本發(fā)明是涉及用于促進口腔區(qū)域中的軟組織體積增大的新型彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿、用于制備該彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的方法及其作為口腔中的植入物用于軟組織體積增大的用途。

軟組織體積增大已成為牙科和顱頜面骨手術中的一個主要挑戰(zhàn)。為了改善軟組織體積增大的功能和美學結果，諸如游離牙齦移植(fgg)或上皮下結締組織移植(sctg)等自體組織移植，盡管存在其缺點，但仍廣泛用于各種適應癥且視為黃金標準(f.cairo等人，2008，j.clin.periodontol.35(增刊8)，314-319；r.jung等人，2004，int.j.periodonticsrestorativedent.24(6)，545-553和d.thoma，2009，clin.oralimplantsres.20(增刊4)，146-165)。然而，用于在第二手術位點處(通常在腭中)的自體組織的收獲程序對于患者而言具有缺點，且對于可恢復的組織的質量和數(shù)量有局限。

因此，可期望用于促進口腔區(qū)域中的軟組織體積增大的再生裝置。

在咀嚼、吞咽、舌運動、說話、牙齒運動和矯正治療期間，口腔結締組織的牙齦細胞暴露于復雜機械力。特別在手術程序后的傷口愈合期間，可能出現(xiàn)內力和外力，對再生裝置和新形成的組織產生壓力。

再生裝置在用于口腔中用于軟組織體積增大之前必須滿足某些準則：其必須是生物相容的、體內再吸收性的，允許牙齦向內生長，顯示良好的組織整合水平以允許順利愈合(無過度發(fā)炎或開裂)，并且在植入后的傷口愈合過程期間(通常至少約3個月)在充足時間內能夠通過作為維持組織體積的支架承受機械力。

迄今為止現(xiàn)有技術中并未公開此種再生裝置。

h.mathes等人在“abioreactortestsystemtomimicthebiologicalandmechanicalenvironmentoforalsofttissuesandtoevaluatesubstitutesforconnectivetissuegafts”，2010，biotechnologyandbioengineering，第9999卷，第9999期中公開了由膠原蛋白海綿組成的再生裝置的此種性質可通過以下方式實現(xiàn)：通過使膠原蛋白纖維交聯(lián)至使得機械穩(wěn)定性(高交聯(lián)度)與平穩(wěn)軟組織愈合(低交聯(lián)度)之間實現(xiàn)適當平衡的程度來硬化基質主體，但完全未記載如何制備此種膠原蛋白海綿。他們公開了由豬膠原蛋白i和iii型組成的三種不同膠原蛋白海綿原型，其具有92μm的平均孔徑和93％孔隙度，且其交聯(lián)度不同(原型由geistlichpharma，wolhusen，瑞士提供)，所述膠原蛋白海綿原型在機械刺激下培養(yǎng)14天后顯示令人滿意的體積保留與良好的成纖維細胞活力。

dsthoma等人在“softtissuevolumeaugmentationbytheuseofcollagen-basedmatrixes:avolumetricanalysis”,2010,j.ofclin.periodontology37,659-666和“softtissuevolumeaugmentationbytheuseofcollagen-basedmatrixesinadogmandible–ahistologicalanalysis”,2011,j.clin.periodontol.:38:1063-1070中公開了上述h.mathes等人的出版物中提及的膠原蛋白海綿原型中的一種在用于狗下頜骨的慢性脊缺陷中28天或84天的時期后顯示與黃金標準sctg(上皮下結締組織移植)相同的體積保留。

現(xiàn)有技術并未公開或暗示此種化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿原型特征是什么，或滿足上述用在口腔中的用于軟組織體積增大的以上標準的任何其他再生膠原蛋白裝置的特征，或此種裝置可如何制備。

ep-1561480公開了用作使腦膜組織生長的硬腦膜替代物的再吸收性膠原蛋白裝置，其包含大多數(shù)孔小于10μm的化學交聯(lián)的膠原蛋白片；和用于制備該膠原蛋白裝置的方法，其包含以下步驟：將膠原蛋白與水在混合物含有基本上溶解的膠原蛋白的條件下混合，將混合物凍干成膠原蛋白裝置并使用甲醛或戊二醛作為交聯(lián)劑使該膠原蛋白裝置化學交聯(lián)。硬腦膜替代物如用于促進口腔區(qū)域中的軟組織體積增大的再生裝置一樣，在傷口愈合期間并不暴露于由上述復雜機械力產生的壓力。

us-2004-0265785描述了用于制造含有至少20％(w/w)彈性蛋白的膠原蛋白-彈性蛋白膜的方法，其包含以下步驟：首先從天然來源的含彈性蛋白的膠原蛋白材料中化學除去疏水性伴隨物質，然后化學除去非疏水性物質。該膠原蛋白-彈性蛋白產物沒有經化學交聯(lián)。

boekemab.k.l.h.等人，2014，journalofmaterialsciences:materialsinmedicine，2014年2月25:423-433描述了用作真皮替代物的膠原蛋白-彈性蛋白支架上的孔尺寸和交聯(lián)對傷口愈合的效應。所公開的edc-nhs化學交聯(lián)支架含有10％～15％彈性蛋白，具有80μm～120μm的孔尺寸和64℃～69℃的變性溫度(參見表1，第425頁)。其通過環(huán)氧乙烷氣體處理來滅菌。作者推斷交聯(lián)尤其因降低成纖維細胞增殖和由新組織代替真皮替代物的能力而在若干重要參數(shù)上不利地影響傷口愈合。真皮替代物如用于口腔區(qū)域中促進軟組織體積增大的再生裝置一樣，在傷口愈合期間并不暴露于由上述復雜機械力產生的壓力。

本發(fā)明的問題或目的是發(fā)現(xiàn)用于促進口腔區(qū)域中的軟組織體積增大的再生膠原蛋白裝置，其是生物相容的、體內再吸收性的，允許牙齦向內生長，顯示良好的組織整合水平以允許平穩(wěn)愈合(無過度發(fā)炎或開裂)，并且在植入后傷口愈合過程期間(通常至少約3個月)在充足時間內能夠通過作為維持組織體積的支架承受機械力。

上述問題通過隨附權利要求中所限定的本發(fā)明解決。

本發(fā)明涉及用于促進口腔區(qū)域中的軟組織體積增大的彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿，其包含60％～96％(w/w)的膠原蛋白和4％～40％(w/w)的彈性蛋白，其通過壓汞式孔隙度測定法顯示中值孔徑為50μm至90μm且孔徑大于10μm的至少80％孔隙度的互連孔、45℃～57℃的初始溫度和50mg/cm³～65mg/cm³的干燥狀態(tài)下的密度。

該化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿包含60％～96％(w/w)膠原蛋白和4％～40％(w/w)彈性蛋白。此處彈性蛋白含量根據涉及水解和rp-hplc的已知方法的修改通過鎖鏈素/異鎖鏈素確定來測量(例如，參見guidae.等人1990developmentandvalidationofahighperformancechromatographymethodforthedeterminationofdesmosinesintissuesjournalofchromatography或rodriguqep2008quantificationofmouselungelastinduringprenataldevelopment，theopenrespiratorymedicinejournal)。為測定干燥彈性蛋白的鎖鏈素/異鎖鏈素含量，使海綿的彈性蛋白經受彈性蛋白分離程序，如由starcher和galione在1976purificationandcomparisonofelastinfromdifferentanimalspeciesinanalyticalbiochemistry中所描述。

該海綿是適當?shù)赜珊写朔N比例的膠原蛋白和彈性蛋白的天然來源的組織得到。此種組織的實例包括哺乳動物(例如豬或牛)腹膜或心包膜、胎盤膜、小腸黏膜下層(sis)和真皮。通常，膠原蛋白主要是膠原蛋白i型、膠原蛋白iii型或其混合物。膠原蛋白也可包括一定比例的特別膠原蛋白ii型、iv型、vi型或viii型或那些或任何膠原蛋白類型的任意組合。

在本申請中所用的術語“膠原蛋白”通常是指60％～96％(w/w)的膠原蛋白和4％～40％(w/w)的彈性蛋白的組合。

優(yōu)選地，經化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿包含70％～90％(w/w)的膠原蛋白和10％～30％(w/w)的彈性蛋白。

用于制備此種化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的適當起始材料的實例是來自通過與ep-b1-1676592的“實施例”中所描述相似的工序由豬或牛腹膜制備的膜或來自通過非常相似工序由豬腹膜制備的膜geistlich(可獲自geistlichpharmaa.g.，瑞士)的膠原蛋白纖維漿料，和/或通過與wo2012/084214的實施例7中所描述相似的工序由豬真皮制備的膠原蛋白纖維漿料。

上述彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿通過培育牙齦細胞的向內生長同時在加載和卸除機械應力之后保持體積來促進口腔區(qū)域中的軟組織增大。

為培育牙齦細胞的向內生長，該化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在適當直徑范圍中必須具有高孔隙度(孔體積分數(shù))以用于牙齦成纖維細胞生長。已發(fā)現(xiàn)，當海綿通過壓汞式孔隙度測定法顯示中值孔徑為50μm～90μm且孔徑大于10μm的至少80％、優(yōu)選至少90％孔隙度的互連孔時，此向內生長被適當?shù)卮龠M。具有此種孔分布的化學交聯(lián)海綿適當?shù)赝ㄟ^包含以下的工序來制備：在交聯(lián)之前，以適當比例將來自如先前段落中公開的由豬或牛腹膜制備的膜的膠原蛋白纖維漿料和如先前段落中公開的由豬真皮制備的膠原蛋白纖維漿料混合。

此處術語“彈性”意指化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿可抵抗壓力，即在體外或體內經受壓力后能夠恢復其原始體積的大部分。

為了在口腔區(qū)域中保持體積，彈性再吸收性化學交聯(lián)的海綿必須能夠在植入后在愈合過程期間(通常約3個月)在充足時間內通過作為維持組織體積的支架來承受由咀嚼、舌運動、說話和牙齒運動引起的復雜機械力。已發(fā)現(xiàn)，當在經設計以模擬體液的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)溶液潤濕的膠原蛋白海綿在37℃的溫度下的體外循環(huán)壓縮機械測試中，在49個壓縮至12.1kpa壓力的循環(huán)后，相對初始厚度的厚度保留為至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％或相對首次加載的滯后保留為小于55％、優(yōu)選小于45％時，獲得植入物的此體內彈性行為。

已發(fā)現(xiàn)，當該海綿顯示45℃～57℃的初始溫度和50mg/cm³～65mg/cm³的干燥狀態(tài)的密度時，獲得上述體外至少70％的厚度保留和小于55％的滯后保留與體內愈合(無過度發(fā)炎或開裂)的組合。

初始溫度通過dsc對膠原蛋白海綿測量，該膠原蛋白海綿使用緩沖溶液根據美國藥典標準：ph.eur.2.2.34，usp<891>潤濕(對于1升水的緩沖組合物：8g氯化鈉、0.2g磷酸鉀、1.15g磷酸鈉和0.2g氯化鉀；初始溫度15℃，終止溫度90℃，加熱速率5℃/min)。此參數(shù)反映海綿的交聯(lián)度。初始溫度與海綿對循環(huán)壓縮的體外抗性(循環(huán)壓縮的機械測試中的厚度保留或滯后保留)、體內彈性(在植入后的愈合過程期間在充足時間內保持組織體積)和良好的整合在周圍組織中(無過度發(fā)炎或開裂)密切相關。

當初始溫度為45℃～57℃、優(yōu)選46℃～53℃時，可獲得所需對循環(huán)壓縮的體外抗性和體內彈性與體內愈合(無過度發(fā)炎或開裂)的組合。當初始溫度低于46℃時，對循環(huán)壓縮的體外抗性和體內彈性可能不足。當初始溫度高于57℃時，存在諸如植入后出現(xiàn)過度發(fā)炎和/或開裂等不良事件的重大風險。

通過在充分凍干后(如下文詳細描述)稱重和測量膠原蛋白海綿的體積而測量的干燥狀態(tài)下的密度是達到所需對循環(huán)壓縮的體外抗性和體內彈性與體內愈合(無過度發(fā)炎或裂開)的組合的另一基本或關鍵參數(shù)。當干燥狀態(tài)下的密度是50mg/cm³～65mg/cm³、優(yōu)選50mg/cm³～60mg/cm³時，可獲得那些特征。當干燥狀態(tài)的密度低于50mg/cm³時，對循環(huán)壓縮的體外抗性和體內彈性可能不足。當干燥狀態(tài)的密度高于65mg/cm³時，存在出現(xiàn)諸如植入后出現(xiàn)過度發(fā)炎和/或開裂等不良事件的風險。

此處術語“再吸收性”意指化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿能夠顯著通過膠原蛋白酶和彈性蛋白酶的作用在體內被再吸收?；瘜W交聯(lián)的膠原蛋白海綿的受控體內再吸收能力對于無過度發(fā)炎或開裂的愈合是必需的。下文詳細描述在使用來自溶組織芽胞梭菌(clostridiumhistolyticum)的膠原蛋白酶的酶促降解測試給出體內再吸收能力的優(yōu)異預測。

在該測試中，對于在體內顯示感興趣的體積保留和無諸如過度發(fā)炎或開裂等不良事件的愈合的所有本發(fā)明的無菌彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的樣品而言，膠原蛋白在3小時～5小時內完全降解。

上述彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿適當?shù)赝ㄟ^包含冷凍干燥和化學交聯(lián)的工序由天然來源的組織制備。合適的天然來源的組織包括豬或牛腹膜或心包膜、豬或牛胎盤膜和豬或牛sis或真皮。優(yōu)選地，天然來源的組織包括豬或牛腹膜和豬真皮。在上述包含冷凍干燥和化學交聯(lián)的工序之后通常為滅菌步驟，其適當?shù)貫棣谜丈浠騲射線滅菌。

化學交聯(lián)可使用任何藥學上可接受的交聯(lián)劑進行，該交聯(lián)劑能夠給予彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在循環(huán)壓縮測試中的相對于初始厚度的所需厚度保留或相對于首次加載的滯后保留。適合的此種交聯(lián)劑包括戊二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁烷二縮水甘油醚(bddge)、n-磺基琥珀酰亞胺基-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯、六亞甲基二異氰酸酯(hmdc)、氰胺(cynamide)、二苯基磷酰疊氮化物(diphenylphosphorylazide)、京尼平(genipin)、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)以及edc和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的混合物。通?？稍趶椥栽傥招曰瘜W交聯(lián)的膠原蛋白海綿中檢測到少量或痕量的未反應的交聯(lián)劑或其典型的直接反應產物。

優(yōu)選地，使用選自戊二醛、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)以及edc和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的混合物的交聯(lián)劑來進行化學交聯(lián)。實際上已使用那些交聯(lián)劑中的每一種來制備本發(fā)明彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的感興趣的原型。

已使用edc或edc和nhs的混合物作為交聯(lián)劑制備超過1000種不同膠原蛋白海綿的原型并將其在各種體外測試和/或體內動物測試中、特別在小鼠、大鼠、兔和狗中測試。優(yōu)選地，使用這兩種交聯(lián)劑中的一種來進行化學交聯(lián)。

本發(fā)明的彈性再吸收性膠原蛋白海綿已特別在以下中測試：

-動物研究，其涉及與黃金標準sctg(上皮下結締組織移植)相比，測量通過植入在狗下頜骨的慢性缺陷中的黏膜體積增益，和

-臨床研究，其用于調查與針對軟組織體積增大的黃金標準sctg(上皮下結締組織移植)相比，其在口腔中在牙齒植入物周圍增加黏膜厚度的組織增大程序中的性能和安全性。

在這兩個研究中，本發(fā)明的彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿顯示出，在植入3個月后可優(yōu)異整合至周圍組織中而不會過度發(fā)炎或開裂，與sctg具有相同的安全性和相同(即，無統(tǒng)計學上差異)的軟組織體積保留。

上述彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿可通過包含以下步驟的工序來制備：

(a)使豬或牛腹膜或心包膜經受在ph高于12的氫氧化鈉溶液中的堿處理、在ph為1～3的鹽酸溶液中的酸處理、使用水溶性有機溶劑的脫水處理和使用有機溶劑的脫脂處理，

使用切割磨機研磨所得干燥膜，通過0.5mm～2mm篩來篩分并將所得粉末懸浮于ph為2.5～3.5的酸化水溶液中，以便獲得膠原蛋白纖維漿料，

(b)使經研磨的?；蜇i真皮經受使用水溶性有機溶劑的脫水處理、使用有機溶劑的脫脂處理、在ph高于12的強無機堿中的堿處理、在ph為0～1的強無機酸中的酸處理，用水沖洗并將所述膠原蛋白纖維懸浮、冷凍干燥、用有機溶劑清洗經干燥的膠原蛋白纖維并在ph為3～4的酸化溶液中研磨經清洗干燥的纖維，以便獲得膠原蛋白纖維漿料，

(c)將3.5份～4.5份(a)中獲得的膠原蛋白纖維漿料與0.5份～1.5份(b)中獲得的膠原蛋白纖維漿料混合，以獲得所得漿料，

(d)將(c)中獲得的所得漿料冷凍干燥并在含有交聯(lián)劑的溶液中將冷凍干燥的產物進行交聯(lián)，用水洗滌并冷凍干燥，和

(e)可選地將(d)中獲得的冷凍干燥的產物通過γ照射或x射線照射來滅菌。

步驟(a)可以與ep-b1-1676592的“實施例”中描述的工序類似地通過使來自幼犢或幼豬的腹膜經受以下過程來進行：用水洗滌，用2％氫氧化鈉溶液進行堿處理，用水洗滌，在0.5％鹽酸溶液中進行酸處理，用水洗滌直至獲得ph為3.5的ph，用7％鹽水溶液使材料收縮，用水洗滌，用丙酮脫水并用正己烷脫脂，使用切割磨機研磨獲得的干燥膜，通過0.5mm～2mm篩來篩分并將所得粉末懸浮在ph為2.5～3.5的酸化水溶液中，以便獲得豬或牛腹膜膠原蛋白纖維漿料。

步驟(a)方便地通過以下方式來進行：使用切割磨機研磨無菌膜geistlich(可獲自geistlichpharmaa.g.，瑞士)，通過0.5mm～2mm篩來篩分并將所得粉末懸浮在ph為2.5～3.5的酸化水溶液中，以便獲得豬腹膜膠原蛋白纖維的漿料。

優(yōu)選地，使用切割磨機研磨后獲得的粉末通過0.5mm～1mm篩來篩分。

步驟(b)可以與wo2012/084214的實施例7中公開的工序類似地通過下述進行：使經研磨的豬皮經受使用水溶性有機溶劑(例如醇或酮)的脫水處理，使用有機溶劑(例如二氯乙烷或二氯甲烷)的脫脂處理，在ph高于12的強無機堿中堿處理6小時～24小時的時間，在ph為0～1的強無機酸中酸處理1小時～12小時的時間，用水沖洗并在溶脹調節(jié)劑的存在下使膠原蛋白纖維懸浮，冷凍干燥，使用不同有機溶劑(例如醇、醚、酮和氯化烴)清洗經干燥的膠原蛋白纖維，并在膠體磨機中于ph為3～4的酸化溶液中研磨經清洗干燥的纖維，以便獲得豬真皮膠原蛋白纖維的漿料。

步驟(a)中制備的膠原蛋白纖維漿料中的(w/w)％膠原蛋白和步驟(b)中制備的膠原蛋白纖維漿料中的(w/w)％膠原蛋白在設定彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的干燥狀態(tài)下的密度中起作用。實際上，后者主要取決于一方面通過將1.5份～4.5份(a)中獲得的膠原蛋白纖維漿料與0.5份～1.5份(b)中獲得的膠原蛋白纖維漿料混合而在步驟(c)中獲得的所得膠原蛋白纖維漿料的(w/w)％膠原蛋白，以及另一方面步驟(d)中的交聯(lián)反應條件。

為了使彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿實現(xiàn)50mg/cm³～65mg/cm³的所需干燥狀態(tài)下的密度，步驟(a)中制備的膠原蛋白纖維漿料通常含有2.0％～4.5％(w/w)、優(yōu)選2.5％～3.75％(w/w)的膠原蛋白，并且步驟(b)中制備的膠原蛋白纖維漿料通常含有3.0％～7.0％(w/w)、優(yōu)選4.0％～6.0％(w/w)的膠原蛋白。

步驟(c)包括將3.5重量份～4.5重量份的(a)中獲得的膠原蛋白纖維漿料與0.5重量份～1.5重量份的(b)中獲得的膠原蛋白纖維漿料混合，以獲得所得漿料。

來自不同豬或牛組織且已經受包括不同研磨程序的不同處理(切磨機用于步驟(a)且膠體磨機用于步驟(b))、給出不同大小的膠原蛋白纖維粒子的適當比例的兩種不同膠原蛋白纖維的漿料的此混合步驟，是用于獲得彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿所期望的孔隙度分布或譜(即如通過壓汞式孔隙度測定法所測得，互連孔具有50μm～90μm的中值孔徑且孔徑大于10μm的至少80％、優(yōu)選至少90％的孔隙度)的簡便方法。

所得漿料通常含有3.0％～6.5％(w/w)、優(yōu)選3.5％～6.0％(w/w)膠原蛋白。

步驟(d)包含將(c)中獲得的所得漿料冷凍干燥，將冷凍干燥產物在含有交聯(lián)劑的溶液中交聯(lián)，用水洗滌并冷凍干燥。

交聯(lián)步驟前后的冷凍干燥通常在低于-10℃的溫度下進行。

交聯(lián)劑適當?shù)剡x自由戊二醛、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)以及edc和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的混合物組成的組。也可使用已知用于交聯(lián)膠原蛋白的其他交聯(lián)劑，例如甲醛、乙醛、1,4-丁烷二縮水甘油醚(bddge)、n-磺基琥珀酰亞胺基-6-(4’-疊氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯、六亞甲基二異氰酸酯(hmdc)、氰胺、二苯基磷酰疊氮化物或京尼平。

當交聯(lián)劑是戊二醛時，冷凍干燥后獲得的海綿適當?shù)卦趐h為7.0～7.5的含有0.01％～0.10％、優(yōu)選0.04％～0.06％的戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液中進行化學交聯(lián)。經化學交聯(lián)的海綿可依次使用水、1m～3mnacl溶液、0.05m～0.15mna2hpo4溶液和水洗滌，然后冷凍干燥。

當交聯(lián)劑是edc時，將冷凍干燥后獲得的海綿適當?shù)厥紫仍诟哂?10℃的溫度下經受脫水熱處理，然后在含有0.05m～0.15mmes(2-(n-嗎啉基)-乙磺酸)或0.05m～0.15m乙酸和2％～20％(w/w)的選自由甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和丁醇組成的組的醇的緩沖溶液中與每g膠原蛋白0.03g～0.80g、優(yōu)選0.2g～0.4gedc進行化學交聯(lián)1小時～8小時的時間。膠原蛋白與反應介質(上述緩沖溶液)的(w/w)比通常為1/10～1/100、優(yōu)選1/20～1/50。當醇是乙醇時，其適當?shù)匾?％～7％(w/w)存在于緩沖溶液中。經化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿可首先用0.05m～0.15mna2hpo4溶液、0.5m～3mnacl溶液洗滌、然后用水洗滌，之后冷凍干燥。

當交聯(lián)劑是edc和nhs的混合物時，將冷凍干燥后獲得的海綿適當?shù)卦诤?.1m～0.3mmes(2-(n-嗎啉基)-乙磺酸)或0.1m～0.3m乙酸和10％～70％(w/w)選自由甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和丁醇組成的組的醇的緩沖溶液中與每g膠原蛋白0.01g～0.60g、優(yōu)選0.05g～0.2gedc和0.01g～0.6g、優(yōu)選0.05g～0.2gnhs化學交聯(lián)1小時～8小時的時間。edc與nhs的摩爾比通常為4～0.5，優(yōu)選2～1。膠原蛋白與反應介質(上述緩沖溶液)的(w/w)比通常為1/10～1/100，優(yōu)選1/20～1/50。當該醇是乙醇時，其適當?shù)匾?0％～60％(w/w)存在在緩沖溶液中?；瘜W交聯(lián)的膠原蛋白海綿可首先用0.05m～0.15mna2hpo4溶液洗滌，然后用水洗滌，之后冷凍干燥。

對于在(c)中獲得的膠原蛋白纖維漿料的各混合物，本領域技術人員將能夠基于本申請的教導僅使用本領域的公知常識和例行實驗來尋找交聯(lián)劑和交聯(lián)條件，從而獲得具有規(guī)定初始溫度和干燥狀態(tài)下的密度的本發(fā)明彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿。

因此，例如，對于含有3.0～6.5(w/w)％膠原蛋白的膠原蛋白漿料，已通過例行實驗發(fā)現(xiàn)以下內容：

-當交聯(lián)劑是edc時：

-隨著緩沖溶液中的edc濃度、edc與膠原蛋白的比率、反應介質與膠原蛋白(w/w)的比率或緩沖溶液中的醇％升高，初始溫度升高。

-隨著緩沖溶液中的醇％升高，干燥狀態(tài)下的密度減小(膠原蛋白的更多收縮)。

-當交聯(lián)劑是混合物edc和nhs時：

-隨著緩沖溶液中交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)劑(edc+nhs)與膠原蛋白的(w/w)的比率、edc與nhs的比率、反應介質與膠原蛋白的(w/w)的比率或緩沖溶液中的醇％升高，初始溫度升高。

-隨著緩沖溶液中的醇％升高，干燥狀態(tài)下的密度減小(膠原蛋白的更多收縮)。

在步驟(d)結束時獲得的經冷凍干燥的彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿將通常經受通過γ照射或x射線照射來滅菌的步驟(e)。若步驟(c)中獲得的膠原蛋白漿料的混合物已無菌且步驟(d)是在無菌條件下進行，則該步驟可不是必需的。

下文詳細描述的體外循環(huán)壓縮測試和使用來自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶的酶促降解測試，在預測化學交聯(lián)的海綿植入口腔中后的體內行為、特別其保持體積和愈合而無諸如過度發(fā)炎或開裂等不良事件的能力中極為有用。

本發(fā)明還涉及用于制備彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的上述方法。

本發(fā)明還涉及用作口腔植入物的上述彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿、該彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿用于制備口腔植入物的用途和增大口腔區(qū)域中的軟組織體積的方法，所述方法特別是通過促進牙齦細胞的向內生長同時在機械應力下保持體積而進行，其包括將上述彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿植入口腔中。

以下實驗方法、測試和實施例闡明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。

用于確定彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在干燥狀態(tài)下的密度的測試

將彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿樣品引入至經配衡的塑料管中，將所述塑料管在冷凍干燥機中于20℃的溫度和低于0.5毫巴的壓力下干燥至少2小時。將具有干燥樣品的管稱重并計算干燥狀態(tài)下的樣品的凈重。

彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿樣品的長度、寬度和高度通過使用電子光標卡尺、通過施加足夠接觸壓力使得樣品松散地固定(即，固定以抵抗由其重量引起的力但當該力增加約10倍時易于移動)來測量。計算干燥狀態(tài)下的樣品的體積。

然后計算各樣品的彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的在干燥狀態(tài)下的密度(重量/體積)。

循環(huán)壓縮測試

使用機械壓縮機(即由zwickroell制造的z2.5材料壓縮機)，利用程序testexpertii來測量初始厚度％和49個壓縮至12.1kpa壓力的循環(huán)后相對于首次加載的滯后。

該測量針對已經在ph為7.4的pbs溶液(通過將80.0gnacl、2.0gkcl、17.7gna2hpo4和2.4gkh2po4溶解在1000ml水中，將該溶液在水中稀釋10倍并使用hcl調節(jié)ph至7.4來制備)中于37℃溫育2小時的無菌彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿樣品浸沒在37℃的pbs中進行。

使樣品以每分鐘33％初始高度的應變速率經受總共49個0.5kpa～12.1kpa的加載循環(huán)，在0.25kpa的預壓力下開始分析。

使用在0.5kpa壓力下的初始高度來計算49個加載和卸載循環(huán)后初始高度的保留。“相對于首次加載的滯后”是在卸載期間耗散的功％，其使用0.5kpa～12.1kpa的首次加載的功(w1，加載，以nm計)和來自第49個卸除循環(huán)的功(w49，卸載，以nm計)，依據式xy：

在49個壓縮至12.1kpa壓力的循環(huán)后，程序testexpert或者excel計算初始厚度的保留％和初始滯后的保留％。

圖1顯示循環(huán)壓縮測試的典型結果。

對于本發(fā)明彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的樣品，在體內顯示出感興趣的體積保留和愈合而無過度發(fā)炎或開裂：

-在49個壓縮至12.1kpa的循環(huán)后，相對于初始高度的高度或厚度保留為至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，和

-在49個壓縮至12.1kpa的循環(huán)后，相對于首次加載的滯后保留小于55％，優(yōu)選小于45％。

使用來自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶的酶促降解測試

在人體中，膠原蛋白是被人類組織基質金屬蛋白酶(mmp)、組織蛋白酶(cathepsin)降解并且推定地被一些絲氨酸蛋白酶來降解。最好的研究是mmp，其中膠原蛋白酶(特別mmp-1、mmp-8、mmp-13和mmp-18)是用于直接膠原蛋白降解的最重要的酶(lauer-fields等人2002matrixmetalloproteinasesandcollagencatabolism，biopolymers–peptidescience小節(jié)和song等人2006matrixmetalloproteinasedependentandindependentcollagendegradation，frontiersinbioscience)。

膠原蛋白酶降解膠原蛋白組織和膜的能力取決于基質撓性和膠原蛋白類型、mmp活性位點和mmp外部位點(exosite)。膠原蛋白酶在三螺旋膠原蛋白處對準，使其解開并隨后將其切割(song等人2006，參見上文)。

為了克服不同膠原蛋白類型之間的降解差異，通常使用具有高催化速度的自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶來評價膠原蛋白的膠原蛋白酶降解(kadler等人2007collagenataglance，jcellsci中)。通常，天然膠原蛋白產物比化學交聯(lián)的膠原蛋白產物降解更快。

在此測試中，將膠原蛋白產物(本發(fā)明的彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿樣品)在37℃下與來自溶組織芽胞梭菌的50單位/ml(1單位定義為于5小時內在ph7.4、37℃于在鈣離子的存在下，從牛跟腱的膠原蛋白釋放的肽等效于茚三酮顏色1.0微摩爾亮氨酸)在含鈣tris緩沖液中一起溫度，并目視地并利用來自bio-radlaboratories的“dcproteinassay”(hercules，usa，目錄號nr.500-0116)使用膠原蛋白i型作為參照材料來測量膠原蛋白基質的降解。使用微孔板光譜儀(infinitem200，可自tecan購得)確定膠原蛋白濃度。

對于體內顯示愈合而無過度發(fā)炎或開裂的本發(fā)明彈性再吸收性化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的樣品，膠原蛋白在3小時～5小時內完全降解(通過目視檢查無可檢測的膠原蛋白纖維)。

實施例1來源于豬腹膜的膠原蛋白纖維漿料的制備

通過機械方式使來自幼豬的腹膜完全沒有肉和油脂，在流水下洗滌并用2％naoh溶液處理12小時。然后在流水下洗滌所述膜并使用0.5％hcl酸化。在材料已酸化貫穿其整個厚度(約15分鐘)后，洗滌該材料直至獲得3.5的ph。然后，使用7％鹽水溶液收縮材料，使用1％nahco3溶液中和并在流水下洗滌。所述材料隨后使用丙酮脫水并使用正己烷脫脂。

將所述材料用乙醇醚干燥并使用包含0.5mm～1.0mm的梯形篩的切割磨機研磨(例如來自fritsch的pulverisette25：參見www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25或來自retsch的sm300：www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm)。

通過將足夠量的干燥粉末懸浮在水中并使用10mm鹽酸調節(jié)ph至2.6來制備4％(w/w)膠原蛋白纖維漿料和6％(w/w)膠原蛋白纖維漿料。

實施例2來源于無菌geistlich膜的膠原蛋白纖維漿料的制備

將geistlich膜(購自geistlichpharmaag，ch-6110，瑞士)干燥并使用包括0.5mm～1.0mm的梯形篩的切割磨機研磨。通過將足夠量的干燥粉末懸浮在水中并使用10mm鹽酸調節(jié)ph至2.6來制備4％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料和6％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料。

實施例3來源于豬真皮的膠原蛋白纖維漿料的制備。

將豬皮在絞肉機中研磨成1mm～20mm的片。使用水溶性溶劑(例如醇或酮)將水除去。使用氯代烴(例如二氯乙烷或二氯甲烷)或非氯代烴(例如己烷或甲苯)將膠原蛋白纖維脫脂。除去溶劑后，將膠原蛋白使用ph高于12的強無機堿處理6小時～24小時的時間并使用ph為0～1的強無機酸處理1小時～12小時的時間。通過用水沖洗來除去過量酸并且通過在諸如無機鹽等溶脹調節(jié)劑的存在下將膠體研磨成0.5％～2％膠原蛋白纖維的均質懸浮液來使懸浮液均質化。通過冷凍干燥將懸浮液干燥，并且使用不同有機溶劑(例如醇、醚、酮和氯代烴)依次清洗經干燥膠原蛋白纖維，然后將溶劑在真空下蒸發(fā)至小于1％(w/w)的溶劑殘留物。

2.5％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料和3.75％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料是在3.4的ph下通過經由膠體研磨足夠量的上文用水獲得的經清洗的干燥纖維的精細研磨來制備。

實施例4利用edc化學交聯(lián)的彈性再吸收性膠原蛋白海綿的制備。

將4份實施例1或實施例2中獲得的4％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料與1份實施例3中獲得的2.5％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料混合并倒入8mm×25mm×25mm的模具中。通過在-45℃下冷凍干燥來干燥所得3.7％膠原蛋白纖維漿料。然后，在120℃下在減壓下(小于200毫巴)將經干燥的膠原蛋白海綿脫水熱處理24小時。

然后，將膠原蛋白海綿在ph為5.5的含有0.1mmes(2-(n-嗎啉基)-乙磺酸)和5％乙醇的緩沖溶液中與每g膠原蛋白0.3gedc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)在攪拌下于室溫化學交聯(lián)120分鐘的時間。

經化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿首先使用0.10mna2hpo4溶液、1mnacl溶液、2mnacl溶液洗滌，然后用水洗滌，并在-45℃下冷凍干燥。

將經干燥化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在30kgy下經γ-滅菌。

經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的測量的初始溫度和干燥狀態(tài)下的密度分別是47℃和64mg/cm³。

在37℃的pbs中的49個壓縮至12.1kpa的壓力的循環(huán)后，經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿顯示其初始厚度的87％保留和初始滯后的41％保留。

壓汞式孔隙度測定法顯示經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿具有88μm的中值孔徑和孔徑大于10μm的95％孔隙度。

使用來自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶的酶促降解測試顯示膠原蛋白在3.25小時內完全降解。

實施例5利用edc和nhs的混合物化學交聯(lián)的彈性再吸收性膠原蛋白海綿的制備。

將4份實施例1或實施例2中獲得的6％(w/w)膠原蛋白纖維漿料與1份實施例3中獲得的3.75％(w/w)膠原蛋白纖維漿料混合并倒入6mm高度的模具中。通過在-10℃下冷凍干燥來干燥所得5.55％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料。

將這些海綿在ph為5.5的含有0.2mmes(2-(n-嗎啉基)-乙磺酸)和50％w/w乙醇的溶液中與每克膠原蛋白0.1gedc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)和每克膠原蛋白0.1gnhs(n-羥基琥珀酰亞胺)在攪拌下于室溫化學交聯(lián)120分鐘的時間。化學交聯(lián)海綿首先使用0.1mna2hpo4溶液、1mnacl溶液、2mnacl溶液洗滌，然后用水洗滌，并在-10℃下冷凍干燥。

將經干燥化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在26kgy下通過γ-照射滅菌。

經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的測量的初始溫度和干燥狀態(tài)下的密度分別是52℃和59mg/cm³。

在37℃下的pbs中的49個壓縮至12.1kpa的壓力的循環(huán)后，經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿顯示其初始厚度的90％保留和相對于首次加載的38％滯后。

壓汞式孔隙度測定法顯示經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿具有69.1μm的中值孔徑和孔徑大于10μm的93.1％孔隙度。

使用來自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶的酶促降解測試顯示膠原蛋白在3.5小時內完全降解。

實施例6利用edc和nhs的混合物化學交聯(lián)的彈性再吸收性膠原蛋白海綿的制備(無滅菌步驟)

將4份實施例2中獲得的6％(w/w)膠原蛋白纖維漿料與1份實施例3中獲得的3.75％(w/w)膠原蛋白纖維漿料混合并倒入6mm高度的模具中。通過在-10℃下冷凍干燥來干燥所得5.55％(w/w)膠原蛋白纖維的膠原蛋白漿料。

將這些海綿在ph為5.5的含有0.2mmes(2-(n-嗎啉基)-乙磺酸)和50％w/w乙醇的溶液中與每克膠原蛋白0.01gedc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)和每克膠原蛋白0.01gnhs(n-羥基琥珀酰亞胺)在攪拌下于室溫進行化學交聯(lián)120分鐘的時間。化學交聯(lián)海綿首先使用0.1mna2hpo4溶液、1mnacl溶液、2mnacl溶液洗滌，然后用水洗滌，并在-10℃下冷凍干燥。

化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的測量的初始溫度和干燥狀態(tài)下的密度分別是57℃和57mg/cm³。

在37℃下的pbs中的49個壓縮至12.1kpa的壓力的循環(huán)后，化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿顯示其初始厚度的80％保留。

壓汞式孔隙度測定法顯示，化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿具有71.0μm的中值孔徑和孔徑大于10μm的94.0％孔隙度。

實施例7利用戊二醛化學交聯(lián)的彈性再吸收性膠原蛋白海綿的制備。

將4份實施例1中獲得的膠原蛋白纖維漿料與1份實施例3中獲得的膠原蛋白纖維漿料混合并倒入6mm高度的模具中。通過在-45℃下冷凍干燥來干燥膠原蛋白漿料。將這些海綿在含有0.05％(w/w)戊二醛的磷酸鈉緩沖液(ph7.0～7.5)中在10℃下化學交聯(lián)60分鐘。依次使用水、2mnacl溶液和0.1mna2hpo4溶液來洗滌經化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿。在最后用水沖洗之后，將海綿在-45℃下冷凍干燥。

將經化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿在25kgy下通過γ-照射滅菌。

經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿的測量的初始溫度和干燥狀態(tài)的密度分別是51℃和52mg/cm³。

在37℃下49個壓縮至12.1kpa的壓力的循環(huán)后，在pbs中的經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿顯示其初始厚度的74％保留和相對于首次加載的48％滯后。

壓汞式孔隙度測定法顯示經滅菌的化學交聯(lián)的膠原蛋白海綿具有63.7μm的中值孔徑和孔徑大于10μm的92.7％孔隙度。

使用來自溶組織芽胞梭菌的膠原蛋白酶的酶促降解測試顯示膠原蛋白在4.5小時內完全降解。