duì)錯(cuò)配，例如2×SSC、0.1％SDS，室溫兩次，每次30分鐘；然后2×SSC、0.1％ SDS,37℃一次，30分鐘；然后2×SSC，室溫兩次，每次10分鐘；或(ⅲ)選擇在標(biāo)準(zhǔn)條件下(例如，Saiki等(1988)科學(xué)239:487-491中所述)典型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中應(yīng)用的引物，其導(dǎo)致PCVⅡ或其變異體序列特異性增殖，則認(rèn)為這兩種核酸片段與PCVⅡ多核苷酸“可選擇性雜交”。
術(shù)語(yǔ)“功能等同”意指與參照氨基酸序列或其免疫原性部分誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列將誘導(dǎo)基本上相同或增強(qiáng)的前面定義的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)是一種在另一種DNA分子中或貼附于另一種DNA分子的可鑒定的DNA片段，其與天然存在的其它分子沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。因此，如果異源區(qū)編碼一種病毒基因，則該基因通常將由其來(lái)源病毒基因組中不貼附病毒基因的DNA貼附。異源編碼序列的另一個(gè)例子是編碼序列本身不是天然發(fā)現(xiàn)(例如，具有與天然基因不同密碼子的合成序列)的構(gòu)建體。如本發(fā)明中涉及的，等位基因變異或自然發(fā)生的突變事件不會(huì)提高DNA的異源區(qū)。
本發(fā)明提及的術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”指(Ⅰ)防止感染或再感染(預(yù)防)，或(ⅱ)相關(guān)疾病癥狀的緩解或消除(治療)。
如本發(fā)明提及的，“生物樣品”指從受體中分離出的組織和液體樣品，包括但不限于，例如，血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髓、膽汁、脊髓液、淋巴組織和淋巴液、皮膚樣品、皮膚、呼吸系統(tǒng)、腸道、和泌尿生殖器道的外分泌物、眼淚、唾液、乳汁、血細(xì)胞、器官、活檢，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品，包括但不限于，在培養(yǎng)基中使細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基，例如，重組細(xì)胞和細(xì)胞成分。
本發(fā)明提及的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“可檢測(cè)標(biāo)記”指能夠檢測(cè)的分子，包括但不限于，放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、發(fā)色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如，生物素活半抗原)等。術(shù)語(yǔ)“熒光劑”指在檢測(cè)范圍內(nèi)能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)或部分。本發(fā)明中可以應(yīng)用的標(biāo)記的具體實(shí)例包括熒光素、若丹明、丹酰、傘花內(nèi)酯、Texas紅、發(fā)光氨、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
至于“脊椎動(dòng)物受體”指心形亞門(subphylum cordata)的所有成員，包括單不限于，哺乳動(dòng)物例如牛、羊、豬、山羊、馬、和人；家畜類動(dòng)物例如狗和貓；以及鳥(niǎo)，包括家養(yǎng)的、野生的和獵鳥(niǎo)例如公雞和母雞包括小雞、火雞和其它雞類鳥(niǎo)。該術(shù)語(yǔ)沒(méi)有指示具體年齡。因此，意圖覆蓋成年和新生動(dòng)物，以及胎兒。B．一般方法本發(fā)明的核心是發(fā)現(xiàn)了一種從PMWS感染豬體內(nèi)分離出來(lái)的新的環(huán)狀病毒，本發(fā)明命名為“PCVⅡ”。本發(fā)明應(yīng)用的材料和方法使發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)家族的核苷酸序列(它們各自含有新PCVⅡ病毒的一個(gè)完整基因組)成為可能。該家族核苷酸序列的可應(yīng)用性，首先使較小異源性差異的該基因組家族的其它成員的分離成為可能，其次，使DNA片段的構(gòu)建和蛋白質(zhì)應(yīng)用于診斷成為可能。例如，至少約8-10個(gè)或更多核苷酸的低聚物，優(yōu)選包括至少約15-20個(gè)核苷酸的低聚物用作疾病診斷的雜交探針。該探針可以用于檢測(cè)，例如，懷疑攜帶病毒的受試者的血清中，病毒基因組的存在。同樣，編碼蛋白質(zhì)的基因可以被克隆和用于設(shè)計(jì)探針，以檢測(cè)和分離其它病毒分離體中的同源基因。
PCVⅡ序列還能夠用于設(shè)計(jì)和生產(chǎn)PCVⅡ-特異性多肽，其用作診斷血清或血液中PCVⅡ引起的抗體是否存在的試劑?？惯@些多肽的抗體也可用作診斷試劑。因?yàn)榭梢越獯a完全基因組范圍中的幾個(gè)開(kāi)放讀碼框，所以能夠推測(cè)PCVⅡ-相關(guān)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。最后，該基因序列的信息還能夠設(shè)計(jì)和生產(chǎn)有效抗PCVⅡ的疫苗，因此用于預(yù)防PMWS和用于生產(chǎn)保護(hù)性抗體。
來(lái)自基因組的序列信息能夠推測(cè)由病毒基因組編碼的各種多肽的氨基酸序列和鑒定其適當(dāng)表位。能夠利用獨(dú)立獲得和表達(dá)的相關(guān)DNA片段生產(chǎn)由PCVⅡ基因組中鑒定的幾種ORF編碼的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，或其適當(dāng)部分，因此利用重組技術(shù)提供所需的多肽。原核宿主和真核宿主都可以被用于該表達(dá)。短多肽片段也可以被化學(xué)合成并被連接到載體蛋白質(zhì)上用作疫苗。另外，可以生產(chǎn)連接于賦予免疫原性的蛋白質(zhì)的表位。由此生產(chǎn)的蛋白質(zhì)本身可以用作疫苗，或者可以用于誘導(dǎo)宿主中免疫活性B細(xì)胞，然后該B細(xì)胞可以用于生產(chǎn)在被動(dòng)免疫治療中應(yīng)用的分泌抗體的雜交瘤。
更具體地說(shuō)，三種PCVⅡ分離體——PCVⅡ412(SEQ ID NO:1)、PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11)、和PCVⅡB9(SEQ ID NO:12,SEQID NO:24)的完全基因序列如土4A-4B所示。各PCVⅡ分離體之間核苷酸序列同源性百分率超過(guò)99％等同性。新發(fā)現(xiàn)的病毒基因組與感染的PK15細(xì)胞分離出的PCV(本發(fā)明中稱為“PCVⅠ”)在核苷酸水平上具有約76％的等同性。如實(shí)施例中的進(jìn)一步描述，在三個(gè)區(qū)段中發(fā)現(xiàn)核苷酸插入和缺失(插入缺失，indel)。
如圖1所示，新病毒含有至少六個(gè)潛在的開(kāi)放讀碼礦(ORF)，它們編碼含有多于50個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，而來(lái)源于PK15的PCVⅠ具有七個(gè)潛在的ORF。代表性PCVⅡ分離體的ORF出現(xiàn)在下列核苷酸位置(應(yīng)用圖4A-4B所示的PCVⅡ分離體的編號(hào))ORF 151-992ORF 2671-360ORF 3565-389ORF 4553-729ORF 51016-1174ORF 61735-1037由這六種ORF編碼的多肽如圖2A-2C所示。
PCVⅡ靶向的主要細(xì)胞是外周血中的單核細(xì)胞，象巨噬細(xì)胞，當(dāng)然感染動(dòng)物的各種組織和器官中也發(fā)現(xiàn)了病毒。感染的巨噬細(xì)胞喪失了其正常功能，使宿主免疫系統(tǒng)損害，導(dǎo)致死亡。
新環(huán)狀病毒的克隆和測(cè)序提供了有關(guān)PMWS病因物質(zhì)的信息。如上面的解釋，測(cè)序信息、以及克隆和其基因產(chǎn)物在診斷和研制疫苗中是有用的。特別是，PCR和基于抗體的診斷方法用于診斷疾病，以及在本發(fā)明中用于專屬地將本發(fā)明的新PCVⅡ病毒與來(lái)源于持續(xù)感染的PK15細(xì)胞的PCVⅠ鑒定和區(qū)別開(kāi)來(lái)。測(cè)序信息還用于設(shè)計(jì)特異性引物，以表達(dá)病毒-特異性基因產(chǎn)物，用于研究病毒結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)特異性抗體，以及鑒定豬環(huán)狀病毒相關(guān)疾病的致病基因。B.1．PCVⅡ基因序列的制備從PMWS感染豬的組織中分離出的病毒得到新PCVⅡ病毒基因組。從各種來(lái)源提取病毒DNA，包括感染的Dulac和Vero細(xì)胞小球、外周血暗黃色膜細(xì)胞、來(lái)自感染動(dòng)物的組織和血清。應(yīng)用實(shí)施例中更充分描述的方法從樣品中提取DNA。
通過(guò)比較環(huán)狀病毒家族中已知病毒之間的序列和結(jié)構(gòu)相似性，利用保守莖環(huán)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)獨(dú)特引物。然后進(jìn)行單引物PCR，并克隆產(chǎn)物。在兩個(gè)方向上對(duì)插入質(zhì)粒載體的不同取向的兩種全長(zhǎng)病毒基因組進(jìn)行測(cè)序。制備其它PCR產(chǎn)物，并測(cè)序以確保引物/莖環(huán)區(qū)的可靠性。
利用類似引物，其它PCVⅡ分離體，得到包括PCVⅡ 9741、和PCVⅡ B9。這可能是首次從病毒顆粒而不是從DNA復(fù)制形式克隆出環(huán)狀病毒。
提取PCVⅡ基因組的方法的描述當(dāng)然大多數(shù)是已經(jīng)公知的。本發(fā)明提供了得到的序列，也可以利用合成法或通過(guò)合成法與應(yīng)用類似于本發(fā)明所述方法的部分序列修補(bǔ)組合制備全序列或其任何部分。B.2．PCVⅡ蛋白質(zhì)的制備PCVⅡ基因組序列的提供使來(lái)源于PCVⅡ基因組的編碼病毒多肽和其抗原活性區(qū)的表達(dá)載體的構(gòu)建稱為可能。編碼所需蛋白質(zhì)的片段可以利用常規(guī)限制性消化從cDNA克隆得到或通過(guò)合成法得到，并被連接到載體中，例如含有融合序列部分例如β-半乳糖苷酶。任何含有一個(gè)開(kāi)放讀碼框的所需的PCVⅡ基因組部分可以作為一種重組蛋白質(zhì)得到，例如一種成熟或融合蛋白質(zhì)，或者能夠通過(guò)化學(xué)合成或一般的重組方法得到。
由上述DNA序列、活性片段、類似物編碼的PCVⅡ蛋白質(zhì)合和來(lái)源于它們的嵌合蛋白質(zhì)能夠通過(guò)很多方法制備是顯而易見(jiàn)的。重組產(chǎn)物可以采用部分蛋白質(zhì)序列形式、全長(zhǎng)序列、包括信號(hào)序列的前體形式，物信號(hào)序列的成熟形式、或甚至融合蛋白質(zhì)(例如，具有合適的重組宿主的引導(dǎo)物，或具有另一種病原的另一種亞單位抗原序列)。
可以構(gòu)建基因文庫(kù)，得到的克隆用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。收集克隆，利用多克隆血清或單克隆抗體篩選PCVⅡ蛋白。
或者，當(dāng)確定氨基酸序列后，可以制備含有已確定氨基酸序列部分密碼子的寡核苷酸探針，并用于篩選編碼受試者蛋白質(zhì)的基因的基因組或cDNA文庫(kù)。制備寡核苷酸太鎮(zhèn)合DNA文庫(kù)，以及通過(guò)核酸雜交篩選它們的基本策略對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。參見(jiàn)，例如，DNA克隆第Ⅰ卷，同上；核酸雜交，同上；寡核苷酸合成，同上；Sambrook等，同上。當(dāng)從篩選文庫(kù)中鑒定出陽(yáng)性雜交的克隆后，可以通過(guò)限制性酶分析和DNA測(cè)序確定特定文庫(kù)插入體含有PCVⅡ蛋白質(zhì)基因或其同源物。然后可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步分離該基因，如果需要，應(yīng)用PCR方案或限制性酶刪除全長(zhǎng)序列的一部分。
同樣，可以應(yīng)用已知方法，例如酚提取法直接從病毒中分離基因，然后進(jìn)一步對(duì)序列操作，已產(chǎn)生任何所需的改變。參見(jiàn)，例如，本發(fā)明的實(shí)施例和Hamel等(1998)病毒學(xué)雜志72:5262-5267，屬于用于得到和分離病毒DNA的方法的描述。
或者，可以通過(guò)合成而不是克隆制備DNA序列。如果DNA序列將要用于制備蛋白質(zhì)，可以用特定氨基酸序列的合適密碼子設(shè)計(jì)DNA序列。通常，如果序列將被用于表達(dá)，那么技術(shù)人員將選擇用于預(yù)期宿主的優(yōu)選密碼子。通過(guò)重疊經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的寡核苷酸來(lái)組合全序列，并組合成完全的編碼序列。參見(jiàn)，例如，Edage(1981)自然292:756；Nambair等(1984)科學(xué)223:1299；Jay等(1984)生物化學(xué)雜志259:6311。
一旦制備或分離出所需蛋白質(zhì)的編碼序列后，可以將它們克隆到任何適當(dāng)載體或復(fù)制子中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量克隆載體，適當(dāng)克隆載體的選擇是一件選擇的問(wèn)題?？寺≈亟MDNA載體并能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的實(shí)施例包括抗菌素(E.coli)、pBR322(E.coli)、pACYC177(E.coli)、pKT230(革蘭氏陰性細(xì)菌)、pGV1106(革蘭氏陰性細(xì)菌)、pLAFR1(革蘭氏陰性細(xì)菌)、pME290(非-E.coli革蘭氏陰性細(xì)菌)、pHV14(E.coli和枯草桿菌)、pBD9(桿菌屬)、pIJ61(鏈霉菌屬)、pUC6(鏈霉菌屬)、YIp5(酵母屬)、YCp19(酵母屬)和牛痘病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。參見(jiàn)，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；B.Perbal，同上。
基因可以處于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)于細(xì)菌表達(dá))和，任選地，操縱基因(本發(fā)明中總稱為“調(diào)控”元件)的操縱之下，以使編碼所需部分的DNA序列在被含有該表達(dá)構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可以含有也可以不含信號(hào)肽或引導(dǎo)序列。如果含有信號(hào)序列，則它可以是自身的同源序列或異源序列。引導(dǎo)序列可以由宿主在轉(zhuǎn)錄后的加工中除去。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利4,431,739；4,425,437,4,338,397。
也可能需要其它的調(diào)控序列，其使蛋白質(zhì)序列的表達(dá)調(diào)控與宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)。調(diào)控序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，實(shí)例包括使基因的表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些序列，包括調(diào)控化合物的存在。載體中還可以出現(xiàn)其它類型的調(diào)控元件，例如，增強(qiáng)子序列。
操縱序列和其它調(diào)控序列可以在插入載體(例如上述克隆載體)之前連接于編碼序列。或者，可以將編碼序列直接克隆到已經(jīng)含有調(diào)控序列和適當(dāng)限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。
在某些情況下，可能需要改編編碼序列，以使它按照適當(dāng)?shù)娜∠蜻B接于控制序列；即，以便維持適當(dāng)?shù)淖x碼框。還可能需要制備所需PCVⅡ蛋白質(zhì)的突變體或類似物?？梢酝ㄟ^(guò)刪除蛋白質(zhì)編碼序列的一部分、或通過(guò)插入序列、和/或通過(guò)取代序列中一種或多種核苷酸制備突變體或類似物。在，例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸雜交，同上中描述了改變核苷酸序列的方法，例如定點(diǎn)突變。
然后表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的，包括美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)提供的無(wú)限增殖細(xì)胞系，例如但不限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、小倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛腎(“MDBK’)細(xì)胞，以及其它細(xì)胞。同樣，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌宿主例如E.coli、枯草桿菌、和鏈球菌spp.將用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明中應(yīng)用的酵母宿主特別地包括啤酒糖酵母、白色假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、多形漢遜氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、季也蒙氏畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowia lipolytica。桿狀病毒表達(dá)載體適用的昆蟲(chóng)細(xì)胞尤其包括Aedes aegypti、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶、Drosophilamelanogaster，草地夜蛾、和粉紋夜蛾。
根據(jù)選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，在表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)經(jīng)上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。然后從宿主細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可以直接從培養(yǎng)基中純化單比知。如果不分泌蛋白質(zhì)，則從細(xì)胞溶解物中分離。適當(dāng)生長(zhǎng)條件的選擇和提取方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。
也可以利用已知氨基酸序列或來(lái)源于目標(biāo)基因的DNA序列得出的氨基酸序列，通過(guò)化學(xué)合成法，例如固相肽合成，制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，肽分析、合成、生物學(xué)，編者Gross和J.Meienhofer，第2卷，科學(xué)出版社，New York(1980)pp.3-254，用于固相肽合成技術(shù)；和M.BOdansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，編，肽分析、合成、生物學(xué)，同上，第1卷，用于典型溶液合成。如果所述抗原的小片段即可引起目標(biāo)受試者的免疫應(yīng)答，則化學(xué)合成肽可能是優(yōu)選的。
基因組分析表明至少存在六個(gè)開(kāi)放讀碼框，至少其中之一編碼推測(cè)的DNA復(fù)制酶基因。B.3．抗原多肽和與載體結(jié)合物的制備肽的抗原區(qū)一般相對(duì)較小，通常位10個(gè)氨基酸或更短的長(zhǎng)度。少至5個(gè)氨基酸的片段通常即可表現(xiàn)抗原區(qū)的特征。因此，利用PCVⅡ基因組作為基礎(chǔ)，編碼任何來(lái)源于PCVⅡ的多種ORF，例如ORF 1-6，特別是ORF 6的短多肽片段的DNA可以重組表達(dá)為融合蛋白質(zhì)或分離肽。另外，可以化學(xué)合成短氨基酸序列。在合成肽被正確配置從而能提供正確表位，但因?yàn)樘《痪哂忻庖咴缘睦又?，可以將肽連接到適當(dāng)?shù)妮d體上。
本領(lǐng)域已知很多獲得該連接的方法，包括利用從Pierce Company,Rockford,Illinois得到的N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶-硫)丙酸鹽(SPDP)和琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SMCC)形成二硫鍵。(如果該缺乏巰基，可以通過(guò)加入半胱氨酸殘基提供。)這些試劑在它們自身之間和一種蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基肽之間形成二硫鍵，通過(guò)賴氨酸上的ε-氨基或其他氨基酸上的其它游離氨基形成酰胺鍵。大量這類二硫化物/酰胺形成試劑是已知的。參見(jiàn)，例如，免疫研究(1982)62:185。其它雙功能偶聯(lián)試劑形成硫醚鍵而不是二硫鍵。商業(yè)提供了很多這類硫醚-形成試劑，包括6-馬來(lái)酰亞胺己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-馬來(lái)酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸等?？梢酝ㄟ^(guò)將羧基與琥珀酰亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸鈉鹽混合活化羧基。上述列表并不詳盡，顯然可以對(duì)所述化合物進(jìn)行改動(dòng)?？梢允褂萌魏屋d體，只要其自身不誘導(dǎo)對(duì)宿主有害的抗體產(chǎn)生，例如各種血清白蛋白，破傷風(fēng)類毒素、或匙孔冒貝血藍(lán)蛋白(KLH)。
當(dāng)結(jié)合物注射到受試者體內(nèi)，將產(chǎn)生抗血清，其含有不僅與結(jié)合物而且與運(yùn)載該序列類似部分的融合蛋白質(zhì)，以及全長(zhǎng)PCVⅡ的適當(dāng)決定簇特異性反應(yīng)的免疫球蛋白。B.4．抗體的產(chǎn)生由本發(fā)明的新病毒編碼的蛋白質(zhì)，或其片段可以用于生產(chǎn)抗體，包括多克隆和單克隆抗體。如果需要多克隆抗體，可以用本發(fā)明的抗原或其片段或突變抗原免疫經(jīng)選擇的哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、兔、山羊、馬等)。收集免疫動(dòng)物的血清，按照已知程序處理。參見(jiàn)，例如，Jurgens等(1985)色譜雜志348:363-370。如果適用含有多克隆抗體的血清，可以通過(guò)免疫親合色譜，應(yīng)用已知程序純化多克隆抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以容易地制備蛋白質(zhì)和其片段的單克隆抗體。利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的一般方法是公知的?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞融合，也可以通過(guò)其它技術(shù)，例如用致瘤DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或者用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化，來(lái)制備無(wú)限增殖的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。參見(jiàn)，例如，M.Schreier等，雜交瘤技術(shù)(1980)；Hammerling等，單克隆抗體和T-細(xì)胞雜交瘤(1981)；Kennett等，單克隆抗體(1980)；還參見(jiàn)美國(guó)專利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890?？顾璧鞍踪|(zhì)或其片段的產(chǎn)生的單克隆抗體的拼接可以篩選各種性質(zhì)；即同種型、表位、親合性等。利用免疫親合技術(shù)，單克隆抗體可以用于純化它們對(duì)抗的個(gè)體抗原。多克隆和單克隆抗體還可以用于主動(dòng)免疫或者可以與亞單位疫苗制劑組合，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。多克隆和單克隆抗體也可以用于診斷目的。B.5．疫苗制劑和給藥本發(fā)明的新病毒蛋白質(zhì)可以配制成疫苗組合物，單獨(dú)或與其它抗原一起用于免疫下述受試者。例如，Remington′s藥物科學(xué)，MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,18版，1990中描述了制備這類制劑的方法。通常，本發(fā)明的疫苗配制成可注射的液體溶液或懸浮液。也可以配制成注射前溶解于或懸浮于液體載體的適當(dāng)固體形式。制劑還可以被乳化或?qū)⒒钚猿煞职庥谥|(zhì)體載體中?；钚悦庖咴煞滞ǔＳ谙嗳菪运幬镙d體，例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合物混合。另外，如果需要，載體可以含有少量輔料例如保濕劑或乳化劑和pH緩沖劑。
制劑中還可以加入增強(qiáng)疫苗有效性的佐劑。這類佐劑包括，沒(méi)有限制，由鋁鹽(明礬)形成的佐劑，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；水包油和油包水型乳劑，例如完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、avridine和二甲基二十八烷基溴化銨(DDA)；由細(xì)菌細(xì)胞壁成分構(gòu)成的佐劑，例如包括單磷脂酰脂類A(MPL)(Imoto等(1985)Tet.Lett.26:1545-1548)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)；來(lái)源于ADP-核糖酸化細(xì)菌毒素，例如來(lái)源于白喉毒素(例如，CRM197，一種非毒性白喉毒素突變體(參見(jiàn)，例如，Bixler等(1989)試驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展(Adv.Exp.Med.Biol.)251:175；和Constantino等(1992)疫苗)、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、E.coli熱不穩(wěn)定毒素(LT1和LT2)、假單胞菌內(nèi)毒素A、肉毒桿菌C2和C3毒素、以及來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌、螺狀梭菌、艱難梭菌的毒素；皂甙佐劑例如Quil A(美國(guó)專利5057540)、或者從皂甙制得的顆粒例如ISCOM(免疫復(fù)合物)；細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-丙三氧基-3-羥磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，等；來(lái)源于CpG家族分子的佐劑，含有CpG基元的CpG二核苷酸和合成的寡核苷酸(參見(jiàn)，例如，Krieg等，自然(1995)374:546和Davis等免疫學(xué)雜志(1998)160:870-876)；以及合成佐劑，例如PCPP(聚[二(羧酸酯苯氧基)膦腈](Payne等，疫苗(1998)16:92-98)。
這類佐劑由很多銷售商商業(yè)提供，例如Accurate Chemicals；RibiImmunechemicals,Hamilton,MT；GIBCO；Sigma,St.Louis,MO。
如上所述，蛋白質(zhì)可以連接于載體，以便增加其免疫原性。適當(dāng)?shù)妮d體包括大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白、匙孔帽貝血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)；多糖，例如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素小珠等；多聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚賴氨酸等；氨基酸共聚物；以及滅活的病毒顆粒。
可以使用天然形式的蛋白質(zhì)，或者可以通過(guò)例如賴氨酸殘基的琥珀?；蚺c半胱氨酸-硫內(nèi)酯反應(yīng)修飾它們的功能基團(tuán)成分。還可以通過(guò)例如，將功能氨基與2-亞氨基硫羥烷或3-(4-二硫吡啶基)丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，將巰基引入載體(或抗原)。還可以修飾適當(dāng)?shù)妮d體，以引入空間手臂(例如己撐二胺或其它大小相似的雙功能分子)用于連接肽。
其它適用于本發(fā)明蛋白質(zhì)的載體包括輪狀病毒的VP6多肽，或其功能片段，如美國(guó)專利5071651所公開(kāi)的。利用美國(guó)專利4722840中公開(kāi)的方法制備的病毒蛋白質(zhì)和受試者免疫原的融合產(chǎn)物也是有用的。其它適用的載體包括細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞，因?yàn)橐赃@種形式出現(xiàn)模擬在受試者體內(nèi)出現(xiàn)的天然模式，故其促進(jìn)被免疫的狀態(tài)?；蛘?，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與紅細(xì)胞偶聯(lián)，優(yōu)選受試者自身的紅細(xì)胞。偶聯(lián)肽與蛋白質(zhì)或細(xì)胞的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
另外，蛋白質(zhì)可以配制成中性或鹽形式的疫苗組合物。藥物可接受鹽包括酸附加鹽(通過(guò)活性肽的游離氨基形成)，其用無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸或磷酸，或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有機(jī)酸形成。還可以用來(lái)源于無(wú)機(jī)堿例如，鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧酸根鹽和例如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等有機(jī)堿與游離羧基形成鹽。
疫苗制劑將含有“治療有效量”的活性成分，也就是說(shuō)，能夠誘導(dǎo)受試者對(duì)給藥組合物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量。該應(yīng)答將通過(guò)感染宿主通常表現(xiàn)癥狀的減輕或消失和/或較短的恢復(fù)時(shí)間證明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)很容易確定準(zhǔn)確用量。蛋白質(zhì)濃度通常約占組合物的1％到95％(w/w)，如果需要甚至更高或更低。
為了免疫受試者，通常非腸道給藥疫苗，通常經(jīng)肌肉內(nèi)注射。然而其它給藥方法，例如皮下、腹膜內(nèi)和靜脈注射也可以接受。給藥量依賴處理動(dòng)物、動(dòng)物免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、和所需的保護(hù)程度而定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地通過(guò)建立量效曲線的常規(guī)試驗(yàn)確定有效劑量。給藥疫苗免疫受試者至少一個(gè)劑量，優(yōu)選兩個(gè)劑量。而且，可以給動(dòng)物給藥需要維持對(duì)感染免疫狀態(tài)的若干劑量。
適用于其它給藥方式的其它疫苗制劑包括栓劑、有時(shí)可以是氣溶膠、鼻內(nèi)給藥制劑、口腔給藥制劑，以及緩釋制劑。對(duì)于栓劑，載體組合物將包括常規(guī)粘合劑和載體，例如，polyalkaline glycol、或甘油三酸酯。該栓劑可以用含活性成分約0.5％-10％(w/w)，優(yōu)選約1％-2％的混合物制備?？诜苿┹d體包括例如通常應(yīng)用的賦形劑，例如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些口服疫苗組合物可以配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑、或粉末劑形式，含活性成分約10％到約95％，優(yōu)選約25％到約70％。
鼻內(nèi)制劑通常包括即不對(duì)鼻粘膜產(chǎn)生刺激也不明顯干擾臨床功能的載體。稀釋劑例如水、生理鹽水或其它已知物質(zhì)可以用于本發(fā)明的主題。鼻內(nèi)制劑還可以含有防腐劑，例如但不限于，氯丁醇和潔爾滅?？梢约尤氡砻婊钚詣┮栽鰪?qiáng)試驗(yàn)蛋白質(zhì)被鼻粘膜吸收的能力。
可以向蛋白質(zhì)中加入載體或介質(zhì)例如脂質(zhì)體、不可重吸收的不滲透聚合物例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物、溶脹性聚合物例如水凝膠、或者可重吸收的聚合物例如膠原和某些聚酸或聚酯例如用于制備重吸收結(jié)構(gòu)的材料，制備控釋或緩釋制劑。本發(fā)明蛋白質(zhì)還可以利用本領(lǐng)域已知的移植微型泵給藥。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以通過(guò)表達(dá)所述蛋白質(zhì)的載體病毒給藥。發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明的載體病毒包括但不限于牛痘和其它痘病毒、腺病毒、和皰疹病毒。舉例說(shuō)明，可以如下構(gòu)建表達(dá)新蛋白質(zhì)的牛痘病毒重組體。首先將編碼特定蛋白質(zhì)的DNA插入適當(dāng)載體，以使所述DNA連接于牛痘啟動(dòng)子并且旁側(cè)牛痘DNA序列，例如編碼胸苷激酶(TK)的序列。然后所述載體用于轉(zhuǎn)染同時(shí)感染牛痘的細(xì)胞。同源重組使牛痘啟動(dòng)子加編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因插入病毒基因組。產(chǎn)生的TK重組體可以在存在5-溴脫氧尿苷的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，然后篩選抗性病毒蝕斑，來(lái)篩選產(chǎn)生的TK重組體。
一種給藥的替代途徑涉及基因治療或核酸免疫。因此，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列(連同調(diào)控元件)可以在其體內(nèi)翻譯之前直接對(duì)受試者給藥?；蛘?，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染受試者的離體細(xì)胞或組織，然后將轉(zhuǎn)化材料重新導(dǎo)入宿主實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移?？梢詫NA直接導(dǎo)入宿主機(jī)體，即通過(guò)注射(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5580859和5589466；國(guó)際
發(fā)明者王利, 洛爾納·A·巴比烏克, 安德魯·A·波特, 菲利普·維爾松 申請(qǐng)人:薩斯喀徹溫大學(xué)