本發(fā)明涉及一種三維移植物、特別是用于修復顱面容貌和損傷關節(jié)的三維移植物，以及使用計算機輔助建模和具有生物相容性墨水的三維生物打印制造患者特異性移植物的方法。
背景技術：
：鼻子和外耳以患者特異性方式重建是整形外科手術中最大的挑戰(zhàn)之一，因為內部軟骨結構的復雜三維性質，以及機械性能和覆蓋皮膚的區(qū)域性變化。耳廓重建適用于先天性畸形、小耳癥、黑素瘤相關組織犧牲和損傷，包括事故和嚴重燒傷。頭頸部燒傷中約90％涉及耳朵。美國和歐盟最常用的全耳廓重建標準治療方法是基于從第六、第七和第八肋骨獲得的自體肋軟骨的兩到三階段手術技術，其通過有限量的獲得的組織盡可能地被雕刻成耳朵。通常在10歲時可以獲得足夠數量的肋軟骨，延遲了重建手術。用于耳朵重建手術的另一種重建方法是使用有機硅植入物來避免對肋骨軟骨采集的需要。然而，將無細胞支架放置在薄層皮膚下，使患者面臨長期并發(fā)癥的高風險。此外，不可能為每個患者提供定制的尺寸和形狀，并且重建的耳朵不會像對側耳朵那樣生長而導致不對稱?？尚械闹亟ú呗陨婕皫醉検中g，其結果高度依賴于重建外科醫(yī)生的專業(yè)知識。捐助方發(fā)病率，由于缺乏肋軟骨支持引起的腹壁塌陷和與軟骨獲取有關的嚴重疼痛是常見的并發(fā)癥。另外，由于運動損傷、創(chuàng)傷和退行性疾病如骨關節(jié)炎，對修復骨軟骨損傷有很大的臨床需求。目前的治療方法涉及骨軟骨移植物的移植，所述骨移植物是自體的或獲自骨庫的。這種治療具有幾個缺點，包括供體位點發(fā)病率、供體組織稀缺、手術難度以及移植物由多個片段組成的事實，每個片段可能會松動或在高度上錯位。鑒于現有技術這樣的狀態(tài)，本發(fā)明的目的是提供用于提供患者特異性移植物的方法和裝置，其改善了上述現有技術現狀的缺陷。該目的通過本說明書的權利要求的主題來實現。技術實現要素：根據本發(fā)明的第一方面，一種提供移植物支架、特別是用于人類患者的移植物支架的方法，所述方法包括以下步驟：-提供顆粒和/或纖維-提供膠凝化多糖水溶液；-提供哺乳動物細胞；-混合所述顆粒和/或纖維、所述膠凝化多糖水溶液和所述哺乳動物細胞以獲得打印混合物；-以三維形式沉積所述打印混合物。根據本發(fā)明的另一方面，提供移植物的方法包括以下步驟：-通過根據本發(fā)明第一方面或其任何具體實施方式的方法提供移植物支架，和-在細胞培養(yǎng)步驟中將所述無細胞支架沉沒到包含哺乳動物細胞，特別是軟骨細胞、干細胞或軟骨前體細胞的細胞培養(yǎng)基中。根據本發(fā)明的另一方面，提供了通過本發(fā)明的任何前述方面或其任何具體實施方式獲得或可獲得的移植物，特別用于顱面或關節(jié)修復的方法。根據本發(fā)明的另一方面，顱面或關節(jié)修復的方法包括針對用軟骨特異性打印混合物進行三維增材制造而改進的用于患者特異性移植物的計算機模型，所述軟骨特異性打印混合物包含至少一種細胞相容性聚合物、至少一種切碎的組織或其他增材顆粒和細胞，交聯是通過嵌入共擠出材料中或生物墨水中的反應性基團和分子的自發(fā)或外在引發(fā)反應內在提供，這些類型中的至少一種存在于聚合物、切碎的組織和細胞中至少一種上以重建功能性和天然軟骨樣組織移植物。根據本發(fā)明的一個方面，通過增材制造方法提供了一種用于更好地適合于制造的組織移植物的機械負載而創(chuàng)建移植物的內部聚合物梯度、孔隙率和支持區(qū)域的方法。根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種制造犧牲性外部支持結構以幫助打印移植物的凸懸特征的方法，其中犧牲聚合物與打印混合物共沉積并用作交聯引發(fā)劑的儲存器以聚合打印混合物，并在聚合后除去。具體實施方式本發(fā)明的第一方面涉及特別是在人類患者中提供移植物支架的方法，包括以下步驟：-提供膠凝化多糖水溶液；-至少提供以下之一：o顆粒和/或纖維o哺乳動物細胞；-混合所述顆粒和/或纖維、所述膠凝化多糖水溶液和所述哺乳動物細胞以獲得打印混合物；-以三維形式沉積所述打印混合物。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液和顆粒。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液和纖維。纖維和/或顆粒，特別是當從軟骨組織獲取時，可以包括有助于支持移植物內細胞生長的因子。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液以及顆粒和纖維。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液和細胞。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液和細胞和一種或幾種生長因子。發(fā)明人驚奇地發(fā)現，即使在沒有軟骨顆?；蚶w維的情況下，提供膠凝化材料和細胞可足以維持細胞活力和增殖，特別是在存在生長因子的情況下。在某些實施方式中，打印混合物包含膠凝化多糖水溶液以及顆粒和細胞。在某些實施方式中，所述打印混合物包含膠凝化多糖水溶液以及顆粒、纖維和細胞。在某些實施方式中，所述顆粒由組織顆粒組成或包括組織顆粒。在某些實施方式中，所述顆粒由軟骨顆粒組成或包含軟骨顆粒。在某些實施方式中，所述顆粒由以凍干軟骨組織構成的顆粒組成或包含以凍干軟骨組織構成的顆粒。在某些實施方式中，所述顆粒由人軟組織組成或包含人軟組織。在某些優(yōu)選實施方式中，所述顆粒由自體軟骨組織組成或包含自體軟骨組織。在某些優(yōu)選實施方式中，所述顆?？梢允桥R床微粉化基質產品，包括biocartilage、amniofix、alloderm-cymetra、cookbiotechsmallintestialmuscosa(sis))顆粒。在某些優(yōu)選實施方式中，所述顆?？梢允橇u基磷灰石或磷酸鈣。在某些實施方式中，所述顆粒和/或纖維由合成聚合物制成，特別是選自聚乙二醇、聚丙二醇、形成凝膠的泊洛沙姆f108、f127、f68、f88、聚噁唑啉、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-馬來酸酐、聚丙交酯、聚-n-異丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺或這些的共聚物或這些的嵌段共聚物的聚合物，或由以上衍生的聚合物。在某些實施方式中，所述顆粒和/或纖維包含或主要由或全部由切碎的組織構成。在某些實施方式中，所述切碎的組織衍生自選自耳軟骨、鼻軟骨、髓核、半月板、氣管、鼻軟骨、肋軟骨、關節(jié)軟骨、滑液、玻璃體液、腦、脊髓、肌肉、結締組織、小腸粘膜下層和肝的組織。在某些實施方式中，切碎的組織在5μm-50μm，50-200μm和200-1000μm的范圍內或其組合的范圍內。在某些實施方式中，所述膠凝化多糖是結冷膠、?；?或硫酸化結冷膠。在某些實施方式中，所述膠凝化多糖選自瓜爾膠、肉桂膠、魔芋膠、阿拉伯膠、加沙膠、刺槐豆膠、黃原膠、硫酸黃原膠、角叉膠、硫酸角叉膠，或任何上述膠凝化多糖的混合物。在某些實施方式中，所述膠凝化多糖溶液除了膠凝化多糖之外還包含作為添加劑的細胞相容性聚合物，特別是選自藻酸鹽、藻酸鹽硫酸酯、硫酸結冷膠、角叉膠、硫酸角叉膠、瓜爾膠、桂皮膠、魔芋膠、阿拉伯膠、加沙膠、刺槐豆膠、黃原膠、硫酸黃原膠、肝素、纖維蛋白、硫酸肝素、彈力蛋白、彈力蛋白原、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸、透明質酸硫酸酯、纖維素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-賴氨酸、殼聚糖、絲和膠原的細胞相容性聚合物。在某些實施方式中，所述添加劑與結冷膠、?；?或硫酸化結冷膠相結合。結冷膠是由細菌pseudomonaselodea生產的水溶性多糖。聚合物的重復單元是四糖，其由d葡萄糖的兩個殘基和l-鼠李糖和d-葡萄糖醛酸的每個殘基之一組成。重復具有以下結構：[d-glc(β1→47d-glca(β1→4)djhbn-glc(β877→u8ir)l-rha(α1→3)]n?！磅；Y冷膠”是本領域已知的術語，并且是指在葡萄糖單元的一些或全部5'氧位置含有乙?；驮谝恍┗蛉?'氧位置含有甘油酸的結冷膠。見圖8：?；Y冷膠(a)是細菌發(fā)酵后的原始產物結冷膠，當純化時，?；透拾滨孺溈杀磺懈?b)。這增強了凝膠化，可以實現不同的剛度。本發(fā)明的某些實施方式將?；图兓慕Y冷膠結合在一起以實現結構的更好的靈活性。在某些實施方式中，所述膠凝化多糖的溶液包括結冷膠或乙?；Y冷膠，或?；Y冷膠的硫酸化產物作為膠凝化多糖，以及藻酸鹽、硫酸藻酸鹽、硫酸結冷膠、角叉膠和/或硫酸角叉膠作為細胞相容性聚合物添加劑。在某些實施方式中，將含有一價、二價和/或三價陽離子的鹽的水溶液加入到所述膠凝化多糖中以實現凝膠化。在某些實施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的二價離子。在某些實施方式中，所述水溶液包含鍶離子(sr2+)。在某些實施方式中，所述水溶液包含鋇離子(ba2+)。在某些實施方式中，所述水溶液包含鈣離子(ca2+)。在某些實施方式中，所述水溶液包含總共10-150mmol/l的二價離子。在某些實施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的鍶離子(sr2+)，特別是15-50mmol/l的sr2+。在某些實施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的鋇離子(ba2+)，特別是15-50mmol/l的ba2+。在某些實施方式中，所述水溶液包含10-150mmol/l的鈣離子(ca2+)，特別是15-100mmol/l的ca2+。在某些實施方式中，所述水溶液包含總計10-150mmol/l的sr2+和ba2+，特別是15-50mmol/l的sr2+和ba2+。在某些實施方式中，所述水溶液包含總計10-150mmol/l的ca2+和ba2+，特別是15-50mmol/l的ca2+和ba2+。在某些實施方式中，所述水溶液包含總計10-150mmol/l的sr2+和ca2+，特別是15-50mmol/l的sr2+和ca2+。在某些實施方式中，所述膠凝化多糖溶液包含生理滲透壓濃度的單糖或二糖，特別是葡萄糖、甘露糖或阿拉伯糖。這種添加對于保護嵌入在打印混合物中的細胞的生存性是重要的。在某些實施方式中，所述顆粒和/或纖維由以下組成，或包括以下：-生物相容性或細胞相容性聚合物，和/或-生物可再吸收性的聚合物，特別是選自pla(聚乳酸或聚丙交酯)、dl-pla(聚(dl-丙交酯))、l-pla(聚(l-丙交酯))、聚乙二醇(peg)、pga(聚乙交酯)、pcl(聚ε-己內酯)、plcl(聚丙交酯-co-ε-己內酯)、二氫硫辛酸(dhla)、藻酸鹽和殼聚糖的聚合物，和/或-合成聚合物，特別是選自聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-馬來酸酐、聚丙交酯、聚-n-異丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺的聚合物或者由其衍生的聚合物；或-天然纖維，特別是選自彈力蛋白、彈性蛋白、絲及其衍生物；-生物相容性導電材料，特別是過渡金屬鉭和導電聚合物聚吡咯(ppy)。在某些實施方式中，顆粒由上述生物聚合物在油乳液中或沉淀形成。在某些具體實施方式中，這樣的生物聚合物是藻酸鹽。在某些實施方式中，所述組織顆粒源自選自耳軟骨、鼻軟骨、髓核、半月板、氣管、鼻軟骨、肋軟骨、關節(jié)軟骨、滑液、玻璃體液、腦、脊髓、肌肉、結締組織、小腸粘膜下層和肝臟的組織。在某些實施方式中，所述細胞相容性聚合物是天然聚合物。在某些實施方式中，細胞相容性聚合物是不同酰化度的結冷膠，特別是?；?00％至10％酰化之間，以100％為高，并且任選地包含選自藻酸鹽、硫酸藻酸鹽、肝素、纖維蛋白、硫酸肝素、彈性蛋白、彈性蛋白原、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸、透明質酸硫酸酯、纖維素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-賴氨酸、殼多糖、不同類型的絲和膠原，以及它們的硫酸化形式的添加劑。在某些實施方式中，≥90％、≥95％或≥98％的所述顆粒在5μm-1000μm，特別是5μm-50μm、5μm-200μm、50μm-200μm或200μm-1000μm的范圍內。在某些實施方式中，所述纖維的長度尺寸為5μm-50μm和50-500μm，縱橫比為2-1000，特別是10-500，更特別是100-500、100-1000、200-1000或500-1000的范圍內。在某些實施方式中，絲纖維的直徑為1μm以下，長度為以上。在本說明書的上下文中，出于術語使用的目的，縱橫比定義為纖維長度與直徑的比率。在某些實施方式中，所述哺乳動物細胞是軟骨細胞、軟骨前體細胞或能夠分化成軟骨前體細胞或軟骨細胞的干細胞。在某些實施方式中，所述哺乳動物細胞選自原代自體軟骨細胞、原代同種異體軟骨細胞、軟骨祖細胞、成軟骨細胞、間充質干細胞、誘導多能干細胞和脂肪來源的干細胞。在某些實施方式中，所述打印混合物包括：-1-6％(w/v)，特別是約3％(w/v)的所述膠凝化多糖；-0.5-10％(w/v)，特別是約4％(w/v)的所述顆粒，-任選地，0.5-8％(w/v)，特別是約2％(w/v)的所述添加劑。在某些實施方式中，所述打印混合物包括：-約3％(w/v)的結冷膠；-約4％(w/v)的軟骨組織顆粒，-約2％(w/v)的藻酸鹽，10ng/mltgbf3和-106-107個軟骨細胞/ml。在某些實施方式中，所述打印混合物與犧牲聚合物一起沉積。這允許產生凸懸結構，例如在形成鼻和耳的某些特征時特別重要。在某些實施方式中，將所述打印混合物沉積在犧牲聚合物支架上。在某些實施方式中，所述犧牲聚合物支架與打印混合物共沉積。在某些實施方式中，所述犧牲聚合物混合物和/或支架包含二價陽離子或其它凝膠/聚合劑。通過將犧牲聚合物混合物擴散到打印混合物中，這些陽離子或其它凝膠/聚合劑允許快速形成支架的三維結構。在某些實施方式中，特別是基于所述患者的對側器官的三維計算機模型，通過3d打印方法得到三維形式和/或所述犧牲性聚合物支架。在某些實施方式中，通過計算機斷層攝影、磁共振成像、激光掃描或利用三維相機獲得三維模型。在某些實施方式中，創(chuàng)建了計算機模型以支持梯度負載，并創(chuàng)建內部結構以獲得更好的細胞存活和孔隙度。在某些實施方式中，所述聚合物支架通過增材制造方法得到。在某些實施方式中，所述增材制造方法是噴墨打印、生物打印、擠出打印或逐層方法。在某些實施方式中，所述聚合物支架的特征在于內部聚合物梯度、孔隙度和支持區(qū)域。在某些實施方式中，添加另外的聚合物以增加基質液體粘度，使得墨水可以一致地擠出并且由于過濾器加壓現象而不被堵塞。在某些實施方式中，在所述細胞培養(yǎng)步驟之前或之后除去犧牲聚合物。在某些實施方式中，所述組織顆粒和/或生物墨水包括生長因子或生物因子組合，特別是選自bmp-2、bmp-7、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3和/或fgf-2，和/或有絲分裂因子，特別是igf-1，以促進愈合和再生。在某些實施方式中，生長因子可以直接加載到生物墨水混合物中。在某些實施方式中，所述生長因子的濃度范圍為0.1-5mg/ml，5-50ng/ml或50-500ng/ml的一種生長因子或幾種生長因子的組合。在某些實施方式中，所述生長因子選自bmp-2、bmp-7、tgf-β1、2、3、igf-1和/或fgf-2。在某些實施方式中，打印混合物，特別是顆粒，包含另外的組分，特別是選自生長因子、抗氧化劑、細胞因子、藥物和生物制劑的組分。在某些實施方式中，犧牲聚合物包括引發(fā)交聯的試劑，所述試劑是一價、二價和三價陽離子、酶、過氧化氫、辣根過氧化物酶、可輻射聚合的單體如苯基-2,4,6-三甲基苯甲?；戊⑺徜嚒Ｔ谀承嵤┓绞街?，交聯引發(fā)基團存在于打印混合物中，特別是選自參與曝光、陽離子介導的交聯和酶介導的交聯的基團。本發(fā)明的另一方面涉及一種提供移植物修復的方法，包括以下步驟：-通過根據前述權利要求中任一項的方法提供移植物支架，和-在細胞培養(yǎng)步驟中將所述無細胞支架沉沒到包含哺乳動物細胞，特別是軟骨細胞、干細胞或軟骨前體細胞的細胞培養(yǎng)基中。本發(fā)明的另一方面涉及通過根據本發(fā)明的前述方法中的任一項的方法或任何特定實施方式或由特定實施方式提供的特征組合獲得的、或可獲得的移植物支架。本發(fā)明提供了通過增材制造方法產生的患者特異性顱面重建移植物。軟骨組織移植物消除了對獲取軟骨的需要，從而減少患者的不適，減少手術時間并允許更好地復制形狀、尺寸和機械靈活性。此外，可以實現更快的組織再生和增加的細胞增殖以增強手術恢復。對于顱面應用，該技術可以與目前使用的皮膚增強治療(即擴張器)或其它天然或合成皮膚移植物組合。打印根據本發(fā)明，通過利用增材制造方法(例如但不限于擠出打印、噴墨打印和其他逐層沉積方法)，基于來自患者的三維掃描模型來產生患者特異性耳和鼻移植物。使用臨床計算機斷層掃描(ct)、磁共振成像(mri)或其他三維成像工具，例如激光掃描儀、3d相機或這些的組合，以產生患者特異性植入物的計算機化模型。對于耳朵重建，圖像可以被鏡像以產生精確模擬對側耳的計算模型，以便組織移植物生產。對于耳朵和鼻子重建，移植物模型庫可用于為患者提供移植物的選擇，特別是在不能進行正常對側掃描的情況下。當使用特定尺寸減小工具通過皮膚層的厚度來減小軟骨框架的尺寸以實現正確尺寸的最終移植物時，這些方法可以導致更好的美容和美學效果。增材制造方法可用于以高精度和無菌條件制備這些構建體。此外，根據患者的需要，為大型構建體中的細胞存活的內部支持結構和孔隙率可以以特定于患者的形狀和/或剛度的方式加入。血管成形軟骨可以被設計為承載血管結構以覆蓋其附近的皮膚和其他組織以防止壞死。打印的軟骨框架可以用作構建上覆組織的生物活性模板，釋放生長因子和其他分泌分子以增強相鄰細胞的活力。該釋放可以特別設計，通過在混合物中具有硫酸化聚合物將生物因子結合到細胞附近并緩慢釋放分子。在某些實施方式中，3d形式可以作為計算機模型創(chuàng)建，以支持梯度的承載力，并創(chuàng)建內部結構以獲得更好的細胞存活和孔隙度。材料生物墨水材料包含至少一種細胞相容性聚合物和至少一種顆粒和細胞，交聯通過反應性基團和分子的自發(fā)或外部觸發(fā)反應提供，這些類型中的至少一種存在于聚合物、切碎的組織和細胞的至少一種中。用于該方法的細胞相容性聚合物(以下稱為“聚合物”)可以是具有必要的細胞相容性的任何合適的聚合物，即它們的存在對細胞無害。它們可以是天然的(生物聚合物)或合成材料，或它們的組合。使之能交聯的必需反應基團可以已經存在于聚合物上，或者可以將聚合物改性成包括這些基團。天然聚合物的典型非限制性實例包括藻酸鹽、硫酸藻酸鹽、肝素、纖維蛋白、硫酸肝素、彈力蛋白、彈力蛋白原、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸、硫酸透明質酸、纖維素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚-l-賴氨酸、殼聚糖、明膠、不同酰化度的結冷膠、硫酸結冷膠、瓜爾膠、肉桂膠、魔芋膠、阿拉伯膠、加沙膠、刺槐豆膠、黃原膠、硫酸黃原膠、角叉膠、硫酸角叉膠，各種類型的絲和膠原蛋白。包括這些聚合物的所有硫酸化形式。合成聚合物的典型非限制性實例包括但不限于以下聚合物或衍生自以下的聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆、聚噁唑啉、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚甲基乙烯基醚-co-馬來酸酐、聚丙交酯、聚n-異丙基丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚烯丙胺。在聚合物、顆粒和細胞中的至少一種中存在的“至少一個”基團是指所添加的反應性基團可以存在于所有這些實體上或者存在于這些實體中的任何一個上。摻入到聚合物溶液中的顆?？梢园ǖ幌抻诔叽绶秶?-500微米之間的纖維、細胞外基質組織顆粒、和負載或未負載的珠粒。交聯基于材料組合、顆粒和細胞的水凝膠的形成可以由許多因子或試劑引發(fā)，包括但不限于一、二、三價陽離子、酶和自由基引發(fā)劑。此外，可以采用物理和物理-化學方法，例如在制造過程中在低ph或高ph溶液和不同溫度區(qū)域進行處理。在某些實施方式中，所述打印混合物和所述聚合物支架中的任一種包含共價連接到其上的反應性基團，特別是通過自發(fā)或外部觸發(fā)反應的交聯促進所述打印混合物或其組分與所述顆粒連接的反應性基團，其中反應性基團存在于聚合物、切碎的組織和細胞中的至少一種上，以重建功能性和天然軟骨樣組織移植物。顆粒所使用的切碎的組織的尺寸可以是任何合適的尺寸，但是在特定的實施方式中，其為5微米-500微米，使得其可以擠出而不堵塞諸如針或閥等分配單元。用于該方法的切碎的組織可以是任何合適的組織，但是有利的是性質與軟骨相似或相同的組織。合適組織的示例性和非限制性實例包括關節(jié)軟骨、髓核、半月板、氣管、鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨、滑液、氣管軟骨、玻璃體液、腦、肝、脊髓、肌肉、結締組織和皮下脂肪、髕骨內脂肪墊，小腸粘膜下層。具體的實例是彈性蛋白和糖胺聚糖含量高的組織，具體的例子是任何類型的軟骨、髓核和半月板?？梢酝ㄟ^任何合適的方法來切碎組織，示例性和非限制性方法包括均化、凍磨、干磨、切割、切碎、粉碎和切片。組織可能進行去細胞化以去除可引起急性炎癥反應的表位和包括hiv在內的病原體。最近，去細胞化的組織，即細胞被殺死且其殘留物被去除的組織作為支架材料的方式更簡單的替代方案已經引起了人們的興趣，其中支架由單一材料組成(hoshiba等人“"decellularizedmatricesfortissueengineering".expertopiniononbiologicaltherapy.2010；10:1717-28)。組織去細胞化使得細胞外基質的支架理想地適合于再生受傷或患病組織，因為它保留了用于重現功能所需的高分辨率結構和生物學指示。去細胞化可以例如通過使用洗滌劑、過氧化氫、氫氧化鈉和酶，rna酶和dna酶來完成。顆?？梢酝ㄟ^諸如以下的非限制性方法制造：通過親水/疏水相互作用的膠體形成、兩相乳液和油界面中。纖維可以通過諸如但不限于靜電紡絲、纖維擠出和纖維拉伸的方法來制造。可以通過任何合適的方法來切碎任何種類的顆粒和纖維，示例性和非限制性的方法包括均化、冷磨、干法研磨、切割、切碎、破碎和切片。這些附加組織片、顆粒和纖維可以用與載體聚合物或這些材料的組合相結合的官能團進一步改性、或被處理以暴露反應性基團，以便進行交聯。此外，生長因子、抗氧化劑和藥物分子可以加載到所加入的聚合物、組織片、顆粒和纖維之中或之上。細胞在本說明書中，術語“細胞”的使用不僅包括單個細胞，特別是哺乳動物細胞，更特別地是人類細胞，特別是自體人細胞，還包括形成球狀體、團狀和微組織的所述細胞的聚集體，這些是本領域熟知和常用的。用于該方法的細胞有利地是與存在于軟骨組織上的細胞類似的細胞。合適的細胞類型的典型非限制性實例包括原代自體軟骨細胞、原代同種異體軟骨細胞、軟骨祖細胞、成軟骨細胞、間充質干細胞、誘導多能干細胞和脂肪來源的干細胞、神經嵴來源的干細胞。打印混合材料在本說明書的上下文中，術語“打印組合物”是指擠出物料，其包含關鍵構成組分：-顆粒，由天然(任選地：干燥的)組織或纖維制成、或由生物相容性、任選生物可再吸收性聚合物制成、或由聚合物和天然組織/纖維共同制成，-膠凝化多糖水溶液，特別是結冷膠或其衍生物的水溶液，和-哺乳動物細胞。根據材料的性質和最終用途，打印混合材料的組成可以在寬范圍內變化。聚合物通常以0.5-20％的重量比例存在。當存在切碎的組織、顆?；蚶w維時，它們通常以干燥聚合物的10-40％的重量比例或以總重量的1-20％的比例存在。當存在細胞時，它們通常以3×106細胞/ml-50×106細胞/ml的濃度使用。除了上述主要組分之外，可交聯材料可以包括其它材料，以賦予材料特定性質。一個特別的例子是彈力蛋白，其在耳廓和鼻腔ecm中含量豐富，以提供組織的彈性，其他實例包括加入聚合物溶液中的生長因子、細胞因子、藥物、生物制品、sirna、dna、抗氧化劑如多酚，其可以增加組織再生。添加的生長因子可能與硫酸化聚合物或未改性聚合物結合，以增強在位于打印混合物中的細胞附近的遞送和有效性。即用形式的打印混合材料是易于熱凝膠化的狀態(tài)，其可以容易地應用于在制造過程中獲得期望的形狀。分子的粉末和凍干的切碎的組織、顆粒和纖維可以分開儲存和滅菌。所有組分可以在包裝之前組合或使用之前再水化，從而長時間保存生長因子和蛋白質。形狀針對每個患者定制患者特異性組織移植物，或者可以為不希望或不可能進行患者成像的情況創(chuàng)建某些模型目錄。從外耳廓和鼻部掃描獲得的三維模型可以被修改為包含內部支持結構、用于多功能機械性質的聚合物梯度和用于在大結構中增強細胞存活的孔隙度。此外，區(qū)域可以根據剛度、生長因子混合物和濃度進行調整，例如以誘導細胞增殖的區(qū)域變化。例如，軟骨移植物的周邊可以更多孔或更柔軟，允許更多的營養(yǎng)物質流入深層結構。此外，在這些構建體中也發(fā)現了區(qū)域特異性和組織類型，例如，在耳朵的耳垂中，脂肪是主要組織，并且負責機械性質。區(qū)域屬性和指定的結構可以容易地以逐層方式構建。在這種分層方法中，交聯機制不僅在單個層內發(fā)生，而且在相鄰層之間也將發(fā)生，從而形成完全一體化的連續(xù)結構。這可以通過在與包含反應性分子儲存器的載體結構接觸的構建體的外圍引發(fā)交聯來實現。支持支持結構可以與打印混合材料共沉積以支持凸懸結構、引發(fā)交聯或防止材料在沉積期間的干燥。支持材料可以含有交聯因子，包括但不限于一、二、三價陽離子、酶和自由基引發(fā)劑。另外，可以采用物理和物理-化學方法通過支持材料相互作用來改變ph和分子濃度。構建體制造后可以洗脫支持結構。洗脫可通過但不限于溫度變化、ph變化或降解分子進行。結果是快速、有效和持久的軟骨修復。直到已經實現足夠的細胞ecm產生以產生天然軟骨樣結構，壽命是在移植物中保持機械性能的重要因素。可以采用本公開方法的應用的典型示例包括：-顱面缺損重建-填充和重建部分組織損失并將其與天然組織整合；-用患者特異性移植物重建氣管(氣道)、半月板或肋軟骨；-填充軟骨缺損本發(fā)明的方法的特征在于具有以下優(yōu)點：-能夠產生患者特異性組織移植物用于顱面和矯形應用，例如但不限于：耳、鼻、關節(jié)軟骨。-能夠調整彎曲性能以使支架與生理參數和天然組織的特定區(qū)域相匹配。-能夠包括具有更緊密聚合物和增強結構的功能性負載承載區(qū)域，以調節(jié)移植物的機械性能。-由于消除了對獲取軟骨的需求，提供更好的患者滿意度和降低的疼痛水平。-利用已經含有生理學準確比例的組織特異性細胞外基質組分的復雜陣列的自體、同種異體或異種天然組織。這些顆粒主要負責刺激軟骨細胞的增殖誘因。-來自任何可能的ecm顆粒的組織片段可以摻入到水凝膠共混物中用于增材制造目的，以產生任何期望的幾何形狀，而不損害其生物化學組成，從而增加器官生物打印的前景。-能夠將治療因子加入到支架中，所述治療因子包括但不限于：藥物化合物、生長因子、肽、蛋白質、糖和基因治療載體。另外，可以包括引誘宿主細胞遷移到支架中的歸巢分子。-通過使用增材制造技術分層各種組織/組合來實現組織結構的區(qū)域組織的可能性。將參考下面的附圖和描繪了具體實施方式的非限制性示例，進一步描述本公開。圖1a)是基于患者ct模型創(chuàng)建的三維模型，并且在為了更好地承載而向移植物添加內部支持結構之后，b)完整組織工程化耳構造的照片，以及c)可以穩(wěn)定耳朵結構以獲得更自然的彎曲特性的內部支持的照片。圖像b和c均采用三維生物打印制作，由切碎的軟骨顆粒、結冷膠和藻酸鹽組成。圖2示出了具有兩種組成的生物墨水的流變學交聯動力學和最終剛度。圖3示出了使用20mm氯化鍶溶液的機械性能的時間依賴性，其中在拉伸下測量在每個時間點破壞時樣品(n＝6)平均極限應力。此外，與陽離子源無關，陽離子(黑色＝氯化鈣，灰色＝氯化鍶)的濃度具有相似的交聯作用?？梢缘贸鼋Y論，機械性能高度依賴于陽離子濃度和交聯時間。圖4是表示在打印工序中嵌入打印混合材料中的軟骨細胞的代謝活性的圖。代謝活性測定(promegamts單一溶液測定使用讀板器(synergyh1，biotek)分析在幾個時間點進行，陽性對照為藻酸鹽1％(淺灰色)，打印混合材料對應于沒有組織顆粒的打印混合材料(灰色)和打印混合材料+由直徑<100μm的軟骨細胞外基質顆粒組成的ecm(深灰色)。所有條件一式三份進行分析。圖5示出了共沉積的支持結構，其提供初始交聯分子，例如來自任何來源的陽離子、酶、蛋白質或引發(fā)交聯級聯a)的其他激活分子，以及在洗脫支持體后具有凸懸特征的最終構建體b)。圖6是由顆粒、結冷膠和藻酸鹽組成的完整天然尺寸組織工程鼻構造的照片。構建體在不到17分鐘內利用三維生物打印制作。線之間的間距為1mm。圖7是顯示在剪切之前(左)、在兩個方向角對角單軸剪切之后(中間)和垂直單軸剪切之后，在3％結冷膠中10％pmma纖維取向的明視場顯微鏡圖像。比例棒為50微米。圖8示出了高度?；Y冷膠(a)和非?；Y冷膠(b)的結冷膠組成。圖9從左向右示出了將患者特異性三維模型在打印過程中轉換成組織工程化鼻移植物。線之間的間距為1mm。圖10顯示了a)藻酸鹽和b)結冷膠的聚合物主鏈中幾種程度硫酸化的傅里葉變換紅外光譜(ftir)結果。在1300cm-1的箭頭標志著硫酸化峰。在聚合物中較高的硫酸化程度下，生長因子結合增加，導致分子的更好的傳遞。圖11顯示了具有和不具有顆粒的生物墨水組合物的流變學表征的結果。旋轉測量剪切變薄a)，1秒剪切(100-1剪切速率)兩個循環(huán)后振蕩中的剪切恢復b)，幾種陽離子條件下單獨的生物墨水離子交聯c)，用20mmsrcl2交聯30分鐘的樣品最大儲能模量g'd)。誤差條表示標準偏差。圖12顯示了打印結構體的拉伸和溶脹特性的測量結果。在打印的啞鈴狀試樣上進行拉伸試驗，其中噴嘴路徑由黑線表示，并在溶脹后顯示打印結構a)。代表性應力-應變曲線，其中在試樣的中心區(qū)域發(fā)生破裂b)?；诘仁?2)和(3)的生物墨水組合物的溶脹行為分別評估總保水率c)和交聯后的保水率d)。標尺上的最小分割為1mm，誤差條表示標準偏差。圖13顯示了打印構建體和細胞增殖測定的細胞存活的測量結果。用活死染色評估打印一層厚的盤后的存活a)，其中在打印3小時后觀察到80％的存活，其在第4天恢復至97％。為了評估大結構中的存活，打印了一個年輕成人尺寸大小的鼻子，并通過活死染色評估的中心切片評價了存活。觀察到細胞存活率為60％。比例條5mm(左)和50μm(右)。另外，用dna定量評估鑄造圓盤中的細胞數c)，其中用生物墨水+軟骨顆粒和均補充tgf-β3的組合物觀察到從第1天到第21天的dna的統計學顯著增加。誤差條代表標準差，顯著性水平為(p<0.05)。實施例實施例1a：患者特異性組織移植物的生物打印進行臨床計算機斷層掃描成像，得到計算的三維物體(圖1)。然后將患者特異性外耳模型鏡像到對側，并生成新的3d模型。與新模型一起，產生外部支持結構模型以在打印過程中支持耳朵結構，特別是凸懸區(qū)域。支持結構被設計成與戰(zhàn)略重要位置的墨水接觸以引發(fā)交聯并支持凸懸特征(圖5)。支持材料的共擠出顯示保持水平生物墨水線不下垂，并且在洗脫支持體之后準確保持打印形狀。此外，制備更致密聚合物的內部支持結構以允許在內部結構中更好的力分布(圖2、3)。所有模型都在stl轉換器(regenhu)中轉換成機器代碼，并轉移到生物打印機(biofactory，regenhu)中進行打印。使用相同的技術，本發(fā)明人已經證明了幾種軟骨結構包括半月板、椎間盤和鼻的打印。雙組分椎間盤移植物可以用兩種生物墨水組合物打印以模擬髓核和纖維環(huán)。實施例1b：用于三維打印目的的軟骨顆粒的制造通過將薄層軟骨移除到含有pbs和1％青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)皿中，從新鮮的牛關節(jié)或耳軟骨中收獲軟骨。將收獲的軟骨轉移到低溫磨中(retsch)，并以30hz的強度碾磨三個周期。收集研磨的軟骨并凍干，得到可以篩分成所需粒度范圍的干粉。這些顆?？梢赃M一步負載生長因子或其他分子，以增強增殖和其他細胞應答。負載后，將顆粒凍干并冷凍保存，以在延長的保質期內最大化生物分子的可用性。實施例1c：打印混合材料制備和打印過程通過將3.5％濃度的結冷膠與3％的藻酸鹽組合制備打印混合材料(“bio-ink”)。將結冷膠針對超純水進行透析，以盡量減少材料中的陽離子殘留。在70-80℃超純水中透析3天，每天將水更換一至兩次。進一步凍干結冷膠得到干燥粉末。將純化的結冷膠溶解在含葡萄糖的去離子水中，使其更與細胞相容，并加入藻酸鹽溶液以獲得聚合物的最終濃度。將聚合物共混物與ecm顆粒和6×106細胞/ml混合以獲得最終的打印混合材料。與陽性對照相比，該打印混合物質顯著刺激細胞增殖(圖4)。對于單獨的生物墨水、具有或不具有生長因子tgf-β3的生物墨水+ecm，培養(yǎng)8周后，通過組織學和免疫染色評估軟骨細胞外基質的產生。不具有生長因子tgf-β3的生物墨水+ecm刺激細胞增殖高于單獨的生物墨水，這在h&e染色中是清晰可見的。生物墨水+軟骨顆粒顯示alcian藍色染色輕微增加，觀察到輕微的膠原蛋白ii染色，表明需要額外的生長因子刺激。在沒有生長因子的顆粒周圍經?？吹郊毎鲋常哂衪gf-β3的生物墨水+軟骨顆粒沒有位點特異性增殖，這表明該顆粒是有絲分裂生長因子的來源。8周后，支架的總體外觀表明，生長因子刺激對軟骨基質產生具有明顯的作用，如通過tgf-β3補充樣品的大小和不透明外觀所見。兩種經補充的生物墨水組合物顯示軟骨ecm組分顯著增加，并且具有開始類似于天然軟骨的細胞密度和gag含量的區(qū)域。此外，在生長因子補充條件下，在整個移植物中膠原ii沉積強烈，而在沒有tgf-β3的培養(yǎng)樣品中僅觀察到細胞周圍染色。進行膠原i型和茜素紅染色以確定纖維軟骨產生和鈣化。在生物墨水+軟骨顆粒和在兩種tgf-β3補充的條件下都發(fā)現膠原蛋白i，這提示了一些纖維軟骨的產生，這可能是由于細胞的傳代。在所有情況下，鈣化不存在，表明軟骨細胞的軟骨表型是穩(wěn)定的。將打印混合材料打印在基材上，并將支持聚合物pluronicf127共擠出以填充隨后的層。pluronic含有20mm的srci2以在與墨水接觸時引發(fā)生物墨水交聯。陽離子由于滲透平衡和引發(fā)交聯的靜電力而擴散到打印混合材料中。結構以410μm針和800mm/分鐘進給速度產生。施加到擠壓注射器的壓力在1.2-1.4巴之間變化。將材料逐層沉積成所需形式后，在將構建體轉移到37℃的細胞培養(yǎng)基中之前，將犧牲支持物pluronic在20mmsrci2浴中洗脫數分鐘。圖1示出了耳軟骨內部支持結構，圖6顯示了由該技術產生的鼻移植物。圖2示出了交聯后的初始儲能模量為100kpa，其與高剛性水凝膠相當。實施例2：為其機械性能和生長因子保留而優(yōu)化的生物墨水組合物生物墨水制備：將結冷膠加入到90℃含有d-葡萄糖(300mm)的超純水中以獲得3.5％的溶液，其中85％為低?；Y冷膠，25％為高?；Y冷膠。將藻酸鹽加入到混合物中以獲得2.5％的溶液。將沸騰燒瓶保持在90℃，同時攪拌直到溶液均相，通常1小時。在細胞混合之前將均相溶液冷卻至30℃。簡言之，將牛軟骨細胞(4×106細胞/ml)在dmem溶液中混合，并以1:10的體積比加入到培養(yǎng)基內的生物墨水中以預交聯生物墨水。進行混合直到溶液達到室溫并裝載打印注射器。結冷膠高?；?gg-ha)和低?；?gg-la)組合物(圖8)有助于最終生物墨水的剛度和彈性。通過改變?；问街g的比例，材料可以交聯更緊密的產生更堅硬的基質，而通過破壞聚合物鏈在交聯中的緊密填充可以產生更彈性的基質。85％gg-la、25％gg-ha組合物中這些參數對于顱面應用是最佳的，其提供高達230kpa極限應力的可調節(jié)交聯性能和在68％的平均破裂應變(圖3)。為了進一步優(yōu)化生物墨水中的生長因子保留，將2％濃度的硫酸結冷膠(gg-3％)(圖8)加入到生物墨水中。與非硫酸化生物墨水相比，該組合物在保持負載生長因子(在這種情況下為tgf-β3和fgf-2)的生物相容性方面優(yōu)異。實施例3：可選的打印材料和具有支持材料的交聯過程在辣根過氧化物酶(hrp)和過氧化氫存在下，將基礎聚合物3％凝膠與結合有3％酪胺的附加的透明質酸混合在一起，以產生可酶促交聯的水凝膠。在生理滲透壓、具體300mm的單糖葡萄糖存在下，將物質溶解在去離子水中。濃度為4％(w/v)的羥基磷灰石顆粒加入到聚合物混合物中。當將hrp以1單位/ml濃度與生物墨水混合或者和pluronicf12730％混合物以及0.0012％的過氧化氫混合時，在hrp和過氧化氫存在下，將該生物墨水組合物進一步生物打印。逐層構建的支架在與支持結構接觸時立即交聯。在冷介質中洗脫支持結構，以減少細胞存在下過氧化氫的負面影響。將結構洗滌數次以使過氧化氫殘余物的量最小化。實施例4：用于生物打印的纖維增強材料將3％結冷膠溶解在去離子水中，并將10％(w/v)聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)纖維作為切斷的電紡纖維加入結冷膠溶液中。用掃描電子顯微鏡對纖維進行成像，以確定纖維直徑約為2微米。在剪切之前(圖7左側)和兩個不同的剪切方向后2分鐘(圖7中間和右側)，將纖維增強的結冷膠成像。2分鐘后，單軸剪切的纖維取向大大增加。此外，單軸但不是單向剪切將短于50微米的纖維定向到剪切方向，從而允許我們在基質中形成非均相的承載結構。然而，當剪切方向改變時，長于50微米的纖維不能保持剪切取向。在擠出打印期間，剪切圖案在噴嘴中是單軸的和單向的，因此將纖維定向至流動方向。在流動快速停止時，我們可以保持纖維取向單軸，這將影響結構的承載能力。這些結構是自然啟發(fā)的，例如關節(jié)軟骨中的膠原ii纖維正在改變不同軟骨層的取向。實施例4a生物墨水交聯示例性的生物墨水是與人微粉化軟骨顆粒或ha顆粒(≤40μm大小)混合的結冷膠和藻酸鹽的混合物。當加入一價、二價或三價陽離子時，因為螺旋聚集成連接區(qū)，通過分子的卷曲部分連接到三維網絡中，而發(fā)生凝膠化(溶膠-凝膠轉變)。打印過程分為三個階段，即生物墨水預打印、打印過程和打印后交聯。最初，將生物墨水裝入注射器并將支持聚合物裝入第二注射器。在這個階段，少量的陽離子存在于生物墨水中以提高粘度和增強打印性能。在打印過程中，共擠出的支持物，陽離子擴散到打印結構的周邊以引發(fā)交聯。最終結構完成后，支持物可以在4℃陽離子補充培養(yǎng)基中洗脫。實施例4b：流變學分析陽離子相關的粘度增強和交聯性能可以通過流變學和機械測試來研究。用antonpaarmcr301(antonpaar，zofingen，switzerland)流變儀測量生物墨水、生物墨水+ha和生物墨水+軟骨顆粒的流變特性，以確定剪切行為和剪切恢復。所有生物墨水顯示剪切稀化行為，這對于擠出是至關重要的(圖11a)。此外，所有組合物在擠出之前具有屈服點(弱凝膠形成)，這對于防止注射器中的顆粒和細胞沉淀是重要的(表1)。生物墨水生物墨水+ha生物墨水+軟骨顆粒屈服點15.6pa±0.7pa17.7pa±6.5pa122pa±22pa10s終止21％90％98％最大g'152kpa±3.0kpa110kpa±2.0kpa96kpa±1.0kpa表1.流變學測量總結。屈服點用赫歇爾/帕克利方程計算。*第二剪切序列后10秒的剪切恢復。剪切恢復曲線(圖11b)說明了打印過程后生物墨水結構的恢復。第二剪切序列后的剪切恢復10秒鐘之后在生物墨水+軟骨顆粒中為98％，在生物墨水+ha中為90％。同時，生物墨水單獨恢復到原始模量的21％。圖11c示出了單獨的生物墨水的陽離子誘導的交聯之后的儲能模量g'，其中陽離子濃度和來源具有明顯的影響。圖11d示出了三種生物墨水組合物的最終儲存模量。與生物墨水+軟骨顆粒(96kpa±1kpa)和生物墨水+ha(10kpa±2kpa)相比，單獨的生物墨水具有最高的最終儲存模量(152kpa±3kpa)，這表明交聯一定程度上受到顆粒的阻礙，而不管其來源如何。實施例4c：機械性能和溶脹行為生物打印的軟骨結構的機械性能在張力下進行評估。使用具有或不具有細胞的生物墨水+ha顆粒打印拉伸啞鈴狀試樣。試樣的規(guī)格部分中的噴嘴路徑(打印方向)被選擇為平行于拉伸方向(圖12a)。相比細胞構建體(e＝116kpa±6.8kpa)，無細胞構建體(e＝230kpa±7.0kpa)的楊氏模量顯著更高(p<0.001)，表示細胞增加了構建體的依從性和/或抑制了交聯。無細胞(37％±6.4％)和細胞(34％±2.1％)(p＝0.54)構建體之間的破裂應變沒有差異。定量具有和不具有顆粒的生物墨水的溶脹，以評估總保水率和凝膠交聯后的保水率(圖12c-d)。在37℃下溶脹長至48小時，增加水凝膠重量至樣品干重的2000-3800％之間，所述樣品是典型水凝膠和26％至54％之間的水凝膠交聯重量。在24小時后實現完全水合狀態(tài)，更具體的是生物墨水和生物墨水+軟骨顆粒在5小時后完全水合，表明較快的溶脹動力學。在48小時后，單獨的生物墨水和含有顆粒的組合物的溶脹比之間的比較表明對顆粒類型的依賴性。實施例4d：生物墨水相容性使用生物墨水+ha研究細胞生物打印過程，以排除顆粒和細胞之間的所有相互作用和增殖誘因。打印一層厚的圓盤，以評估打印后的細胞存活(圖13a)，將其與混合前的細胞的初始存活進行比較。為了研究大結構中的細胞存活，打印了一個年輕人尺寸的鼻子(3.1厘米、2.6厘米和1.5厘米)，并保持在靜態(tài)培養(yǎng)物中，直到從中央切片(最小擴散距離為5mm)評價構建體中間的細胞存活。使用顆粒的生物打印在打印3小時后顯示出80％的存活，然而，在4天后，細胞存活恢復至97％，其保持直到實驗結束。年輕人尺寸的鼻子移植物在支架的中心相比周邊96％的生存(圖13b)生存降低(在第7天為60％的活細胞)。這表明需要引入內部孔隙或渠道以增強營養(yǎng)運輸。通過將互連孔隙引入1.5厘米高的立方體，結構中心的存活與外圍一樣高?？梢酝ㄟ^將移植物內的支持聚合物擠出而將這種營養(yǎng)通道或工程化孔隙加入到生物打印結構中，所述支持聚合物隨后可以在后續(xù)洗滌/交聯步驟中被清除。使用這種技術，可以創(chuàng)建一個復雜的3d互連多孔網絡，用于使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基灌注移植物。為了進一步增強營養(yǎng)物的物質傳遞，移植物也可以在動態(tài)生物反應器中進行預處理。在培養(yǎng)21天的鑄造凝膠中評價軟骨顆粒和生長因子(在這種情況下為tgf-β3)補充對細胞增殖的作用。單獨的生物墨水沒有刺激細胞增殖；實際上在第7天dna損失緩慢恢復。另一方面，生物墨水+軟骨顆粒刺激增殖，并在21天內引起dna的統計學顯著增加(p<0.001)。補充tgf-β3的情況下，在第7天含有軟骨顆粒的樣品中dna統計學顯著增加(p<0.001)。在第21天，兩種生物模式顯示出dna的增加，這兩者之間沒有統計學意義上的顯著差異。實施例4e：細胞外基質產生和軟骨形成在培養(yǎng)基中3周和8周后，用組織學和免疫染色評估單獨生物墨水和生物墨水+軟骨顆粒中軟骨細胞外基質的制造。3周后的組織學評估顯示，補充有tgf-β3(10ng/ml)的兩種生物墨水組合物中細胞數量、gag合成和膠原蛋白ii產生明顯增加。此外，在3和8周的h&e染色中清楚可見，沒有生長因子的生物墨水+軟骨顆粒相比單獨的生物墨水更多地刺激細胞增殖。在兩個時間點，生物墨水+軟骨顆粒顯示alcian藍色染色輕微增加，并且在8周時間點觀察到輕微的膠原蛋白ii染色，表明需要額外的生長因子刺激。經?？吹郊毎跊]有生長因子補充的顆粒周圍增殖，這表明細胞-顆粒粘附和/或顆粒中的生長因子是重要的。然而，因為在具有tgf-β3樣品的生物墨水+軟骨顆粒中，沒有觀察到位點特異性增殖，所以結果表明相反，顆粒是有絲分裂生長因子的來源，而不是特定的細胞-基質粘合劑誘發(fā)。8周后，支架的總體外觀表明，生長因子刺激對軟骨基質產生具有明顯的影響，因為觀察到不透明的外觀和尺寸的增加。在8周時，兩種補充的生物墨水組合物顯示軟骨ecm組分顯著增加，并且具有已經開始類似于天然軟骨的細胞密度和gag含量的區(qū)域。此外，在生長因子補充條件下，在整個移植物中膠原ii沉積強烈，而在沒有tgf-β3的培養(yǎng)物中僅觀察到細胞周圍染色。在生物墨水+軟骨顆粒和tgf-β3補充條件中膠原蛋白i，表明一些纖維軟骨產生，這可能是由于細胞的傳代。在所有情況下，鈣化不存在，表明軟骨細胞的軟骨表型是穩(wěn)定的。實施例4f：磁共振成像為了評估打印結構的形狀保留，評估了幾種mri技術。將打印的鼻子保存在pbs中2周，以確保在t2加權mr成像之前完全溶脹。將這些圖像閾值化并轉換成.stl文件，并與用于打印的原始模型和打印后的軟骨移植物進行比較。原始模型和打印移植物的比較說明了精確的材料擠出和詳細的結構。然而，與原始模型相比，觀察到稍厚的鼻孔壁。此外，當比較兩個星期溶脹后的打印結構與mri模型時，觀察到鼻孔壁略微增厚，然而，沒有檢測到降解或形狀惡化的跡象。實施例5：生物打印工藝參數可再現打印過程的一個重要因素是連續(xù)線的連接性。為了評估線間距的影響，必須進行線厚度的優(yōu)化。測試壓力、進料速率和針頭直徑等打印參數，將線的厚度標準化為900μm±53μm。在確定平均線厚度之后，通過打印具有不同線間距的一系列拉伸試驗啞鈴來研究有效線粘附。啞鈴被拉伸測試直到破損，數據表明，通過增加線間距，結構缺陷的可能性增加，表明為了向打印結構提供可重現的機械性能，線應重疊約40-50％。數據表明，破損時極限應力的變化在重疊線的數量下降到20％的測試樣品中沒有差異，而穩(wěn)定性不足以進行測試的樣品數量隨線間距的增加而增加。根據數據，最佳線間距受討論中的生物墨水的，但是通過增加重疊，內部打印過程相關缺陷的可能性減少。此外，可以通過改變工藝參數如壓力、打印速度和針頭直徑來自由選擇線條厚度。對新設計的生物墨水進行了數次機械測試，以研究影響結構和機械性能重現性的參數。用不同打印方向和載有細胞的生物墨水打印的試樣的拉伸評估揭示了通過加入4×106的接種密度的細胞將不改變楊氏模量、極限應力和破損應變，說明細胞的體積分數(約1％)由結實的周圍基質補償。此外，啞鈴狀試樣相對于張力在不同的打印方向上打印，即平行于張力(0°)、垂直于張力(90°)和與張力成45°角(45°)。打印方向在組之間沒有顯示任何統計學上的顯著差異，表明可以基于打印和工藝相關參數而不是基于最終結構的估計機械載荷來設計生物打印結構。當前第1頁12