專利名稱：可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程中用組織工程法構建人工器官技術領域，涉及一種可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚及其構建方法。
背景技術：
組織工程是目前生命科學領域的研究熱點，相關的研究涉及到各個方面。近年來，隨著組織工程技術的發(fā)展，研制人工皮膚替代物的研究報道逐漸增多，尤其是通過組織工程技術研制不同類型的人工皮膚，其核心是應用工程學的原理和方法與生命科學相結合，發(fā)展具有恢復、保持或改善功能的生物替代品。
皮膚是覆蓋與保護體表的重要組織器官。由于炎癥、潰瘍、外傷、燒傷、腫瘤術后以及先天性畸形等原因常造成皮膚的缺損與異常。對于這種組織缺損目前多采用自體皮瓣或自體皮膚的移植，這種方法不僅存在著造成供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷，而且常常存在著供皮來源受限的影響。此外，移植物經常與鄰近部位的皮膚存在著色澤、質地和功能上的差異。
理想的皮膚替代品應該是能夠將所缺失的真皮和表皮層同時修復，這就是所謂全層復合皮膚。復合皮膚包括兩種細胞成分，即位于表層的表皮細胞和位于真皮層的成纖維細胞。目前，盡管組織工程學方法在皮膚、粘膜、肌肉、骨(和軟骨)、血管、神經和角膜的研制方面已經取得了巨大進展，部分產品已經應用于臨床，并獲得了可喜的治療效果與市場效益，但是已經或正在研制中的組織工程產品仍不完善，目前所見報道的組織工程皮膚替代物大多與正常組織有較大差異，如前所述沒有正常皮膚的毛囊、血管、汗腺以及黑色素細胞、郎格罕細胞等成分。在方法成熟上、研制周期上以及在產品成本上等多方面存在有缺陷。研制中的組織工程產品距臨床應用還有一定的距離。

發(fā)明內容
根據現(xiàn)有技術狀況，本發(fā)明的目的在于，提供一種可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚及其構建方法。
本發(fā)明可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚，其特征在于是由體外培養(yǎng)的角朊細胞、皮膚成纖維細胞和黑色素細胞經組織工程方法構建而成；所述的角朊細胞、皮膚成纖維細胞和黑色素細胞是從人的包皮組織分離后經擴大培養(yǎng)所建立的相應細胞庫中獲??；所述的皮膚成纖維細胞是指與表皮分離后的真皮成纖維細胞；真皮成纖維細胞是以0.5×105～1×107/ml的密度與濃度為1～15％的小牛皮I型膠原混合培養(yǎng)后，再以1×105～5×106/ml密度接種角朊細胞；角朊細胞中所含黑色素細胞的比例為2％-30％。
根據所述的可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚，本發(fā)明提供的構建方法，包括有滅菌、消化、分離和培養(yǎng)，其特征在于包括以下步驟(1)構建組織工程皮膚的細胞來源、分離和培養(yǎng)a)將人的包皮組織用70-80％乙醇浸泡；b)用皮膚分離液對包皮組織進行消化，手工分離表皮和真皮；c)分別在分離的表皮和真皮中加入表皮消化液和真皮消化液，消化后離心，去除消化液，分別得到角朊細胞和真皮細胞；d)將消化后的角朊細胞分成兩份，分別加入角朊細胞培養(yǎng)液和黑色素細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，再進行擴大培養(yǎng)；e)將消化后的真皮細胞在培養(yǎng)液中重懸，得真皮成纖維細胞，接種到培養(yǎng)瓶中，進行擴大培養(yǎng)。
(2)構建可調節(jié)色素分泌的人工皮膚a)取真皮成纖維細胞以0.5×105～1×107/ml的密度與濃度為1～15％的小牛皮I型膠原混合，孵育凝固后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)3～7天；孵育溫度37℃，時間20-120分鐘；b)在凝固后的真皮成纖維細胞表面以1×105～5×106/ml密度接種角朊細胞，角朊細胞中混合有2％～30％的黑色素細胞，黑色素細胞的具體比例是根據所構建皮膚的膚色要求確定；c)繼續(xù)培養(yǎng)(3～7天)至細胞匯集成片，將復合了真皮成纖維細胞、角朊細胞和黑色素細胞的小牛皮I型膠原移至氣液面進行器官培養(yǎng)，培養(yǎng)3～21天即獲得組織工程皮膚，保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明所述的可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚的構建方法中的消化過程，需多次用加入有抗生素的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)進行清洗；消化過程中所用的皮膚分離液是指消化表皮和真皮之間的基底膜并將表皮和真皮分離的消化液，主要成分是中性蛋白酶，以2.4單位/毫升濃度配制；所述的表皮細胞消化液是指消化細胞間基質，將角朊細胞從表皮中分離的消化液，主要成分是胰酶，以0.25％濃度配制；所述的真皮細胞消化液是指消化真皮的纖維締結組織，將真皮成纖維細胞從真皮組織中分離出來的消化液，主要成分是I型膠原酶，以625單位/毫升濃度配制。所述的黑色素細胞培養(yǎng)液的配方為90％～98％商用培養(yǎng)基MCDB153，2％～10％胎牛血清，并含有商用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)0.2～1.5ng/ml和商用血管內皮素(Endothelin-1)1.5～5ng/ml。
本發(fā)明所建立的黑色素細胞培養(yǎng)方法可以使黑色素細胞保持高增殖活力和良好的生長狀態(tài)，并且可以達到100％的純度。因此，本發(fā)明將黑色素細胞與角朊細胞按適當?shù)谋壤旌?，進一步構建能夠調節(jié)皮膚色素生成的組織工程皮膚以滿足不同臨床病例的要求。實驗結果表明，所構建的組織工程皮膚結構完整，表皮細胞和成纖維細胞活力良好。動物實驗用所構建的含色素的人組織工程皮膚修復裸鼠的全層皮膚缺損，結果顯示其可以有效地修復動物的全層皮膚缺損，并且成功地形成了含色素的皮膚。附圖中的對比照片對本發(fā)明的效果做了很好的說明。


圖1本發(fā)明皮膚在培養(yǎng)過程中所見到的明顯色素照片。
圖2對照組在相同條件下無色素出現(xiàn)的照片。
圖3Dopa染色顯示黑色素細胞位于皮膚基底部照片。
圖4S-100染色顯示黑色素細胞位于皮膚基底部照片。
圖5透射電鏡觀察顯示細胞漿中豐富的黑色素照片。
圖6用本發(fā)明皮膚修復的全層皮膚缺損裸鼠照片。
圖7；用不含黑色素細胞皮膚修復的全層皮膚缺損裸鼠照片。
圖8圖6裸鼠黑色素細胞狀態(tài)照片。其中圖1是在本發(fā)明皮膚器官培養(yǎng)3天后就可以見到明顯的色素出現(xiàn)；圖2說明不含黑色素細胞的組織工程皮膚在同樣條件下培養(yǎng)3天后仍為白色，未見到色素形成；圖5說明黑色素細胞位于皮膚基底部，細胞漿中有豐富的黑色素顆粒。細胞突起深入到角朊細胞之間；圖6說明用本發(fā)明皮膚修復的全層皮膚缺損裸鼠在6周后即可見到皮膚愈合良好，表面光滑，色澤為黑色；圖7說明用不含黑色素細胞皮膚修復的全層皮膚缺損裸鼠在6周后即可見到皮膚愈合良好，表面光滑，與周圍組織未見明顯色澤差異；圖8是針對S-100免疫組化染色顯示，用含黑色素細胞皮膚修復的全層皮膚缺損裸鼠的皮膚基底部含有大量黑色素細胞，表明含有黑色素細胞皮膚成功修復了裸鼠的全層皮膚缺損，黑色素細胞狀態(tài)良好。
具體實施例方式
以下結合實驗對本發(fā)明方法做進一步的詳細說明1、各細胞的分離、培養(yǎng)(I)取新生兒或青少年包皮環(huán)切術后包皮組織，為保證無菌，處理前在75％乙醇中浸泡1分鐘；(II)將包皮組織轉入培養(yǎng)皿中，用加有抗生素的PBS緩沖溶液清洗，用剪鑷修剪，去除皮下組織，用刀片將組織分切為2mm×10mm；(III)取4塊組織放入離心管中，加入4ml皮膚分離液，37℃消化2.5小時；如果用冷消化(推薦使用)，則用PBS將上述分離液稀釋一倍，加入4ml，4℃消化14-16小時；(IV)將消化后的皮膚置入培養(yǎng)皿中，用鑷將表皮和真皮仔細分離(須極為小心，避免把真皮組織帶入表皮組織中)，此外，消化后的皮膚最好不要清洗，因為殘留在組織內的消化液含有中性蛋白酶，有利于下一步的消化；(V)將分離的表皮放入離心管中，加入表皮細胞消化液4ml，37℃消化10分鐘；用含血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復吹打以獲得單細胞懸液，過200目篩網以去除剩余殘渣，收集濾液，離心去除消化液，用PBS清洗兩次，將所得角朊細胞分為兩份，分別加入商用角朊細胞培養(yǎng)液K-SFM和黑色素細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；(VI)將真皮組織剪碎后置入離心管，加入4m1真皮細胞消化液，37℃消化至大部分組織消失(個體不同，時間有所差異，約4-5小時)；離心去除消化液，用PBS清洗兩次，用真皮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；(VII)原代細胞長滿70％-80％時，用0.25％(w/v)胰酶消化傳代，擴大培養(yǎng)。
2、可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚的構建取生長狀態(tài)良好的細胞，將真皮成纖維細胞以1.5×106/ml的密度與取自小牛皮濃度為6％的I型膠原混合，37℃孵育凝固后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)4天；在其表面以1×106/ml密度接種角朊細胞(其中含有3-5％的黑色素細胞)，繼續(xù)培養(yǎng)3天，將復合了細胞的膠原移至氣液面進行器官培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2周即獲得組織工程皮膚，保存?zhèn)溆?。取所構建的組織工程皮膚，用Dopa染色、透射電鏡和免疫組化(S-100抗體)檢測構建的皮膚中黑色素細胞的分布和狀態(tài)，以及色素的分泌情況。結果可見含黑色素細胞的組織工程皮膚在氣液面上培養(yǎng)到第三天時，可以見到明顯的色素出現(xiàn)(圖1)，呈棕黑或黃褐色；對照組不加黑色素細胞的組織工程皮膚為白色(圖2)；Dopa染色(圖3)和S-100免疫組化(圖4)結果顯示，在組織工程皮膚基底層處可見散布的黑色素細胞，細胞與周圍角朊細胞排列緊密，其突起深入到周圍的角朊細胞之間；透射電鏡結果顯示，黑色素細胞分布在表皮基底層，胞漿中有豐富的黑色素顆粒，突起深入到角朊細胞間(圖5)。
上述結果表明，本發(fā)明能成功地構建可以調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚。
3、動物皮膚缺損修復實驗2％戊巴比妥鈉腹腔注射30～50mg/kg麻醉，在Balb/c裸鼠背部切取全層皮作圓形創(chuàng)面，直徑1.5cm，以供皮膚移植。取上述含黑色素的組織工程皮膚，覆蓋創(chuàng)面，用線縫合，加壓包扎。對照組用不含黑色素的組織工程皮膚修復皮膚缺損。6周后取標本，4％多聚甲醛固定，脫水透明，石蠟包埋，切片，烤片后脫蠟至水，行免疫組織化學染色(S-100抗體)。結果顯示取材時，可見裸鼠皮膚缺損愈合良好，表面光滑，色澤為黑色(圖6)，但是皮膚仍有一定的收縮。對照組裸鼠無色素生成(圖7)。免疫組化結果顯示，在表皮基底細胞層可見大量S-100陽性細胞，細胞突起較多，伸入到臨近角朊細胞之間，為典型的黑色素細胞的特征(圖8)。
本發(fā)明組織工程方法通過獲得自體或異體的極少量皮膚組織，將其在體外(實驗室中)經過滅菌、消化、分離、培養(yǎng)，在獲得足夠的細胞數(shù)量時將其重組成全層皮膚組織(包括表皮層及結締組織)，用于患者皮膚創(chuàng)傷的修復，該全層皮膚組織在種植后不易變形，易于愈合。以此為基礎，今后我們就可以制作含不同比例黑色素細胞的組織工程皮膚，從而獲得各種色澤的皮膚以滿足不同的臨床修復要求。如果能縮短體外培養(yǎng)時間，徹底解決組織工程方法研制的異體皮膚的免疫排斥，建立用于皮膚組織工程的種子細胞系統(tǒng)，降低成本，建立異體皮膚庫，將有重要的臨床價值和社會經濟效益。
權利要求
1.一種可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚，其特征在于由體外培養(yǎng)的角朊細胞、皮膚成纖維細胞和黑色素細胞經組織工程構建而成；所述的角朊細胞、皮膚成纖維細胞和黑色素細胞是從包皮組織分離后經擴大培養(yǎng)所建立的相應細胞庫中獲?。凰龅钠つw成纖維細胞是指與表皮分離后的真皮成纖維細胞；真皮成纖維細胞是以0.5×105～1×107/ml的密度與濃度為1～15％的小牛皮I型膠原混合培養(yǎng)后，再以1×105～5×106/ml密度接種角朊細胞；角朊細胞中所含黑色素細胞的比例為2％-30％。
2.根據權利要求1所述的可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚的構建方法，包括有滅菌、消化、分離和培養(yǎng)，其特征在于本發(fā)明方法包括以下步驟(1)構建組織工程皮膚的細胞來源、分離和培養(yǎng)a)將人的包皮組織用70-80％乙醇浸泡；b)用皮膚分離液對包皮組織進行消化，用手工分離表皮和真皮；c)分別在分離的表皮和真皮中加入表皮消化液和真皮消化液，消化后離心，去除消化液，分別得到角朊細胞和真皮細胞；d)將角朊細胞分成兩份，分別加入角朊細胞培養(yǎng)液和黑色素細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；e)將真皮細胞在培養(yǎng)液中重懸，得到真皮成纖維細胞，接種到培養(yǎng)瓶中，進行擴大培養(yǎng)；(2)構建可調節(jié)色素分泌的人工皮膚a)取真皮成纖維細胞以0.5×105～1×107/ml的密度與濃度為1～15％的小牛皮I型膠原混合，孵育凝固后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)；b)在凝固物的表面以1×105～5×106/ml密度接種角朊細胞，角朊細胞中混合有2％～30％的黑色素細胞；c)繼續(xù)培養(yǎng)至細胞匯集成片，將復合了真皮成纖維細胞、角朊細胞和黑色素細胞的小牛皮I型膠原移至氣液面進行器官培養(yǎng)，獲得組織工程皮膚，保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于消化過程中所用的皮膚分離液是指消化表皮和真皮之間的基底膜并將表皮和真皮分離的消化液，主要成分是中性蛋白酶，以2.4單位/毫升濃度配制；所述的表皮細胞消化液主要成分是胰酶，以0.25％濃度配制；所述的真皮細胞消化液主要成分是I型膠原酶，以625單位/毫升濃度配制。
4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于將真皮成纖維細胞與小牛皮I型膠原混合后，孵育溫度為37℃，時間為20-120分鐘，凝固后，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)的時間為3-7天；將復合了真皮成纖維細胞、角朊細胞和黑色素細胞的小牛皮I型膠原移至氣液面進行器官培養(yǎng)的時間為3-21天。
5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述黑色素細胞培養(yǎng)液的配方為90％～98％的商用培養(yǎng)基MCDB153，2％～10％的胎牛血清；并含有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)0.2％～1.5ng/ml，血管內皮素(Endothelin-1)1.5～5ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程中用組織工程方法構建人工器官技術領域，涉及一種可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚及其構建方法，特征是在體外培養(yǎng)皮膚的角朊細胞、成纖維細胞和黑色素細胞，然后用組織工程方法在體外將這三種細胞按比例混合，構建含有色素的人工皮膚；同時，通過改變摻入黑色素細胞的比例，可以獲得具有不同膚色的人工皮膚以應用于皮膚缺損修復和美容修復，滿足不同的臨床修復要求。
文檔編號A61L27/60GK1493367SQ03134539
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權日2003年9月2日
發(fā)明者金巖, 劉源, 趙宇, 金 巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院, 陜西艾爾膚生物工程有限責任公司, 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學