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hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用

文檔序號:10478843閱讀:590來源:國知局
hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法,該制備方法使用0.125mm3大小的透明軟骨顆粒,對hBMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后,制備hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物,用于修復(fù)軟骨表面的缺損,可以同時重建堅強(qiáng)的軟骨下骨支撐,又可以恢復(fù)完整平滑的關(guān)節(jié)軟骨表面,可以填充軟骨下骨小梁間隙,并可與毗鄰的缺損形成無縫隙連接。透明軟骨顆粒的存在可以在修復(fù)組織內(nèi)形成模擬正常的部分軟骨細(xì)胞外基質(zhì),以及部分正常的軟骨細(xì)胞,有利于加速重建過程,并增強(qiáng)表面的修復(fù)組織強(qiáng)度,采用的hBMSCs可以可起到雙重作用,可延緩關(guān)節(jié)面的磨損和臨近關(guān)節(jié)面的退變。
【專利說明】hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]關(guān)節(jié)內(nèi)骨軟骨復(fù)合缺損和損傷是臨床常見疾病且難以治療,骨軟骨復(fù)合組織缺損是指同時包含關(guān)節(jié)面軟骨組織缺損和軟骨下骨缺損的復(fù)合式缺損,透明軟骨組織缺乏自我修復(fù)能力,將導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的結(jié)局。目前常用的治療方式有軟骨下骨鉆孔、微骨折、自體或異體軟骨移植以及軟骨細(xì)胞移植,組織工程軟骨組織移植等。都存在著修復(fù)能力有限、修復(fù)組織為纖維軟骨成分,無法同時修復(fù)軟骨下骨缺損,修復(fù)組織機(jī)械強(qiáng)度不足,疾病傳播、供區(qū)有限、步驟繁瑣、費(fèi)用昂貴等不足且并發(fā)癥多。目前國內(nèi)外治療骨軟骨復(fù)合組織缺損的現(xiàn)狀是尚無能同時滿足軟骨下骨支撐和光滑軟骨面的理想方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在臨床上治療關(guān)節(jié)內(nèi)骨軟骨復(fù)合組織損傷或缺損的關(guān)鍵因素在于既能重建堅強(qiáng)的軟骨下骨支撐,又能再造光滑的關(guān)節(jié)軟骨面,這樣才能獲得良好的效果。傳統(tǒng)的方法如同種異體軟骨移植、軟骨下骨鉆孔、微骨折、組織工程等單一方法都有各種并發(fā)癥和缺陷,影響著這種常見疾病的治療效果。為此,本發(fā)明提出一種hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法及其應(yīng)用,該方法制備的復(fù)合物在制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損中的應(yīng)用,用于組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損,方便臨床應(yīng)用。
[0005]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法,該制備方法使用
0.125_3大小的透明軟骨顆粒。
[0006]上述hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法具體采用以下步驟:
(1)同種異體或自體透明軟骨顆粒的制備:
將切取的自體關(guān)節(jié)內(nèi)非負(fù)重區(qū)股骨遠(yuǎn)端滑車溝兩側(cè)的透明軟骨或同種異體透明軟骨切成0.125mm3大小的顆粒狀;
(2)hBMSCs(自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的誘導(dǎo)液培養(yǎng):
髂嵴部位消毒后,用肝素預(yù)處理過的16號穿刺針于髂嵴處穿刺抽取骨髓20ml,置于含有15ml條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液(α—MEM培養(yǎng)基,內(nèi)含終濃度為10%胎牛血清,100 u/ml青霉素鈉,100yg/ml鏈霉素、20ng/ml hIGF_l、10 ng/ml hTGFUOng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml),和104U/ml終濃度的肝素的液體中混勻;分3部分接種于1cm培養(yǎng)皿,37 °C、5 %CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng);第5日首次換液去除大部分未貼壁的細(xì)胞,之后隔日換液一次;15?20d細(xì)胞長至接近80 %融合時傳代;傳代方法:0.25%胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合液,370C消化3min;細(xì)胞變圓,透亮度和細(xì)胞間隔增大后,加入DMEM培養(yǎng)基5ml終止消化,離心收集細(xì)胞懸液;PBS洗滌一次細(xì)胞,細(xì)胞沉淀稀釋至5 X 105/ml接種培養(yǎng);
(3)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備:
消化收集hBMSCs,將5 X 17細(xì)胞以I ml 1.2%藻酸鈉充分懸浮,加入5g透明軟骨顆粒攪拌均勻;37°C培養(yǎng)箱內(nèi)保存?zhèn)溆?使用時20ml注射器內(nèi)吸入hBMSCs/藻酸鈉/透明軟骨顆粒懸液,另一個注射器吸入終濃度為102mM CaCl2,同時向缺損內(nèi)注入,靜置15min使凝膠充分交聯(lián),吸棄多余液體;
(4)軟骨下骨重建:
對于軟骨面缺損而軟骨下骨量尚可但有硬化情況,將原有硬化的軟骨下骨鑿出,制備成約Imm3大小的骨粒,混合同樣大小的自體骨粒,或骨替代制品如硫酸鈣、磷酸三鈣等,打壓入原有缺損處,使新形成的骨面超出毗鄰關(guān)節(jié)軟骨面1.5-2mm高度。如軟骨下骨量明顯不足,僅適用自體骨粒,或骨替代制品進(jìn)行軟骨下骨打壓植骨。同時根據(jù)擬修復(fù)缺損的大小,切取關(guān)節(jié)內(nèi)非負(fù)重區(qū)如滑車溝兩側(cè)的透明軟骨備用。
[0007](5)軟骨面的重建:
在重建的軟骨下骨的表面,均勻涂抹上述制備的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-透明軟骨顆粒-藻酸鈣凝膠復(fù)合物,使最終形成的表面高于臨近關(guān)節(jié)軟骨面0.5mm。
[0008]該制備方法使用0.125mm3大小的透明軟骨顆粒作為修復(fù)骨軟骨復(fù)合缺損的成分,使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物修復(fù)骨軟骨復(fù)合缺損,對骨軟骨復(fù)合組織缺損的軟骨下骨缺損進(jìn)行Imm3大小顆粒骨打壓植骨重建。
[0009]上述自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法制得的復(fù)合物在制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損中的應(yīng)用,該治療方法是一種組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損的方法。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
本發(fā)明的hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物,首次提出用于制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損的藥物,利用組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損的方法,可以一期或者二期同時重建堅強(qiáng)的軟骨下骨支撐,又可以恢復(fù)完整平滑的關(guān)節(jié)軟骨表面,且修復(fù)重建的表面為透明軟骨表面,其耐磨性和生物力學(xué)性能接近正常軟骨。注射覆蓋的方法可以填充軟骨下骨小梁間隙,并可與毗鄰的缺損形成無縫隙連接,在加強(qiáng)軟骨下支撐強(qiáng)度的同時可以重塑平滑表面。透明軟骨顆粒的存在可以在修復(fù)組織內(nèi)形成模擬正常的部分軟骨細(xì)胞外基質(zhì),以及部分正常的軟骨細(xì)胞,有利于加速重建過程,并增強(qiáng)表面的修復(fù)組織強(qiáng)度。采用的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在軟骨下骨的環(huán)境中分化為骨樣細(xì)胞,在軟骨表面的關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境中分化為軟骨細(xì)胞,并且在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的環(huán)境中更有利于向軟骨細(xì)胞分化,如此可起到雙重作用。發(fā)揮正常關(guān)節(jié)軟骨面的功能,可延緩關(guān)節(jié)面的磨損和臨近關(guān)節(jié)面的退變,延緩或阻止骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0012]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;诒景l(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013]本實(shí)施例針對在臨床上治療關(guān)節(jié)內(nèi)骨軟骨復(fù)合組織損傷或缺損的傳統(tǒng)方法存在各種并發(fā)癥和缺陷的問題,提出一種hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法,該制備方法制得的復(fù)合物用于制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損,既能重建堅強(qiáng)的軟骨下骨支撐,又能再造光滑的關(guān)節(jié)軟骨面,取得了良好的效果。具體來講,
一種hBMSCs /透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法,具體采用以下步驟:
(1)同種異體或自體透明軟骨顆粒的制備:
將切取的自體關(guān)節(jié)內(nèi)非負(fù)重區(qū)股骨遠(yuǎn)端滑車溝兩側(cè)的透明軟骨或同種異體透明軟骨切成0.125mm3大小的顆粒狀;
(2)hBMSCs(自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的誘導(dǎo)液培養(yǎng):
髂嵴部位消毒后,用肝素預(yù)處理過的16號穿刺針于髂嵴處穿刺抽取骨髓20ml,置于含有15ml條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液(α—MEM培養(yǎng)基,內(nèi)含終濃度為10%胎牛血清,100 u/ml青霉素鈉,100yg/ml鏈霉素、20ng/ml hIGF_l、10 ng/ml hTGFUOng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml),和104U/ml終濃度的肝素的液體中混勻;分3部分接種于1cm培養(yǎng)皿,37 °C、5 %CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng);第5日首次換液去除大部分未貼壁的細(xì)胞,之后隔日換液一次;15?20d細(xì)胞長至接近80 %融合時傳代;傳代方法:0.25%胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合液,370C消化3min;細(xì)胞變圓,透亮度和細(xì)胞間隔增大后,加入DMEM培養(yǎng)基5ml終止消化,離心收集細(xì)胞懸液;PBS洗滌一次細(xì)胞,細(xì)胞沉淀稀釋至5 X 105/ml接種培養(yǎng);
(3)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備:
消化收集hBMSCs,將5 X 17細(xì)胞以I ml 1.2%藻酸鈉充分懸浮,加入5g透明軟骨顆粒攪拌均勻;37°C培養(yǎng)箱內(nèi)保存?zhèn)溆?使用時20ml注射器內(nèi)吸入hBMSCs/藻酸鈉/透明軟骨顆粒懸液,另一個注射器吸入終濃度為102mM CaCl2,同時向缺損內(nèi)注入,靜置15min使凝膠充分交聯(lián),吸棄多余液體;
(4)軟骨下骨重建:
對于軟骨面缺損而軟骨下骨量尚可但有硬化情況,將原有硬化的軟骨下骨鑿出,制備成約Imm3大小的骨粒,混合同樣大小的自體骨粒,或骨替代制品如硫酸鈣、磷酸三鈣等,打壓入原有缺損處,使新形成的骨面超出毗鄰關(guān)節(jié)軟骨面1.5-2mm高度。如軟骨下骨量明顯不足,僅適用自體骨粒,或骨替代制品進(jìn)行軟骨下骨打壓植骨。同時根據(jù)擬修復(fù)缺損的大小,切取關(guān)節(jié)內(nèi)非負(fù)重區(qū)如滑車溝兩側(cè)的透明軟骨備用。
[0014](5)軟骨面的重建:
在重建的軟骨下骨的表面,均勻涂抹上述制備的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-透明軟骨顆粒-藻酸鈣凝膠復(fù)合物,使最終形成的表面高于臨近關(guān)節(jié)軟骨面0.5mm。
[0015]上述自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法制得的復(fù)合物在制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損中的應(yīng)用,該治療方法是一種組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損的方法。該制備方法使用0.125mm3大小的透明軟骨顆粒作為修復(fù)骨軟骨復(fù)合缺損的成分,使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物修復(fù)骨軟骨復(fù)合缺損,對骨軟骨復(fù)合組織缺損的軟骨下骨缺損進(jìn)行Imm3大小顆粒骨打壓植骨重建。
[0016]
組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損的方法重建動物骨軟骨復(fù)合缺損模型:
一、動物分組:成年山羊24只,體重18kg?25kg,按體重隨機(jī)分為3組。組I (修復(fù)組):組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損;組11: hBMSCs組:僅將hBMSCs復(fù)合藻酸鈣凝膠修復(fù)骨軟骨缺損;組II1:對照組:制造缺損不修復(fù)。
[0017]二、動物自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/纖維蛋白凝膠復(fù)合物的制備:無菌條件下穿刺抽取山羊骨髓20ml,置于含有15ml條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液(α — MEM培養(yǎng)基,內(nèi)含終濃度為10%胎牛血清,100 u/ml青霉素鈉,100yg/ml鏈霉素、20ng/ml hIGF_l、10 ng/mlhTGF-0、2Ong/ml hBMP-2、地塞米松40 ng/ml),和104U/ml終濃度的肝素的液體中混勻。接種于1cm培養(yǎng)皿。37 °C、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),15?20d細(xì)胞長至接近80 %融合時傳代。消化收集hBMSCs,將5X 17細(xì)胞以I ml人纖維蛋白原溶液充分懸浮,加入5g透明軟骨顆粒攪拌均勻。37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>[0018]三、動物手術(shù):山羊肌注速眠新0.lml/kg麻醉后,常規(guī)消毒鋪單,取膝關(guān)節(jié)正中切口,長約7cm,依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜,髕旁內(nèi)側(cè)入路將髕骨向外側(cè)翻開,顯露股骨滑車及股骨髁。用特制的6_直徑空心鉆鉆取深為6mm的骨軟骨缺損,填塞止血。自動物髂嵴取自體松質(zhì)骨粒,混合以磷酸三鈣顆粒,打壓入原有缺損處,使新形成的骨面超出毗鄰關(guān)節(jié)軟骨面Imm高度。在重建的軟骨下骨的表面,均勻涂抹上述制備的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-透明軟骨顆粒纖維蛋白凝膠復(fù)合物,使最終形成的表面高于臨近關(guān)節(jié)軟骨面0.5mm。沖洗關(guān)節(jié)腔后,徹底止血,修復(fù)離斷的肌肉、韌帶及筋膜組織,逐層關(guān)閉切口。
[0019]四、術(shù)后檢測:
I.大體觀察:術(shù)后4周、8周、16周分別切開關(guān)節(jié)進(jìn)行大體觀察修復(fù)效果。
[0020]2.組織學(xué)檢查:取各周組修復(fù)組織標(biāo)本,2 %甲醛液脫鈣,水充分沖洗后,石蠟包埋切片行如下染色檢查:
(I )HE染色:切片常規(guī)梯度酒精入水,蒸餾水洗,蘇木素染色;水洗后鹽酸酒精分化,水洗后梯度脫水,伊紅溶液染色,依次過高濃度酒精,二甲苯透明兩次,封片鏡檢。
[0021](2)甲苯胺藍(lán)染色:切片梯度酒精入水,蒸餾水漂洗,甲苯胺藍(lán)乙醇溶液染色12?15min,水浸洗后95%酒精分化適當(dāng);100%酒精脫水兩次;二甲苯透明兩次;封片鏡檢。
[0022](3)Masson’ s三色染色:石蠟切片脫蠟;蒸餾水洗;哈里斯氏明礬蘇木精染色10?20min;蒸餾水洗變藍(lán);酸性復(fù)紅、麗春紅、橙黃G稀釋液5 min;0.2%醋酸水略洗;5%磷鎢酸液分化媒染5 min;0.2%醋酸水略洗;亮綠液5 min;0.2%醋酸水略洗;脫水、透明、封片鏡檢。
[0023](4)脫鈣石蠟切片Π型膠原免疫組化染色:取標(biāo)本后,10 %甲醛固定48h ;水洗,10 %甲酸脫鈣;5 %Na2S04浸泡48h ;水洗后入70 %酒精,丙酮固定,入二甲苯兩次;石蠟包埋切片按試劑盒操作說明行II型膠原免疫組化染色。以不加一抗作為空白對照,正常關(guān)節(jié)軟骨作為陽性對照。
[0024]3.電鏡觀察:取16周修復(fù)組織,進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡檢查。
[0025]透射電鏡觀察:2%戊二醛I3BS固定液4°C前固定2h;PBS緩沖液漂洗2次X 1min;I %鋨酸PBS固定液后固定2h; PBS緩沖液漂洗1min X 2次;30 %?50 %?70 %乙醇逐級脫水;70 %乙醇含醋酸雙氧鈾4 °C快染;80 %?95 %?100 %乙醇梯度脫水;環(huán)氧丙烷置換1min X 2次;618包埋后,LKB V型超薄切片機(jī)切片;枸櫞酸鉛染色液染色;H— 500透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。
[0026]掃描電鏡觀察:切取組織用4cCI3BS洗滌2次,2 %戊二醛磷酸緩沖液中前固定24h,I %鋨酸后固定2h,乙醇逐級脫水,醋酸異戊酯置換,臨界點(diǎn)干燥(HITACHI,HCP — 2),粘附于載物臺上,BAL — TEC離子濺射,在QUANTA—200掃描電鏡(Philip Holland)上觀察修復(fù)組織表面形態(tài)。
[0027]4.修復(fù)組織蛋白聚糖含量測定:切取16周各組標(biāo)本正常軟骨及修復(fù)軟骨組織,用愛茜藍(lán)法測定其中蛋白聚糖(glycosaminoglycans,GAG)含量。同時測定正常軟骨中蛋白聚糖含量與之相比較。稱取50mg組織,加裂解液(50mmol/L Tris.Cl PH=8.0、150mmol/LNaCl、100mg/L苯基甲基磺酰氯、lmg/L抑蛋白酶肽、1%吐溫一 20、0.5%去氧膽酸鈉、0.1%SDS)研磨至成糜狀,一60°C凍干,凍干產(chǎn)物以Iml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解。取50μ1樣本與50μ18mol/L GnCl混勻。依次加入50μ1 溶液I (0.054 mol/L H2SO4、0.75%Triton XlOO )、750μ?溶液 2 (5ml愛茜藍(lán)貯液中加入1.0ml 1.8 mol/L H2S04、8.0ml 8mol/L GnCU2.5ml10% Triton XlOO,最后加ddH20定容至100ml ),振蕩混勻,4°C反應(yīng)Ih。離心后加入750μI 二甲基亞砜(DMSO)洗液(40%01^0、0.0511101/1^%(:12)室溫振洗301^11,離心后以10(^1溶解液(4.0mol/LGnCl、33%異丙醇)重溶愛茜藍(lán)一蛋白聚糖沉淀復(fù)合物,移入96孔板中,酶標(biāo)儀在600nm波長處測定吸光值。各樣本至少檢測3次,以ddH20作為空白對照,裂解液作為陰性對照。結(jié)果采用t檢驗(yàn)。制作硫酸軟骨素(CS)標(biāo)準(zhǔn)曲線:將CS貯液(0.5 g/L)梯度稀釋至1、2、
10、20、30、40g/L,愛茜藍(lán)法檢測吸光值,標(biāo)準(zhǔn)曲線在相同條件下重復(fù)3次。
[0028]5.X—ray觀察:取16周實(shí)驗(yàn)組和對照組山羊完整膝關(guān)節(jié)攝前后位X線片觀察骨軟骨柱愈合情況。
[0029]6.MRI觀察:取16周各組標(biāo)本行MRI成像檢測缺損修復(fù)情況。
[0030]7.統(tǒng)計分析:使用SAS 6.12統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn),p〈0.05選定為有顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
[0031]五、結(jié)果分析。
[0032]1.動物術(shù)后均無感染,傷口愈合良好。術(shù)后4小時山羊自行飲水,第二天可自主進(jìn)食。動物不行外固定,自由籠中活動。手術(shù)肢體可部分負(fù)重,第4?5天可完全負(fù)重。
[0033]2.大體觀察:4周時:修復(fù)組:骨軟骨缺損表面較光整,充填以色白質(zhì)韌的新生軟骨樣組織,分布不均,質(zhì)地較堅韌。hBMSCs組:骨軟骨缺損大部分未被充填,部分缺損充填以暗灰色質(zhì)軟組織,缺損界限可分辨。對照組:缺損存在,無明顯修復(fù)跡象,周緣軟骨面輕度壓陷,形成“火山口”樣變化,缺損底部覆蓋有薄層深紅色纖維肉芽組織,質(zhì)軟。8周時:修復(fù)組:骨軟骨缺損被完全填充修復(fù),新生組織顏色及質(zhì)地接近正常軟骨,表面平滑,色白質(zhì)硬。hBMSCs組:缺損基底覆蓋暗紅色再生組織,質(zhì)軟。對照組:缺損無明顯修復(fù),周緣軟骨壓陷加劇,局部軟骨面變黃軟化,缺損底部覆蓋有薄層結(jié)締組織,色暗紅,質(zhì)軟,缺損對側(cè)脛骨平臺部分關(guān)節(jié)面磨損,軟骨變薄。16周時:修復(fù)組:骨軟骨缺損處的關(guān)節(jié)面平滑,新生軟骨組織色白質(zhì)硬,類似于正常軟骨。hBMSCs組:缺損大部分仍存在,局部髁部關(guān)節(jié)面稍變平。對照組:缺損稍縮小,局部髁關(guān)節(jié)面變平,周圍軟骨壓陷明顯,軟骨退變,底部有薄層色暗紅的結(jié)締組織,質(zhì)軟,缺損對側(cè)脛骨平臺面軟骨磨損嚴(yán)重,遺留輕度跛行。
[0034]3.組織學(xué)觀察:修復(fù)組:光鏡觀察可見修復(fù)組織新生軟骨細(xì)胞排列規(guī)整,相對密集,甲苯胺藍(lán)染色與毗鄰軟骨類似,形成的表面較平滑,基質(zhì)著色深,高倍鏡可見基底部細(xì)胞分布均勻,排列密集,胞核較大,細(xì)胞外基質(zhì)分布均一,甲苯胺藍(lán)著色較深。II型膠原免疫組化染色可見修復(fù)組織基質(zhì)有深棕黃色著色,分布均勻,細(xì)胞排列規(guī)整。掃描電鏡觀察可見16周時修復(fù)的骨軟骨表面平滑光整,纖維排列規(guī)則;對新生軟骨橫斷面掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)纖維排列規(guī)則,纖維間縫隙為致密的細(xì)胞外基質(zhì)填充。透射電鏡觀察移植軟骨存在同源軟骨細(xì)胞群,細(xì)胞突起較多,細(xì)胞器豐富,細(xì)胞周圍膠原纖維排列規(guī)整ABMSCs組:缺損大部分仍存在,部分修復(fù)組織細(xì)胞排列密集,細(xì)胞外基質(zhì)分布欠均勻。對照組:缺損存在,無明顯修復(fù)現(xiàn)象,缺損基底部覆蓋有薄層纖維結(jié)締組織,甲苯胺藍(lán)無著色,毗鄰軟骨層甲苯胺藍(lán)著色淺,部分軟骨層裂。
[0035]4.軟骨蛋白聚糖含量測定:結(jié)果正常軟骨中GAG含量為18.62 ± 1.35mg/g;修復(fù)組織為 14.95 ± I.30mg/g ; hBMSCs組為6.85 ± 0.95mg/g ;對照組為I.60 ± 0.90mg/g。各組間比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.05)。
[0036]5.X線觀察:在術(shù)后16周修復(fù)組可見軟骨下骨愈合良好,內(nèi)外髁對稱,相對關(guān)節(jié)面平滑;hBMSCs組和對照組則仍可見骨質(zhì)缺損,相對關(guān)節(jié)面有局部骨質(zhì)硬化現(xiàn)象。
[0037]6.MRI觀察:矢狀位T2WI觀察修復(fù)組軟骨下骨質(zhì)信號均一,軟骨層厚度均一,較平滑光整,信號一致。hBMSCs組和對照組股骨髁處可見深達(dá)軟骨下骨質(zhì)的大片局部信號增高區(qū),軟骨層缺失,邊緣軟骨層變薄,信號減低。
[0038]由上述對成年山羊骨軟骨復(fù)合缺損的不同分組的實(shí)驗(yàn)分析,可見采用本發(fā)明的組合式修復(fù)骨軟骨復(fù)合組織缺損的方法術(shù)后效果最好,既能重建堅強(qiáng)的軟骨下骨支撐,又能恢復(fù)完整平滑的關(guān)節(jié)軟骨表面,且修復(fù)重建的表面為透明軟骨表面,其耐磨性和生物力學(xué)性能接近正常軟骨。
[0039]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案,而非對其限制;盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改,或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或者替換,并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項】
1.一種hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法,其特征在于,該制備方法使用0.125_3大小的透明軟骨顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法,其特征在于具體采用以下步驟: (1)同種異體或自體透明軟骨顆粒的制備: 將切取的自體關(guān)節(jié)內(nèi)非負(fù)重區(qū)股骨遠(yuǎn)端滑車溝兩側(cè)的透明軟骨或同種異體透明軟骨切成0.125mm3大小的顆粒狀; (2)hBMSCs的誘導(dǎo)液培養(yǎng): 髂嵴部位消毒后,用肝素預(yù)處理過的16號穿刺針于髂嵴處穿刺抽取骨髓20ml,置于含有15ml條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液,α—MEM培養(yǎng)基,內(nèi)含終濃度為10%胎牛血清,100 u/ml青霉素鈉,100yg/ml鏈霉素、20ng/ml hIGF_l、10 ng/ml hTGFUOng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml,和104U/ml終濃度的肝素的液體中混勻;分3部分接種于1cm培養(yǎng)皿,37°C、5 %CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng);第5日首次換液去除大部分未貼壁的細(xì)胞,之后隔日換液一次;15?20d細(xì)胞長至接近80 %融合時傳代;傳代方法:0.25%胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合液,370C消化3min;細(xì)胞變圓,透亮度和細(xì)胞間隔增大后,加入DMEM培養(yǎng)基5ml終止消化,離心收集細(xì)胞懸液;PBS洗滌一次細(xì)胞,細(xì)胞沉淀稀釋至5 X 105/ml接種培養(yǎng); (3 )hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備: 消化收集hBMSCs,將5 X 17細(xì)胞以I ml 1.2%藻酸鈉充分懸浮,加入5g透明軟骨顆粒攪拌均勻;37°C培養(yǎng)箱內(nèi)保存?zhèn)溆?使用時,20ml注射器內(nèi)吸入hBMSCs/藻酸鈉/透明軟骨顆粒懸液,另一個注射器吸入終濃度為102mM CaCl2,同時向缺損內(nèi)注入,靜置15min使凝膠充分交聯(lián),吸棄多余液體,得hBMSCs/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物。3.上述權(quán)利要求1或2所述自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/透明軟骨顆粒/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備方法制得的復(fù)合物在制備治療骨軟骨復(fù)合組織缺損中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/50GK105833348SQ201610241144
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】張海寧, 冷萍
【申請人】青島大學(xué)附屬醫(yī)院
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