本發(fā)明涉及制備基于無機(jī)聚磷酸鹽(聚p)和磷酸鈣或碳酸鈣的顯示成骨活性的非晶形、納米顆粒材料或微粒材料的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明人顯示非晶形聚磷酸鈣(ca-聚p)微?？捎糜阝伜辖鸨砻娴纳锕δ芑?。本發(fā)明的方法允許在鈦氧化的ti-6al-4v支架上制造耐久且穩(wěn)定的、幾乎均勻且具有形態(tài)發(fā)生活性的ca-聚p層，與生物惰性的非改性鈦表面相比，其支持骨細(xì)胞的生長并增強(qiáng)骨細(xì)胞的功能活性。優(yōu)選的方面涉及在低濃度聚磷酸鈉(na-聚p)的存在下形成非晶形磷酸鈣(cap)顆粒。這種材料導(dǎo)致參與骨形成的蛋白的表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)。本發(fā)明的另一方面涉及含有聚p穩(wěn)定的acc和少量球霰石的材料，該材料在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示成骨活性并支持植入?yún)^(qū)域的再生。本發(fā)明的非晶形材料具有用于骨植入物的潛力。

背景技術(shù)：

除了膠原蛋白和水之外，骨骼的基本構(gòu)成塊還包含碳酸化磷灰石[ca5(po4，co3)3(oh)]以及羥基磷灰石(ha)。結(jié)晶礦物質(zhì)可能由非晶形磷酸鈣(acp)形成(wangy,etal.(2013)water-mediatedstructuringofboneapatite.natmater12:1144-1153)。

最近的證據(jù)表明非晶形碳酸鈣(acc)作為用于形成acp和碳酸化磷灰石的生物種子，其是由碳酸酐酶(ca)，很可能是由可溶性ca-ii同種型和/或細(xì)胞膜相關(guān)ca-ix形成的材料(wangxh,etal.(2014)modulationoftheinitialmineralizationprocessofsaos-2cellsbycarbonicanhydraseactivatorsandpolyphoshate.calciftissueint94:495-509；müllerweg,etal.mineralizationofbone-relatedsaos-2cellsunderphysiologicalhypoxicconditions.febsj.2015oct10)。

acc是碳酸鈣最不穩(wěn)定的多晶型物，其存在于非晶形相和結(jié)晶相中；在三種主要的結(jié)晶多晶型物球霰石、霰石和方解石中，亞穩(wěn)態(tài)球霰石是結(jié)晶caco3的熱力學(xué)最不穩(wěn)定形式(meldrumfc,h(2008)controllingmineralmorphologiesandstructuresinbiologicalandsyntheticsystems.chemrev108:4332-4432)。

因此，可以將骨ha的形成細(xì)分為以下三個(gè)機(jī)械上不同的階段：

1.通過碳酸酐酶來酶促形成acc生物種子；

2.在acp形成下，通過磷酸鹽來非酶促交換碳酸鹽離子；和

3.將acp轉(zhuǎn)化為結(jié)晶相碳酸化磷灰石/ha。

acc作為潛在的誘導(dǎo)再生/支撐材料的應(yīng)用，受到acc本身不穩(wěn)定這一事實(shí)的阻礙。acc在體內(nèi)的穩(wěn)定性通過通常與mg²⁺結(jié)合的專門蛋白調(diào)節(jié)，而在體外條件下，非生物來源添加劑如可溶性聚羧酸鹽，還有mg²⁺、三磷酸鹽或聚磷酸鹽種類，將acc凍結(jié)到相對穩(wěn)定的相(kellermeierm,etal.(2010)stabilizationofamorphouscalciumcarbonateininorganicsilica-richenvironments.jamchemsoc132:17859-17866)。

相反，球霰石足夠穩(wěn)定以允許解離，反過來又可以作為骨再生的潛在離子緩沖系統(tǒng)，并且由此可以修改caco3向ha的轉(zhuǎn)化過程(r,etal.(2015)transformationofvateritenanoparticlestohydroxycarbonateapatiteinahydrogelscaffold:relevancetoboneformation.jmaterchemb3:7079-7089)。

最近，本發(fā)明人成功地制備了基于非晶形聚磷酸鹽(聚p)的微粒(müllerweg,etal.anewpolyphoshatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialsletters2015；148:163-166；müllerweg,etal.retinolencapsulatedintoamorphousca²⁺polyphoshatenanospheresactssynergisticallyinmc3t3-elcells.eurjpharmbiopharm2015；93:214-223)，該微粒不僅在成骨細(xì)胞系統(tǒng)上以合成代謝方式起作用，而且還為它們的靶細(xì)胞(如成骨細(xì)胞)提供代謝燃料，并引起細(xì)胞內(nèi)atp水平提高以及線粒體數(shù)量的增加(müllerweg,etal.amorphousca²⁺polyphoshatenanoparticlesregulatetheatplevelinbone-likesaos-2cells.jcellsci2015；128:2202-2207)。本發(fā)明人還在gb1420363.2中公開了這種生物相容性的、生物可降解的和具有生物活性的基于聚p的材料。在gb1420363.2中描述的微粒的大小，可以通過確定的pi：ca²⁺摩爾比來調(diào)節(jié)(müllerweg,etal.(2015)anewpolyphoshatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialslett148:163-166)。所形成的顆粒保持非晶形狀態(tài)，因此容易被堿性磷酸酶(alp)酶促水解。

聚p在血液中以相當(dāng)大的量存在并且較大程度存在血小板中，并且已經(jīng)被認(rèn)為是用于形成骨磷酸鈣沉積物的磷酸鹽來源。通過alp從該聚合物酶促去除正磷酸鹽，其可以用作骨礦化的供體。此前，發(fā)明人描述了聚p調(diào)節(jié)細(xì)胞特異性分化過程，例如用模型細(xì)胞系saos-2細(xì)胞將礦物沉積物形成到骨形成成骨細(xì)胞上，使用模型細(xì)胞系raw264.7，誘導(dǎo)alp以及使opg(骨保護(hù)素)：rankl(核因子κb配體的受體激活劑)的比例向合成代謝的成骨細(xì)胞途徑改變，并由此抑制破骨細(xì)胞的功能。此外，聚p誘導(dǎo)用于編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)和支架結(jié)構(gòu)纖維所成的系統(tǒng)膠原蛋白的基因。酶介導(dǎo)的骨形成中的現(xiàn)有技術(shù)和聚p的作用已被描述于，例如：

wangxh,hcandmüllerweg.enzymaticallysynthesizedinorganicpolymersasmorphogeneticallyactivebonescaffolds:applicationinregenerativemedicine.intrevcellmolbiol2014；313:27-77；

wangxh,etal.(2015)polyphoshateasametabolicfuelinmetazoa:afoundationalbreakthroughinventionforbiomedicalapplications.biotechnolj.doi:10.1002/biot.201500168；

müllerweg,etal.(2015)non-enzymatictransformationofamorphouscaco3intocalciumphosphatemineralafterexposuretosodiumphosphateinvitro:implicationsforinvivohydroxyapatiteboneformation.chembiochem16:1323-1332；和

müllerweg,etal.polyphoshate:amorphogeneticallyactiveimplantmaterialservingasmetabolicfuelforboneregeneration.macromolecbiosci2015；15:1182-1197。

因?yàn)楝F(xiàn)有材料的局限性(例如患者的長期固定期，植入物引起的感染等)，迫切需要新的骨植入材料。理想地，這些植入物必須遵循骨形成的自然過程的原理，允許受損骨組織的快速再生。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，發(fā)明人描述了聚p可以穩(wěn)定acc相。在本發(fā)明的方法中，在5％[w/w]的水平下，聚p顯著抑制acc轉(zhuǎn)化為結(jié)晶caco3，在10％[w/w]的百分比下，該聚合物幾乎完全阻斷了該過程。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是意想不到的。以前已經(jīng)報(bào)道，可以將摻有規(guī)定ca²⁺摩爾比的可溶性na-聚p加工成固體納米尺度的納米顆粒/微粒，其保持非晶形(müllerweg,etal.(2015)anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialsletters148:163-166；müllerweg,etal.(2015)retinolencapsulatedintoamorphousca²⁺nanospheresactssynergisticallyinmc3t3-e1cells.eurjpharmbiopharm93:214-223)。不能期望，ca-聚p可以作為亞穩(wěn)態(tài)acc的穩(wěn)定劑；另參見：gb1420363.2和gb1502116.5。

聚p作為骨細(xì)胞上的具有形態(tài)發(fā)生活性的無機(jī)分子，誘導(dǎo)其礦化(gb1420363.2、gb1502116.5、gb1403899.6)。在本申請中，發(fā)明人還顯示含有5％[w/w]或10％[w/w]聚p的caco3，在saos-2細(xì)胞以及人間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)中通過誘導(dǎo)alp和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bmp2)的基因表達(dá)而包含成骨潛能。更令人驚奇和意外的是，acc以“協(xié)同”方式增強(qiáng)了聚p對bmp2表達(dá)的刺激作用。此外，本發(fā)明人證明，本發(fā)明的acc/聚p混合材料是生物相容性的并且在體內(nèi)支持再生，使其成為用于骨替換/植入物的有希望的支架材料。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明人使用用于從氯化鈣和磷酸氫二銨開始制備cap的技術(shù)。在新穎的方法中，除了用10：6的特征性ca/p摩爾比制備ha之外，他們還制備了混合有各種量聚p的cap。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，含有>10重量％聚p的cap制品(相對于改性cap/ha沉積物)是非晶形的，而含有<10重量％聚p的cap/ha樣品由結(jié)晶相組成。發(fā)現(xiàn)所有樣品都支持骨細(xì)胞相關(guān)saos-2細(xì)胞的生長，但令人驚奇的是，只有含有10重量％(wt.％)的聚p的cap制品引起強(qiáng)的形態(tài)發(fā)生活性，如通過測量用于編碼alp和i型膠原蛋白的基因(骨和骨相關(guān)細(xì)胞分化的標(biāo)記基因)表達(dá)所確定的。基于這些結(jié)果，本發(fā)明的基于聚p/cap的材料可能有益于作為骨替代植入物的應(yīng)用。

此前，本發(fā)明人開發(fā)了在規(guī)定濃度cacl2存在下于環(huán)境條件下制備的基于聚p的材料。該材料由生物相容性的和生物可降解的球形非晶形顆粒組成。

現(xiàn)在發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可將這種以微粒范圍尺寸制備的具有生物活性的材料用于通過形成到硅烷偶聯(lián)劑aptms的ca²⁺離子橋接的ti-6a1-4v支架的表面包被層，如電子顯微鏡和元素分析(edx)方法所證明。該發(fā)現(xiàn)和包被層的高耐久性和穩(wěn)定性是出乎意料的，尤其是由于ca-聚p顆粒的微粒性質(zhì)。

ca-聚p包被的鈦合金的另一令人驚奇的特性是，其作為骨樣saos-2細(xì)胞生長的合適基底的特性，盡管其明顯降低的表面粗糙度不可能支持細(xì)胞附著，甚至更多，與未處理的鈦支架相比，其誘導(dǎo)這些細(xì)胞表達(dá)關(guān)鍵酶(碳酸酐酶ix(caix)和alp)的能力，所述酶參與啟動(dòng)酶誘導(dǎo)的骨礦物質(zhì)沉積。

基于它們的特性，本發(fā)明的包被的鈦支架是用于制備具有新穎的再生誘發(fā)特征的高精度植入物的有希望的材料，其可以以個(gè)體化的尺寸和形狀生產(chǎn)。

眾所周知，na-聚p容易螯合ca²⁺并形成不溶性沉淀。因此，可以預(yù)期，向cacl2和(nh4)2hpo4中加入na-聚p將導(dǎo)致非晶形ca-聚p和結(jié)晶cap(ha)礦物沉積物的共沉淀。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明人在沉淀過程中，與cacl2和(nh4)2hpo4(用于在水溶液中形成ha的底物)一起加入了增加濃度的na-聚p。令人驚奇和意外的是，他們發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)制備尺寸約為100nm的非晶形聚p/cap混合顆粒的情況下，10wt.％的聚p的含量防止了結(jié)晶ha的形成。以本發(fā)明這個(gè)方面為基礎(chǔ)的結(jié)果總結(jié)如圖1所示。

這一發(fā)現(xiàn)是重要的，因?yàn)橛捎诓焕奈锢?低溶解度)和機(jī)械特性(脆性)，即使是生物相容性的結(jié)晶ha，其應(yīng)用目前也僅限于粉末、包被層和多孔體以及非承重植入物(wangmc,etal.crystallinesize,microstructureandbiocompatibilityofhydroxyapatitenanopowdersbyhydrolysisofcalciumhydrogenphosphatedehydrate(dcpd).ceramicsintern2015；41:2999-3008)。如果cap可以在非晶形相中合成，則可以避免這些缺點(diǎn)。

本發(fā)明人證明，非晶形聚p/cap顆粒(縮寫：acap-聚p)結(jié)合細(xì)胞生長促進(jìn)活性顯示出不同的形態(tài)發(fā)生活性。他們發(fā)現(xiàn)acap-聚p引起兩個(gè)用于骨形成的標(biāo)記基因(i型膠原蛋白和alp)的強(qiáng)烈上調(diào)。acap-聚p的效力與ca-聚p相當(dāng)。

基于其引發(fā)形態(tài)發(fā)生活性的特性，本發(fā)明的acap-聚p顆粒提供了用作人造骨植入物的有希望的材料，其由生理代謝物/聚合物制備。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可通過聚p來穩(wěn)定亞穩(wěn)態(tài)acc相。在人骨中，acc形成為結(jié)晶碳酸化磷灰石/ha的前體。聚p用作非酶促碳酸鹽/磷酸鹽交換的磷酸鹽源。本發(fā)明人證明，關(guān)于caco3，在5％[w/w](稱為“ccp5”)的百分比時(shí)，聚p抑制acc向結(jié)晶caco3轉(zhuǎn)變，而在10％[w/w](稱為“ccp10”)時(shí)幾乎完全抑制。他們顯示兩種制品都是非晶形的，但也含有少量的球霰石，如通過xrd、ftir和sem分析所顯示的。

本發(fā)明人證明，與方解石相反，本發(fā)明的acc/聚p顆粒顯示成骨活性。它們誘導(dǎo)saos-2細(xì)胞以及人間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)中編碼alp的基因的表達(dá)，以及bmp2基因的表達(dá)。此外，在大鼠的體內(nèi)研究中，使用含有本發(fā)明的acc/聚p材料并插入動(dòng)物背部肌肉的plga微球體，本發(fā)明人證明包封的acc/聚p顆粒不僅是生物相容性的，而且還支持植入?yún)^(qū)域的再生。令人驚奇的是，與生物惰性方解石相比，含有少量球霰石的acc具有成骨潛力和優(yōu)異的特性?；谶@些特性，本發(fā)明的材料代表用于骨植入物的有希望的支架材料。

以下關(guān)于聚p的專利申請被認(rèn)為是相關(guān)的：gb1406840.7、gb1403899.6、wo2012/010520、gb1420363.2、gb1502116.5和gb1510772.5。

在gb1420363.2中，本發(fā)明人公開了制備由鈣-聚p微粒組成的材料的方法，該材料顯示出以下特性：(i)它是非晶形的，和(ii)在能夠礦化的細(xì)胞系統(tǒng)中具有生物活性。

結(jié)果也報(bào)道于：müllerweg,etal.anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialsletters2015；148:163-166；müllerweg,etal.retinolencapsulatedintoamorphousca²⁺polyphosphatenanospheresactssynergisticallyinmc3t3-e1cells.eurjpharmbiopharm2015；93:214-223；和müllerweg,etal.polyphosphate:amorphogeneticallyactiveimplantmaterialservingasmetabolicfuelforboneregeneration.macromolecbiosci2015；15:1182-1197。

在gb1420363.2中描述的材料的特性，優(yōu)于ha(也參見實(shí)施例)以及用于骨再生和修復(fù)的常規(guī)聚p制品(例如gb1406840.7和gb1403899.6)。

現(xiàn)在，本發(fā)明人成功地開發(fā)出通過其可以用聚p緊密地覆蓋鈦/鈦合金的步驟。在用hcl蝕刻后，金屬表面與aptms共價(jià)連接，之后ca-聚p顆?？梢酝ㄟ^ca²⁺離子鍵連接到所述表面(圖2)。

在金屬表面的本發(fā)明的聚p包被，證明是耐用的并且令人驚奇地穩(wěn)定。

aptms可以被其它硅烷偶聯(lián)劑代替，例如3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯。除了聚p之外，aptms另外的官能團(tuán)允許肽與硅烷包被的鈦表面結(jié)合。

與未處理的鈦圓片相當(dāng)高的表面粗糙度(最大約為7μm)相比，ti-ca-聚p圓片是平滑的，最大粗糙度為0.8μm。通常，與中等粗糙表面相比，細(xì)胞附著到非常光滑表面的程度較低(例如，huanghh,etal.effectofsurfaceroughnessofgroundtitaniumoninitialcelladhesion.biomoleng2004；21:93-97)。因此，出乎意料的是，在沒有任何圓片的對照試驗(yàn)中看到，聚p包被的圓片允許saos-2細(xì)胞以一定速率生長。

發(fā)明人顯示，在2天的孵育期后，在含有未處理的鈦圓片試驗(yàn)中的細(xì)胞死亡。這與在這段時(shí)間內(nèi)saos-2細(xì)胞密集地附著到ti-ca-聚p圓片并形成幾乎均勻的單細(xì)胞層的觀察結(jié)果形成鮮明對比。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，在ti-ca-聚p圓片上生長的細(xì)胞顯示細(xì)胞擴(kuò)散的表型形態(tài)，這是活性細(xì)胞代謝和細(xì)胞遷移的明顯標(biāo)志。

“關(guān)于”表示所示值的+/-10％。

本發(fā)明的另一方面涉及以下發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明的ca-聚p包被層能夠刺激骨形成細(xì)胞的功能活性，如通過在包被的金屬表面(與未處理的鈦表面相比)上生長的細(xì)胞中編碼碳酸酐酶ix(caix)和alp的轉(zhuǎn)錄物的增加的穩(wěn)態(tài)水平所證明(如用qrt-pcr定量的)。

酶ca參與骨形成的引發(fā)(形成caco3沉積物；müllerweg,etal.inductionofcarbonicanhydraseinsaos-2cells,exposedtobicarbonateandconsequencesforcalciumphosphatecrystalformation.biomaterials2013；34:8671-8680；wangxh,etal.enzyme-basedbiosilicaandbiocalcite:biomaterialsforthefutureinregenerativemedicine.trendsbiotechnol2014；32:441-447)。

alp是具有功能活性的礦物沉積而形成成骨細(xì)胞的確定標(biāo)志物(參見：wangxh,etal.bio-silicaandbio-polyphosphate:applicationsinbiomedicine(boneformation).curropinbiotechnol2012；23:570-578)。

本發(fā)明的數(shù)據(jù)顯示鈦氧化的ti-6a1-4v支架是用于體外骨樣saos-2細(xì)胞的惰性基底。如果包被具有形態(tài)發(fā)生活性的ca-聚p聚合物，則該金屬獲得生物功能特性。具有聚p的這種植入材料的生物功能化的進(jìn)展，不僅提供個(gè)體化植入物的制備，而且還提供了將硬而脆的金屬植入物的機(jī)械特性與較軟的骨骼及其周圍組織的機(jī)械特性相匹配的有利特性。

聚p的鏈長可以在約3個(gè)至約1000個(gè)磷酸鹽單元的范圍，優(yōu)選在約20個(gè)至約200個(gè)磷酸鹽單元的范圍，以及最優(yōu)選約40個(gè)磷酸鹽單元。

本發(fā)明方法中使用的ca-聚p微粒的優(yōu)選組成是化學(xué)計(jì)量比(磷酸鹽與鈣)為：0.1比1至50比1，優(yōu)選1比1至10比1，以及最優(yōu)選7比1。

盡管它們的直徑(0.2μm和3μm)在允許受體介導(dǎo)的胞吞作用(約50nm)的范圍之外，出人意料的是，ca-聚p微粒是具有生物活性的。

與通過常規(guī)技術(shù)制備的ca-聚p鹽相比，該聚p材料是生物可降解的，并且顯示出優(yōu)異的形態(tài)發(fā)生活性。

本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用/使用該方法來制備具有生物活性的鈦合金植入物。本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用/使用該方法來制備刺激成骨細(xì)胞活性的植入物。本發(fā)明方法的另一方面是，將ca-聚p包被的鈦合金表面和植入物與鎵鹽組合應(yīng)用/使用，以便利用它們在通過應(yīng)用本發(fā)明方法所制備的包被層上的增強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，鎵鹽(如硝酸鎵)增強(qiáng)了具有生物活性的ca-聚pti合金包被層對具有功能活性特征的成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)、穩(wěn)態(tài)水平的刺激作用。這一發(fā)現(xiàn)令人驚奇，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道鎵鹽只能通過破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收，但不影響或僅最低限度影響成骨細(xì)胞的基因表達(dá)和alp活性(verrone,etal.galliummodulatesosteoclasticboneresorptioninvitrowithoutaffectingosteoblasts.brjpharmacol2010；159:1681-1692)。

本發(fā)明的另一方面涉及令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即如果在通常導(dǎo)致結(jié)晶ha合成的步驟中，聚p以一定濃度存在，也可以制備與結(jié)晶ha相比具有優(yōu)異特性，并且實(shí)現(xiàn)與gb1420363.2中公開的聚p微粒幾乎相同的生物活性(形態(tài)發(fā)生活性、刺激骨相關(guān)基因表達(dá))的含有非晶形聚p的材料。

由本發(fā)明人開發(fā)的制備具有生物活性的非晶形聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)的本發(fā)明方法，包括以下步驟：

a)將聚p鹽的水溶液加入到磷酸鹽源的水溶液中；

b)將所得溶液加入到溶解的鈣鹽中；

c)將ph調(diào)節(jié)至堿性值，優(yōu)選約10；和

d)收集、洗滌和干燥數(shù)小時(shí)后，優(yōu)選在室溫下24小時(shí)后形成的所得沉淀。

聚p鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉(na-聚p)。如果聚p鹽的量高于5wt.％的聚p鹽，則形成本發(fā)明的聚p-取代的cap顆粒(acap-聚p)，稱為cap制品。作為實(shí)例，用10wt.％的聚p鹽的聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了最佳結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明方法制備的形成本發(fā)明聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)的cap成分的鈣鹽和磷酸鹽源，可以分別是氯化鈣(cacl2)和磷酸氫二銨[(nh4)2hpo4]]。

通過本發(fā)明方法制備的聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)獲得最佳結(jié)果，其中計(jì)算鈣鹽的量和用作磷酸鹽源的試劑的量以獲得ca/p摩爾比為10：6的cap。

聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)的平均尺寸可以在約20nm至約300nm的范圍，優(yōu)選在約70nm至約120nm的尺寸范圍。

本發(fā)明的另一方面涉及以下發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明的聚p-取代的cap顆粒(acap-聚p)能夠刺激骨形成細(xì)胞的功能活性，如通過在骨形成saos-2細(xì)胞中編碼i型膠原蛋白(col-i)和堿性磷酸酶(alp)的轉(zhuǎn)錄物的增加的穩(wěn)態(tài)水平所證明(如用qrt-pcr定量的)。

意外地是，這些聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)具有生物活性，盡管它們的直徑(70-120nm)大于可被受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(約50nm)攝取的顆粒的直徑。

與通過常規(guī)技術(shù)制備的ha晶體相比，聚p取代的cap顆粒(acap-聚p)是生物可降解的，并且顯示出優(yōu)異的形態(tài)發(fā)生活性。

本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用該方法制備生物活性植入材料。本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用該方法來制備刺激成骨細(xì)胞活性的人造骨植入物。

本發(fā)明的另一方面涉及制備含有少量球霰石的acc多晶型物。發(fā)明人在合成acc期間，將陰離子聚合物聚p的na⁺鹽加入到caco3(cacl2和na2co3)的前體中(圖3)。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在最終濃度為10％時(shí)聚p幾乎完全防止acc轉(zhuǎn)變?yōu)槠浣Y(jié)晶多晶型物球霰石、霰石和方解石。

分別測試的caco3固體和聚p生理代謝物都具有成骨潛力，并且可以作為具有生物活性的骨移植物的成分。反過來，所開發(fā)的支架不僅利用聚p的形態(tài)發(fā)生潛力，而且還利用該聚合物的特性在acc階段冷凍caco3固體。該材料的成骨活性優(yōu)于方解石；它通過刺激成骨細(xì)胞來強(qiáng)烈誘導(dǎo)編碼alp(骨形成標(biāo)志物)的基因的表達(dá)。該結(jié)果已經(jīng)從骨樣saos-2細(xì)胞和msc的研究中獲得。

此外，發(fā)明人證明，acc/聚p通過成骨細(xì)胞強(qiáng)烈上調(diào)bmp2(骨形成誘導(dǎo)物)的表達(dá)。更重要的是：他們驚奇地發(fā)現(xiàn)acc以“協(xié)同”的方式增加由聚p誘導(dǎo)的bmp2表達(dá)，導(dǎo)致bmp2轉(zhuǎn)錄水平的更快上升?？梢灶A(yù)期本發(fā)明的acc/聚p微粒的這種效應(yīng)將導(dǎo)致骨缺損的更快愈合。

acc/聚p材料不僅具有生物相容性，而且還支持受損植入?yún)^(qū)域的細(xì)胞再生。為了評估acc/聚p材料在體內(nèi)的生物相容性，本發(fā)明人將本發(fā)明的材料包封在plga微球體中。并行地，對照球體保持沒有acc/聚p。將珍珠/微球嵌入大鼠背部的肌肉。觀察期2周、4周和8周后，從大鼠中取出組織樣本，并在切片和用mayer蘇木精染色后進(jìn)行顯微鏡檢查。檢查顯示，在具有含有acc/聚p材料的微球的動(dòng)物中，分別在4周和8周后，具有細(xì)胞的植入物區(qū)域的晚期增殖(repopulation)變得明顯。相反，缺少acc/聚p的微球沒有任何細(xì)胞。通過測量植入?yún)^(qū)域組織樣本的硬度(中值redym剛度)來支持這些結(jié)果，其顯示了在8周時(shí)間段后與對照相比顯著增加1.8倍(植入前在肌肉樣品中測量值的81％)。

本發(fā)明人開發(fā)的用于制備本發(fā)明的acc/聚p材料的優(yōu)選方法，包括以下步驟：

a)在例如1升0.1mnaoh中制備含有聚p鹽的溶液；

b)向該溶液中加入0.5mol/l的na2co3；

c)用1.5倍體積的去離子水稀釋所得溶液；

d)將該溶液與相同體積的含有0.5mol/lcacl2·2h2o的水溶液快速混合(導(dǎo)致鈣離子和碳酸根離子之間的等摩爾濃度比)；和

e)在室溫下用丙酮洗滌后，過濾并干燥沉淀物。

用于制備本發(fā)明的acc/聚p微粒的0.1mnaoh溶液中聚p鹽的優(yōu)選濃度，在0.001mol/l至1.0mol/l的范圍，優(yōu)選在0.01mol/l至0.1mol/l的范圍(基于磷酸鹽單位)。

如果用于制備本發(fā)明的acc/聚p微粒的0.1mnaoh溶液中的聚p鹽的濃度為0.025mol/l，或者，甚至更優(yōu)選為0.05mol/l(基于磷酸鹽)，則獲得最佳結(jié)果。所得的制品分別稱為“ccp5”和“ccp10”。聚p鹽優(yōu)選為na-聚p。

聚p的鏈長可以在3個(gè)至約1000個(gè)磷酸鹽單元的范圍。具有平均鏈長為約10個(gè)至約100個(gè)磷酸鹽單元的聚p分子獲得最佳結(jié)果，并且在該范圍內(nèi)最佳約40個(gè)磷酸鹽單元。

本發(fā)明的另一方面涉及以下發(fā)現(xiàn)：本發(fā)明的acc/聚p顆粒通過在骨形成saos-2細(xì)胞中(如用qrt-pcr定量的)誘導(dǎo)編碼alp和bmp2的基因表達(dá)而顯示出成骨活性。

與不存在聚p下由acc快速形成的方解石相比，acc/聚p顆粒是生物可降解的，并且顯示出優(yōu)異的形態(tài)發(fā)生活性。

發(fā)明人證明，使用具有10％[w/w]聚p(“ccp10”)的acc制品，ca²⁺和co3^2-的同時(shí)釋放在孵育的最初48小時(shí)期間是快速的，從而允許從支架釋放生物學(xué)活性陰離子co3^2-和po4^3-。如本發(fā)明人之前所證明的那樣，正磷酸鹽將從聚p中酶促地釋放出來(müllerweg,wangxh,diehl-seifertb,kropfk,schloβmacheru,lieberwirthi,glasserg,wiensm,hc(2011)inorganicpolymericphosphate/polyphoshateasaninducerofalkalinephosphataseandamodulatorofintracellularca²⁺levelinosteoblasts(saos-2cells)invitro.actabiomater7:2661-2671)。反過來，co3^2-以及hco3^-陰離子很有可能通過調(diào)節(jié)嵌入到破骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞質(zhì)膜上的hco3^-/cl^-陰離子交換器的效率，誘導(dǎo)骨形成細(xì)胞上的礦化過程。

本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用該方法制備具有生物活性的植入材料。本發(fā)明方法的另一方面是，應(yīng)用該方法來制備刺激成骨細(xì)胞活性的人造骨植入物。此外，本文描述的本發(fā)明的另一方面是，通過應(yīng)用本發(fā)明方法來制備的植入物。

用聚p穩(wěn)定亞穩(wěn)態(tài)acc的本發(fā)明方法，還允許將acc/聚p顆粒應(yīng)用于膳食補(bǔ)充劑。如發(fā)明人所證明的，例如，參見圖18，這些顆粒，例如，與結(jié)晶方解石多晶型物相比，“cc10”在長時(shí)間的孵育期內(nèi)釋放鈣。

因此，本發(fā)明的acc/聚p顆粒也可以用作治療鈣缺乏癥的膳食補(bǔ)充劑。

因此，本發(fā)明的另一方面是，穩(wěn)定的acc(acc/聚p)作為膳食補(bǔ)充劑用于預(yù)防/治療骨質(zhì)疏松癥的用途。

鈣在許多生物過程(例如細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌肉收縮、神經(jīng)元傳遞和血管收縮/血管擴(kuò)張)中起重要作用。通過聚p穩(wěn)定的acc可以作為鈣的易于獲得的食物補(bǔ)充劑，用于預(yù)防/治療與鈣代謝紊亂相關(guān)的許多病理學(xué)病癥。

根據(jù)最近關(guān)于生物種子caco3性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，可以在骨形成過程中描述通過po4^3-進(jìn)行co3^2-的陰離子交換和從聚p供給正磷酸鹽，接下來一系列的機(jī)制不同的過程(圖4)。在骨礦物質(zhì)沉積的第一階段，像在軟骨內(nèi)骨化中，使包含長骨的骨骺和骨干之間的生長中心的干骺端中的軟骨鈣化。很可能是由ca-ii和/或ca-ix來酶促驅(qū)動(dòng)這種鈣化過程。第二，除了在骨形成區(qū)域和骨折部位的成骨細(xì)胞之外，積聚的血小板將聚p釋放到細(xì)胞外空間，其中聚合物在正磷酸鹽釋放下經(jīng)歷alp介導(dǎo)的胞外水解。第三，在生物種子合成的空間附近形成的可用的磷酸鹽單元，作為形成acp的來源。如本方案中所描繪的，本發(fā)明的材料是有希望的生物相容性成骨支架，其提供用于生物種子開發(fā)(caco3[co3^2-])和隨后轉(zhuǎn)化為磷酸鈣(聚p[po4^3-])的底物。

因此，總之，本發(fā)明涉及制備具有生物活性的鈦合金包被層的方法，其包括以下步驟：a)通過將聚磷酸鈉(na-聚p)的水溶液與二水氯化鈣(cacl2·2h2o)水溶液在形成膠體懸浮液的條件下，在升高的溫度，優(yōu)選在90℃下混合幾小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)來制備聚磷酸鈣(ca-聚p)微粒；b)使用硅烷偶聯(lián)劑將所述ca-聚p微粒膠體懸浮液偶聯(lián)到合適的鈦合金支架上；和c)將b)的懸浮液的ph值調(diào)節(jié)至微堿性值，優(yōu)選為8.0，以允許通過ca²⁺離子鍵形成將聚磷酸鹽(聚p)結(jié)合到硅烷官能化的金屬支架。鈦合金可以是ti-6a1-4v。硅烷偶聯(lián)劑可以是(3-氨丙基)三甲氧基硅烷[aptms]。

本發(fā)明還涉及用于制備具有生物活性的非晶形聚磷酸鹽取代的磷酸鈣顆粒(“acap-聚p”)的方法，其包括以下步驟：a)將聚磷酸鹽的水溶液加入到磷酸鹽源的水溶液中；b)將所得溶液加入到溶解的鈣鹽中；c)將ph調(diào)節(jié)至堿性值，優(yōu)選10；和d)收集、洗滌和干燥數(shù)小時(shí)后，優(yōu)選在室溫下24小時(shí)后形成的所得沉淀。聚磷酸鹽可以是聚磷酸鈉。

本發(fā)明還涉及用于制備具有生物活性的非晶形碳酸鈣(acc)-聚磷酸鹽微粒的方法，其包括以下步驟：a)制備在約0.1m氫氧化鈉中的聚磷酸鹽水溶液；b)向所述溶液中加入約0.5mol/l的碳酸鈉；c)用約1.5倍體積的去離子水稀釋所得溶液；d)將所述溶液與相同體積的含有氯化鈣的水溶液混合，從而產(chǎn)生鈣離子和碳酸根離子之間的約等摩爾濃度比；e)在約室溫下用諸如丙酮的低級烷基酮洗滌；和f)過濾和干燥形成的沉淀物，基于磷酸鹽，步驟a)中聚磷酸鹽的濃度在約0.001mol/l至約1.0mol/l的范圍，優(yōu)選在約0.01mol/l至約0.1mol/l的范圍。優(yōu)選地，基于磷酸鹽，步驟a)中聚磷酸鹽的濃度為約0.025mol/l或約0.05mol/l。

優(yōu)選的方法是，其中聚磷酸鹽的鏈長在約3個(gè)至約1000個(gè)磷酸鹽單元的范圍，優(yōu)選在約10個(gè)至約100個(gè)磷酸鹽單元的范圍，以及最優(yōu)選約40個(gè)磷酸鹽單元。優(yōu)選的方法是，其中聚磷酸鹽的量高于磷酸鈣制品的5wt.％，優(yōu)選10wt.％。

優(yōu)選的方法是，其中鈣鹽是氯化鈣(cacl2)，磷酸鹽源是磷酸氫二銨[(nh4)2hpo4]]。

在本發(fā)明中，聚磷酸鈣微粒的特征在于：磷酸鹽比鈣的化學(xué)計(jì)量比為0.1比1至50比1，優(yōu)選1比1至10比1，或化學(xué)計(jì)量比為7比1。

優(yōu)選的方法是，其中計(jì)算所述鈣鹽的量和用作磷酸鹽源的試劑的量，以獲得ca/p摩爾比為10：6的磷酸鈣。優(yōu)選的方法是，其中聚磷酸鈣微粒的平均尺寸在約0.1μm至約30μm，優(yōu)選0.8μm至3μm的范圍。優(yōu)選的方法是，其中聚磷酸鹽取代的磷酸鈣顆粒(“acap-聚p”)的平均尺寸為約20nm至約300nm，優(yōu)選約70nm至約120nm的范圍。

優(yōu)選的方法是，其還包括制備具有生物活性的鈦合金植入物的步驟。還優(yōu)選的方法是，其還包括制備具有生物活性的植入材料的步驟。還優(yōu)選的方法是，其還包括將至少一種鎵鹽包含在所述植入物中的步驟。優(yōu)選地，所述具有生物活性的植入材料是人造骨植入物。優(yōu)選地，所述具有生物活性的植入材料是人造骨植入物。

本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法制備的植入物，或通過本發(fā)明的方法制備的穩(wěn)定的acc組合物。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明制備的包被層可以用作植入物(任選地與至少一種鎵鹽組合使用)，或作為食物或膳食補(bǔ)充劑(例如acc組合物)。穩(wěn)定的acc組合物用于治療鈣缺乏癥，或用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥。

現(xiàn)在將在以下優(yōu)選實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，但并不受限于此。為了本發(fā)明的目的，本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體并入。

附圖說明

圖1顯示從前體ca²⁺、po4^3-和oh^-形成非晶形cap(acap)的示意圖。acap經(jīng)歷了成熟為結(jié)晶ha，或者在<10wt.％的聚p存在下同樣成熟為結(jié)晶cap(參見底部的插圖，顯示cap晶體；sem圖像)。如果cap沉淀物中聚p的含量增加至>10wt.％，則形成球狀非晶形acap-聚p(參見頂部的插圖；sem圖像)。

圖2顯示使用硅烷偶聯(lián)劑aptms將聚p結(jié)合到鈦圓片的示意圖。用hc1蝕刻鈦合金ti-6a1-4v，暴露于鈦圓片上的羥基與硅烷偶聯(lián)劑aptms交聯(lián)，所述偶聯(lián)劑形成至聚p的ca²⁺橋。脫水/縮聚后的偶聯(lián)劑仍然含有游離的反應(yīng)性胺基，其可用于進(jìn)一步偶聯(lián)至活性組分，例如，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺。在此過程中，金屬表面與硅烷共價(jià)連接，而硅烷又可以通過ca²⁺離子橋結(jié)合聚p。

圖3顯示制備方解石和補(bǔ)充有聚p的caco3的示意圖。插圖顯示各自產(chǎn)物的sem圖像。

圖4顯示軟骨內(nèi)骨化過程和推薦的骨礦物質(zhì)沉積階段的示意圖。穿透血管后，在骨干中的初級骨化中心的透明軟骨開始鈣化。在骨骺的次級骨化中心，松質(zhì)骨的形成稍后開始。在骨骺和骨干之間的骨骺和骺板的表面(生長區(qū))，透明軟骨的兩個(gè)區(qū)域保留關(guān)節(jié)軟骨。生長區(qū)的礦物沉積被細(xì)分為i期：由膜相關(guān)ca-ix介導(dǎo)形成的非晶形碳酸鈣(acc)生物種子；ii期：在形成用于碳酸鹽-磷酸鹽轉(zhuǎn)移反應(yīng)的正磷酸鹽情況下，從血小板釋放的聚p經(jīng)歷alp介導(dǎo)的水解作用；和iii期：磷酸鹽單元用于(碳酸化)磷酸鈣形成。

圖5顯示與ti-ca-聚p圓片(b、d、f)相比，鈦合金圓片(a、c、e)的表面粗糙度。通過光學(xué)顯微鏡可視化圓片的表面，并使用vk分析儀軟件分析粗糙度。顯示了線掃描的軌跡(c、d)。在e、f中顯示代表性區(qū)域的高度剖面圖；數(shù)字表示法向量直線內(nèi)的偏差的最大尺寸。

圖6顯示通過edx光譜(a、c、e)和sem(b、d、f)，對鈦和ti-ca-聚p圓片進(jìn)行的元素組成分析。(a、b)未處理的圓片(ti6a14v)；(c、d)在聚p和cacl2反應(yīng)試驗(yàn)中，用較低濃度的aptms(1mg/試驗(yàn)；聚p@ti6a14v-1)制備的ti-ca-聚p圓片；和(e，f)ti-ca-聚p圓片，其在較高aptms濃度(2mg/試驗(yàn)；聚p@ti6a14v-h)存在下被包被。

圖7顯示鈦圓片對saos-2細(xì)胞生長的影響。將細(xì)胞在其他相同條件下接種到不含有鈦圓片(空白柱)、鈦合金圓片(交叉條紋柱)或ti-ca-聚p圓片(填充柱))的24孔板中。在1d、2d和3d的孵育期后收獲細(xì)胞，并通過xtt試驗(yàn)確定細(xì)胞的存活力。數(shù)據(jù)表示10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd(*p<0.01)。

圖8顯示編碼(a)caix和(b)alp的基因的表達(dá)。將表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化為gapdh的表達(dá)。在沒有任何鈦圓片(空白柱)，或者在鈦合金圓片上(交叉條紋柱)或在ti-ca-聚p圓片上(填充柱)培養(yǎng)細(xì)胞。首先在mac不存在下孵育培養(yǎng)物3d；然后將它們轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有mac的培養(yǎng)基中，并且如所述，繼續(xù)孵育另外3d或5d。然后收集細(xì)胞，提取rna并進(jìn)行qrt-pcr，以測定caix和alp轉(zhuǎn)錄物；將gapdh的表達(dá)作為參考。數(shù)據(jù)表示為五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sd；每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行(*p<0.01)。nd表示未檢出。

圖9顯示具有形態(tài)發(fā)生活性的ca-聚p的鈦圓片的包被層。如果包被了具有形態(tài)發(fā)生活性的ca-聚p聚合物，則金屬材料(ti-6a1-4v)獲得生物功能特性。在該過程中，鈦表面被蝕刻，導(dǎo)致羥基的暴露。在ph8時(shí)，它們與硅烷偶聯(lián)劑(例如aptms)形成共價(jià)連接。在這種環(huán)境下，在硅烷和聚p之間形成了ca²⁺離子橋。那些包被的鈦圓片允許骨樣saos-2細(xì)胞沉降并誘導(dǎo)它們進(jìn)行基因表達(dá)(caix和alp)；這些酶至關(guān)重要地參與骨礦物質(zhì)/羥基磷灰石(ha)沉積。

圖10顯示從純na-聚p“聚p”和純“ha”以及在不同量的na-聚p存在下制備的ha(即“ha(2.5)聚p”中為2.5wt.％，“ha(5)聚p”中為5wt.％，和“ha(10)聚p”為10wt.％)獲取的衍射圖案。從底部到頂部給出各自的圖案。“聚p”和“acap(10)聚p”沒有看到衍射信號。突出顯示ha或結(jié)晶cap特征的衍射峰(■)。

圖11顯示“聚p”樣品和“ha”樣品以及cap樣品(其中正磷酸鹽已被聚p部分取代，“ha(2.5)聚p”樣品、“ha(5)聚p”和“acap(10)聚p”樣品)的ftir光譜。標(biāo)記了“co3^2-和po4^3-”的一些振動(dòng)帶；另外指出了h2o和co2帶的區(qū)域。(a)在4000至500的波數(shù)范圍(cm^-1)；(b)2000cm^-1至500cm^-1部分的放大。

圖12顯示聚p和cap顆粒的tem顯微照片。(a)“ha”晶體；(b和c)“ha(2.5)聚p”晶體和“ha(5)聚p”晶體；和(d)“acap(10)聚p”非晶形球狀顆粒。

圖13顯示在saos-2細(xì)胞中編碼(a)ⅰ型膠原蛋白(col-i)或(b)堿性磷酸酶(alp)的基因的穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平。將細(xì)胞暴露于10μg/lml的聚p納米顆粒“aca-聚p-np”(填充柱)，或暴露于100mg/ml的“ha”(空白柱)，“ha(2.5)聚p”(右陰影柱)，“ha(5)聚p”(左陰影線柱)或“acap(10)聚p”(交叉陰影線柱)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基/血清中初始孵育3d后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到缺乏(減去mac)或含mac(加上mac)的培養(yǎng)基/血清中。在7d的孵育期后，收獲細(xì)胞，提取rna，隨后用于qrt-pcr分析。表達(dá)值以與參考基因gapdh的比值給出。結(jié)果是5次平行實(shí)驗(yàn)的平均值；*p<0.01。

圖14顯示方解石以及“ccp5”(0.05gna-聚p/試驗(yàn))和“ccp10”(0.1gna-聚p))的ftir光譜。將方解石與acc的主要區(qū)別振動(dòng)區(qū)域/信號，o-h(約3250cm^-1)的振動(dòng)范圍和在725cm^-1處的co3的不對稱v2線加畫圓圈。

圖15顯示從(a)方解石和(b)含有兩種不同濃度的聚p的兩種caco3制品(“ccp5”或“ccp10”)獲得的xrd圖案。特征信號被突出顯示并用各自的米勒指數(shù)標(biāo)記，在括號中給出。請注意在(a)和(b)之間的縱坐標(biāo)標(biāo)注的不同比例。

圖16顯示由cacl2·2h2o和na2co3形成的固體的形態(tài)；sem分析。(a和b)在不存在聚p的情況下，形成方解石晶體。在沉淀過程中加入聚p后，形態(tài)發(fā)生變化。(c和d)在存在5％聚p的情況下，“ccp5”顆粒顯示出球形外觀。(e和f)在10％聚p的情況下，“ccp10”，固體顯示出對應(yīng)于球霰石晶體(vat)的薄片狀形狀。

圖17顯示在3d孵育期后，在50μg/ml的“ccp10”(a和b)或方解石(c和d)存在下，saos-2細(xì)胞的生長方式。通過相位差/nomarski光學(xué)鑒定細(xì)胞。試驗(yàn)中的caco3顆粒在相差圖像中變得可見，并被標(biāo)記(><)。

圖18顯示從caco3顆粒釋放ca²⁺。將“ccp10”或方解石在tris-hcl緩沖液(ph7.4)中孵育不同時(shí)間，分析上清液中ca²⁺濃度。結(jié)果是6次平行實(shí)驗(yàn)的平均值；*p<0.01。

圖19顯示在(a)saos-2細(xì)胞和(b)msc中alp基因的穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平。細(xì)胞保持在沒有任何caco3固體的情況下(對照)，或暴露于50μg/ml的“ccp5”(左側(cè)陰影線柱)、“ccp10”(右側(cè)陰影線柱)或方解石(填充柱)。在mac不存在下的3d預(yù)孵育期之后，在mac不存在(減去mac)或暴露于mac(加上mac)的情況下，繼續(xù)孵育細(xì)胞。在7d孵育后收獲細(xì)胞，提取其rna并進(jìn)行qrt-pcr分析。表達(dá)值以與參考基因gapdh的比值給出。結(jié)果是5次平行實(shí)驗(yàn)的平均值；*p<0.01；根據(jù)加晶種期間在細(xì)胞中測量的表達(dá)來計(jì)算所述值。

圖20顯示在“ccp10”和聚p(ca²⁺復(fù)合物)存在下，在saos-2細(xì)胞中bmp2基因的穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平。細(xì)胞保持在沒有任何添加劑的情況下(對照)，或暴露于50μg/ml的“ccp10”(右陰影線柱)、5μg/ml的聚p(ca²⁺絡(luò)合物；50μm磷酸鹽單元；交叉陰影線柱)或50μg/ml方解石(填充柱)。在mac不存在下的3d預(yù)孵育期之后，在mac存在下將細(xì)胞繼續(xù)孵育長達(dá)7天，并通過qrt-pcr分析bmp2表達(dá)。表達(dá)值以與參考基因gapdh的比值給出。結(jié)果是5次平行實(shí)驗(yàn)的平均值；*p<0.01；根據(jù)加晶種期間細(xì)胞中測定的表達(dá)來計(jì)算所述值(第0天)；#p<0.01(僅適用于“ccp10”)；在相應(yīng)的孵育期間，根據(jù)在具有聚p(ca²⁺絡(luò)合物)的細(xì)胞中測量的表達(dá)來計(jì)算所述值。

圖21顯示微球的形態(tài)；(a)對照球“cont-mic”，和(b)加載聚p的球體“聚p-mic”。

實(shí)施例

在以下實(shí)施例中，僅針對鏈長為40個(gè)磷酸鹽單元的聚p分子描述本發(fā)明的方法。通過使用具有較低和較高鏈長(如約20個(gè)至100個(gè)單元)的聚p分子可獲得類似的結(jié)果。

鈦-ca-聚p(ti-ca-聚p)圓片

鈦合金(ti-6a1-4v)圓片被蝕刻，以允許與硅烷偶聯(lián)劑aptms交聯(lián)(圖2)。在第二步，通過ca²⁺離子橋用聚p覆蓋圓片。最后將樣本ti-ca-聚p圓片在100℃下干燥。我們目的是使用硅烷偶聯(lián)劑aptms來提供另外的官能團(tuán)(胺基團(tuán))，以將生物活性肽偶聯(lián)至聚p包被的金屬表面。鈦圓片的功能化也用3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯成功地進(jìn)行，僅允許聚p-鈦包被層。

鈦合金圓片與ti-ca-聚p圓片之間的比較(光學(xué)顯微鏡圖像)顯示，與鈦合金圓片的深灰色表面顏色相反，ti-ca-聚p圓片具有閃亮的銀白色外觀。在用聚p包被圓片的表面之后，它們失去其高的粗糙度。雖然未處理的圓片具有≈5.5μm的平均粗糙度，最大值為7.02μm(圖5a、圖5c、圖5e)，但是聚p包被的圓片最大程度地暴露了0.78μm的表面粗糙度(圖5b、圖5d、圖5f)。

通過edx光譜進(jìn)行鈦圓片表面的元素特異性分析(圖6)。未經(jīng)處理的圓片的表面，在4.5kev顯示出鈦的優(yōu)勢kα峰，并在4.9kev顯示出較低kβ峰(圖6a)。表面的形態(tài)被標(biāo)記為粗糙(圖6b)。如果在有聚p和cacl2的包被溶液中孵育后，蝕刻并與較低濃度的aptms(1mg/試驗(yàn))反應(yīng)后檢查鈦圓片，通過sem可解析ca-聚p微粒(müllerweg,tolbae,hc,diehl-seifertb和wangxh.retinolencapsulatedintoamorphousca²⁺polyphoshatenanospheresactssynergisticallyinmc3t3-e1cells.eurjpharmbiopharm2015；93:214-223)(圖6d)。顆粒的大小在0.8μm至3μm變化。在100℃干燥圓片后，進(jìn)行edx測定。代表性的光譜(圖6c)顯示了在2.01kev下磷的當(dāng)前優(yōu)勢kα峰。此外，鈣峰(3.69kev)是可檢測的。鈦峰(4.5kev)也是可記錄的。如果通過sem檢查在加入較高量的aptms(2mg/試驗(yàn))后用聚p包被的圓片樣品，則通過sem可以看到幾乎均勻的聚p表面(圖6f)。edx測量支持這一觀察結(jié)果，其顯示(幾乎)完全消失的鈦峰(圖6e)，而磷峰和鈣峰成為優(yōu)勢。

ca-聚p包被層的耐久性

如下文“方法”部分所述，通過測定來自sbf(缺少ca²⁺作為組分)中包被圓片的ca²⁺釋放，來測量聚p的表面包被層。在平行試驗(yàn)中，測量了來自ti-ca-聚p圓片以及未處理的鈦圓片(對照)的ca²⁺釋放。作為另外的對照，將一ti-ca-聚p圓片插入補(bǔ)充有1μg/ml的alp的sbf培養(yǎng)基中；將所有樣品于37℃孵育。在所有三種試驗(yàn)中的時(shí)間為零時(shí)，ca²⁺濃度為<3μg/ml。在孵育培養(yǎng)基中1d后，測定的ca²⁺量如下：ti-ca-聚p圓片：<3μg/ml(<3μg/ml[對照]；12±3μg/ml[ti-ca-聚p圓片+alp])；進(jìn)行5次平行試驗(yàn)。與和alp一起的ti-ca-聚p圓片的試驗(yàn)相反，在3d的孵育期后，在含有ti-ca-聚p圓片的試驗(yàn)中ca²⁺釋放略微增加。測量以下值：5.2±0.8μg/ml[ti-ca-聚p圓片](<3μg/ml[對照]；86.9±3.2μg/ml[ti-ca-聚p圓片+alp])。在孵育試驗(yàn)12d后，其值如下：9.7±1.2μg/ml[ti-ca-聚p圓片]；<3μg/ml[對照]；153.1±17.1μg/ml[ti-ca-聚p圓片+alp]。

saos-2細(xì)胞在鈦圓片上的生長

通過如下文“方法”部分中所述的xtt試驗(yàn)，來測定骨樣saos-2細(xì)胞的總體生長速率。對于所有三個(gè)平行的實(shí)驗(yàn)系列，將細(xì)胞以3×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔(2ml試驗(yàn))的密度接種；不含鈦圓片的試驗(yàn)、鈦合金圓片試驗(yàn)、ti-ca-聚p圓片試驗(yàn)(圖7)。在1-d孵育期后，細(xì)胞密度從0.3吸光度單位增加到0.49±0.6單位(無圓片試驗(yàn))和0.47±0.05單位(含ti-ca-聚p圓片)，而在有鈦合金圓片的試驗(yàn)中密度下降至0.26±0.03單位。該趨勢在隨后的孵育期內(nèi)增加，并且在3-d孵育期后所述值達(dá)到：0.09±0.02(鈦合金圓片；顯著降低)、0.72±0.08(無圓片)和0.68±0.07(ti-ca-聚p圓片)。這些數(shù)據(jù)意味著鈦表面不支持saos-2細(xì)胞的生長，而在ti-ca-聚p圓片上生長的細(xì)胞顯示與沒有任何圓片的培養(yǎng)物相同的生長動(dòng)力學(xué)。

通過染色圓片表面，還強(qiáng)調(diào)了包被有聚p的圓片的特性，其是用于saos-2細(xì)胞生長的非常合適的基底。未包被聚p的鈦合金圓片與saos-2細(xì)胞孵育3d；在此之后，沒有在圓片上看到細(xì)胞。相比之下，如果將聚p包被的ti-ca-聚p圓片在saos-2細(xì)胞存在下孵育相同的時(shí)間段，則觀察到幾乎均勻的單細(xì)胞層。在較高放大率下仔細(xì)檢查顯示，細(xì)胞顯示出細(xì)胞擴(kuò)散的特性，這是細(xì)胞至關(guān)重要的生存和生長的特征信號。

作為對saos-2細(xì)胞容易生長到ti-ca-聚p圓片上的結(jié)論的進(jìn)一步支持，分析了覆蓋有細(xì)胞區(qū)域的元素碳(c)、鈦(ti)和磷(p)的分布。通過基于sem的edx映射，進(jìn)行元素的半定量測定。通過記錄背散射電子獲得細(xì)胞的定位。在細(xì)胞生長區(qū)域內(nèi)，測量元素c的高積聚，在細(xì)胞生長的圓片的周圍表面上，細(xì)胞區(qū)域外部的鈦和聚p顯著。

碳酸酐酶ix和堿性磷酸酶的表達(dá)

作為生長在鈦圓片上的saos-2細(xì)胞功能活性的標(biāo)記物，通過定量qrt-pcr測定了編碼酶碳酸酐酶ix(caix)和堿性磷酸酶(alp)的兩個(gè)基因的表達(dá)。在mac不存在下生長3d的saos-2細(xì)胞中caix轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平的研究，對于含有鈦合金圓片的培養(yǎng)物，表達(dá)水平從0.31±0.03(在接種時(shí)間)到0.12±0.01顯著降低，而不存在圓片或存在ti-ca-聚p圓片的培養(yǎng)細(xì)胞中的水平分別從0.27±0.02和0.25±0.03增加到0.38±0.04和0.40±0.05(圖8a)。隨后在mac存在下孵育培養(yǎng)物，導(dǎo)致在不含圓片或ti-ca-聚p圓片浸沒的試驗(yàn)中caix表達(dá)水平的增加。在mac存在下5d后，檢測到在不存在圓片的細(xì)胞中，caix轉(zhuǎn)錄物水平從0.38±0.04至0.81±0.08顯著增加。在ti-ca-聚p圓片上培養(yǎng)的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)從0.41±0.05至0.59±0.06顯著增加。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，用聚p包被到鈦植入材料上提供了具有生物活性表面的材料(圖9)。

同時(shí)，同樣通過qrt-pcr來測定酶alp基因的表達(dá)。再次，數(shù)據(jù)(圖8b)顯示，在3d孵育期后，相對于不存在任何圓片，在含有鈦合金圓片的培養(yǎng)物中alp的表達(dá)水平顯著降低。稍后在孵育過程中，水平低至表達(dá)無法可靠地記錄。相比之下，在mac存在下alp的穩(wěn)態(tài)表達(dá)，在無圓片的試驗(yàn)中和在有ti-ca-聚p圓片的試驗(yàn)中都顯著增加，分別為從0.038±0.005到0.097±0.007(在沒有圓片的第5天)，從0.034±0.004到0.074±0.007。

在另一組實(shí)驗(yàn)中，在100μm硝酸鎵存在下進(jìn)行測定(參見表1)。如上所述，在沒有任何鈦圓片、或在鈦合金圓片上、或在ti-ca-聚p圓片上培養(yǎng)細(xì)胞，首先在mac不存在下培養(yǎng)3d，然后在補(bǔ)充有mac的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)5d。結(jié)果表明，與硝酸鎵不存在下為0.27±0.02至0.81±0.08(另見圖8)相比，在圓片不存在下，在mac不存在下生長3d，以及隨后在mac存在下生長5d的saos-2細(xì)胞中，caix轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平從0.24±0.05增加至0.89±0.11(表1)。如果將細(xì)胞在ti-ca-聚p圓片上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不存在硝酸鎵的試驗(yàn)相比，在硝酸鎵存在下caix轉(zhuǎn)錄物的水平更強(qiáng)的增加；相對于從0.25±0.04至0.59±0.06(不存在硝酸鎵；還參見圖8)，caix轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平從0.27±0.04增加到0.96±0.15(存在100μm硝酸鎵)，表明ca-聚p包被層和鎵鹽有很強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)(與沒有圓片和有ti-ca-聚p圓片的試驗(yàn)比較)。

如果在不存在圓片和存在鈦合金圓片或ti-ca-聚p圓片的情況下，測定了硝酸鎵對alp轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)態(tài)水平的影響，則得到類似的結(jié)果。在鈦圓片不存在下添加鎵鹽，與沒有這一添加劑的試驗(yàn)相比，對alp轉(zhuǎn)錄物水平的影響很??；而在ti-ca-聚p圓片存在下，如果與沒有該補(bǔ)充物的試驗(yàn)(從0.030±0.003增加到0.074±0.007；還見圖8)相比，也觀察到對ca-聚p引起的alp轉(zhuǎn)錄物水平增加的強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)(從0.027±0.003增加到0.115±0.007)。在未包被的鈦合金圓片上培養(yǎng)的細(xì)胞，沒有觀察到可檢測的或僅觀察到非常小的轉(zhuǎn)錄物水平。

表1.鎵對編碼caix和alp的基因表達(dá)的影響。在試驗(yàn)混合物中不存在或存在100μm硝酸鎵時(shí)，如圖8的圖例所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化為gapdh的表達(dá)。在沒有任何鈦圓片、或者在鈦合金圓片、或者在ti-ca-聚p圓片上培養(yǎng)細(xì)胞。首先將培養(yǎng)物在mac不存在下孵育3d，然后轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有mac的培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育另外3d或5d。nd，不可檢測。

xrd分析

通過應(yīng)用粉末x射線衍射(xrd)法，進(jìn)行“ha”以及聚p-ha顆粒的相鑒定(圖10)。而對于純na-聚p而言，沒有明確的衍射信號可以被解析，表明是非晶形相，純的“ha”以及“ha(2.5)聚p”和“ha(5)聚p”表現(xiàn)出寬的衍射峰，表明形成低結(jié)晶度的ha；沒有檢測到其他結(jié)晶相(jcpds[http://www.icdd.com/]#09-0432)。然而，當(dāng)聚p的量增加至10wt.％時(shí)，如在“acap(10)聚p”中，在xrd圖案中沒有看到結(jié)晶的跡象(圖10)。這些結(jié)果表明，隨著聚p含量的增加，制備的ha樣品的結(jié)晶度逐漸降低。

fitr光譜分析

在這里記錄的cap的所有光譜[如純“ha”以及“ha(2.5)聚p”和“ha(5)聚p”]，顯示了典型的ha條帶(圖11a和圖11b)，除了“acap(10)聚p”。如預(yù)期的那樣，在1090cm^-1，1015cm^-1和960cm^-1處記錄了具有高強(qiáng)度的ha的典型吸收帶，具有對稱v1(po4^3-)伸縮振動(dòng)和不對稱v3(po4^3-)伸縮振動(dòng)。此外，在556cm^-1和604cm^-1處的v4(po4^3-)峰是特征彎曲振動(dòng)。相比之下，“acap(10)聚p”的光譜顯示了在1100-900cm^-1的區(qū)域中對稱v1(po4^3-)伸縮振動(dòng)和不對稱v3(po4^3-)伸縮振動(dòng)以及出現(xiàn)為以610cm^-1附近為中心的一個(gè)峰的p＝o彎曲振動(dòng)的v4(po4^3-)諧波的磷酸鹽吸收帶的明顯移動(dòng)。另外，從～3600cm^-1直至3100cm^-1的范圍的寬吸收帶指向v3和v1，具有拉伸模式的與氫鍵合的h2o分子。在1629cm^-1處的吸收帶歸因于h2o分子的變形模式v2，證明在合成樣品中物理吸附水的存在。據(jù)報(bào)道，cap的ftir光譜中556cm^-1和604cm^-1附近的振動(dòng)帶，反映了結(jié)晶po4^3-的諧波振動(dòng)的特征彎曲信號；兩個(gè)峰的移位表明從結(jié)晶相向非晶形相的轉(zhuǎn)變。在“acap(10)聚p”的圖中清楚地看出這種移動(dòng)，其中兩個(gè)峰現(xiàn)在顯示為一個(gè)峰，表明該樣品的非晶形性質(zhì)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)也與報(bào)道的xrd圖案一致(圖10)。

為了比較，聚p的譜也包括在cap追蹤中(圖11)。顯然的，對于聚p，1261cm^-1附近的峰顯示屬于體現(xiàn)聚p特征的(o-p＝o)的不對稱拉伸模式。接近1090cm^-1和960cm^-1的吸收帶分別屬于(o-p-o)的不對稱拉伸模式和對稱拉伸模式。這些信號進(jìn)一步證實(shí)了聚p的存在。此外，864cm^-1附近的吸收帶指示了p-o-p連接的不對稱拉伸模式，和以763cm^-1附近為中心的部分分裂帶應(yīng)屬于這些連接的對稱拉伸模式。

tem和粒度分布結(jié)果

通過tem分析cap樣品的形態(tài)?！癶a”樣品顯示平均長度為39±8nm和寬度為14±4nm的針狀納米晶體(圖12a)。在長度為42±10nm和寬度為9±5nm的“ha(2.5)聚p”樣品中，可以看出幾乎相同的尺寸(圖12b)?！癶a(5)聚p”制品中存在的晶體稍長為56±12nm且寬度為6±3nm(圖12c)。相比之下，含有最高比例聚p的cap制品(“acap(10)聚p”)顯示出具有不同形態(tài)的顆粒(圖12d)。不同于解析的直徑為70nm至120nm(96±15nm)的針狀結(jié)構(gòu)球形顆粒。那些顆粒具有聚集成較大實(shí)體的傾向。

cap樣品和ca-聚p納米顆粒對細(xì)胞生長的影響

通過應(yīng)用mtt試驗(yàn)來檢測在cap樣品上的saos-2細(xì)胞的細(xì)胞存活力和生長。將那些樣品以100μg/ml的濃度加入細(xì)胞。并行地，用10μg/ml的ca-聚p納米顆?！癮ca-聚p-np”進(jìn)行孵育，所述“aca-聚p-np”是經(jīng)證明可增加細(xì)胞生長速率并導(dǎo)致alp和col-i基因表達(dá)增加的樣品。

結(jié)果表明，在2d的孵育期后，在不同基底上沒有看到細(xì)胞生長的顯著差異。然而，在3d的孵育期后，在“aca-聚p-np”存在下測量到saos-2細(xì)胞生長的顯著增加(從1.74±0.19吸光度單位[第2天]至2.45±0.20吸光度單位)。在不同cap樣品上生長的增加較低，對于“ha”(從1.54±0.18至1.93±0.21)和“acap(10)聚p”(從1.54±0.18至2.31±0.25)生長的增加是顯著的。

sem分析

將細(xì)胞在純“ha”上或在“acap(10)聚p”圓片上培養(yǎng)3d。然后將樣品用多聚甲醛固定，并通過sem檢查。可以看出，在兩種試驗(yàn)中，對于“ha”和“acap(10)聚p”培養(yǎng)物，細(xì)胞均牢固地附著于基底。在較高放大倍數(shù)下，細(xì)胞擴(kuò)散的特性變得明顯。

cap上的saos-2細(xì)胞的基因表達(dá)傾向

最初將骨相關(guān)saos-2細(xì)胞培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)移到新的缺少mac或補(bǔ)充mac并且還含有cap樣品(100μg/ml)或聚p納米顆粒(10μg/ml)培養(yǎng)基中。然后在qrt-pcr分析之前繼續(xù)孵育7d，以確定col-1或alp轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)水平(圖13)。

測定顯示，在接種細(xì)胞時(shí)col-1的表達(dá)低且為0.26±0.07個(gè)表達(dá)單位，其與gapdh的表達(dá)相關(guān)。在不存在mac和存在cap樣品或聚p納米顆粒7d的情況下，與“ha(2.5)聚p”(至0.35±0.05)、“ha(5)聚p”(至0.43±0.05)以及“acap(10)聚p”(至0.52±0.06)孵育之后，表達(dá)水平顯著增加，如預(yù)期的那樣，對于聚p“aca-聚p-np”(至0.63±0.07)也是一樣；圖13a。暴露于mac后，所有穩(wěn)態(tài)表達(dá)水平顯著較高，并且例如“ha”的值達(dá)到0.41±0.05，和“acap(10)聚p”的值達(dá)到1.06±0.11。后者“acap(10)聚p”的值接近暴露于聚p納米顆粒的細(xì)胞中具有的1.38±0.16的誘導(dǎo)水平。

如果與參考基因gapdh相關(guān)，則記錄alp基因相當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)表達(dá)模式。再次，與在mac存在下孵育7d的細(xì)胞的測量值相比，在mac不存在下alp表達(dá)水平較低(圖13b)。只有在沒有mac但補(bǔ)充有聚p納米顆粒的試驗(yàn)中，alp的表達(dá)水平的增加是顯著的(從0.12±0.02到0.17±0.01)。然而，暴露于mac后，所有含聚p的cap制品的表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞接種期間所見到的表達(dá)水平。對于“ha(2.5)聚p”的增加值為0.15±0.03，對于“ha(5)聚p”的增加值為0.28±0.03，和對于“acap(10)聚p”的增加值為0.89±0.09。再次，如果與含有較少量聚p的樣品相比，后一種表達(dá)水平更接近于具有1.37±0.16的暴露于聚p的細(xì)胞所測定的值。

聚p對方解石形成的影響：ftir光譜和xrd光譜

對于所有的caco3固體，記錄以下ftir信號：在≈1080cm^-1處的v1(對稱伸縮)，在≈870cm^-1處的v2(平面外彎曲)，在≈1400cm^-1處的v3(雙重退化平面不對稱伸縮)和在≈700cm^-1處的v4(雙重退化平面彎曲)。用ftir/kbr小球獲得的發(fā)表的ir數(shù)據(jù)(rodriguez-biancojd,shaws和benninglg(2011)thekineticsandmechanismsofamorphouscalciumcarbonate(acc)crystallizationtocalcite,viavaterite.nanoscale3:265-271)，包括方解石的位于約1400cm^-1(v3)的峰、876cm^-1(v2)的峰和714cm^-1(v4)的峰，以及球霰石的位于1090cm^-1(v1)的峰、870cm^-1(v2)的峰和745cm^-1(v4)的峰(圖14)。在聚p不存在下制備的我們的樣品的特征如下。對于方解石，記錄了典型的振動(dòng)帶1391cm^-1、872cm^-1和712cm^-1，而在聚p存在下制備的樣品，對于“ccp5”聚p在1398cm^-1、869cm^-1和742cm^-1處顯示出吸附峰，以及對于“ccp10”顯示在1398cm^-1、869cm^-1和741cm^-1處的帶，證明了球霰石的形成。顯然，在制備的caco3固體中(“ccp10”對“ccp5”)，聚p含量較高時(shí)，對于球霰石在741cm^-1附近的信號強(qiáng)度降低。這表明acc的形成。除co3^2-的吸收峰外，從1200cm^-1到950cm-¹的峰對應(yīng)于聚p中磷酸鹽的吸收峰。

用xrd證實(shí)了上述結(jié)果，其中給出了在聚p不存在下制備的樣品在大約23°、30°、36°和40°處的衍射峰；那些信號對應(yīng)于方解石。相反，在聚p(“ccp5”)存在下制備的樣品在大約24°、27°、32°和44°處顯示出峰，這也反映了球霰石的存在。此外，這些數(shù)據(jù)證明，在聚p不存在下制備的caco3固體是純方解石(圖15a)，而“ccp5”樣品由與acc結(jié)合的球霰石組成，其可以從樣品“ccp5”的低強(qiáng)度信號以及衍射峰的加寬來推理(圖15b)。因此，如“ccp10”中聚p的量的增加，降低了acc向球霰石的轉(zhuǎn)化率。明顯地，來自“ccp10”樣品的xrd圖案，其顯示了樣品的非晶形性質(zhì)，但是還含有少量的球霰石。

形成的固體形態(tài)

通過sem研究了由cacl2·2h2o和na2co3沉淀形成的固體。在聚p不存在下形成的顆粒其顯微照片顯示典型的結(jié)晶方解石，由{104}面包圍的菱面體晶體，圖16a和圖16b。顆粒的尺寸在5.3μm至8.9±2.4μm之間變化。相反，在聚p存在下由cacl2·2h2o和na2co3形成的固體顯示不同的形態(tài)。在較低的聚p濃度下，“ccp5”顆粒呈球形外觀，球形晶體的平均尺寸為9.4±3.7μm(圖16c和圖16d)；我們將這些顆粒歸屬于球霰石。它們被非常豐富地積累的尺寸范圍為100nm至200nm的小納米顆粒包圍，我們將其指定為acc。如“ccp10”中增加聚p，球狀顆粒消失，并被五角形片狀/六邊形片狀的顆粒(5-10μm大小的球霰石)取代(圖16e和16f)。

caco3樣品對細(xì)胞生長/存活力的影響

通過應(yīng)用mtt試驗(yàn)(參見上文)測定暴露于caco3制品后saos-2細(xì)胞的細(xì)胞生長/存活力。將caco3樣品以50μg/ml的濃度加入到細(xì)胞中。并行地，進(jìn)行缺乏任何caco3固體的對照試驗(yàn)。結(jié)果表明，在對照試驗(yàn)和三種caco3系列(“ccp5”、“ccp10”或方解石)中，細(xì)胞生長/存活力從時(shí)間0的0.70±0.11增加到2d后的大約1.1個(gè)吸收單位和3d后的2.35個(gè)單位，僅有不顯著的變化。

caco3固體在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性

saos-2細(xì)胞以附著方式生長(pautkec,etal.(2004)characterizationofosteosarcomacelllinesmg-63,saos-2andu-2osincomparisontohumanosteoblasts.anticancerres24:3743-3748)。如果培養(yǎng)物暴露于方解石或“ccp5”固體，培養(yǎng)皿表面上的生長行為，在含有“ccp10”(圖17a和圖17b)或方解石(圖17c和圖17d)的試驗(yàn)中是類似的。3d后，細(xì)胞生長幾乎達(dá)到融合。然而，值得注意的是，與在方解石試驗(yàn)中觀察到的那些相比，在含有“ccp10”的試驗(yàn)中，在這段時(shí)間后漂浮在培養(yǎng)基中的礦物顆粒的數(shù)量顯著降低。該觀察結(jié)果可作為“ccp10”顆粒在5d孵育期內(nèi)經(jīng)歷溶解的指示。這一發(fā)現(xiàn)由測定支持，其顯示在模擬體液(oyanea,kimhm,furuyat,kokubot,miyazakit,nakamurat(2003)preparationandassessmentofrevisedsimulatedbodyfluids.jbiomedmaterresa65:188-195)中的3d孵育期后，基于可沉淀的碳酸鹽測量(數(shù)據(jù)未顯示)，方解石顆粒的量僅降低5-10％，而只有35％的“ccp10”顆粒可被回收。

從caco3顆粒釋放ca²⁺

在單獨(dú)的試驗(yàn)中，將方解石或“ccp10”加入用1mtris-hcl(ph7.4)緩沖的1ml試驗(yàn)中。雖然幾乎沒有從方解石樣品釋放ca²⁺，但在48hr后，已經(jīng)從“ccp10”釋放了6.8±1.1μg/ml(反應(yīng)混合物中總ca²⁺的68％)；在整個(gè)192hr孵化期間，這一程度進(jìn)一步增加(圖18)。

在saos-2細(xì)胞以及msc中alp的表達(dá)

在不存在和存在mac的情況下，測定caco3樣品對saos-2細(xì)胞以及msc的形態(tài)發(fā)生活性。使用saos-2細(xì)胞，確定在mac不存在下，alp與參考基因表達(dá)(gapdh)之間的表達(dá)比顯著地從0.31±0.9增加到≈0.6。在沒有mac的實(shí)驗(yàn)組中，沒有測量到顯著差異，而不管在試驗(yàn)中caco3樣品是不存在(對照)還是存在(圖19a)。然而，如果在mac激活的細(xì)胞中測定表達(dá)比(alp：gapdh)，則測量到比值顯著增加至0.87±0.12(在對照中)、增加至1.74±0.23(“ccp5”)、或增加至1.86±0.29(“ccp10”)。相反，在用方解石的試驗(yàn)中，沒有測量到細(xì)胞的響應(yīng)(0.14±0.05)。

如果將msc用于實(shí)驗(yàn)，則發(fā)現(xiàn)如果與參考gapdh基因表達(dá)相關(guān)的alp的類似表達(dá)模式。再次，在任何caco3固體不存在下以及在“ccp5”和“ccp10”兩者存在下的試驗(yàn)中，在mac存在下看到顯著增加的表達(dá)比。在暴露于方解石的細(xì)胞中沒有測定到誘導(dǎo)作用(圖19b)

在saos-2細(xì)胞中bmp2的表達(dá)

通過qrt-pcr分析測定bmp2對“ccp10”和聚p(ca²⁺絡(luò)合物)響應(yīng)的表達(dá)水平。將saos-2細(xì)胞在礦化培養(yǎng)基(mccoy's培養(yǎng)基/mac)中孵育長達(dá)7天。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，向培養(yǎng)物中加入“ccp10”(50μg/ml)、聚p(ca²⁺絡(luò)合物；5μg/ml；對應(yīng)于磷酸鹽的50μm)或方解石(50μg/ml)。終止后，從培養(yǎng)物中提取rna并進(jìn)行qrt-pcr。使用管家基因gapdh的表達(dá)作為參考。如圖20所示，加入“ccp10”或聚p(ca²⁺絡(luò)合物)3至7天后，bmp2的表達(dá)水平顯著增加。然而，與聚p(ca²⁺絡(luò)合物)相比，“ccp10”的bmbp2表達(dá)增加更快。在“ccp10”的3天孵育期后，已經(jīng)達(dá)到bmb2基因表達(dá)的最高水平，而由聚p(ca²⁺絡(luò)合物)誘導(dǎo)的該基因的表達(dá)僅在更長時(shí)間(5天孵育期)后達(dá)到最高水平(與“ccp10”相比類似的水平)。在第3天，與聚p(ca²⁺絡(luò)合物)相比，響應(yīng)“ccp10”的bmp2的表達(dá)水平顯著高(約2倍)，表明兩種組分的“協(xié)同”效應(yīng)。7天后，“ccp10”和聚p(ca²⁺絡(luò)合物)的表達(dá)水平均降低，但依然保持顯著。在聚p不存在下，由亞穩(wěn)態(tài)acc形成的方解石對bmp2基因表達(dá)沒有顯示任何刺激作用。

用于動(dòng)物研究的微球

對照球“contmic”具有(≈845μm[820±60μm]；n＝50)的大小，而含有聚p的那些大小稍微小一些(≈838μm[816±65μm])；圖21a和圖21b。微球表面的結(jié)構(gòu)是多孔的，具有25nm-30nm的孔(此處未示出)?！熬踦-mic”中的聚p含量為7.26±0.92％。測定“contmic”和“聚p-mic”的顆粒硬度；“contmic”的中值redym剛度為26.99±6.22kpa，“聚p-mic”微球的中值redym剛度為23.96±23.96kpa。

大鼠中的相容性研究

如“材料和方法”所述，將微球樣品(20mg)，“contmic”和“聚p-mic”嵌入大鼠背部的肌肉中。在2周、4周或8周后，取出帶微球的組織樣品，切片并用蘇木精溶液染色。在用于“contmic”和“聚p-mic”系列的每組所有三只處死的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中，沒有在一個(gè)離體的標(biāo)本中可以看到任何組織病理學(xué)改變的跡象。2周后，在微球已經(jīng)放入肌肉的區(qū)域，一些細(xì)胞分散在微球區(qū)域內(nèi)。然而，“cont-mic”微球在肌肉區(qū)域中停留4周和8周后，它們顯示是空的或接近無細(xì)胞的。相比之下，在“聚p-mic”微球內(nèi)4周后，細(xì)胞在球體內(nèi)的積累明顯。8周后，球體幾乎充滿了浸潤細(xì)胞。

8周后植入?yún)^(qū)域硬度的測定顯示了明顯增加的中值redym剛度，對于“cont-mic”是33.13±7.97kpa，對于“聚p-mic”微球是60.11±12.13kpa。在植入前，大鼠背部肌肉具有74.40±14.33kpa的中值redym剛度。

方法

聚磷酸鹽

已從chemischefabrikbudenheim(budenheim；德國)獲得實(shí)施例中使用的聚磷酸鈉(平均鏈為40個(gè)磷酸鹽單元的na-聚p)。

ti-ca-聚p圓片

鈦合金(ti-6a1-4v)圓片(直徑15mm和厚度2mm)，可以從例如nobelbiocare獲得。使用前，用砂紙(碳化硅，matador)拋光，然后在蒸餾水中用超聲波清洗，隨后在丙酮(10min)和40％乙醇溶液(15min)中洗滌，最后在蒸餾水中漂洗20min。將樣品在50℃下干燥24小時(shí)。然后在室溫下將鈦合金圓片在20ml的5mhcl中孵育6h。在蒸餾水中溫和洗滌之后，將圓片在室溫下干燥，并在硅烷偶聯(lián)劑(3-氨丙基)三甲氧基硅烷[aptms](例如，來自sigma-aldrich)存在下，將處理的圓片樣品用10mlca-聚p納米顆粒懸浮液覆蓋。

通過將0.5gna-聚p與atpms溶液(1wt％)在100ml水中混合，然后加入0.1gca²⁺氯二水合物(cacl2·2h2o)來制備ca-聚p微粒。將鈦圓片于90℃在上述懸浮液中孵育3小時(shí)；在這些條件下，最初形成膠體懸浮液。將環(huán)境ph調(diào)節(jié)至8.0，以便通過ca²⁺離子鍵/橋接將聚p結(jié)合到硅烷蝕刻的鈦圓片。樣品保留在該懸浮液中1d。研究了兩種不同的atmps濃度(分別為1mg/試驗(yàn)和2mg/試驗(yàn))對在鈦表面上形成的包被層形態(tài)的影響。最后，取出樣本鈦-鈣-聚p(ti-ca-聚p)圓片，并在100℃干燥(參見圖1)。

在實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，如果沒有提及其他的，則使用以較高比例的aptms然后與ca-聚p一起制備的圓片。

ha和聚p-羥基磷灰石的合成

可以通過濕法化學(xué)沉淀法，由氯化鈣(cacl2)作為ca²⁺源和磷酸氫二銨((nh4)2hpo4)作為磷酸鹽源合成羥基磷灰石(ha)納米粒子。為了沉淀化學(xué)計(jì)量的ha(ca10(po4)6(oh)2；ca/p比為1.667)，將100ml0.3m(nh4)2hpo4水溶液逐滴加到100ml0.5mcacl2水溶液中。為了獲得ca/p摩爾比為10：6的ha，計(jì)算試劑的量。加入氫氧化鈉溶液，使反應(yīng)的ph值保持在10。

為了制備各種聚p含量的聚p取代的ha納米顆粒，起始成分(cacl2和(nh4)2hpo4)還如下補(bǔ)充有2.5wt.％、5wt.％或10wt.％的na-聚p(稱為ha，或各自的cap制品)。將各自量的na-聚p、0.12g[“ha(2.5)聚p”]、0.25g[“ha(5)聚p”]或0.50g[“acap(10)聚p”]加入到(nh4)2hpo4水溶液；然后將該溶液加入到溶解的cacl2中。將ph保持在10。將所得沉淀物在室溫下放置24h。然后過濾沉淀，用蒸餾水洗滌3次，然后在60℃的熱風(fēng)烘箱中干燥24h。最終粉末稱為“ha”、“ha(2.5)聚p”、“ha(5)聚p”和“acap(10)聚p”。

制備聚p納米顆粒

對于比較功能/生物學(xué)研究，可以如所述制備非晶形ca-聚p納米顆粒(müllerweg,tolbae,hc,diehl-seifertb和wangxh.retinolencapsulatedintoamorphousca²⁺polyphosphatenanospheresactssynergisticallyinmc3t3-e1cells.eurjpharmbiopharm2015；93:214-223)。簡言之，將2.8g在30ml蒸餾水中的cacl2逐滴加到溶于50ml蒸餾水中且ph為10.0的1gna-聚p中。將形成的非晶形ca-聚p納米顆粒在水中洗滌，然后在50℃干燥；該制品稱為“aca-聚p-np”。球形顆粒的平均直徑為96±28nm，并且它們具有非晶形狀態(tài)(müllerweg,etal.anewpolyphosphatecalciummaterialwithmorphogeneticactivity.materialsletters2015c；148:163-166)。

制備碳酸鈣微粒

使用等摩爾濃度比ca²⁺和co3^2-的cacl2·2h2o溶液和na2co3溶液，通過快速混合在水溶液(室溫)中直接沉淀制備碳酸鈣(caco3)，示意圖見圖3。

為了研究聚p對沉淀的caco3的影響，向其中補(bǔ)充有0.05g或0.1gna-聚p的20ml0.1mnaoh的溶液中加入1.05gna2co3；隨后將該溶液用30ml去離子水稀釋。然后加入含有1.47gcacl2·2h2o的50ml水。由此，分別向caco3沉淀試驗(yàn)中加入5％[w/w](加入0.05gna-聚p)和10％[w/w](0.1gna-聚p)聚p。將獲得的懸浮液過濾，用丙酮洗滌并在室溫下干燥。樣品稱為“ccp5”(每次caco3沉淀試驗(yàn)為0.05gna-聚p)或“ccp10”(0.1g)。

ca-聚p包被層的耐久性

可以例如通過測定來自圓片的ca²⁺釋放，來量化鈦圓片周圍的ca-聚p包被層的穩(wěn)定性和耐久性。將對照圓片以及ti-ca-聚p盤浸沒在模擬體液(sbf)中，但是省略ca²⁺作為組分；將ph調(diào)節(jié)至8.0。試驗(yàn)體積為1ml，并且在37℃下進(jìn)行孵育。通過應(yīng)用絡(luò)合滴定法測定ca²⁺濃度；使用試劑eriochromeblackt(例如，來自sigma-aldrich)。在實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，在圓片一個(gè)平面上的聚p包被層的表面厚度，已通過顯微鏡確定為≈5μm。反過來，在圓片一個(gè)平面上的ca-聚p(密度≈3g/ml)的總量，具有≈2.4mg的值。

如實(shí)施例所示，將5μg來自牛腸粘膜的堿性磷酸酶(alp)(例如來自sigma；≥6,500dea單位/mg蛋白)加入到反應(yīng)混合物中。

顯微鏡分析

可以例如用來自keyence的、配備有vh-z25變焦鏡頭(25x至175x放大)或vh-z-100長距離高性能變焦鏡頭(高達(dá)1000x放大)的vhx-600數(shù)碼顯微鏡，來進(jìn)行圓片的光學(xué)顯微鏡檢查?？梢岳缤ㄟ^使用keyencevk分析儀軟件，來測量表面粗糙度。對于掃描電子顯微鏡(sem)分析，可以使用例如hitachisu8000電子顯微鏡(hitachihigh-technologieseuropegmbh，krefeld，德國)。

電子顯微鏡和能量色散x射線光譜

對于透射電子顯微鏡(tem)分析，例如可以使用在120kv的加速電壓下在tecnai12透射電子顯微鏡(fei)上操作的temcam-f416(4k×4k)ccd照相機(jī)(tvips)。該設(shè)備與粒度分析儀(imagej)連接；在實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)評估了25-50個(gè)晶體/球體。

可以例如在低電壓(1kv)用su8000儀器(hitachihigh-technologieseurope)，進(jìn)行掃描電子顯微鏡(sem)分析。對于實(shí)施例中所述的研究，使細(xì)胞于6孔板中在已經(jīng)壓制成直徑為34mm、厚1mm圓片的cap制品上生長3天。用4％多聚甲醛固定在cap基底上生長的細(xì)胞。

可以例如用連接到掃描電子顯微鏡(nova600nanolab；fei)，在10kv操作且收集時(shí)間為30-45s的edaxgenesisedx系統(tǒng)，進(jìn)行能量色散x射線(edx)光譜。分析大約5μm²的區(qū)域。

可以用例如hitachisu8000顯微鏡，在低電壓(<1kv，近表面有機(jī)表面的分析)下進(jìn)行edx映射。將sem與xflash5010檢測器(允許同時(shí)進(jìn)行基于edx的元素分析的x射線檢測器)相結(jié)合。設(shè)備的這種組合用于更高電壓(10kv)分析，在此期間將xflash5010檢測器用于沉積物表面的元素映射。hypermap數(shù)據(jù)庫用于解釋。

x射線衍射分析

可以如所述進(jìn)行x射線衍射(xrd)實(shí)驗(yàn)(raynauds,etal.calciumphosphateapatiteswithvariableca/patomicratioi.synthesis，characterizationandthermalstabilityofpowder.biomaterials2002；23：1065-1072)。可以例如在具有cukα輻射(40kv，30ma)的philipspw1820衍射儀上，在2θ＝5-65°(δ2θ＝0.02，δt＝5s)的范圍記錄干燥粉末的圖案。ha晶體可以如所述進(jìn)行鑒定(leedsh，paiy，changs.affectofthermaltreatmentofthehydroxyapatitepowderonthemicroporeandmicrostructureofporousbiphasiccalciumphosphatecompositeparticles.jbiomatnanobiotechnol2013；4：14-1-118)。

傅里葉變換紅外光譜

可以通過使用微磨(瑪瑙研缽和杵)礦物粉末，例如在配備有g(shù)oldengateatr部件(specac)的atr-ftir分光鏡/varian660-ir光譜儀(agilent)中，進(jìn)行傅立葉變換紅外(ftir)光譜分析。實(shí)施例中所示的每個(gè)光譜代表具有4cm^-1(通常為550-1800cm^-1)的光譜分辨率的100次掃描的平均值。可以例如用varian660-ir軟件包5.2.0(agilent)，實(shí)現(xiàn)光譜的基線校正、平滑化和分析?？梢岳缬胦riginpro(版本8.5.1；originlab)進(jìn)行光譜的圖形顯示和注釋。

從caco3顆粒釋放ca²⁺

在單獨(dú)的試驗(yàn)中，將100μg/ml方解石或“ccp10”加入到含有1ml1mtris-hcl(ph7.4)的eppendorf管中。在室溫下孵育2h、2d、3d和8d后，取出100μl的樣品并離心，分析上清液中ca²⁺濃度?？梢岳缬霉舛葴y試試劑盒(例如，millipore/merckchemicals；貨號100858“calciumcelltest”)進(jìn)行測定。從測試試驗(yàn)中減去空白值。

培養(yǎng)saos-2細(xì)胞

將骨細(xì)胞如saos-2細(xì)胞(人類成骨肉瘤細(xì)胞)，在補(bǔ)充有2mml-谷氨酰胺、10％或15％熱滅活胎牛血清(fcs)和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的mccoy培養(yǎng)基(biochrom-seromed)中培養(yǎng)。將細(xì)胞在25-cm²培養(yǎng)瓶或6孔板(表面積9.46cm²；例如來自orangescientifique)中，在37℃的濕潤培養(yǎng)箱中孵育。常規(guī)地，以3×10⁴個(gè)或1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔開始培養(yǎng)，總體積為3ml。在此指出，培養(yǎng)物首先在不存在礦化-激活混合物(mac)中，在包含5mmβ-甘油磷酸酯、50mm抗壞血酸和10nm地塞米松的情況下培養(yǎng)3d。然后在不存在或存在mac的情況下，將培養(yǎng)物繼續(xù)孵育多達(dá)7d。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，向每個(gè)孔中加入ha/聚p礦物樣品(100μg/ml[ha，cap]或10μg/ml[“aca-聚p-np”])。每三天，用新鮮的培養(yǎng)基/血清替換培養(yǎng)基，并且在此指出也有mac。對于使用圓片的研究，使用24孔板(例如，來自corning；每個(gè)孔的直徑為15.6mm)，其中插入15mm大的圓片。以2ml細(xì)胞/培養(yǎng)基/fcs的總體積進(jìn)行試驗(yàn)。

在實(shí)施例中所示的另一系列實(shí)驗(yàn)中，在100μm硝酸鎵存在下進(jìn)行了試驗(yàn)。

細(xì)胞增殖/細(xì)胞存活力試驗(yàn)

可以例如通過基于四唑鹽xtt(例如，細(xì)胞增殖試劑盒ii(roche))或3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑(mtt；#m2128，sigma)的比色測定法，來測定細(xì)胞增殖/生長(wangxh,etal.(2014)modulationoftheinitialmineralizationprocessofsaos-2cellsbycarbonicanhydraseactivatorsandpolyphosphate.calciftissueint94:495-509)。

人類間充質(zhì)干細(xì)胞

用人間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)測定alp的表達(dá)，在saos-2細(xì)胞平行測定alp的表達(dá)。使用已建立的方法分離和培養(yǎng)細(xì)胞(wangxh,etal.themarinesponge-derivedinorganicpolymers,biosilicaandpolyphosphate,asmorphogeneticallyactivematrices/scaffoldsfordifferentiationofhumanmultipotentstromalcells:potentialapplicationin3dprintinganddistractionosteogenesis.marinedrugs12,1131-1147)。

逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)pcr分析

應(yīng)用定量實(shí)時(shí)rt[逆轉(zhuǎn)錄]-pcr(qrt-pcr)技術(shù)，來確定圓片對saos-2細(xì)胞中以下基因表達(dá)水平的影響。簡言之，從細(xì)胞中提取rna，使用以下引物對進(jìn)行pcr反應(yīng)：碳酸酐酶ix(caix；nm_001216人)fwd：5'-acatatctgcactcctgccctc-3'[nt977至nt998](seqidno1)和rev：5'-gcttagcactcagcatcactgtc-3'[nt1105至nt1083](seqidno.2)，堿性磷酸酶(alp；nm_000478.4)fwd：5'-tgcagtacgagctgaacaggaaca-3'[nt1141至nt1164](seqidno.3)和rev：5'-tccaccaaatgtgaagacgtggga-3'[nt1418至nt1395](seqidno.4)，i型膠原蛋白(coli；nm_000088.3)fwd：5'-gactgccaaagaagccttgcc-3'[nt5073至nt5093](seqidno：5)和rev：5'-ttcctgactctcctccgaaccc-3'[nt51196至nt5175](seqidno：6)和bmp2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；nm_001200.2)fwd：5'-accctttgtacgtggacttc-3'[nt1681至nt1700](seqidno：7)和rev：5'-gtggagttcagatgatcagc-3'[nt1785至nt1804](seqidno：no：8)。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)作為參考(nm_002046.5)fwd：5'-ccgtctagaaaaacctgcc-3'[nt929至nt947](seqidno.9)和rev：5'-gccaaattcgttgtcatacc-3'[nt1145至nt1126](seqidno.10)?？梢岳缭趇cycler(bio-rad)中，應(yīng)用各自的icycler軟件進(jìn)行pcr反應(yīng)。在確定ct值后，計(jì)算各個(gè)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。

制備基于plga的微球

詳細(xì)描述制備用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的微球體(wangsf,etal.(2014)bioactiveandbiodegradablesilicabiomaterialforboneregeneration.bone：67：292-304)。使用4mlplga/二氯甲烷溶液(體積比1:5)制備缺少ccp10的微球體；它們被稱為“cont-mic”(plga：聚(d，l-丙交酯-共-乙交酯)；丙交酯：乙交酯[75:25]；mol.wt.66,000-107,000)。對于制備含有caco3/聚p的微球體，以20％的濃度將“ccp10”微球體(“聚p-mic”)加入到plga/二氯甲烷混合物中。通過具有0.8mm孔徑的注射器壓制粘性反應(yīng)混合物。通過這種方法，獲得平均直徑≈820μm的微球體。

如所述測定微球體中聚p的含量(mahadevaiahms,etal.(2007)asimplespectrophotometricdeterminationofphosphateinsugarcanejuices，wateranddetergentsamples.e-journalofchemistry4：467-473)。

測定機(jī)械特性

可以例如用配備有已經(jīng)被熔合到套圈光纖頂部的懸臂的納米壓痕儀，來測定微球體和植入?yún)^(qū)域(再生區(qū)域)的肌肉組織的機(jī)械特性(wangsf等人(2014)bioactiveandbiodegradablesilicabiosaterialforboneregeneration.bone67：292-304)。使用該技術(shù)來量化降低的楊氏模量(redym)。

體內(nèi)相容性研究

在實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，使用重量在240g和290g(年齡：兩個(gè)月)之間的(雄性)性別的wistar大鼠；每組使用3只動(dòng)物。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，隨意提供飲食和飲水。在手術(shù)前，用10ml/kg體重的環(huán)丙沙星處理動(dòng)物，用于抗生素預(yù)防。然后通過肌內(nèi)注射用氯丙嗪/氯胺酮對動(dòng)物進(jìn)行麻醉。接下來在垂直于上肢水平的椎軸的右側(cè)半部和左側(cè)半部，進(jìn)行≈1cm切口的常規(guī)消毒。皮膚切開后，將肌肉切開并分開以容納微球。將微球體(100μl體積，≈20mg)引入肌肉中，并在更深的層中穩(wěn)定(vidyas.,parameswarana.,sugumaranvg(1994)comparativeevaluationoftissue.compatibilityofthreerootcanal.sealantsinrattusnorwegicus:ahistopathologicalstudy.endodontology6:7-17)。經(jīng)過2周、4周或8周的時(shí)間，處死動(dòng)物，切開有周圍組織的樣本并切片。對樣品宏觀地檢查炎癥、感染和變色。將樣品固定在福爾馬林中，切片，用梅氏蘇木精染色，然后通過光學(xué)顯微鏡(例如，用olympusahbt3顯微鏡)進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)分析

使用配對studentt檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評估。

序列表

<110>維爾納·恩斯特·路德維格·格奧爾格·米勒

<120>作為具有形態(tài)發(fā)生活性的包被層和支架的非晶形無機(jī)聚磷酸鹽-磷酸鈣和碳酸鈣顆粒

<130>m32732wo02

<150>gb1420363.2

<151>2014-11-17

<150>gb1513011.5

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