發(fā)明領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及醫(yī)療裝置和生物療法，更具體地涉及用于骨修復(fù)的基材，其包括負(fù)載蛋白的基質(zhì)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求vanderploeg等人于2014年8月28日提交的第62/043,3567號(hào)美國臨時(shí)申請(qǐng)和decker等人于2015年5月1日提交的第62/155,835號(hào)美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。將前述申請(qǐng)中的每一個(gè)的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

背景

每年大約兩百萬例骨科手術(shù)中使用骨移植物，并且通常采取三種形式之一。自體移植物，其通常由從患者的一個(gè)部位獲得的并將移植到同一患者的另一個(gè)部位的骨組成，是骨移植材料的基準(zhǔn)，因?yàn)檫@些材料同時(shí)是骨引導(dǎo)的(它充當(dāng)用于新骨生長的支架)、骨誘導(dǎo)的(促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)育)和成骨的(包含形成新骨的成骨細(xì)胞)。然而，自體移植物供應(yīng)上的限制使使用尸體來源的同種異體移植物成為必要。然而，這些材料與自體移植物相比不夠理想，因?yàn)橥N異體移植物可能引發(fā)宿主-移植物免疫應(yīng)答或可能傳播感染性或朊病毒疾病，并且它們經(jīng)常被消毒或處理以除去細(xì)胞，消除了它們的成骨能力。

人源的骨移植材料的缺點(diǎn)促使對(duì)合成骨移植材料的興趣增加。合成移植物通常包含以糊劑或油灰的形式遞送的鈣陶瓷和/或粘固劑(cement)。這些材料是骨引導(dǎo)的，但不是骨誘導(dǎo)的或成骨的。為了改善它們的功效，合成的含鈣材料已經(jīng)負(fù)載有骨誘導(dǎo)材料，特別是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)，例如bmp-2、bmp-7，或其他生長因子，例如成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)、胰島素樣生長因子(igf)、血小板源性生長因子(pdgf)和/或轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)。然而，顯著的技術(shù)挑戰(zhàn)阻礙了骨誘導(dǎo)材料有效地加入到合成骨移植替代物中，這進(jìn)而限制了高質(zhì)量的骨誘導(dǎo)的合成骨移植材料的開發(fā)。

發(fā)明概述

本發(fā)明通過提供具有改進(jìn)的骨誘導(dǎo)材料負(fù)載的移植材料及其制備方法和使用方法，解決了當(dāng)前合成的骨移植物的不足。一方面，本發(fā)明涉及用于形成復(fù)合骨誘導(dǎo)支架的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括骨誘導(dǎo)材料(該材料通常是，但也不必然是蛋白質(zhì)或肽，并且在本文所描述的示例性實(shí)施方案中，將可互換地稱為“骨誘導(dǎo)蛋白”)，鈣陶瓷顆粒和可流動(dòng)的生物相容的基質(zhì)材料中的至少一種，和限定至少一個(gè)室和至少一個(gè)入口的裝置，所述入口用于將所述蛋白質(zhì)、顆粒和/或基質(zhì)材料引入到所述室中。在不同的情況下，所述骨誘導(dǎo)材料在水溶液中，和/或所述裝置包括靜態(tài)混合元件(例如在一個(gè)或多個(gè)室中或通過流體連接于一個(gè)或多個(gè)室)。在一些情況下，顆粒、骨誘導(dǎo)材料和/或可流動(dòng)的生物相容的基質(zhì)材料中的一種或多種包括致孔劑或在致孔劑旁邊被結(jié)合到支架中，該致孔劑為任選的可移除的微粒，具有與可浸出的、可塌陷的(collapsible)、可溶解的或以其他方式可降解的顆粒的平均尺寸類似的平均尺寸。所述基質(zhì)任選地選自：透明質(zhì)酸(ha)、修飾的ha、膠原、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽、瓊脂糖、自組裝肽、全血、富血小板血漿、骨髓穿刺液、聚乙二醇(peg)、peg的衍生物、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、泊洛沙姆(poloxamer)、和其共聚物或組合。如果使用顆粒，其通常是多孔的，并且可以包括選自以下的材料：磷酸一鈣一水合物、磷酸二鈣、脫水磷酸二鈣、磷酸八鈣、沉淀羥磷灰石、沉淀無定形磷酸鈣、磷酸一鈣、α-磷酸三鈣(α-tcp)、β-磷酸三鈣(β-tcp)、燒結(jié)羥磷灰石、氧基磷灰石、磷酸四鈣、羥磷灰石，缺鈣羥磷灰石、及其組合。所述骨誘導(dǎo)材料任選地選自：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bmp-2)、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-9、設(shè)計(jì)的bmp(designerbmp)、成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、及其組合。同時(shí)，所述裝置任選地包括改進(jìn)結(jié)合到支架中的要素的混合的結(jié)構(gòu)，例如在室內(nèi)或可連接到室的靜態(tài)混合元件，和/或可插入到室中的有孔針。在一些情況下，如以下更詳細(xì)描述的，可以使用所述系統(tǒng)的各種實(shí)施方案來實(shí)施所述方法和/或形成醫(yī)學(xué)植入物。

另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備合成的移植材料的方法(任選地，但不一定使用上述系統(tǒng)之一)，其包括例如通過將顆粒與包含骨誘導(dǎo)材料的溶液接觸，使鈣陶瓷顆粒負(fù)載有骨誘導(dǎo)材料或與骨誘導(dǎo)材料結(jié)合，所述溶液任選地包括促進(jìn)與顆粒結(jié)合的生物相容的基質(zhì)的隨后形成的試劑，例如膠凝劑、膠凝催化劑和/或交聯(lián)劑。所述方法還可以包括將負(fù)載蛋白的鈣陶瓷顆粒包埋在生物相容的基質(zhì)中，所述生物相容的基質(zhì)可以流經(jīng)負(fù)載蛋白的顆粒(例如通過使可流動(dòng)的基質(zhì)材料流動(dòng)到包含負(fù)載蛋白的顆粒的室中)。在各種實(shí)施方案中，所述骨誘導(dǎo)材料是bmp-2、bmp-4、bmp-6、bmp-7或設(shè)計(jì)的bmp。所述鈣陶瓷顆粒各自包括硫酸鈣和磷酸鈣，例如羥磷灰石、磷酸三鈣、缺鈣羥磷灰石、或其組合，而生物相容的基質(zhì)材料在各種實(shí)施方案中為透明質(zhì)酸(ha)及其功能化的或修飾的變體、膠原(動(dòng)物或重組人的)、明膠(動(dòng)物或重組人的)、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽、瓊脂糖、自組裝肽、全血、富血小板血漿、骨髓穿刺液、聚乙二醇(peg)及其衍生物，官能化的或以其他方式可交聯(lián)的合成的生物相容的聚合物，包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、泊洛沙姆(poloxamer)和本領(lǐng)域已知的其他的熱敏或反向熱敏聚合物，及上述的任何一種或多種的共聚物或混合物。所述生物相容的基質(zhì)材料在一些情況下是反應(yīng)性的，并且可以被觸發(fā)以經(jīng)歷聚合反應(yīng)和交聯(lián)反應(yīng)中的一種或多種以形成凝膠或其他的聚合物團(tuán)；當(dāng)在這種情況下時(shí)，一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)任選地在30秒和5分鐘之間發(fā)生，并且在該間隔中，所述基質(zhì)材料可以任選地流動(dòng)到顆粒上和/或與顆?；旌希瑥亩龠M(jìn)更均勻的植入物的形成。

另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用上述系統(tǒng)和/或方法形成的植入物，該植入物包括生物相容的基質(zhì)、與鈣陶瓷顆粒的內(nèi)表面(例如孔表面)結(jié)合的骨誘導(dǎo)材料，該鈣陶瓷顆粒轉(zhuǎn)而結(jié)合于基質(zhì)。在優(yōu)選的情況中，所述植入物是基本上均勻的，即骨誘導(dǎo)材料和鈣陶瓷顆粒和生物相容的基質(zhì)材料中的一種或多種的濃度沿著所述植入物的至少一個(gè)物理維度基本上恒定。

再另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療患者的方法，包括遞送包含負(fù)載有骨誘導(dǎo)材料或與骨誘導(dǎo)材料結(jié)合的鈣陶瓷顆粒的組合物，所述顆粒包埋到生物相容的基質(zhì)中。在各種實(shí)施方案中，所述骨誘導(dǎo)材料為bmp-2、bmp-4、bmp-6、bmp-7或設(shè)計(jì)的bmp。所述鈣陶瓷顆粒各自包括硫酸鈣和磷酸鈣，例如羥磷灰石、磷酸三鈣、缺鈣羥磷灰石、或其組合，而生物相容的基質(zhì)在各種實(shí)施方案中為透明質(zhì)酸(ha)及其官能化的或修飾的變體、膠原(動(dòng)物或重組人的)、明膠(動(dòng)物或重組人的)、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽、瓊脂糖、自組裝肽、全血、富血小板血漿、骨髓穿刺液、聚乙二醇(peg)及其衍生物、官能化的或以其他方式可交聯(lián)的合成的生物相容的聚合物，包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、泊洛沙姆(poloxamer)和本領(lǐng)域已知的其他熱敏或反向熱敏聚合物，及上述任何一種或多種的共聚物或混合物。

再另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于使用骨誘導(dǎo)材料治療患者的試劑盒。該試劑盒通常包括鈣陶瓷顆粒、骨誘導(dǎo)材料和生物相容的支架材料，以及用于將它們組合以形成骨誘導(dǎo)合成骨移植物的機(jī)械工具。在一些情況下，該試劑盒包括容器，所述容器包括用于容納顆粒的室以及入口和出口，通過所述入口和出口可以將流體供應(yīng)到室和/或從室中抽出。在一個(gè)方案中，通過使包含骨誘導(dǎo)材料的液體流動(dòng)通過入口并與顆粒接觸，使所述顆粒負(fù)載骨誘導(dǎo)材料；此后，將所述顆粒與生物相容的基質(zhì)材料混合或以其他方式將顆粒與生物相容的基質(zhì)材料接觸放置。

附圖說明

通過附圖說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案。應(yīng)理解的是，附圖不一定是按比例的，并且對(duì)于理解發(fā)明非必要的細(xì)節(jié)或者使得其他細(xì)節(jié)難以理解的細(xì)節(jié)可以省略。應(yīng)理解的是，本發(fā)明不必限于本文所描述的特定的實(shí)施方案。

圖1a-b顯示本發(fā)明的具有不同的大孔隙度的兩種構(gòu)建體。

圖2a-c顯示制備合成的骨誘導(dǎo)骨移植材料的示例性方法的幾個(gè)步驟。

圖3a顯示包括有孔針的示例性混合裝置。圖3b示出在示例性的混合室中流體流動(dòng)的方向。圖3c-n顯示了在其他類似的混合裝置中，使用無孔針(c至h)和使用在中心設(shè)置的將骨誘導(dǎo)因子(bmp2在該處為青色)和生物相容的基質(zhì)的溶液施加至顆粒的有孔針(i至n)制備的支架的橫截面視圖。這些圖說明與沒有包埋有孔針的裝置相比，使用有孔針施加溶液實(shí)現(xiàn)了骨誘導(dǎo)材料、顆粒和基質(zhì)材料的改進(jìn)的分布。

圖4a-b顯示混合并修整端部后的圓柱形的植入物(2a)和混合后在注射器中形成的圓柱形的植入物(2b)。

圖5顯示在抗壓測試之前在流變儀上的圓柱形的植入物的切片。

圖6是比較各種水凝膠組合物的剪切存儲(chǔ)(g')和剪切損失(g")模量之間的相位差的圖表。

圖7是顯示每種水凝膠組合物完成交聯(lián)反應(yīng)所需的時(shí)間的圖表。

圖8是顯示每種水凝膠組合物的最大剛度的圖表。

圖9顯示用于連接兩個(gè)混合注射器的各種連接器設(shè)計(jì)。

圖10a-d顯示用于測試混合潛力的內(nèi)部混合結(jié)構(gòu)的變化。靜態(tài)混合器設(shè)計(jì)包括空心管(10a)、半球(10b)、單橫梁(ioc)和雙橫梁(10d)。

圖11a-b顯示使用透明塑料制備的連接器的機(jī)械研磨的原型(11a)以實(shí)現(xiàn)混合過程的可視化(11b)。

圖12顯示在包括半球靜態(tài)混合器的連接器中積累的廢料。

圖13a-b顯示包括連接到兩個(gè)混合注射器(13b)的單橫梁靜態(tài)混合器(13a)的3-d打印的連接器。

圖14a-b是顯示測試的每種水凝膠組合物的每個(gè)5mm切片的彈性模量(14a)和密度(14b)的平均值的圖表。

圖15是顯示由不同顆粒濃度組成的水凝膠組合物的機(jī)械性能的可變性的圖表。

圖16是顯示具有相同的顆粒組成的水凝膠組合物的切片之間的機(jī)械性能的偏差的圖表。

圖17是顯示在每種水凝膠組合物的切片之間的熒光素標(biāo)記的白蛋白的歸一化強(qiáng)度值的圖表。

圖18是顯示每種水凝膠組合物的熒光團(tuán)標(biāo)記的白蛋白熒光的偏差的圖表。

圖19是顯示在包含20％或30％顆粒的水凝膠組合物的四個(gè)切片中使用af488標(biāo)記的bmp-2的歸一化強(qiáng)度值的圖表。

圖20a-b是包含按體積計(jì)30％的具有在bmp緩沖液中稀釋的bmp-2的顆粒的水凝膠組合物的共聚焦圖像。

圖21a-b是顯示從af488標(biāo)記的bmp-2發(fā)射的熒光的平均強(qiáng)度的圖表。

詳述

骨誘導(dǎo)組合物

根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方案的植入物(也稱為“構(gòu)建體”)通常包括三種組分：骨引導(dǎo)材料，例如鈣陶瓷或其他的固體礦物主體，骨誘導(dǎo)材料，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白，和反應(yīng)以形成凝膠或其他物質(zhì)的可流動(dòng)的生物相容的基質(zhì)材料。如本文所使用的，骨引導(dǎo)材料指促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(osteoblasticcell)的向內(nèi)生長的任何材料，所述成骨細(xì)胞樣細(xì)胞包括成骨細(xì)胞(osteoblast)、前成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和其他細(xì)胞，其能夠分化為合成和/或維持骨骼組織的細(xì)胞或以其他方式促進(jìn)合成和/或維持骨骼組織的細(xì)胞的發(fā)育。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述骨引導(dǎo)材料是包含骨引導(dǎo)磷酸鈣陶瓷的多孔顆粒，其適用于提供在顆粒上負(fù)載的骨誘導(dǎo)物質(zhì)的持續(xù)釋放。在一些情況下，所述顆粒包括微孔和大孔兩者，其限定了骨誘導(dǎo)物質(zhì)可以粘附或以其他方式結(jié)合在其上的表面。微孔和大孔兩者增加了骨誘導(dǎo)物質(zhì)可以粘附的總表面積，但是只有大孔允許細(xì)胞的浸潤。因此，在微孔中的骨誘導(dǎo)物質(zhì)只能逐漸變得可用，因?yàn)轭w粒被浸潤大孔的細(xì)胞降解。

所述顆粒可以由任何合適的骨引導(dǎo)材料制備，所述材料具有適于使本發(fā)明的植入物保留在原位并隨著對(duì)于骨形成和骨愈合而言最佳的時(shí)間間隔(例如數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月)釋放骨誘導(dǎo)材料的組成和結(jié)構(gòu)。雖然這些特性可以在應(yīng)用間變化，但所述顆粒通常包括但不限于磷酸一鈣一水合物、磷酸二鈣、脫水磷酸二鈣、磷酸八鈣、沉淀羥磷灰石、沉淀無定形磷酸鈣、磷酸一鈣、α-磷酸三鈣(α-tcp)、β-磷酸三鈣(β-tcp)、燒結(jié)羥磷灰石、氧基磷灰石、磷酸四鈣、羥磷灰石、缺鈣羥磷灰石、及其組合。

關(guān)于顆粒結(jié)構(gòu)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒通過(a)表面積和(b)孔隙度表征，此外，選擇(a)表面積和(b)孔隙度以使本發(fā)明的植入物保留在原位并隨著對(duì)于骨形成和骨愈合而言最佳的時(shí)間間隔(例如數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月)釋放骨誘導(dǎo)材料。孔隙度具有兩個(gè)部分：微孔隙度和大孔隙度，可以對(duì)其進(jìn)行選擇以獲得所需的顆粒停留時(shí)間或骨誘導(dǎo)材料的釋放動(dòng)力學(xué)。微孔隙度通常指存在以下孔，其具有相對(duì)窄的平均直徑，但仍然足夠大以允許流體，例如負(fù)載bmp的溶液浸潤到微孔中而沒有立即接觸微孔的表面(即，足夠大以允許流體進(jìn)入而沒有過多的表面張力)。就顆粒而言，大孔隙度通常是指存在在尺寸上允許細(xì)胞浸潤的孔。

骨誘導(dǎo)材料通常包括刺激成骨細(xì)胞的產(chǎn)生或增加成骨細(xì)胞的活性和/或抑制破骨細(xì)胞的活性或產(chǎn)生的肽和非肽生長因子。在一些實(shí)施方案中，骨誘導(dǎo)材料是轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)超家族的成員，如tgf-β。更優(yōu)選地，骨誘導(dǎo)材料是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)，例如bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-9或設(shè)計(jì)的bmp，例如berasi等人的題為“designerosteogenicproteins”的第us20120046227al號(hào)美國預(yù)授權(quán)公開申請(qǐng)所描述的bmp-ger或bmp-ger-nr嵌合bmp，其全部公開內(nèi)容出于所有目的通過引用并入本文。在其他的實(shí)施方案中，骨誘導(dǎo)材料是成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、血小板源性生長因子、小分子、核苷酸、脂質(zhì)或本文所列出的一種或多種因子的組合。

本發(fā)明的各種實(shí)施方案使用生物相容的基質(zhì)，其可以是任何合適的生物相容的材料，其優(yōu)選地(a)當(dāng)與顆粒一起使用時(shí)，表現(xiàn)出足夠的剛度和/或柱強(qiáng)度以承受植入時(shí)施加在其上的負(fù)載，(b)其不引起過度炎癥(即足以抑制或阻礙新骨形成或斷骨愈合的炎癥)，不抑制成骨細(xì)胞的增殖或以其他方式干擾顆粒和/或骨誘導(dǎo)材料的活性，和(c)在合適的間隔內(nèi)具有足夠的內(nèi)聚力以允許新骨的沉積。此外，生物相容的基質(zhì)是任選的可降解的和/或骨引導(dǎo)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物相容的基質(zhì)由反應(yīng)形成凝膠或其他固體物質(zhì)的可流動(dòng)的前體材料制成，例如通過在顆粒存在下的聚合和/或交聯(lián)。在各種實(shí)施方案中，基質(zhì)包括透明質(zhì)酸(ha)及其官能化的或修飾的形式、膠原(動(dòng)物或重組人的)、明膠(動(dòng)物或重組人的)、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽、瓊脂糖、自組裝肽、全血、富血小板血漿、骨髓穿刺液、聚乙二醇(peg)及其衍生物、官能化的或以其他方式可交聯(lián)的合成的生物相容的聚合物，包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、泊洛沙姆和本領(lǐng)域已知的其他的熱敏或反向熱敏聚合物，及上述的任何一種或多種的共聚物或混合物?；|(zhì)材料形成凝膠或其他物質(zhì)的反應(yīng)過程優(yōu)選為短的，但非瞬時(shí)的過程，其需要例如30秒、1分鐘、5分鐘、直至10分鐘，以允許材料流動(dòng)到顆粒上和/或與顆?；旌喜⑿纬上鄬?duì)均勻的混合物，這將產(chǎn)生組成上(和因此機(jī)械性能上)均勻的植入物。

在一些情況下，為了反應(yīng)形成凝膠或物質(zhì)，基質(zhì)材料需要催化劑和共反應(yīng)物中的一種或多種。催化劑或共反應(yīng)物可以與基質(zhì)材料同時(shí)提供，或者在一些情況下，可以在引入基質(zhì)材料之前提供。在一個(gè)實(shí)例中，所選擇的基質(zhì)材料進(jìn)行酶催化的交聯(lián)反應(yīng)所必需的試劑(過氧化氫)包含在施用于顆粒的骨誘導(dǎo)材料的溶液中。因此，當(dāng)聚合物溶液與顆粒接觸時(shí)開始交聯(lián)。在添加基質(zhì)材料之前，也可以將其他的交聯(lián)劑或聚合劑，例如過氧化氫，光引發(fā)劑或二價(jià)陽離子添加到顆粒中。

包括如上所述的骨誘導(dǎo)材料、顆粒和生物相容的基質(zhì)的本發(fā)明的植入物或構(gòu)建體還具有適于促進(jìn)骨生長和愈合的特性，其包括(a)適于本申請(qǐng)的骨誘導(dǎo)材料的釋放的動(dòng)力學(xué)，(b)適于促進(jìn)但不干擾新骨形成的停留時(shí)間，(c)允許細(xì)胞和組織，包括伴隨新骨形成的新的血管組織的浸潤的大孔隙度，和(d)足夠的剛度和/或抗壓性以承受施加到植入物的負(fù)載。

關(guān)于大孔隙度，圖1顯示了具有相對(duì)高(圖1a)和相對(duì)低(圖1b)的孔隙度的本發(fā)明的構(gòu)建體。在圖1中以橫截面顯示的構(gòu)建體在組成上彼此類似，但是圖1a的構(gòu)建體摻入致孔劑尺寸的蔗糖晶體，而圖1b的構(gòu)建體沒有。不希望被任何理論束縛，相信在沒有添加致孔劑的情況下，構(gòu)建體的孔隙度將隨顆粒的尺寸變化：所使用的陶瓷顆粒的尺寸越大，它們之間的空間越大。然而，當(dāng)陶瓷顆粒在300至500微米范圍內(nèi)時(shí)，如在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，并且如圖1b所描述的，在不添加致孔劑的情況下，顆粒之間的孔通常將低于理想的孔隙度(也為300至500微米)。

負(fù)載過程

本發(fā)明的合成的骨移植材料通常通過顆粒、骨誘導(dǎo)材料和生物相容的基質(zhì)材料的順序組合來制備。圖2a-c描繪了用于制備合成的骨移植物的示例性兩步方法。首先，如圖2a-b所示，將骨誘導(dǎo)材料，例如bmp施加到顆粒上，例如通過使含有骨誘導(dǎo)材料的溶液流動(dòng)到顆粒上，以允許材料粘附到顆粒內(nèi)的各種表面，包括內(nèi)部孔表面(如果有)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，施加到顆粒的溶液的體積足以完全潤濕顆粒，從而確保所有表面(包括內(nèi)部孔表面)與骨誘導(dǎo)材料一起孵育。顆粒的孵育可以在各種間隔、溫度、壓力下進(jìn)行(可能是促進(jìn)微孔的完全浸潤必需的)，或者可以另外的以任何合適的方式操作以調(diào)節(jié)骨誘導(dǎo)材料和顆粒的組合。任選地通過包含一種或多種表面活性劑來促進(jìn)流體浸潤到顆粒中。

在負(fù)載步驟之后，將顆粒包埋到生物相容的基質(zhì)中。在一些情況下，如在圖2c中所示，將產(chǎn)生基質(zhì)的制劑，例如可交聯(lián)的預(yù)聚物施加到顆粒并且反應(yīng)以形成基質(zhì)。優(yōu)選地將致孔劑添加到制劑中，使得到的構(gòu)建體具有合適的大孔隙度(例如在300和500微米之間的孔)。可以使用任何致孔劑，但是在優(yōu)選的實(shí)施方案中，致孔劑是生物相容的，是作為尺寸與在構(gòu)建體中使用的陶瓷顆粒類似的微粒提供的，并且具有的密度大于或至少不顯著小于產(chǎn)生基質(zhì)的制劑的密度，使得其在基質(zhì)的形成期間不被置換或稀釋。當(dāng)使用可浸出的顆粒時(shí)，其優(yōu)選地相對(duì)不溶于制劑中，使得其在生物相容的基質(zhì)形成的同時(shí)保持在固相中。在一些實(shí)施方案中，使用被配置為響應(yīng)于所施加的外部能量，例如超聲或uv光而塌陷或溶解的微球，而在其他的實(shí)施方案中，使用熱敏致孔劑顆粒，例如熱敏性(或反向熱敏性)聚合物珠作為致孔劑。

在構(gòu)建體形成后，致孔劑可以降解或迅速除去，或者甚至在將構(gòu)建體植入患者體內(nèi)后仍保留在原位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，致孔劑在幾小時(shí)或幾天，但小于一周內(nèi)保持完整。

除了上述聚合物組合物之外或代替上述聚合物組合物，生物相容的基質(zhì)可以包括可用于治療骨的其他材料，例如丙烯酸酯聚合物材料(如聚甲基丙烯酸甲酯)、脫礦骨、磷酸鈣油灰等。

在一些情況下，在生物相容的基質(zhì)中顆粒的負(fù)載和/或它們的位置是由最終用戶成套進(jìn)行的。這種成套負(fù)載通過試劑盒來促成，該試劑盒在示例性實(shí)施方案中包括用于容納顆粒，并且骨誘導(dǎo)材料和/或生物相容的基質(zhì)可以流入其中的容器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，容器包括入口、出口和用于容納多個(gè)顆粒的空間。入口和出口的一個(gè)或多個(gè)可連接到流體源，例如通過公或母魯爾接頭的方式。試劑盒還任選地包括用于限制骨誘導(dǎo)材料的聚集物的摻入和/或用于防止顆粒逸出的過濾器和用于改進(jìn)流動(dòng)通過其中的材料混合的靜態(tài)混合器中的一個(gè)或多個(gè)。另外，骨誘導(dǎo)材料和生物相容的基質(zhì)材料中的一種或多種可以以液體形式提供，例如，在預(yù)裝載的注射器中，或以可復(fù)溶的形式提供(例如以凍干或冷凍干燥的形式與用于復(fù)溶的稀釋劑一起在小瓶中)。當(dāng)使用致孔劑時(shí)，其可以單獨(dú)提供，用于在其施用于負(fù)載的顆粒之前即刻與生物相容的基質(zhì)混合，或者如果在其中是穩(wěn)定的，其可以與顆粒、骨誘導(dǎo)材料(例如在其溶液中)和/或生物相容的基質(zhì)中的一種或多種混合。例如，在使用可浸出的致孔劑顆粒(例如無機(jī)鹽晶體)時(shí)，其可以單獨(dú)提供，然后將其添加到骨誘導(dǎo)材料和/或生物相容的基質(zhì)材料與顆粒的孵育物中，或者其可以在將基質(zhì)材料施加到顆粒之前與使用稀釋劑(例如水)潤濕的凍干的生物相容的基質(zhì)材料一起提供；可浸出的致孔劑以顆?；蚓Я?grain)的形式提供，所述顆?；蚓Я５某叽绱笾孪嗤⑶蚁鄬?duì)不溶于稀釋劑。

為了使用本發(fā)明的試劑盒，使用者首先將含有顆粒的容器連接到含有骨誘導(dǎo)材料的第一溶液源，使第一溶液流入容器中并流經(jīng)顆粒。接下來，使用者斷開第一溶液源并連接含有生物相容的基質(zhì)材料的第二溶液源。在基質(zhì)形成之后，移除移植物并任選地制備用于植入患者體內(nèi)，例如通過修整和/或負(fù)載到植入物中。

本發(fā)明的某些原理通過以下非限定性實(shí)施例說明：

實(shí)施例1：水凝膠的特性的測試

在一些情況下，本發(fā)明公開的裝置、系統(tǒng)和方法可以用于將骨誘導(dǎo)材料均勻地負(fù)載到水凝膠支架內(nèi)的磷酸鈣顆粒上。一種潛在的水凝膠材料是酪胺取代的透明質(zhì)酸(ha)。為了理解這種水凝膠的流動(dòng)特性，如圖3所示，使用ar2000流變儀(tainstruments，newcastledelaware)分析了在特定濃度(5mg/ml或10mg/ml)下具有交聯(lián)活性的酪胺堿(tyraminebase)的各種取代(1％、3％和5％)的水凝膠的振蕩和流動(dòng)測試。使用其中將900μl水凝膠分配到2°，40mm直徑的鋁錐下的流變儀表面上的流程測試水凝膠動(dòng)力學(xué)。在恒定溫度(25℃)下，每種水凝膠的粘度是相對(duì)于0至60pa的施加的剪切應(yīng)力范圍的。為了分析每種水凝膠隨時(shí)間的變化，對(duì)六種水凝膠組合物中的每一種進(jìn)行振蕩測試。將900μl水凝膠加入到鋁錐下方的流變儀的平臺(tái)。進(jìn)行20分鐘的時(shí)間掃描，其中振蕩的頻率在恒定的1％應(yīng)變下保持在1hz。90秒后，根據(jù)下式，在鋁錐邊緣的周圍以三個(gè)等量添加化學(xué)計(jì)量的過氧化氫：總過氧化氫量(μl)＝(0.496)(x)(y)；其中x＝酪胺堿取代的百分比(即1％＝1)，y＝水凝膠的濃度(即5mg/ml＝5)。

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)剪切模量g'和g"以及它們之間的δ相位差定量。作為對(duì)照，在沒有添加過氧化物的水凝膠中進(jìn)行振蕩測試，確保水凝膠的變化是由于添加過氧化物試劑。使用振蕩數(shù)據(jù)通過以下等式1獲得每種水凝膠的復(fù)數(shù)剪切模量：

實(shí)施例2：使用有孔針形成軸向上均勻的植入物

轉(zhuǎn)向圖3，在測試bmp和可流動(dòng)基質(zhì)材料過程中面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是這些材料在植入物形成過程中不均勻的混合，這產(chǎn)生相對(duì)不均勻的植入物，其可能由于在基質(zhì)中bmp和/或顆粒的濃度不均勻而更容易出現(xiàn)機(jī)械故障和/或不一致的生物活性。改善植入物的一致性的一種方式是使用有孔針(圖3a)，其包括沿著其長度的多個(gè)端口，通過這些端口溶液可以流入填充有顆粒的室(例如注射器筒)中。在如圖3所示的實(shí)施例1中，具有閉合的遠(yuǎn)端的有孔針或多或少地插入到狹長的室的中心，例如至少部分地使用顆粒填充的注射器筒。此后，熒光標(biāo)記的bmp-2和過氧化氫(用于交聯(lián)生物相容的基質(zhì)所需的試劑)的溶液通過針流入室內(nèi)。在bmp-2/過氧化氫溶液之后，使官能化的透明質(zhì)酸溶液流動(dòng)通過針并流經(jīng)顆粒。供選擇地，通過注射器的魯爾接頭將溶液依次施加到顆粒，而不使用位于中心的有孔針。在兩種情況下，流體在近端到遠(yuǎn)端的方向上流動(dòng)。在沒有有孔針的情況下，流入室的溶液在到達(dá)位于遠(yuǎn)端的顆粒之前必然接觸位于近端的顆粒。相比之下，有孔針允許新鮮溶液與顆粒貫穿室的長軸幾乎同時(shí)接觸。如圖3c至3n所示，當(dāng)與bmp/過氧化氫和生物相容的基質(zhì)的大量推注施加所達(dá)到的分布相比時(shí)，使用有孔針產(chǎn)生了沿著所獲得的植入物的徑向(例如從中心到邊緣)尺寸和軸向(近端到遠(yuǎn)端)尺寸基本上更均勻地分布的bmp(熒光信號(hào))。

實(shí)施例3：使用靜態(tài)混合器形成均勻的植入物

為了在生物相容的基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生包含負(fù)載bmp的顆粒的植入物，將植入物的組分置于兩個(gè)注射器中并且來回通過靜態(tài)混合器連接器。將水凝膠材料加入到一個(gè)注射器中，同時(shí)將顆粒、所需的蛋白(或染料)和0.09％的過氧化氫在另一個(gè)注射器中合并。然后將混合連接器緊密地?cái)Q到保持水平的注射器上，使得沒有組分可以離開系統(tǒng)和/或過早混合。為了混合水凝膠和顆粒組分，首先將水凝膠注射器插入，使得水凝膠移動(dòng)到含有顆?；旌衔锏淖⑸淦髦?。然后將顆?；旌衔镒⑸淦鞑迦耄沟盟薪M分通過靜態(tài)混合器移動(dòng)到另一個(gè)注射器中。該混合在5秒的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行10次。在該過程中，裝置沿其軸線旋轉(zhuǎn)以減輕顆粒的沉降。在5秒的混合時(shí)間后，將裝置垂直設(shè)置，使得所有材料流入注射器的底部并且植入物凝固。注射器的形狀和使用的材料的量(1800μl)形成直徑為10mm的20mm長的圓柱形植入物。

實(shí)施例4：機(jī)械植入物分析

使用平行板流變儀來評(píng)價(jià)使用靜態(tài)混合裝置制備的植入物的機(jī)械性能。使用ar2000流變儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)流變測試。使用單橫梁設(shè)計(jì)來制備植入物，以在10mg/ml的濃度下混合3％的酪胺取代物、臺(tái)盼藍(lán)染料、0.09％過氧化物和顆粒。(表1)。

表1：支架混合物的濃度

將得到的植入物(直徑10mm，長度20mm)切成四個(gè)5mm厚的切片(圖4a-b)。將這些切片標(biāo)記為從a(對(duì)應(yīng)于在切割時(shí)最接近注射器的開口的切片)至d(離注射器的開口最遠(yuǎn)的切片)。將切片儲(chǔ)存在100μl的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中以防止干燥。測量每個(gè)切片的質(zhì)量，并通過將質(zhì)量除以0.393ml體積計(jì)算密度。使用直徑40mm的鋁平行板配置在每個(gè)植入物盤上施加壓縮力(圖5)。將流變儀板移動(dòng)到樣品頂部以上100μm，并以恒定速率(10μm/s)降低，將樣品壓縮至50％應(yīng)變(2.5mm)。記錄壓縮力作為流變儀板的高度的函數(shù)。基于這些值，計(jì)算每個(gè)樣品的實(shí)際應(yīng)力和實(shí)際應(yīng)變曲線。基于該圖表的線性區(qū)域計(jì)算彈性模量并在樣品之間進(jìn)行比較。這些試驗(yàn)用20體積％、25體積％和30體積％的顆粒濃度完成。對(duì)照試驗(yàn)包括測試沒有顆粒的水凝膠和使用沒有混合幾何形狀的中空管連接器混合的30％顆粒濃度的水凝膠。

實(shí)施例5：熒光板讀數(shù)器分析

使用熒光標(biāo)記的白蛋白alexafluor-647(af647)蛋白(647nm激發(fā)波長；670nm發(fā)射波長)制備植入物。使用單橫梁原型在10mg/ml的濃度下混合3％的酪胺取代物、在pbs中以1：250稀釋的標(biāo)記的白蛋白af647、0.09％的過氧化物和顆粒(表1)。在將模具切成5mm的切片并收集機(jī)械測試數(shù)據(jù)后，將每個(gè)切片置于具有100μl的pbs的48孔板的單個(gè)孔中。用spectramax^tmm5酶標(biāo)儀(moleculardevices，llc，sunnyvale，ca)讀板，以確定每個(gè)5mm切片內(nèi)的熒光強(qiáng)度。然后用每個(gè)切片內(nèi)的白蛋白的量將熒光強(qiáng)度歸一化。在使用白蛋白初始測試后，使用在bmp緩沖液(50mm谷氨酸，0.75％甘氨酸，ph3.75)中以1:120稀釋的alexafluor-488(af488)標(biāo)記的bmp-2(488nm激發(fā)波長；520nm發(fā)射波長)制備植入物，并且使用相同的方法測量熒光。

實(shí)施例6：水凝膠凝固和剛度測量

在各種水凝膠(例如，1％、3％和5％的酪胺堿取代；5mg/ml和10mg/ml的濃度)中表征相對(duì)的過氧化物連接凝固時(shí)間和剛度。每個(gè)相位差曲線的穩(wěn)定下降顯示每種水凝膠從粘性液體到彈性固體的進(jìn)展(圖6)。凝固時(shí)間是從加入過氧化物時(shí)直到剪切模量的剪切存儲(chǔ)g'(彈性)組分超過剪切損失g"(粘性)組分的時(shí)間跨度。在給定的酪胺堿取代中，具有較高的酪胺堿取代和較高的水凝膠濃度的水凝膠凝固較慢(圖7)。具有最長的凝固時(shí)間的水凝膠在5mg/ml下為1％取代，在10mg/ml下為1％取代，在10mg/ml下為3％取代(表2)。

表2：交聯(lián)反應(yīng)的完成時(shí)間

復(fù)數(shù)剪切模量g*確定了在測試的水凝膠中的相對(duì)剛度。在給定的酪胺堿取代中，具有較高濃度的水凝膠具有較大的復(fù)數(shù)模量(圖8)。最終凝固的最硬的水凝膠在10mg/ml下為3％取代和在10mg/ml下為5％取代(圖8；表3)。選擇在10mg/ml下具有3％取代的水凝膠。

表3：在20分鐘的交聯(lián)反應(yīng)期間測量的最大剛度值

實(shí)施例7：裝置原型設(shè)計(jì)

在選擇水凝膠之后，開發(fā)了用于均勻地混合植入物組分的裝置。創(chuàng)建用于混合裝置的多個(gè)構(gòu)思以開始設(shè)計(jì)過程。這些構(gòu)思包括但決不限于雙筒注射器、旋轉(zhuǎn)葉片式混合器、軋管法和靜態(tài)混合器。由于水凝膠交聯(lián)反應(yīng)的快速凝固時(shí)間，在凝膠通過混合剪切之前，使用攪拌棒的標(biāo)準(zhǔn)混合不會(huì)提供足夠的顆粒分布。選擇靜態(tài)混合器是因?yàn)樗顑?yōu)地滿足功能設(shè)計(jì)要求。靜態(tài)混合器操作簡單，制造成本低，是一次性的并且均勻地混合植入物的組分，同時(shí)使廢料最少化。此外，該裝置能夠與商業(yè)注射器一起使用，消除了與制造新注射器相關(guān)的時(shí)間和成本。

靜態(tài)混合器的設(shè)計(jì)經(jīng)過幾次迭代，制造了提供注射器之間的最短距離以及氣密配合的連接器。混合器的先前版太長，導(dǎo)致材料留在連接器內(nèi)部，并且其不是氣密的，使得材料從裝置滲出。該裝置的機(jī)械加工和3d打印版均是短而氣密的，但是重現(xiàn)機(jī)械加工版更困難并且耗時(shí)。3d打印的混合器被重新設(shè)計(jì)以包括各種內(nèi)部幾何形狀，其被配置為通過混合器的擾動(dòng)材料流，使得顆粒均勻地分散在整個(gè)水凝膠中。一些混合器，例如雙橫梁和半球設(shè)計(jì)，不允許所有材料流動(dòng)通過，在連接器中留下浪費(fèi)的材料。選擇單橫梁設(shè)計(jì)，部分是因?yàn)樗峁┝司鶆虻幕旌希瑫r(shí)允許大部分材料流動(dòng)通過。

靜態(tài)混合器設(shè)計(jì)選自四種初始構(gòu)思。3d打印原型被設(shè)計(jì)為配合現(xiàn)有注射器的螺紋以使它們氣密。最初，將橡膠o形環(huán)添加到混合器的內(nèi)部以形成氣密密封。進(jìn)一步的設(shè)計(jì)變化導(dǎo)致更好的配合螺紋，消除了對(duì)o形環(huán)的需要。為了將浪費(fèi)最小化，減小了連接到混合器時(shí)注射器的端部之間的距離?；旌掀餍螤畹倪M(jìn)展如圖9所示。如圖10a-d所示，一旦設(shè)計(jì)的形狀和螺紋完成，將產(chǎn)生內(nèi)部混合結(jié)構(gòu)的變化，例如中空管(10a)、半球(10b)、單橫梁(ioc)和雙橫梁(10d)，以測試它們的混合能力。

由于3d打印機(jī)的溫度限制，不能使用用于觀察混合裝置內(nèi)的混合的透明塑料。因此，通過研磨透明塑料管材使其與沒有螺紋的商用注射器具有壓配合密封，產(chǎn)生靜態(tài)混合器的另外的原型(圖11a-b)。雖然這些部件實(shí)現(xiàn)通過裝置觀察混合過程，但機(jī)械加工的限制限定了內(nèi)部幾何形狀的可變性。3d打印原型證明了好得多的可重現(xiàn)性以及生產(chǎn)和修飾的時(shí)間效率。最初通過目視比較植入物和它們產(chǎn)生的廢料來評(píng)價(jià)不同的混合幾何形狀。在雙橫梁和半球原型的靜態(tài)混合器組件中保留了相對(duì)大量的廢料(圖12)。因此，選擇單橫梁3d打印設(shè)計(jì)作為最終的裝置設(shè)計(jì)(圖13)。

實(shí)施例8：評(píng)估產(chǎn)生的構(gòu)建體的均勻性

混合器設(shè)計(jì)一旦完成，就測試所產(chǎn)生的支架的均勻性和重現(xiàn)性。支架的均勻機(jī)械強(qiáng)度甚至確保在恢復(fù)期間的骨生長。如果支架的機(jī)械性能不均勻，則發(fā)育的骨的強(qiáng)度和密度也可能變化。因此，測試形成的植入物的密度和全部四個(gè)切片的彈性模量。結(jié)果證明給定的支架內(nèi)全部切片的密度相對(duì)均勻，偏差約為4％。此外，用于給定顆粒濃度的支架是可重現(xiàn)的，因?yàn)閱我唤M合物的每個(gè)測試顯示出相對(duì)等同的密度，方差約為5％。因此，混合裝置能夠相對(duì)于均勻支架的密度分布重復(fù)地產(chǎn)生均勻的支架，并滿足在10％方差內(nèi)的要求。在這些測試期間確實(shí)產(chǎn)生的一些方差，可能是由于尺寸不完美的切片，因?yàn)槟z是柔性的并且在被切割為切片時(shí)可能變形。

當(dāng)分析支架的彈性模量時(shí)，沒有觀察到這種一致性。與在其他顆粒濃度下觀察到的約11％的偏差相比，30％的顆粒構(gòu)建體導(dǎo)致更均勻的分布，全部切片僅偏離約9％。雖然不同支架的切片之間的這種差異僅為約2％，但足以區(qū)分30％的濃度是唯一滿足切片之間均勻性的10％方差要求的。

30％顆粒的植入物具有約8％的植入物之間的偏差，滿足重現(xiàn)性的10％的方差要求，而20％和25％顆粒的植入物則沒有滿足。支架趨向于在近端切片(a)中具有比在遠(yuǎn)端(d)處相對(duì)更低的彈性模量。這可以歸因于支架完成其交聯(lián)時(shí)，水凝膠中較重的顆粒在混合結(jié)束時(shí)下降。盡管存在該因素，30％顆粒的植入物滿足關(guān)于均勻性和重現(xiàn)性的10％的方差要求。

均勻性的另一個(gè)量度是顆粒和蛋白質(zhì)在植入物的整個(gè)長度上的擴(kuò)散。來自植入物的一部分的熒光強(qiáng)度指示存在的蛋白質(zhì)的量。這也間接表明了顆粒的存在，因?yàn)闊晒獾鞍锥ㄎ辉谒鼈冎車?。已證明30％的顆粒濃度是在熒光強(qiáng)度均勻性上具有小于10％偏差的唯一組合物，進(jìn)一步證實(shí)以體積計(jì)30％的顆粒是期望的濃度。使用30％的顆粒來完成使用中空管作為混合裝置的對(duì)照測試，以驗(yàn)證該混合是由所選擇的內(nèi)部幾何形狀引起的。兩個(gè)對(duì)照測試導(dǎo)致整個(gè)構(gòu)建體的熒光強(qiáng)度的約12％的偏差。這不能滿足10％的誤差閾值，并支持單橫梁原型作為最佳設(shè)計(jì)的功效。與來自其他組合物的等同切片相比，0％顆粒的對(duì)照構(gòu)建體的濃度顯示出熒光發(fā)射強(qiáng)度的顯著差異。這表明顆粒在白蛋白的蛋白定位中起重要作用，并將蛋白固定在更小的區(qū)域中。盡管由于材料和時(shí)間有限，該結(jié)果未用bmp-2重新測試，但由于白蛋白的低成本、生物相容性和類似的磷酸鈣結(jié)合性質(zhì)，其用作令人滿意的替代物。盡管白蛋白僅測試了兩次，但是使用bmp-2的讀板器測試的初步結(jié)果顯示20％和30％的顆粒濃度對(duì)應(yīng)于白蛋白的結(jié)果。

混合裝置及其使用方法的開發(fā)需要確定最優(yōu)的支架組合物?；旌涎b置所需的功能要求是產(chǎn)生具有均勻的機(jī)械性能、顆粒分散在整個(gè)水凝膠中和蛋白質(zhì)分布在顆粒之間的植入物。均勻性定義為植入物之間的變化小于10％。在開發(fā)初始原型后，測試各種顆粒濃度確定了優(yōu)選范圍為按體積計(jì)20-30％的顆粒。較低的顆粒濃度提供的用于bmp結(jié)合和結(jié)構(gòu)支撐的顆粒太少。濃度超過30％導(dǎo)致可用于結(jié)合顆粒的水凝膠無效。另外，顆粒之間的水凝膠體積允許成骨細(xì)胞和血管更容易地浸潤植入物。當(dāng)在注射器內(nèi)形成植入物時(shí)，頂部趨向于畸形。將該層修整以使植入物具有期望的形狀和長度。在手術(shù)室中，當(dāng)使植入物成形為配合所植入的部位時(shí)，這種不完美形狀的端部將被切除。這些特性通過流變儀壓力分析、讀板器熒光測試和共焦顯微鏡成像來測試。

實(shí)施例9：評(píng)估體內(nèi)植入物的機(jī)械性能

計(jì)算沿著所產(chǎn)生的構(gòu)建體的線性切片的彈性模量以確定機(jī)械強(qiáng)度的梯度(圖14a)。盡管機(jī)械強(qiáng)度趨向于從構(gòu)建體的近端(切片a)到遠(yuǎn)端(切片d)區(qū)域減小，但是對(duì)于測試的顆粒濃度而言，整個(gè)切片的彈性模量和密度的方差是最小的(圖14b)。比較相同顆粒濃度的整個(gè)構(gòu)建體之間的偏差以確定重現(xiàn)性。與用20％和25％的顆粒產(chǎn)生的構(gòu)建體相比，由30％的顆粒組成的構(gòu)建體在全部測試中產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上更低的彈性模量偏差。在全部測試中，在產(chǎn)生的含有20％、25％和30％的顆粒濃度的支架中發(fā)現(xiàn)密度有約5％的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(圖15)。比較相同的顆粒濃度的構(gòu)建體中切片之間的偏差以確定均勻性。在構(gòu)建體之間沒有測定出針對(duì)全部切片的彈性模量和密度偏差的顯著的差異。所有三個(gè)密度偏差均低于為均勻性所限定的10％的誤差閾值；然而，只有30％的顆粒濃度低于彈性模量偏差的閾值(圖16)。

實(shí)施例10：評(píng)估植入物蛋白質(zhì)的分布

熒光發(fā)射的擴(kuò)散顯示用靜態(tài)棒混合裝置產(chǎn)生的構(gòu)建體在其切片之間熒光發(fā)射上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(圖17)。與其他組合物相比，0％的顆粒組合物顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上更低的熒光發(fā)射強(qiáng)度。含有30％的顆粒的構(gòu)建體的熒光平均差異約為90％，而20％和25％的植入物分別為約14％和16％(圖18)。盡管對(duì)于20％和30％的顆粒濃度bmp-2熒光讀數(shù)僅完成一次，但是熒光測量與其相應(yīng)濃度的白蛋白值相似(圖19)。

實(shí)施例11：使用共聚焦顯微鏡評(píng)估植入物蛋白質(zhì)含量

使用共聚焦顯微鏡來驗(yàn)證讀板器熒光數(shù)據(jù)的結(jié)果。使用單橫梁裝置原型混合在10mg/ml的水凝膠濃度下的3％的酪胺取代物、在bmp緩沖液中以1：120稀釋的af488標(biāo)記的bmp-2、0.09％的過氧化物和按體積計(jì)30％的顆粒來制備植入物。在將構(gòu)建體切割成5mm的切片并進(jìn)行機(jī)械測試后，將每個(gè)切片切割至1mm并使用升高的蓋玻片(slidecover)固定到載玻片上，在共焦顯微鏡下觀察。從每個(gè)切片的中心和邊緣收集跨越100微米的10個(gè)圖像的堆棧(stack)，并使用imagej圖像處理軟件進(jìn)行分析。收集在每個(gè)圖像中的顆粒和水凝膠區(qū)域的塌陷堆棧的平均熒光強(qiáng)度。

用于bmp-2的共聚焦顯微鏡檢查的最大強(qiáng)度塌陷堆棧圖像顯示于圖20a-b中。蛋白質(zhì)顯示集中于顆粒周圍(參見箭頭)。具有較不集中的熒光的區(qū)域是水凝膠的區(qū)域。這通過比較每個(gè)切片的中段和邊緣處的水凝膠和顆粒區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度值來證實(shí)(圖21a-b)。

如期望的，圖像顯示在每個(gè)切片中存在的蛋白質(zhì)特異性定位于每個(gè)顆粒周圍。通過計(jì)算每個(gè)圖像中的顆粒區(qū)域和水凝膠區(qū)域中的平均強(qiáng)度獲得熒光強(qiáng)度。盡管該過程僅針對(duì)單個(gè)植入物進(jìn)行，但是在顆粒中的蛋白質(zhì)強(qiáng)度比在水凝膠中的高得多。然而，與更接近中段的測量相比，在切片的邊緣處的熒光強(qiáng)度測量有更高的可變性。

在共焦圖像中觀察到的意想之外的副作用是圍繞每個(gè)顆粒的磷酸鈣粉塵云。每個(gè)圖像有清晰部分，其包含與蛋白質(zhì)結(jié)合的小片的顆粒碎片。這種效應(yīng)可能是在混合過程中被破碎的顆?；蜷L期儲(chǔ)存的副作用所致。需要進(jìn)一步的研究以確定這種碎片為什么存在，和如果有的話，它將對(duì)體內(nèi)植入物的性能有什么影響。

如本文所公開的，所使用的水凝膠的性質(zhì)極大地影響了混合裝置滿足合成的骨移植材料的功能需求的能力。一旦過氧化物交聯(lián)反應(yīng)完成，由于剪切的風(fēng)險(xiǎn)，植入物的組分不能夠再混合。隨著延長的混合時(shí)間，混合勢(mixingpotential)增加，因此較長的凝固時(shí)間與產(chǎn)生的植入物的更均勻分布相關(guān)。通過水凝膠表征實(shí)驗(yàn)確定的凝固時(shí)間提供了測試的水凝膠之間的相對(duì)凝膠速度。具有較高的酪胺堿取代的水凝膠趨向于具有較快的凝固時(shí)間，相對(duì)于在取代百分比內(nèi)的其他水凝膠，在較高濃度下的水凝膠凝固較慢。雖然在裝置混合條件下，混合構(gòu)建體組分時(shí)的凝固時(shí)間顯著更快，但是通過表征過程確定所測試的水凝膠之間的相對(duì)反應(yīng)時(shí)間。因此，與更快凝固的那些(在5mg/ml下5％的取代和在10mg/ml下5％的取代)相比，具有最長的相對(duì)凝固時(shí)間的水凝膠(在5mg/ml下1％的取代，在10mg/ml下1％的取代和在10mg/ml下3％的取代)更適合與混合裝置一起使用。此外，確定每種水凝膠的剪切模量作為機(jī)械穩(wěn)定性的指標(biāo)。為了轉(zhuǎn)換到臨床環(huán)境，由混合裝置產(chǎn)生的植入物必須承受體內(nèi)的力。因此，具有顯著更大剛度的水凝膠(在10mg/ml下3％的取代和在10mg/ml下5％的取代)是用于與混合裝置一起使用的更好的配合。由于臨床使用所需的相對(duì)較長的混合時(shí)間和較高的剛度，具有在10mg/ml濃度下的3％酪胺堿取代的水凝膠最適合作為合成的骨移植材料。

結(jié)論

本文所使用的短語“和/或”應(yīng)當(dāng)被理解為意指如此結(jié)合的要素(即在一些情況下以連接方式存在的并在其他情況下以分離方式存在的要素)中的“任一個(gè)或兩者”。除非明確表示相反的情況，通過“和/或”從句具體限定的那些要素之外的其他要素可以任選地存在，無論與具體限定的那些要素相關(guān)還是不相關(guān)。因此，作為非限制性實(shí)例，當(dāng)與開放式的語言例如“包括”聯(lián)用時(shí)，在一種實(shí)施方案中提及“a和/或b”可以僅指a而沒有b(任選地包括除了b之外的要素)，在另一種實(shí)施方案中可以僅指b而沒有a(任選地包括除了a之外的要素)，在又另一實(shí)施方案中，可以指a和b兩者(任選地包括其他要素)等。

術(shù)語“基本上由...組成”意指排除有助于功能的其他材料，除非本文另有定義。盡管如此，這些其他材料可以以痕量共同地或單獨(dú)地存在。

如本說明書中所使用的，術(shù)語“基本上”或“大約”是指加或減10％(例如，按重量計(jì)或按體積計(jì))，在一些實(shí)施方案中，加或減5％。在整個(gè)說明書中提及的“一個(gè)實(shí)施例”、“實(shí)施例”、“一個(gè)實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”意指結(jié)合該實(shí)施例描述的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性包括在本技術(shù)的至少一個(gè)實(shí)施例中。因此，貫穿本說明書在各處出現(xiàn)的短語“在一個(gè)實(shí)施例中”、“在實(shí)施例中”、“一個(gè)實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”不一定都指相同的實(shí)施例。此外，特定特征、結(jié)構(gòu)、程序、步驟或特性可以在本技術(shù)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中以任何合適的方式組合。本文提供的標(biāo)題僅僅是為了方便，并且不旨在限制或解釋要求保護(hù)的技術(shù)的范圍或含義。

上面已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。然而，明確地指出的是，本發(fā)明不限于那些實(shí)施方案，而意圖將對(duì)本文中明確描述的內(nèi)容的添加和修改也包括在本發(fā)明的范圍中。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本文所描述的各種實(shí)施方案的特征不是相互排斥的，并且可以以各種組合和排列存在，即使這樣的組合或排列沒有在本文中明確表示。事實(shí)上，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將想到對(duì)本文所描述內(nèi)容的變化、修改和其他的實(shí)施方式。因此，本發(fā)明不僅由之前的說明性描述來限定。