專利名稱：惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用基因工程技術(shù)，涉及一種疫苗，特別涉及一種惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
我國惡性腫瘤在城市地區(qū)發(fā)病率居死因第一位，在農(nóng)村居第二位，嚴(yán)重威脅人民健康和生命。采用腫瘤疫苗對(duì)腫瘤患者進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，激發(fā)和增強(qiáng)患者對(duì)腫瘤的免疫排斥反應(yīng)，為腫瘤的治療提供了一條新路。近年，世界各國都在積極開展腫瘤疫苗研制，有多種腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但由于種種原因，如腫瘤疫苗中的核心部分-抗原不理想、腫瘤疫苗中的輔助部分的免疫佐劑不理想，和MHC限制性，以及長期以來，腫瘤疫苗制備工藝缺乏現(xiàn)代工程技術(shù)(例如納米技術(shù))的滲透和開拓，致使一些困難問題，例如，疫苗的靶向性問題，抗原的有效遞呈問題，疫苗的緩釋問題等尚未得到解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，應(yīng)用基因工程技術(shù)，提供一種惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，該方法首先制備MAGE-1～Hsp70融合蛋白與SEA復(fù)合抗原物，以納米技術(shù)構(gòu)建腫瘤納米疫苗，充分發(fā)揮機(jī)體免疫功能，有效殺傷腫瘤細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤患者手術(shù)切除腫瘤后控制復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低死亡率的目的。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)解決方案是選用腫瘤特異性共有抗原基因黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)和生物免疫佐劑熱休克蛋白70(Hsp70)基因連接，構(gòu)成融合基因(MAGE-1～Hsp70)，通過大腸桿菌表達(dá)，分離與純化，獲得MAGE-1～Hsp70融合蛋白，經(jīng)變性與復(fù)性，得到高活性的融合蛋白，將此融合蛋白與超抗原葡萄球菌腸毒素A組合，構(gòu)成復(fù)合抗原物。制備納米脂質(zhì)體，包裹復(fù)合抗原物，通過N-羥基琥珀酰亞胺酯與Hsp70分子連接，形成N-Hsp70，將其插入納米脂質(zhì)體磷脂膜外層，構(gòu)成惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗。
采用本發(fā)明所制備的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)1)采用皮下注射，使用簡便、安全；2)抗瘤廣譜；3)具有靶向性；4)殺瘤效果強(qiáng)。


圖1是本發(fā)明的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的模式圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人依上述技術(shù)方案所作出的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
本發(fā)明的具體實(shí)施步驟1.腫瘤特異性共有抗原基因的克隆1.1.MAGE-1基因的克隆與測(cè)序1.1.1.人MAGE-1基因的序列(Homo sapiens)1 atgtctcttg agcagaggag tctgcactgc aagcctgagg aagcccttga ggcccaacaa61 gaggccctgg gcctggtgtg tgtgcaggct gccgcctcct cctcctctcc tctggtcctg121 ggcaccctgg aggaggtgcc cactgctggg tcaacagatc ctccccagag tcctcaggga181 gcctccgcct ttcccactac catcaacttc actcgacaga ggcaacccag tgagggttcc241 agcagccgtg aagaggaggg gccaagcacc tcttgtatcc tggagtcctt gttccgagca301 gtaatcacta agaaggtggc tgatttggtt ggttttctgc tcctcaaata tcgagccagg361 gagccagtca caaaggcaga aatgctggag agtgtcatca aaaattacaa gcactgtttt421 cctgagatct tcggcaaagc ctctgagtcc ttgcagctgg tctttggcat tgacgtgaag481 gaagcagacc ccaccggcca ctcctatgtc cttgtcacct gcctaggtct ctcctatgat
541 ggcctgctgg gtgataatca gatcatgccc aagacaggct tcctgataat tgtcctggtc601 atgattgcaa tggagggcgg ccatgctcct gaggaggaaa tctgggagga gctgagtgtg661 atggaggtgt atgatgggag ggagcacagt gcctatgggg agcccaggaa gctgctcacc721 caagatttgg tgcaggaaaa gtacctggag taccggcagg tgccggacag tgatcccgca781 cgctatgagt tcctgtgggg tccaagggcc cttgctgaaa ccagctatgt gaaagtcctt841 gagtatgtga tcaaggtcag tgcaagagtt cgctttttct tcccatccct gcgtgaagca901 gctttgagag aggaggaaga gggagtctga1.1.2.克隆MAGE-1基因的引物MAGE-1-P1CGGAATTCATGTCTCTTGAGCAGAGGAGTC (EcoR I)MAGE-1-P2CGAAGCTTTCAGACTCCCTCTTCCTCCTCT (Hind III)1.1.3.克隆MAGE-1基因的方法采用TRIZOL法提取肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，ATCCNumber HB-8065)的總RNA，采用RT-PCR技術(shù)使用MAGE-1-P1和MAGE-1-P2擴(kuò)增MAGE-1全長序列，克隆到克隆載體pUC19(通用克隆載體，GenBank/EMBLNumber L09137)的EcoR I和Hind III之間，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(通用質(zhì)粒保存菌株，非本專利專用菌株)。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒及酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海博亞公司完成。所得的MAGE-1基因與GenBank(gi29029615)公布的一致。
2.生物免疫佐劑Hsp70基因的克隆、原核表達(dá)2.1.Hsp70基因序列(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)1 atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa61 ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc121 gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc181 aacgtcgatc gcaccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag241 attgacggca agaaatacac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat gaagctgaag301 cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc361 tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac421 gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgacaagggc481 gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg541 ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc601 ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc661 ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag
721 gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc781 gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg841 atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc901 ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc961 gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac1021 cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg1081 aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac caagggcggg1141 gtgatgacca ggctcatcga gcgcaacacc acgatcccca ccaagcggtc ggagactttc1201 accaccgccg acgacaacca accgtcggtg cagatccagg tctatcaggg ggagcgtgag1261 atcgccgcgc acaacaagtt gctcgggtcc ttcgagctga ccggcatccc gccggcgccg1321 cgggggattc cgcagatcga ggtcactttc gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc1381 accgccaagg acaagggcac cggcaaggag aacacgatcc gaatccagga aggctcgggc1441 ctgtccaagg aagacattga ccgcatgatc aaggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat1501 cgcaagcgtc gcgaggaggc cgatgttcgt aatcaagccg agacattggt ctaccagacg1561 gagaagttcg tcaaagaaca gcgtgaggcc gagggtggtt cgaaggtacc tgaagacacg1621 ctgaacaagg ttgatgccgc ggtggcggaa gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt1681 tcggccatca agtcggcgat ggagaagctg ggccaggagt cgcaggctct ggggcaagcg1741 atctacgaag cagctcaggc tgcgtcacag gccactggcg ctgcccaccc cggcggcgag1801 ccgggcggtg cccaccccgg ctcggctgat gacgttgtgg acgcggaggt ggtcgacgac1861 ggccgggagg ccaagtga2.2.克隆Hsp70的引物TBhsp70-1GGCGGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATC (BamH I)TBhsp70-2GCGGAATTCTCACTTGGCCTCCCGGCCGTC (EcoR I)2.3.克隆Hsp70基因的方法取結(jié)核桿菌H37Rv(ATCC Number 25618，非本專利專用菌株)，加入裂解液，煮沸5min，進(jìn)行PCR。循環(huán)條件94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循環(huán)30次。取15μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，回收，以BamHI和EcoR I雙酶切，克隆到pGEX-4T-1載體(Amersham產(chǎn)品，7-5130-01)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Hsp70，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒及酶切鑒定，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海博亞公司完成。所獲得的基因序列與GenBank(GI15607142)公布的一致。
2.4.Hsp70原核表達(dá)載體的構(gòu)建采用BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pGEX-Hsp70，瓊脂糖電泳，回收1878bp片段，插入pET28a(+)(Novegen產(chǎn)品，69864-3)的相應(yīng)位置，構(gòu)建pET28-Hsp70原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒及酶切鑒定。
3.Hsp70蛋白的分離純化將pET28-Hsp70質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)(含噬菌體T7啟動(dòng)子原核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌株，非本專利專用菌株)，取單克隆，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用Ni2+-NTA Agarose(Invitrogen產(chǎn)品，R901-15)提取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，再通過ATP-Sephrose 4B(Fluka產(chǎn)品，WA13234)對(duì)Hsp70蛋白進(jìn)行純化，得到有活性的Hsp70蛋白。
4.融合基因的構(gòu)建、原核表達(dá)4.1.引物設(shè)計(jì)MAGE-1-P3GCGCATATGTTCCTGATAATTGTCCTGGTC(Nhe I)MAGE-1-P4GCAGGATCCGACTCCCTCTTCCTCCTC(BamH I)4.2.融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用MAGE-1-P3和MAGE-1-P4引物以pUC19-MAGE-1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增MAGE-1基因，克隆到pET28-Hsp70的Nhe I和BamH I之間，構(gòu)建MAGE-1～Hsp70的融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-M1-Hsp70，常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒及酶切鑒定。
5.融合蛋白的原核表達(dá)、變性復(fù)性與分離純化將質(zhì)粒pET28-M1-Hsp70轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽性克隆，采用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定融合蛋白的表達(dá)。常規(guī)提取包涵體，采用6M尿素變性蛋白，采用Sephadex G-25(Amersham產(chǎn)品，17-0033-01)色譜復(fù)性，采用Ni2+-NTA Agarose進(jìn)行初步分離，采用ATP-Sepherose 4B進(jìn)行分離純化。
6.Hsp70與融合蛋白的蛋白水平檢測(cè)6.1.Hsp70與融合蛋白的鑒定分別采用Hsp70抗體，MAGE-1和MAGE-3的抗血清進(jìn)行Western blot，對(duì)Hsp70與融合蛋白進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。
6.2.Hsp70與融合蛋白的純度分析采用SDS-PAGE與凝膠薄層掃描鑒定Hsp70與融合蛋白的純度。
7.融合蛋白功能分析采用負(fù)載融合蛋白的腫瘤患者的樹突狀細(xì)胞(DC)，在體外刺激其外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，分別通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTL的表面標(biāo)志物(CD3/CD4/CD8)，通過細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
本發(fā)明中，經(jīng)負(fù)載融合蛋白的DC刺激產(chǎn)生的CTL，其CD3+T細(xì)胞的比例為82％，其中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為72％，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量為14％。51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)顯示負(fù)載融合抗原的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)肝細(xì)胞癌HHCC的殺傷作用為62±23％，明顯高于陰性對(duì)照組(18±11％)。
8.葡萄球菌腸毒素A(SEA)的制備8.1.SEA基因序列1 atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca61 cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct121 gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct181 aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc241 ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt301 gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt361 gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat421 aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat481 acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat
541 cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat601 gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac661 gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat721 aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa8.2.構(gòu)建SEA原核表達(dá)質(zhì)粒的引物S1GCGGGATCCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATG(BamH I)S2CGGAATTCTTAACTTGTATATAAATATATATATCAATATG(EcoR I)8.3.SEA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達(dá)與分離純化從產(chǎn)SEA的標(biāo)準(zhǔn)菌株FRI 100(產(chǎn)SEA的葡萄球菌，Tomas DJ，et al.J.Food Sci.52793-794，1987)中，提取基因組DNA，采用引物S1和S2，通過PCR擴(kuò)增SEA的基因，采用BamH I和EcoR I雙酶切目的片段，插入pGEX-4T-1(GST融合表達(dá)質(zhì)粒，Amersham產(chǎn)品，27-4581-01)的相應(yīng)位置，構(gòu)建SEA的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-SEA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒及酶切鑒定。測(cè)序由上海博亞公司完成。所獲得的基因序列與GenBank(gi21204850)公布的一致。
采用IPTG誘導(dǎo)含pGEX-SEA的大腸桿菌DH5α，表達(dá)產(chǎn)物采用GSTrap FF柱(Amersham產(chǎn)品，17-5130-01)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物通過凝血酶(Amersham產(chǎn)品，27-0846-01)切除GST部分，獲得SEA。
9.復(fù)合抗原物的制備將融合蛋白與SEA以摩爾數(shù)1000∶1的比例，在4℃條件下，緩慢進(jìn)行混合，即構(gòu)成復(fù)合抗原物。
10.納米脂質(zhì)體對(duì)復(fù)合抗原物的包裹及檢測(cè)10.1.納米脂質(zhì)體對(duì)復(fù)合抗原物的包裹取卵磷脂與膽固醇(Sigma產(chǎn)品)共計(jì)1.6g(摩爾比為5∶1)，溶于20mL氯仿-甲醇(1∶1)中，將復(fù)合抗原物溶液加入上述混合液，使復(fù)合抗原物的終濃度為1mg/mL，25℃恒溫水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，使磷脂等材料呈均勻類脂薄膜。加入10ml 0.9％NaCl水合介質(zhì)，旋轉(zhuǎn)洗膜2h，得到脂質(zhì)體混懸液。冰水浴條件下，采用探針式超聲2min，得納米脂質(zhì)體膠體溶液。室溫條件，0.15μm微孔濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10.2.納米脂質(zhì)體大小的檢測(cè)脂質(zhì)體滴到敷有Formav膜的400目銅網(wǎng)上，滴加2％磷鎢酸復(fù)染色，空氣中干燥后，透射電子顯微鏡觀察納米脂質(zhì)體的大小。
納米脂質(zhì)體的大小為35nm±5nm。
10.3.納米脂質(zhì)體包封率的檢測(cè)凝膠柱Sephedex G-75(Amersham產(chǎn)品)分離納米脂質(zhì)體，洗脫液為pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，分離游離的復(fù)合抗原物，通過HPLC(KLB)測(cè)定總復(fù)合抗原量和游離的復(fù)合抗原量，計(jì)算游離藥物量。
包封率＝(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100％。其中，Wtotal為脂質(zhì)體懸液中復(fù)合抗原的總量，Wfree為游離復(fù)合抗原量。
納米脂質(zhì)體的包封率≥80％。
10.4.納米脂質(zhì)體載藥量的測(cè)定測(cè)單位體積脂質(zhì)體懸液內(nèi)包裹抗原的含量，按如下公式計(jì)算載藥量載藥量＝(Wtotal-Wfree)mg/體積ml納米脂質(zhì)體的載藥量為1mg/ml～1.2mg/ml。
11.腫瘤納米疫苗的表面修飾將N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sigma產(chǎn)品)與Hsp70蛋白在水溶液混合24h，進(jìn)行交聯(lián)，常規(guī)PBS透析24h，制備脂肪鏈修飾的Hsp70，即N-Hsp70，將其加入納米脂質(zhì)體，制備腫瘤納米疫苗。
12.腫瘤納米疫苗的體外免疫學(xué)特性分析參見圖1的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的模式圖。
12.1.靶向性檢測(cè)通過速度沉降法分離制備出外周血單個(gè)核細(xì)胞，接著用標(biāo)記羊抗鼠IgG的免疫磁珠分選CD14+樹突狀細(xì)胞(DC)前體細(xì)胞，然后用細(xì)胞因子GM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(5μg/ml)協(xié)同培養(yǎng)5～7d，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志分子HLA-DR為92.5％；CD14為27％；CD80為78％；CD40為72％；CD83為82％。
分別將表面修飾的納米疫苗和未修飾的納米疫苗采用熒光素FITC進(jìn)行標(biāo)記，將二者與DC混合培養(yǎng)30min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的熒光強(qiáng)度。結(jié)果為采用Hsp70進(jìn)行表面修飾的納米疫苗組的陽性熒光比例為60％～80％，高于未修飾的納米疫苗組的熒光強(qiáng)度(28％)。
12.2.殺傷性檢測(cè)將DC細(xì)胞與納米疫苗混合，培養(yǎng)4h，采用該DC刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)7d，獲得CTL，通過流式細(xì)胞檢測(cè)CTL的表面標(biāo)志物(CD3/CD4/CD8)。采用CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌SMMC-7721等)進(jìn)行殺傷，應(yīng)用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)，觀察殺傷狀況。
在本發(fā)明中，與納米疫苗混合培養(yǎng)的的DC，誘導(dǎo)PBMC，經(jīng)體外培養(yǎng)7d后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL表型，CD3+T細(xì)胞的比例為79％，其中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量為69％，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量為12％。51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721的殺傷作用為55±23％，明顯高于陰性對(duì)照組(12±11％)。
13.腫瘤納米疫苗的體內(nèi)免疫學(xué)特性分析
13.1.人源化SCID鼠的建立選取非“滲漏”SCID鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌性，體重18±2克)，分離HLA-A2+PBMC，以5×107/只，轉(zhuǎn)輸SCID鼠，建立SCID鼠人源化模型(SCID-hu)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其PBMC的表型(人CD3/CD4/CD8)。(注我國HLA-A2陽性人群的比例為50％以上)13.2.治療性實(shí)驗(yàn)取SCID-hu鼠，分別于其一側(cè)皮下移植肝癌細(xì)胞系SMMC-7721(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，董春榮等，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)15，1980)、胃癌細(xì)胞系SGC-7901(人胃癌細(xì)胞系，林超鴻等，上海腫瘤雜志1(1)1-3，1981)和乳腺癌細(xì)胞系MCF(人乳腺癌細(xì)胞系，ATCC Number HTB-22)，各1×107/只，接種后每周，觀察腫瘤大小并記錄。在腫瘤生長至直徑約5mm(約3周)，分別采用多點(diǎn)皮下注射納米疫苗50μl/只/次(含有復(fù)合抗原物約50μg)，10天后強(qiáng)化免疫1次，多點(diǎn)皮下注射納米疫苗50μl/只/次，治療后4周后觀察腫瘤的生長情況，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤抑制率。
分離PBMC，采用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率；通過IFN-γELISPOT檢測(cè)PBMC中針對(duì)MAGE-1的CTL數(shù)量。
本發(fā)明的納米疫苗對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721、胃癌細(xì)胞系SGC-7901、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的腫瘤抑制率分別為43％、69％和62％。51Cr釋放實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組PBMC對(duì)相應(yīng)腫瘤的殺傷率，結(jié)果為51±13％、72±18％和66±25％，明顯高于對(duì)照組的殺傷率(14±11％、21±14％和22±19％)。IFN-γELISPOT檢測(cè)PBMC中針對(duì)MAGE-1的CTL數(shù)量分別為230±56/106個(gè)細(xì)胞、360±89/106個(gè)細(xì)胞、338±129/106個(gè)細(xì)胞。
13.3.預(yù)防性實(shí)驗(yàn)分別對(duì)SCID-hu鼠的皮下多點(diǎn)注射納米疫苗50μl/只/次(含有復(fù)合抗原物約50μg)，10天后強(qiáng)化免疫1次，皮下多點(diǎn)注射納米疫苗50μl/只/次，免疫兩周后在同一區(qū)域及對(duì)側(cè)皮下分別移植肝癌細(xì)胞SMMC-7721，胃癌細(xì)胞SGC-7901和乳腺癌細(xì)胞MCF-7，各1×107/只，3周后觀察腫瘤形成率。觀察SCID-hu鼠生存時(shí)間，根據(jù)以下公式計(jì)算生命延長率。
肝細(xì)胞癌SMMC-7721、胃癌細(xì)胞系SGC-7901、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7在納米疫苗免疫的SCID-hu鼠上的成瘤率分別為5/10、3/10和4/10，而對(duì)照組的成瘤率分別為10/10、9/10和10/10。納米疫苗免疫的SCID-hu鼠的生存時(shí)間為81±29d、104±42d和88±27d，明顯高于相應(yīng)對(duì)照組的生存時(shí)間(55±13d、58±21d和52±25d)，生命延長率為47％、79％和69％。
權(quán)利要求
1.一種惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)將腫瘤特異性抗原MAGE-1基因與生物免疫佐劑結(jié)核桿菌熱休克蛋白70(Hsp70)基因連接，構(gòu)成MAGE-1～Hsp70融合基因，通過大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，獲得MAGE-1～Hsp70融合蛋白；2)上述MAGE-1～Hsp70融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)6M尿素變性，SephadexG-25凝膠色譜柱復(fù)性后，再通過Ni2+-NTA Agarose親和色譜和ATP-Sepherose4B親和色譜進(jìn)行分離與純化，得到有活性的MAGE-1～Hsp70融合蛋白；3)將有活性的MAGE-1～Hsp70融合蛋白與超抗原葡萄球菌腸毒素A(SEA)以摩爾數(shù)比為1000∶1組合，構(gòu)成復(fù)合抗原物；4)采用卵磷脂和膽固醇，通過超聲技術(shù)制備納米脂質(zhì)體，包裹復(fù)合抗原物；5)最后，通過N-羥基琥珀亞胺酯與Hsp70分子連接，形成N-Hsp70，將N-Hsp70與納米脂質(zhì)體混合，N-Hsp70插入納米脂質(zhì)體磷脂膜外層，構(gòu)成惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，所述腫瘤特異性抗原MAGE-1基因產(chǎn)物可以更換為MAGE基因家族編碼的蛋白，或癌胚抗原，或人乳頭狀瘤病毒16的E6和E7蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，所述腫瘤特異性抗原MAGE-1基因產(chǎn)物可以增加以下成分MAGE基因家族編碼的蛋白，或癌胚抗原，或人乳頭狀瘤病毒16的E6和E7蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物免疫佐劑可以更換為結(jié)核桿菌Hsp65或人熱休克蛋白70。
5.如權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，所述納米脂質(zhì)體可以更換為納米乳劑。
6.如權(quán)利要求1所述的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，其特征在于，所述SEA可以更換為葡萄球菌腸毒素B(SEB)或葡萄球菌腸毒素C(SEC)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制備方法，采用腫瘤特異性共有抗原基因黑色素瘤抗原－1(MAGE－1)和生物免疫佐劑熱休克蛋白70(Hsp70)基因連接，構(gòu)成融合基因(MAGE－1～Hsp70)，通過大腸桿菌表達(dá)，分離與純化，獲得MAGE－1～Hsp70融合蛋白，經(jīng)變性與復(fù)性，得到高活性的融合蛋白，將此融合蛋白與超抗原葡萄球菌腸毒素A組合，構(gòu)成復(fù)合抗原物。制備納米脂質(zhì)體，包裹復(fù)合抗原物，通過N－羥基琥珀酰亞胺酯與Hsp70分子連接，形成N－Hsp70，將其插入納米脂質(zhì)體磷脂膜外層，構(gòu)成惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗。采用本發(fā)明制備的惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)1)采用皮下注射，使用簡便、安全；2)抗瘤廣譜；3)具有靶向性；4)殺瘤效果強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1528452SQ0313462
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者隋延仿, 葉菁, 吳道澄, 李增山, 孫玉靜, 陳廣生, 曲萍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)