發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于治療眼部疾病的產(chǎn)品的領(lǐng)域以及包含其的制劑。

現(xiàn)有技術(shù)

不受控的新血管發(fā)生涉及各種疾病的病因，諸如：實體瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬以及，在眼部水平上，角膜新血管形成、年齡相關(guān)性黃斑變性(armd或amd)、黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(rop)、脈絡(luò)膜新血管形成(cnv)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(dr)和新血管性青光眼。

與許多其它與衰老有關(guān)的慢性疾病一樣，amd具有多因素來源，并且其發(fā)作是由遺傳和生活方式相關(guān)的因素的不利組合引起的。

在cnv的治療中進行的抗-vegf研究(最初開發(fā)用于癌癥治療)導(dǎo)致在cnv的治療中使用哌加他尼(pegaptanib)pfizer)和蘭尼單抗genentech)。貝伐單抗genentech)目前也在amd的治療中“標(biāo)簽外(offlabel)”使用。

還應(yīng)該考慮，amd的治療不僅限于脈絡(luò)膜新血管形成的治療(抗vegf的玻璃體內(nèi)注射和光動力學(xué)治療)，還包括使用多種具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用的物質(zhì)，所述物質(zhì)能夠在導(dǎo)致充分發(fā)展的疾病的過程的不同水平上起作用并起到預(yù)防疾病發(fā)作、減緩其進展成晚期形式、減少組織損傷并增強抗vegf藥物的作用。

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(dr)是1型和2型糖尿病最嚴(yán)重和頻繁的微血管并發(fā)癥之一，由于黃斑水腫的發(fā)作和繼發(fā)性視網(wǎng)膜玻璃體新血管形成，其常常導(dǎo)致失明而顯著影響患者的生活質(zhì)量。

目前可獲得的用于dr的治療的目的是對比視網(wǎng)膜疾病的血管發(fā)生和炎癥過程，并且結(jié)果是在一些情況下，它們減緩了疾病的進展。

青光眼是引起視神經(jīng)組織逐漸喪失，使其端部(head)暴露導(dǎo)致視力喪失的視神經(jīng)病變。葡萄膜炎是由虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜組成的眼中膜(tunicamedia)(血管)的部分或全部的炎癥。

目前可獲得的治療后葡萄膜炎(posterioruveitis)的治療工具是玻璃體內(nèi)注射或植入物(taylors.r.等人,newdevelopmentsincorticosteroidtherapyforuveitis,ophthalmologica.2010；224suppl1：46-53)，并非沒有以視覺器官為代價的非常重要的次要效果(眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜水腫等)。

在過去二十年中，玻璃體內(nèi)注射已經(jīng)被認為是非常有價值的，因為與其它施用途徑相比，玻璃體內(nèi)注射通常允許在視網(wǎng)膜和玻璃體中達到更高的濃度。然而，玻璃體內(nèi)途徑與患者的嚴(yán)重風(fēng)險，諸如視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎和玻璃體內(nèi)出血相關(guān)。此外，此施用途徑需要重復(fù)注射藥物以確保治療效果，這通常不被患者良好耐受。

因此，目前可獲得的治療并不令人滿意，因為現(xiàn)有的益處/副作用之比不成比例。

為了此原因，已經(jīng)開發(fā)了可植入玻璃體的非生物可降解的控制釋放體系但即使這些也具有與玻璃體內(nèi)注射相關(guān)的相同風(fēng)險，以及對植入的外科手術(shù)的需求和排斥的可能性。

使用眼周施用途徑(眼球周圍(peribulb)、鞏膜后部(posteriorjuxtascleral)、眼球后結(jié)膜下膜(retrobulbarsubtenon)和結(jié)膜下)取得了風(fēng)險和收益之間的妥協(xié)，盡管比玻璃體內(nèi)效率低，但更加安全。

這些施用途徑利用了傳統(tǒng)的可注射制劑的使用，并且允許活性成分通過擴散穿過鞏膜纖維組織——其形成了不太耐受藥物的屏障——達到靶部位(玻璃體和視網(wǎng)膜)。在任何情況下，被注射的藥物通過前部(房水的流出)或后部(視網(wǎng)膜和全身循環(huán))途徑清除，要求與不良的患者依從性(疼痛、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎和玻璃體出血)相關(guān)的多次施用。

因此，目前對眼的后部區(qū)段疾病的治療僅有與不期望的作用相關(guān)的藥物遞送系統(tǒng)。

還已知，當(dāng)今的納米顆粒類型的先進藥物遞送系統(tǒng)是藥物遞送的最前沿。

脂質(zhì)性質(zhì)的納米顆粒體系諸如固體脂質(zhì)納米顆粒(sln)和納米結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)體系(nlc)是由生物相容性脂質(zhì)(純甘油三酯、甘油酯的復(fù)合混合物、蠟)組成的并且用無毒的表面活性劑諸如卵磷脂和泊洛沙姆穩(wěn)定的膠體系統(tǒng)。它們的尺寸在100nm和500nm之間。在室溫下，顆粒處于固態(tài)。

已經(jīng)表明，由于與常規(guī)藥物形式相比增加的眼前(pre-ocular)保留時間，脂質(zhì)納米顆粒提高了幾種藥物在眼中的生物利用度，從而避免了重復(fù)和頻繁的滴注(int.j.pharm.,238241-245(2002))。

菊粉是可從多種植物和水果中提取的天然多糖。它是由通過β-(2-1)葡萄糖-呋喃糖苷鍵鍵合的d-果糖單元的直鏈組成的碳水化合物，其偶爾在其還原性末端結(jié)合葡萄糖分子。由于菊粉具有許多有利性質(zhì)的事實(毒性缺乏、生物相容性、在水中的溶解性和對腸道細菌菌群的益生作用)，菊粉在無數(shù)應(yīng)用中被使用(kolidas,gibsongr.jnutr2007；137:2503s-2506s；gocheva等人,colloidsandsurfacesa:physicochem.eng.aspects2011；391:101-104)，并且其中許多在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

近期，為了得到新的藥物遞送系統(tǒng)(dds)諸如水凝膠、納米顆粒、大分子生物綴合物和聚合物膠束，無數(shù)研究者把他們的注意力投向菊粉的化學(xué)改性。

菊粉在側(cè)鏈中被伯胺化學(xué)改性，其已經(jīng)用于獲得與親水鏈諸如聚乙二醇(peg)和與疏水性分子諸如神經(jīng)酰胺的綴合。

杯芳烴(calixarene)是甚至以低成本易于合成的環(huán)狀多酚，其特征在于顯著的合成多功能性、在不同水平上對其官能化的傾向以及最后，具有低程度的細胞毒性和免疫原性。

近年來，杯[4]芳烴(calix[4]arene)已被作為用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的新的分子平臺被認真地研究，其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用由其衍生物在體外和在體內(nèi)所示出的低細胞毒性(int.j.pharm.2004,273,57)和免疫原性(bioconjugatechem.1999,10,613)支持。

杯芳烴骨架的合適官能化提供了具有抗炎、抗腫瘤、抗微生物和疫苗模擬活性的衍生物(curr.drugdiscov.technol.2009,6,306；chem.soc.rev.2013,42,366,us2010/0056482；wo2005123660a2)。

已經(jīng)提出了將水溶性杯芳烴(對于將藥物復(fù)合在其疏水性腔內(nèi)的能力，其與環(huán)糊精類似)作為用于制藥工業(yè)的賦形劑，而能夠在水性介質(zhì)中組裝成納米結(jié)構(gòu)化體系的兩親性杯芳烴是有前景的藥物遞送系統(tǒng)(j.sci.ind.res.2012,71,21；chem.soc.rev.2013,42,366,ep1293248a1；us2010/0185022a19)。它們中的一些已經(jīng)被恰當(dāng)?shù)毓こ袒愿鶕?jù)外部刺激釋放藥物，該外部刺激諸如氧化還原電勢、溫度(acsnano,2011,5,2880)、ph(phys.rev.e,2007,73,051904)、酶活性(rscadvances,2013,3,8058)的變化，等等。杯芳烴衍生物穿透細胞膜的能力(chem.commun.2012,48,1129；j.am.chem.soc.2008,130,2892)以及用識別和結(jié)合存在于靶細胞表面上的互補受體的歸巢基團(hominggroup)使杯芳烴骨架官能化的能力，使得杯芳烴也是有前景的用于靶向藥物遞送的系統(tǒng)(org.biomol.chem.2015,13,3298)。

水飛薊賓(silibinin)是水飛薊(silybummarianum)中含有的約1:1比例的兩種非對映異構(gòu)體a和b的混合物。

其在臨床領(lǐng)域的主要應(yīng)用是：治療由酒精引起的肝臟疾病、肝硬化、捕蠅蕈中毒(amanitapoisoning)、病毒性肝炎和藥物誘導(dǎo)的肝臟疾病。

另一方面，已知由于水飛薊賓在水中的低溶解度(430mg/l)，其生物利用度和功效相當(dāng)有限。

水飛薊賓似乎是用于預(yù)防和治療人類的惡性膠質(zhì)瘤的有效的劑(ranap.singh,oncogene,2005)。

此外，在體外和口服施用基于水飛薊素(silymarin)的制劑之后，已經(jīng)示出了水飛薊賓的抗血管發(fā)生活性，特別是針對amd。

鑒于上文，具有可能有利于醫(yī)師治療性治療眼部疾病，特別是神經(jīng)變性疾病諸如黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變的新藥理學(xué)制劑的前景，增加了對化合物諸如水飛薊賓被官能化以增強其原位利用度的興趣。

除了用描述的所有納米結(jié)構(gòu)化體系廣泛研究的水飛薊賓之外，還用這些納米結(jié)構(gòu)化制劑中的一些研究了天然來源的但不以低水溶性、易于化學(xué)降解和酶降解、低生物利用度為特征的其他活性成分，諸如：索拉非尼、姜黃素、拉坦前列素。

索拉非尼(bay43-9006，bayer)

是作用于多重靶標(biāo)(vegf、pdgf、egf；其實際上被定義為多激酶抑制劑)的具有普遍存在的抗vegf作用、具有在腫瘤中被證實的抗血管發(fā)生作用(ep1140840b1，bayer)的二芳基脲，并且它是在歐洲被批準(zhǔn)用于治療肝細胞癌的第一個抗腫瘤劑片劑)。

索拉非尼在治療視網(wǎng)膜疾病中的治療指數(shù)可以通過在眼部水平使用局部施用來增加：以這種方式，可以獲得藥理作用同時限制全身副作用的發(fā)生。此外，局部施用允許使用與經(jīng)全身施用具有相同作用所需的那些劑量相比有限的劑量，并且從而降低最終產(chǎn)品的成本。

姜黃素(curcumin)

是從姜黃(curcumalonga)的根狀莖中提取的黃色多酚(二阿魏?；淄?diferuloylmethane))；姜黃是一種用于烹飪行業(yè)并且由于其在膽道疾病和一些炎性狀況中的治療性質(zhì)而用于醫(yī)學(xué)中的亞洲植物。

拉坦前列素(latanoprost)

是一種活性成分，其如比馬前列素(bimatoprost)和曲伏前列素(travoprost)一樣是前列腺素類似物的一部分。前列腺素類似物是一類用于局部使用的藥物，其近期已被用于治療開角型青光眼(open-angleglaucoma)；最初，由于缺乏關(guān)于其長期效果的信息而不被推薦為一線治療。在與前列腺素的長期治療相關(guān)的副作用中，主要副作用涉及虹膜色素沉著變化、睫毛增厚和延長、黃斑水腫發(fā)作(alexandercl等人,prostaglandinanalogtreatmentofglaucomaandocularhypertension；annpharmacother.,2002)。

附圖簡述

圖1示出了與游離水飛薊賓的溶解曲線相比，由sln-a在ph7.4的pbs中釋放的水飛薊賓的百分比作為孵育時間的函數(shù)。

圖2示出了由被inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b體系在ph7.4的pbs中釋放的水飛薊賓的百分比作為孵育時間的函數(shù)和游離水飛薊賓的溶解曲線。

圖3示出了與游離水飛薊賓的擴散曲線相比，由inu-c8和inu-c8-peg的聚合物膠束在ph7.4的pbs中釋放的水飛薊賓的百分比作為孵育時間的函數(shù)。

圖4(a和b)示出了在不同濃度下培養(yǎng)4小時(4a)和24小時(4b)后，inu-c8和inu-c8-peg的空膠束在16hbe細胞系上的細胞相容性曲線。

圖5a示出了對于用inuc8peg-索拉非尼體系、用空載體inuc8peg和用索拉非尼甲苯磺酸酯預(yù)處理20小時、然后暴露于h2o2傷害的arpe-19細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖5b示出了對于用h2o2傷害3小時并用inuc8peg-索拉非尼體系(c8pegsor)、用空載體inuc8peg(c8peg)和用索拉非尼甲苯磺酸酯(sor)后處理20小時的arpe-19細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖6a示出了對于用inuc8peg-索拉菲尼體系、用空載體inuc8peg(c8peg)和用水飛薊賓預(yù)處理20小時、然后暴露于h2o2傷害的arpe-19視網(wǎng)膜細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖6b示出了對于用h2o2傷害3小時并用inuc8peg-水飛薊賓體系(c8pegsib)、用空載體inuc8peg(c8peg)和用水飛薊賓(sib)后處理20小時的arpe-19視網(wǎng)膜細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖7示出了在無h2o2(對照，c)或有h2o2(h)并且用inuc8peg(1μm和10μm)、用inuc8pegslb(1μm和10μm)或用slb(1μm和10μm)處理或不處理的樣品上使用抗parp11:800一抗(cellsignaling)進行的代表性蛋白質(zhì)印跡。條帶的光密度分析(直方圖)用β-肌動蛋白歸一化。

圖8示出了由杯芳烴納米顆粒在ph7.4的pbs中釋放的水飛薊賓的百分比作為孵育時間的函數(shù)。

圖9a示出了對于用杯芳烴-水飛薊賓體系(calixslb)、用空載體(calix)和用單獨的水飛薊賓預(yù)處理20小時、然后暴露于50μmfeso4的arpe-19視網(wǎng)膜細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖9b示出了對于用feso450μm處理5小時并用杯芳烴-水飛薊賓體系(calixslb)、用空載體(calix)和用單獨的水飛薊賓(sib)后處理20小時的arpe-19視網(wǎng)膜細胞的影響；定量釋放到培養(yǎng)基的ldh。

圖10a/b示出了對無feso4(ctr)或有feso4(fe)并用calix(1μm)、用calixsib(1μm)或用sib(1μm)進行處理或不處理的樣品進行的代表性蛋白質(zhì)印跡。使用抗vegf1:100一抗(santacruz)(10a)，以及對無feso4(ctr)或有feso4(fe)并用calix(0.1μm和1μm)、calixsib(0.1μm和1μm)或用sib(0.1μm和1μm)處理或不處理的樣品進行的代表性蛋白質(zhì)印跡。使用抗組織蛋白酶d1:200一抗(santacruz)。條帶的光密度分析(直方圖)用β-肌動蛋白歸一化(10b)。

圖11示出了杯芳烴體系對活性成分姜黃素的保護作用，對此示出了在0.1mpbs和在無血清培養(yǎng)基中30分鐘內(nèi)降解90％以比較。

圖12示出了用姜黃素、杯芳烴體系和杯芳烴-姜黃素體系處理后對sirc角膜細胞的細胞毒性測試的結(jié)果。

圖13示出了姜黃素、杯芳烴和杯芳烴-姜黃素對j744巨噬細胞的mit測定的細胞毒性測試的結(jié)果。

圖14示出了用lps刺激并預(yù)先暴露于用姜黃素、杯芳烴體系和杯芳烴-姜黃素體系處理的j744巨噬細胞的活力。

圖15示出了在姜黃素、杯芳烴體系和杯芳烴-姜黃素體系的存在下，受到lps應(yīng)激的j744巨噬細胞中組成型蛋白ikbα的降解的減少。

圖16示出了在姜黃素、杯芳烴1和杯芳烴-姜黃素的存在下，受到來自lps應(yīng)激的j744巨噬細胞中nfkb的減少。

圖17示出了在受到lps應(yīng)激的j744巨噬細胞中ino和cox2的表達以及它們在姜黃素、杯芳烴1和杯芳烴-姜黃素的處理的存在下降低。

圖18a/b示出了在葡萄膜炎模型中，在用摻入或未摻入水飛薊賓的杯芳烴體系、用摻入或未摻入姜黃素的杯芳烴體系處理的動物的房水中的組織學(xué)評分和蛋白質(zhì)測定的結(jié)果。

圖19a/b示出了在杯芳烴-拉坦前列素體系和含有拉坦前列素的商用產(chǎn)品iopize的單次施用(a)和長期治療后的張力過高(hypertonia)模型中眼內(nèi)壓降低的趨勢。

發(fā)明概述

描述了包含被摻入到sln和nlc脂質(zhì)納米顆粒體系、以及基于杯芳烴(calixarene)(可能地粘膜粘附劑)摻入的或者摻入到基于兩親性菊粉共聚物的膠束和納米顆粒體系中的水飛薊賓的用于局部施用的制劑，所述制劑用于治療神經(jīng)變性眼部疾病。

發(fā)明詳述

本發(fā)明用用于局部應(yīng)用的制劑克服了上文所述的缺點，所述制劑包含摻入到以下中的水飛薊賓：

(1)sln(固體脂質(zhì)納米顆粒)和nlc(納米結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)載體)型的脂質(zhì)納米顆粒體系；

(2)基于杯芳烴的納米結(jié)構(gòu)化體系；

(3)基于兩親性菊粉共聚物的膠束和納米顆粒體系，對于后者提供了對感興趣的眼部疾病具有使用理論基礎(chǔ)的其他活性成分的摻入和釋放的實例。

所述制劑能夠?qū)⒅委熡行┝康幕钚猿煞诌f送至玻璃體或視網(wǎng)膜，用于治療神經(jīng)變性眼部疾病如黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、青光眼。本發(fā)明還涉及如上文定義的摻入水飛薊賓的納米顆粒體系的制備方法。

特別地，遵循下文描述的一般方法制備sln和nlc型體系。

將脂質(zhì)相(由固體脂質(zhì)或液體脂質(zhì)與固體脂質(zhì)的混合物組成)熔化至高于其熔點約5-10℃。

將水飛薊賓溶解于乙醇的等分試樣中，并然后在磁力攪拌下加至熔化的脂質(zhì)混合物中。

然后將含有水飛薊賓的熱脂質(zhì)混合物在含有水、表面活性劑或表面活性劑的混合物的水性溶液中沉淀(沉淀法)，或用預(yù)先在相同溫度下加熱的含有水、表面活性劑或表面活性劑的混合物的水性溶液乳化。在后一種情況下，將所得的預(yù)乳液：分散于在2℃和5℃之間的溫度冷卻的水或水性介質(zhì)中(微乳液法)，或進行高壓均質(zhì)化(高壓熱均質(zhì)化法)。在所有情況下，允許所得的納米乳液冷卻至室溫，然后通過對蒸餾水的徹底透析(comw12000-14000)純化。然后，冷凍保護劑被加至納米顆粒分散體中，所述納米顆粒分散體可以經(jīng)受離心(在10℃、4000rpm，持續(xù)10分鐘)。最后，冷凍干燥后，將固體脂質(zhì)納米顆?；厥詹Υ嬖诶鋬龉裰杏糜陔S后的表征和/或用粘膜粘附劑聚合物包被。在后一種情況下，將0.1％水性溶液中的inu-eda和inu-deta聚合物和殼聚糖加至納米顆粒懸浮液中，并在室溫和磁力攪拌下孵育30分鐘。

上述脂質(zhì)相由脂質(zhì)組成，所述脂質(zhì)例如選自：甘油三酯類諸如三硬脂酸甘油酯(tristearin)、三棕櫚精(tripalmitin)、辛酸/癸酸甘油三酯(mygliol)；甘油二酯類諸如precirolato5(二硬脂酸甘油酯)；甘油單酯類諸如單硬脂酸甘油酯；脂族醇諸如鯨蠟醇；脂肪酸(c10-c22)；脂肪醇的脂肪酸酯諸如棕櫚酸鯨蠟醇酯；聚乙二醇化和非山萮酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物諸如compritolhd-5-ato(peg-8山崳酸酯和三山崳精(tribehenin))和compritol888ato(山崳酸單酯、山萮酸二酯和山萮酸三酯的混合物)；聚乙二醇化辛酸和聚乙二醇化己酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯諸如accoconcc-6。

在該方法中用作表面活性劑/助表面活性劑的物質(zhì)可以例如選自：非離子表面活性劑，包括卵磷脂諸如epikuron200；聚乙二醇和聚丙二醇嵌段共聚物諸如pluronic；聚乙二醇化脫水山梨糖醇衍生物諸如吐溫；聚乙二醇的脂肪醇醚如brij；離子表面活性劑，包括膽汁鹽諸如?；悄懰徕c；季胺，包括西吡氯銨和溴化二十八烷基二甲基銨。

在該方法中用作冷凍保護劑的物質(zhì)可以例如選自：糖類諸如乳糖和海藻糖；聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。

在該方法中用于賦予粘膜粘附性的物質(zhì)例如選自：含有胺基團的菊粉聚合物(inu-eda和inu-deta)、低分子量聚合物(殼聚糖)和陽離子表面活性劑(ccp和ddab)。

根據(jù)進一步的實施方案，本發(fā)明涉及包含下式(i)或(ii)的基于菊粉的共聚物的眼用制劑，

其中r是-(ch2)p-ch3；其中p在0和19之間的范圍內(nèi)；

其中r是-(ch2)p-ch3；其中p在0和19之間的范圍內(nèi)并且n在9和450之間的范圍內(nèi)，

以及涉及此類共聚物。

上文給出的式(i)和(ii)的基于菊粉的共聚物通過用脂族鏈c8或c8和peg的鏈將菊粉官能化獲得。

已經(jīng)證明了這些具有兩親性特征的共聚物能夠聚集以形成膠束或納米顆粒，以摻入靈活(flexible)和不同量的藥物并將其以活性形式釋放，持續(xù)延長且受控的時間，此外，它們是高度生物相容的并且允許容易地制造眼科制劑。

通過向dmf中的聚合物溶液中加入一定量的活性成分(諸如索拉非尼或水飛薊賓)獲得制劑。然后將所得溶液在真空下干燥并通過超聲和攪拌循環(huán)(10分鐘的3個循環(huán))在ph7.4的pbs中分散。此后，將分散體在25℃置于軌道振蕩器中持續(xù)18小時，然后用具有標(biāo)稱截留值(mwco)為1000da的膜對水透析。

最后，將所得分散體冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明的進一步的實施方案，其涉及含有基于兩親性杯芳烴的納米結(jié)構(gòu)化體系的眼用制劑。

在此類體系中，除了賦予粘膜粘附性之外，多個帶正電荷的配體單元的存在還可以通過存在于細胞表面上的互補受體的分子識別來協(xié)助通過角膜和視網(wǎng)膜上皮。

特別地，本發(fā)明涉及用于局部眼用的制劑，其包含被烷氧基胺(包括膽堿)官能化的杯[4]芳烴(calix[4]arene)衍生物組成的陽離子大分子，以獲得通式(a)的新載體，

其中：

r＝ch3、(ch2)xch3、(ch2)xoh

r1＝ch3、(ch2)xch3、(ch2)xoh

其中

x＝1-3

n＝4、6、8

m＝2-15

并且其中當(dāng)r＝r1＝ch3時，m不為2-9

除了遞送已知的活性成分之外，其還具有可以增強活性成分的生物活性的其自身的生物活性。

可以看出，式a代表形成大環(huán)的酚單元數(shù)(n＝4、6、8)上、在疏水尾部長度(m＝2-15，表示ch2的數(shù)目)上、在杯芳烴的上緣處存在的極性基團的結(jié)構(gòu)(r和r1＝ch3、(ch2)xch3、(ch2)xoh，其中x＝1-3以及其組合)上不同的杯芳烴衍生物。

如上文所述的杯芳烴化合物是新的，并且它們也是本發(fā)明的對象；這些化合物在負載和釋放待在眼部疾病的治療中使用的、以低水溶性、易于化學(xué)降解和酶降解、低生物利用度為特征的、無論是否是天然來源的活性成分方面表現(xiàn)出極大的多功能性。

作為靶向分子，膽堿引導(dǎo)和促進穿過存在膽堿載體的角膜上皮、血液-視網(wǎng)膜屏障和視網(wǎng)膜上皮(adv.drugdeliv.rev.2006,58,1136)。

并且在此情況下，如同對于上文所述的基于菊粉的共聚物，發(fā)現(xiàn)杯芳烴體系已經(jīng)示出了形成能夠摻入和釋放水飛薊賓或其它活性成分諸如姜黃素/拉坦前列素的納米聚集體的能力。

生物相容性和易于制備是通過以下方式獲得的制劑的特征：將杯芳烴衍生物在pbs(ph7.4)中簡單地溶解、加入過量的活性成分(相溶解度法)、超聲處理持續(xù)15分鐘、在25℃下攪拌2-3天、離心并在ghp0.2μm過濾器上過濾。

在本發(fā)明中獲得的納米顆粒體系具有的平均直徑在50nm和200nm之間的范圍內(nèi)，多分散性指數(shù)低于0.5。藥理學(xué)上有效量的活性成分被摻入到所述納米顆粒中。特別地，在本發(fā)明中獲得的納米顆粒體系具有的藥物載量在1％w/w和15％w/w之間的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的進一步的特征和優(yōu)點將從以非限制性實例的方式進行的其一些實施方案的以下描述更清楚地呈現(xiàn)。

sln(固體脂質(zhì)納米顆粒)和nlc(納米結(jié)構(gòu)化的脂質(zhì)載體)型的脂質(zhì)納米顆粒體系、或基于杯芳烴的納米結(jié)構(gòu)化體系(無論是否是粘膜粘附性的)、或基于兩親性菊粉共聚物的膠束和納米顆粒體系中的含有選自水飛薊賓或索拉非尼或姜黃素或拉坦前列素的活性成分的根據(jù)本發(fā)明的制劑，允許活性成分的局部施用，用于治療神經(jīng)變性眼部疾病諸如：cnv、amd、黃斑水腫、新血管性青光眼、黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(rop)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(dr)、葡萄膜炎、眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、全身性疾病的視網(wǎng)膜并發(fā)癥。

制劑通常呈冷凍干燥的固體產(chǎn)品的形式，并且除了摻入在上文所述的脂質(zhì)、聚合物或杯芳烴納米結(jié)構(gòu)中的活性成分之外，還可以含有組分諸如表面活性劑和/或冷凍保護劑和眼科制劑中經(jīng)常使用的其它賦形劑。

實施例1

含有水飛薊賓的sln(sln-a)的制備

下文描述了用水飛薊賓負載用compritolhd-5-ato制備的本發(fā)明的sln對象的程序和獲得的實驗數(shù)據(jù)。

sln-a的制備

用高壓熱均質(zhì)法制備sln-a。將200毫克compritolhd5ato熔化至高于其熔點約5℃-10℃(65℃-70℃)。將藥物(68mg)溶于乙醇的等分試樣(0.5ml)中，并然后在磁力攪拌下加至熔化的脂質(zhì)混合物中。然后將含有藥物的熱脂質(zhì)混合物在預(yù)先在相同溫度下加熱的pluronicf68表面活性劑的水溶液(于100ml中60mg)中乳化。使用emulsiflex-c5設(shè)備(avestin)，將所得的預(yù)乳液進行高壓均質(zhì)化(在7500±2500psi下4個循環(huán))、放置在溫度為65℃-70℃的熱水浴中。允許所得的納米乳液冷卻至室溫，然后通過對蒸餾水的透析(comw12000-14000)進行純化。此后，將冷凍保護劑海藻糖(脂質(zhì):冷凍保護劑重量比＝1:1w/w)加入到納米顆粒分散體中，進行離心(在10℃，4000rpm持續(xù)10分鐘)。最后，使用modulyo冷凍干燥機進行冷凍干燥后，將sln回收并儲存在冷凍柜中，用于隨后的表征。

sln-a體系的尺寸確定和ζ電位測量

所制備的sln-a體系的平均直徑和多分散性指數(shù)(pdi)通過使用zetasizernanozsp(malverninstrument)的光相關(guān)光譜法(photo-correlationspectroscopy，pcs)確定。對于分析，將每個樣品用0.9％w/w的nacl水溶液適當(dāng)?shù)叵♂尅⑦^濾通過0.2-μm過濾器并以相對于入射光173°的角度進行讀數(shù)并一式三份地分析。

根據(jù)激光多普勒測速法和光散射分析(m3-pals技術(shù))的原理，使用具有he-ne激光器、功率＝4.0mw、波長＝633nm的zetasizernanozsp(malvern)測量ζ電位。

獲得的平均直徑、pdi和ζ電位的結(jié)果在表1中給出。

表1

sln-a體系的平均流體動力學(xué)直徑、多分散性指數(shù)(pdi)、ζ電位。

sln-a的藥物載量(％dl)的確定

為了確定負載于sln-a樣品中的水飛薊賓的量，將10mg之前進行冷凍干燥的組合物溶解于四氫呋喃(thf)中。然后用甲醇處理有機溶液以沉淀脂質(zhì)并提取活性成分。然后將所得懸浮液過濾通過0.45μm過濾器并通過hplc分析。發(fā)現(xiàn)關(guān)于％dl(表示為負載到sln中的活性成分的百分比，假設(shè)100mg被進行冷凍干燥的材料由脂質(zhì)+活性成分組成)獲得的結(jié)果為8.5％w/w。

在ph7.4，水飛薊賓從sln-a的釋放

將本發(fā)明中描述的體系在體外、在37℃下使用ph7.4的磷酸鹽緩沖液進行釋放研究，孵育時間在0小時和12小時之間的范圍內(nèi)。所獲得的結(jié)果已經(jīng)示出了本發(fā)明的體系在12小時內(nèi)緩慢地釋放藥物至最高達7.8％w/w的最大值。在ph7.4和37℃下孵育后藥物的釋放和溶解曲線在圖1中示出。

所描述的體系是穩(wěn)定的，即在ph7.4下將藥物非常緩慢地釋放到外部介質(zhì)中，并且這可以是有利的，以便通過包含活性成分的納米顆粒來優(yōu)化其在病理部位中的遞送。

實施例2

含有水飛薊賓的nlc(nlc-b)的制備

通過非限制性實例的方式，下文描述了用水飛薊賓負載用compritolhd-5-ato、gelucire44/14和accononcc-6制備的本發(fā)明的nlc對象的程序和獲得的實驗數(shù)據(jù)。

nlc-b的制備

用溶劑沉淀-蒸發(fā)法制備nlc-b。將compritolhd5ato(250mg)熔化至高于其熔點約5℃-10℃(65℃-70℃)并將藥物(30mg)加至熔化的脂質(zhì)中。將gelucire44/14(100mg)和accononcc-6(100mg)溶解于乙醇(2.0ml)中，然后在磁力攪拌下加至熔化的脂質(zhì)混合物中。然后將含有藥物和表面活性劑的熱脂質(zhì)混合物在預(yù)先在相同溫度下加熱的、包含表面活性劑牛磺膽酸鈉的熱水溶液(100ml中100mg)中沉淀，并使用ultra-turrax均質(zhì)化(13.500rpm)。將仍然在攪拌下的熱的納米顆粒懸浮液置于冰浴中，直到其溫度達到10℃的值。然后將所得的納米顆粒通過對蒸餾水的透析(comw12000-14000)純化持續(xù)3天，并然后加入冷凍保護劑海藻糖(脂質(zhì):冷凍保護劑重量比＝1:2w/w)。最后，使用modulyo冷凍干燥機冷凍干燥后，將nlc回收并儲存在冷凍柜中，用于隨后用菊粉衍生物(inu-deta)和殼聚糖包被。在使用inu-deta包被的情況下，在磁力攪拌下，將9ml經(jīng)過透析的納米顆粒懸浮液(濃度為4.3mg/ml)與1ml的0.1％inu-deta孵育1小時。在用低分子量(5000mw)殼聚糖包被的情況下，在磁力攪拌下，將含添加的海藻糖的9ml經(jīng)透析并冷凍干燥的納米顆粒(濃度為0.165mg/ml)與1ml的0.1％殼聚糖孵育30分鐘。然后將經(jīng)包被的納米顆粒冷凍干燥并儲存為粉末用于隨后的表征。

nlc-b體系的尺寸確定和ζ電位測量

通過使用zetasizernanozsp(malverninstrument)的光相關(guān)光譜法(photo-correlationspectroscopy，pcs)確定所制備的被inu-eda和殼聚糖包被的nlc-b體系的平均直徑和多分散性指數(shù)(pdi)。對于分析，將每個樣品用0.9％w/w的nacl水溶液適當(dāng)?shù)叵♂?、過濾通過0.2-μm過濾器并以相對于入射光173°的角度進行讀數(shù)并一式三份地分析。

根據(jù)激光多普勒測速法和光散射分析(m3-pals技術(shù))的原理，使用具有he-ne激光器、功率＝4.0mw、波長＝633nm的zetasizernanozsp(malvern)測量ζ電位。

獲得的平均直徑、pdi和ζ電位的結(jié)果在表2中給出。

表2

被inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b的平均流體動力學(xué)直徑、多分散性指數(shù)(pdi)、ζ電位。

用inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b的％dl的確定

為了確定負載在用inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b樣品中的水飛薊賓的量，將2mg之前經(jīng)歷過冷凍干燥的組合物熱溶解于8ml乙醇(etoh)中并超聲處理持續(xù)3分鐘。然后將所得溶液用5.00μm再生纖維素過濾器過濾并用hplc分析。

發(fā)現(xiàn)關(guān)于％dl(以負載到nlc中的活性成分的百分比表示，假設(shè)100mg經(jīng)受冷凍干燥的材料由脂質(zhì)+活性成分組成)獲得的結(jié)果為，對于被inu-deta包被的nlc-b，％dl為6.05％w/w，并且對于用殼聚糖包被的nlc-b，％dl為3.07％w/w。

在ph7.4，活性成分從被inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b的釋放

本發(fā)明中描述的被inu-deta和殼聚糖包被的nlc-b體系在體外、37℃下使用ph7.4的磷酸鹽緩沖液進行釋放研究，孵育時間在0小時和12小時之間的范圍內(nèi)。獲得的結(jié)果已經(jīng)示出了，本發(fā)明的兩個體系緩慢地釋放藥物，對于用inu-deta包被的nlc-b，在12小時內(nèi)最高達50％w/w的最大值，對于用殼聚糖包被的nlc-b，在12小時內(nèi)最高達30％w/w的最大值。在ph7.4和在37℃孵育后，藥物水飛薊賓從2個被包被的體系中的釋放和溶解曲線在圖2中示出。

基于inu-c8和inu-c8-peg2000的聚合膠束的制備

以非限制性實例的方式，下文描述了用水飛薊賓或索拉非尼負載基于inu-c8和inu-c8-peg2000的本發(fā)明的聚合物膠束對象的程序和獲得的實驗數(shù)據(jù)。

inu-c8和inu-c8-peg2000共聚物的臨界聚集濃度(cac)的確定

按照文獻中已經(jīng)存在的程序，以良好的收率進行了inu-c8和inu-c8-peg2000共聚物的生產(chǎn)。

使用芘作為熒光探針，通過熒光光度分析法確定inu-c8和inu-c8-peg2000共聚物的cac。將20μl芘的丙酮溶液(6.0×10^-5m)置于小瓶中，并在37℃下在軌道振蕩器上蒸發(fā)至干燥。然后，向含有芘殘留物的小瓶中加入2ml具有遞增的濃度并且在1×10^-5mg/ml和5mg/ml之間的范圍內(nèi)的共聚物水溶液，以獲得等于6.0×10^-7m的芘的終濃度。在持續(xù)攪拌下，將所得到的分散體在37℃保持24小時，以使探針與膠束平衡。分別使用以下波長記錄芘的發(fā)射和激發(fā)光譜：373nm和333nm。結(jié)果在表3中示出。

表3

制備的一些共聚物的cac

負載水飛薊賓或索拉非尼的inu-c8和inu-c8-peg的聚合膠束的制備。

通過干式絡(luò)合法(捏合)制備負載水飛薊賓和索拉非尼的聚合物膠束。詳細地說，使用研缽和研杵將200mginu-c8或inu-c8-peg與藥物(50mg)干混并在乙醇(5ml)的存在下研磨。然后，將蒸發(fā)乙醇后獲得的干燥基質(zhì)(由藥物均勻地分散于其中的聚合物形成)緩慢地并且在機械攪拌下水合以促進單體的自聚集和藥物摻入于所得膠束的疏水性核中。

將所得分散體進行超聲處理和攪拌循環(huán)(10分鐘的3個循環(huán))。此后，將分散體以2000rpm離心5分鐘，并在截留值5μm的注射器式過濾器上過濾以除去未摻入的藥物。最后，將所得分散體在液氮中冷凍并冷凍干燥。

inu-c8和inu-c8-peg2000的聚合物膠束的％dl的確定

將3mg負載水飛薊賓或負載索拉非尼的膠束分散在甲醇(5ml)中；將分散體超聲處理持續(xù)10分鐘，并然后置于劇烈攪拌4小時。此后，使用截留值0.2μm的注射器式過濾器過濾分散體，并最后將濾液用甲醇(5ml)洗滌以得到10ml的終體積。為了確定從萃取程序獲得的600μl甲醇溶液中的水飛薊賓，加入400μl的1％乙酸(v/v)以符合用于hplc分析的洗脫劑混合物的組成。因此，通過hplc分析，使用c6-苯基、1％(v/v)(60:40)甲醇:乙酸柱作為洗脫相確定從膠束提取的藥物的量。將流速設(shè)定為0.65ml/min并在288nm監(jiān)測洗脫液。

為了確定索拉非尼，用hplc直接分析1ml從萃取程序獲得的甲醇溶液，以確定被膠束摻入的藥物的量。使用c6-苯基、甲醇:水(v/v)(90:10)柱作為洗脫相進行hplc分析。將流速設(shè)定為1ml/min并在266nm監(jiān)測洗脫液。

結(jié)果在表4中示出。inu-c8和inu-c8-peg的聚合物膠束的平均尺寸和ζ電位的確定

使用malvernzetasizernanozs，通過動態(tài)光散射測量確定膠束的尺寸分布。這些測量在173°的固定角度和25℃的溫度下進行。在過濾通過具有5μm的截留值的纖維素膜過濾器后，分析膠束的水溶液(2mg/ml)。使用相關(guān)函數(shù)的累積分析獲得平均流體動力學(xué)直徑和多分散性指數(shù)(pdi)。通過電泳遷移率并使用smoluchowsky關(guān)系計算ζ電位(mv)，假設(shè)k·a>>1(其中k和a分別為德拜-休克爾參數(shù)和顆粒半徑)。結(jié)果在表4中示出。可以看出，所有的共聚物能夠摻入疏水性藥物索拉非尼和水飛薊賓。

表4

膠束的平均流體動力學(xué)直徑、多分散性指數(shù)(pdi)、ζ電位和藥物載量。

^a藥物載量是指索拉非尼和水飛薊賓

釋放研究

為了評估所得體系釋放被摻入的藥物的能力，將適量的inu-c8和inu-c8-peg聚合物膠束(15mg)分散在ph7.4的pbs(5ml)中并在標(biāo)稱截止量(mwco)為1kda的漂浮透析膜spectra/por中轉(zhuǎn)移。將含有負載藥物的膠束分散體和單獨的藥物的透析膜浸入ph7.4的pbs(50ml)中，并在連續(xù)攪拌(100rpm)下在benchtop808c軌道式振蕩恒溫器420型中在37℃孵育24小時。在預(yù)定的時間間隔，從透析膜外部取出外部介質(zhì)的等分試樣(1ml)，并用等量的新鮮介質(zhì)代替。將取出的樣品冷凍干燥、懸浮于甲醇:乙酸1％(v/v)中，并用hplc分析以確定釋放的藥物的量。以示例的方式，示出了摻入到體系中的活性成分水飛薊賓的釋放圖。將所有釋放數(shù)據(jù)與使用相同程序獲得的單獨的水飛薊賓(0.25mg)的擴散曲線進行比較(圖3)?？紤]到稀釋過程，對數(shù)據(jù)進行了校正。每個實驗一式三份地進行并發(fā)現(xiàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)誤差±5％。從圖中可以看出，與游離水飛薊賓的擴散相比，負載水飛薊賓的inu-c8和inu-c8-peg的聚合物膠束示出了非常緩慢的釋放動力學(xué)(在孵育12小時后，小于5％w/w的水飛薊賓被釋放)。對于活性成分索拉非尼，也獲得了相似的釋放曲線。

穩(wěn)定性研究

通過將新鮮冷凍干燥的體系在4℃和25℃下孵育1、2和3個月來評估負載水飛薊賓或索拉非尼的inu-c8和inu-c8-peg的膠束的穩(wěn)定性。特別地，將新鮮制備的樣品和冷凍干燥的樣品在受控溫度儲存1、2和3個月。孵育期后，將樣品分散在雙蒸水(2mg/ml)中，并通過動態(tài)光散射測量分析以評價其平均直徑、多分散性指數(shù)和ζ電位。分別地，將3mg樣品分散于甲醇(5ml)中；首先將分散體超聲處理持續(xù)10分鐘并攪拌2小時，并且最后過濾通過具有5μm截留值的注射器式過濾器并用另外5ml甲醇稀釋。使用對于確定藥物載量所描述的相同程序，通過hplc分析確定提取的活性成分的量。

獲得的結(jié)果示出了，制備的膠束和負載的藥物都在長期儲存時具有良好的物理穩(wěn)定性。作為一個實例，表5示出了通過動態(tài)光散射測量獲得的與負載水飛薊賓或索拉非尼的inu-c8膠束相關(guān)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，以評價平均直徑、pdi和ζ電位中的變化，以及hplc分析以評估藥物載量和負載的藥物的穩(wěn)定性。

表5

在4℃和25℃儲存1、2和3個月后，負載水飛薊賓/索拉非尼的inu-c8膠束的穩(wěn)定性。

體外細胞相容性研究

使用商業(yè)試劑盒(celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay,promega)，通過mts測定在人支氣管上皮(16hbe)細胞系上評價inu-c8和inu-c8-peg的空膠束的生物相容性。將細胞以2·10⁴細胞/孔的密度鋪板在96孔板上并懸浮于富含10％體積/體積的胎牛血清(fbs)、1％體積/體積抗生素(10mg/ml鏈霉素、10000u-1ml青霉素)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)中，并在標(biāo)準(zhǔn)條件(95％rh和5％co2，在37℃)下孵育。孵育24小時后，去除培養(yǎng)基，并用含有濃度等于0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml的inu-c8和inu-c8-peg的空膠束的200μl新鮮培養(yǎng)基替換。在孵育4和24小時后，去除膠束在dmem中的分散液、用dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)洗滌細胞1次，并用100μl新鮮培養(yǎng)基和20μlmts溶液在37℃孵育2小時。僅與dmem孵育的細胞被用作陰性對照。結(jié)果表示為與對照細胞相比的細胞活力降低的百分比(圖4a和4b)。所有實驗一式三份地進行。

進行的研究示出，所測試的聚合物膠束具有良好的細胞相容性，并且在體外對人支氣管上皮細胞系不表現(xiàn)出細胞毒性作用。此結(jié)果使得這些體系潛在地可用作體內(nèi)藥物遞送的有效體系。在arpe-19視網(wǎng)膜細胞和sirc角膜上皮細胞上也證實了研究的空體系和負載活性成分的體系的生物相容性。

評價與水飛薊賓或與索拉非尼甲苯磺酸酯綴合的膠束載體inu-c8和inu-c8-peg對暴露于20小時預(yù)處理然后用h2o2傷害以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的視網(wǎng)膜細胞的保護作用?？盏暮途Y合物inuc8peg載體示出了比沒有peg的載體更大的保護作用，但是由于peg的存在，只有較高濃度的與水飛薊賓或索拉非尼綴合的載體inuc8peg才能夠引起ldh釋放的降低。以示例的方式，圖5a和圖6分別示出了與活性成分索拉非尼或水飛薊賓綴合的體系的實驗測試數(shù)據(jù)。

在后處理方案中，被h2o2傷害持續(xù)3小時隨后被暴露于用與水飛薊賓或索拉非尼綴合的inu-c8和inu-c8-peg體系處理的視網(wǎng)膜細胞示出了兩種載體恢復(fù)傷害誘導(dǎo)的損傷的良好的能力。然而，與任一個活性成分綴合的inuc8peg體系在抑制h2o2-誘導(dǎo)的應(yīng)激方面更有效。以示例的方式，圖5b和圖6b分別示出了與活性成分索拉非尼或水飛薊賓綴合的體系的實驗測試數(shù)據(jù)。

對于parp-1蛋白——一種參與響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激的dna修復(fù)的116kda的聚(adp-核糖)聚合酶(calciumoverloadisacriticalstepinprogrammednecrosisofarpe-19cellsinducedbyhigh-concentrationh2o2guang-yuli等人,(2010)biomedicalandenvironmentalsciences)——的表達，通過蛋白質(zhì)印跡分析暴露于用inuc8peg體系(空的或與水飛薊賓綴合的)后處理的視網(wǎng)膜細胞的裂解物。在體內(nèi)和體外，parp-1由胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7加工，形成24kda的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和參與凋亡的89kda催化結(jié)構(gòu)域(importanceofpoly(adp-ribose)polymeraseanditscleavageinapoptosisf.joliver等人,(1998)j.biol.chem.)。圖7示出了用h2o2處理后parp-1蛋白的減少，證實了細胞凋亡狀態(tài)。相反，與游離載體和slb本身相比，在用綴合載體處理的樣品中觀察到parp-1的更高的表達。在用h2o2處理的樣品中證實了綴合slb的inuc8peg以劑量依賴的方式抑制由氧化損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡的能力。使用游離slb的后處理減少了凋亡過程，然而效率低于綴合載體。

實施例4

杯芳烴納米顆粒的制備

作為實例，下文描述了用水飛薊賓、姜黃素或拉坦前列素負載杯[4]芳烴衍生物(化合物1)的程序和獲得的實驗數(shù)據(jù)。

制備

調(diào)整文獻中對于相似衍生物描述的程序，以良好收率合成了兩親性杯[4]芳烴衍生物，其在大環(huán)的下邊緣具有四個十二烷基脂族鏈并且在上邊緣具有四個膽堿的極性頭(化合物1)?；衔锿ㄟ^nmr光譜和質(zhì)譜表征。

杯芳烴衍生物在納米聚集體中的組裝自發(fā)地發(fā)生。在pbs(ph7.4)中簡單溶解提供了含有具有表6中示出的尺寸、多分散性指數(shù)和ζ電位的納米聚集體的膠體溶液。

通過向作為底體(bottombody)的膠體溶液中加入過量的藥物(摩爾比1:5)進行藥物負載。將混合物暴露于超聲波持續(xù)15分鐘，并在振蕩器中在25℃、200rpm下攪拌2-3天。隨后在4000rpm下離心持續(xù)30分鐘并在ghpacrodisc0.2μm過濾器上過濾提供了負載水飛薊賓的納米顆粒的膠體溶液。將此溶液冷凍干燥，不加入冷凍保護劑和使用標(biāo)準(zhǔn)的冷凍干燥器，提供了白色粉末，將該粉末重新懸浮于水時恢復(fù)負載藥物的納米顆粒的膠體溶液。膠體溶液在ghpacrodisc0.2μm過濾器上的重過濾和隨后的確定％dl的hplc分析示出了，在冷凍干燥后，體系保持摻入的藥物載量(表6)。

尺寸確定和ζ電位測量

使用zetasizernanozs-90(malverninstrument)測量負載和不負載水飛薊賓的杯芳烴納米顆粒的平均直徑、多分散性指數(shù)(pdi)和ζ電位，讀數(shù)是相對于入射光線以90°的角度進行的并且一式三份地分析。獲得的平均直徑、pdi和ζ電位的結(jié)果在表6中給出。

表6

杯芳烴納米聚集體的平均流體動力學(xué)直徑、多分散性指數(shù)(pdi)、ζ電位。

杯芳烴納米顆粒的藥物載量(％dl)的確定

為了確定負載到含有1mg/ml杯芳烴納米顆粒的膠體溶液中的水飛薊賓的量，將溶液的等分試樣用甲醇稀釋并通過hplc分析?？紤]到水飛薊賓在288nm處的吸收帶，測量藥物的量。考慮到pbs中的水飛薊賓在327nm處的帶，還在uv分光計上測量藥物的量。

發(fā)現(xiàn)關(guān)于％dl(以負載的活性成分的重量與負載的活性成分的重量+納米顆粒的重量之間的百分比表示)獲得的結(jié)果等于10％-11％。

在ph7.4的pbs中，水飛薊賓從杯芳烴np中的釋放

在體外、37℃下、孵育時間在0小時和12小時之間的范圍內(nèi)，通過透析研究水飛薊賓在ph7.4的磷酸鹽緩沖液中的釋放。所得的結(jié)果已經(jīng)表明，該體系在12小時內(nèi)緩慢釋放藥物最高達6.5％w/w的最大值(圖7)。緩慢釋放可能對在病理部位藥物遞送的目的有利。

負載水飛薊賓的杯烷烴納米顆粒在ph7.4的pbs中的穩(wěn)定性研究

通過將pbs中的膠體溶液保持在25℃來評估負載水飛薊賓的杯芳烴納米顆粒的穩(wěn)定性。自制備起第7天和第14天的對照示出了尺寸、pdi和％dl值幾乎沒有變化(表10)。制劑的穩(wěn)定性是重要的藥理學(xué)(例如達到眼后部的病理部位)和工業(yè)化要求。

表10

杯芳烴納米顆粒-水飛薊賓膠體溶液在25℃下7天和14天后的穩(wěn)定性。

在與水飛薊賓綴合的杯芳烴-膽堿載體在arpe-19細胞中的初步研究后，確定了濃度在0.01μm-1μm的范圍內(nèi)并孵育20小時的、游離的或與slb綴合的載體不引起毒性。然后，使用化合物feso4作為氧化傷害，通過細胞氧化還原狀態(tài)的變化測試綴合體系和空體系的影響。孵育超過24小時后，將細胞預(yù)處理20小時，并隨后暴露于50μmfeso4的傷害3小時[“預(yù)處理”20小時藥物+3小時傷害]。進行的評價毒性和保護免受所研究的載體的損害的活力測試是用來評估培養(yǎng)基中l(wèi)dh的釋放。圖8a示出了被50μmfeso4傷害或不傷害的arpe細胞中，與slb綴合的載體(calixslb)、空載體(calix)和單獨的水飛薊賓(slb)的劑量曲線。注意，slb降低ldh的釋放，而calixslb和空calix不顯著改變arpe-19細胞的ldh釋放。相反，當(dāng)細胞暴露于feso4(50μm)時，calixslb示出了降低ldh釋放的良好潛力，該效果在單獨用calix和slb處理的樣品中未觀察到。這些結(jié)果表明，calix和slb可能一起使細胞準(zhǔn)備好以防止氧化還原狀態(tài)的變化。

在隨后的實驗中，測試了用基于杯芳烴的化合物后處理的效果。因此，細胞用50μmfeso4處理5小時，并與各種化合物孵育20小時。如圖8b中示出的，即使在后處理條件下，calixslb仍保護免受傷害，并且該作用被證實為單獨地能夠保護免受氧化還原狀態(tài)改變的兩種化合物的協(xié)同作用。

圖9a示出了vegf的蛋白質(zhì)印跡分析，其示出了在用feso4傷害后可溶性vegf表達水平的降低，此降低被空calix、slb和在1μmcalixslb的濃度的calixslb消除。事實上，calixslb本身能夠增加vegf的水平。這些結(jié)果與lin等人報道的觀察結(jié)果一致：對于缺氧條件下的arpre細胞和用藥物預(yù)處理的arpre細胞的vegf分泌被抑制(silibinininhibitsvegfsecretionandage-relatedmaculardegenerationinahypoxia-dependentmannerthroughthepi-3kinase/akt/mtorpathwaychlin等人,(2013)britishjournalofpharmacology)。缺乏分泌導(dǎo)致缺乏不能充當(dāng)(自分泌信號傳導(dǎo))自身調(diào)節(jié)物的游離vegf，伴隨血管發(fā)生過程的減少。

組織蛋白酶d是一種細胞內(nèi)天冬氨酰蛋白酶，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為前酶原(pre-pro-enzyme)合成，被加工至產(chǎn)生活性片段。根據(jù)其所在的細胞環(huán)境，它可以通過不同機制誘導(dǎo)或抑制細胞凋亡。48kda片段是一種活性中間體形式，從該活性中間體形式產(chǎn)生另外兩個活性片段；因此，48kda片段的降低與蛋白水解過程的活化相關(guān)，反之其升高表明了細胞凋亡的抑制。在氧化應(yīng)激的存在下，組織蛋白酶d的活化可以活化胱天蛋白酶8，其反過來活化胱天蛋白酶3，導(dǎo)致細胞死亡(regulatoryroleofcathepsindinapoptosis,a.minarowska等人,(2007)foliahistochemicaetcytobiologica)(caspase-8-mediatedapoptosisinducedbyoxidativestressisindependentoftheintrinsicpathwayanddependentoncathepsinsh.k.baumgartner等人,(2007)amjphysiolgastrointestliverphysiol.)。如在圖9b中示出的，將細胞暴露于feso4導(dǎo)致組織蛋白酶d的48kda條帶的減少。用calix或slb后處理增加組織蛋白酶d的表達水平，但在用calixslb處理的樣品中觀察到該蛋白的更大的增加，證實了綴合物關(guān)于保護活性的潛在的效果，保護活性被檢測為組織蛋白酶d參與其中的凋亡過程的抑制。

杯芳烴載體化合物(1)適于負載多種疏水性分子，作為本發(fā)明中的一個實例，除水飛薊賓以外，它負載姜黃素和拉坦前列素。以上活性成分的特征在于低水溶性、易于化學(xué)降解和酶降解、低生物利用度。姜黃素和水飛薊賓是在從炎癥到癌癥的多種狀況中使用的天然物質(zhì)，拉坦前列素是用于治療青光眼(仍然是世界上不可逆轉(zhuǎn)的失明的主要原因的狀況)的前列腺素f2α類似物。

并且，對于這些活性成分，活性成分在納米聚集體化合物(1)中的負載通過相溶解度法發(fā)生，藥物載量≥10％?；钚猿煞值膭┝客ㄟ^hplc分析和uv分光光度法進行。

負載活性成分的納米聚集體(化合物1)由dls和ζ電位測量表征，其示出了納米尺寸、多分散性指數(shù)和表面負載也適用于藥物遞送系統(tǒng)(表11)

表11

負載活性成分姜黃素或拉坦前列素的聚集體1的化學(xué)和物理化學(xué)特征

杯芳烴1將姜黃素以及水飛薊賓在水性介質(zhì)中的溶解度增加了至少10倍。

杯芳烴1在作為溶劑的pbs中保護姜黃素，其在0.1mpbs和無血清基質(zhì)中、在30分鐘內(nèi)示出了80％-90％的降解。(圖10)

在室溫下超過6個月，杯芳烴1在作為溶劑的pbs中保護拉坦前列素免于降解(表12)。這是一個有趣的結(jié)果，因為它允許生產(chǎn)與目前市場上不同的創(chuàng)新制劑，將其從冷鏈中釋放出來并且不含防腐劑。

表12

膠體杯芳烴-拉坦前列素溶液在pbs中、室溫下、從制備起最高達4個月的穩(wěn)定性：尺寸、pdi、拉坦前列素濃度

測試杯芳烴1、負載活性成分的杯芳烴和單獨的活性成分的膠體溶液的細胞毒性：sirc角膜細胞(圖11)、j774巨噬細胞(圖12)和arpe視網(wǎng)膜細胞。結(jié)果示出了杯芳烴和杯芳烴-活性成分組合對所有測試的細胞類型具有良好的生物相容性。

在體外、在通過用lps傷害而發(fā)生炎癥應(yīng)激的j774細胞上測試杯芳烴1、杯芳烴-姜黃素和單獨的姜黃素的膠體溶液的抗炎活性。具體地，用濃度為10μg/ml的脂多糖(lps)刺激j774細胞24小時，用lps刺激誘導(dǎo)炎癥過程的活化，諸如nfκb核轉(zhuǎn)移和細胞因子產(chǎn)生，如果不同時釋放亞硝酸鹽和亞硝化應(yīng)激。然后，在用lps刺激(10μg/ml持續(xù)24小時)和用不同濃度的被研究的遞送體系預(yù)處理2小時后，評價細胞活力。用lps刺激后的細胞活力降低了50％，用被檢查的物質(zhì)諸如姜黃素、載體、和與姜黃素締合的載體處理能夠恢復(fù)細胞活力，幾乎將其恢復(fù)到對照水平，除了已經(jīng)顯示對被傷害的細胞有毒性的較高濃度(圖13)。然后通過蛋白質(zhì)印跡分析來評價遞送體系的抗炎活性。首先，觀察到iκbα的降解(圖14)和隨之而來的nfκb向核轉(zhuǎn)移(圖15)，這導(dǎo)致促炎性基因諸如編碼細胞因子的那些的產(chǎn)生和活化。結(jié)果表明，用lps刺激(10μg/ml持續(xù)30分鐘)顯著增加iκbα的降解和隨后nfκb向核的轉(zhuǎn)移(其水平顯著增加，如可在圖15中看到的)。相反，用遞送系統(tǒng)預(yù)處理能夠顯著降低iκbα的降解和nfκb轉(zhuǎn)移(圖15)。nfκb活化涉及蛋白質(zhì)和炎性介質(zhì)諸如環(huán)加氧酶2(cox-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inos)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致亞硝酸鹽的產(chǎn)生增加。通過蛋白質(zhì)印跡分析，觀察到用lps刺激(10μg/ml持續(xù)24小時)顯著增加了inos和cox-2二者的水平。用姜黃素、載體和與姜黃素締合的載體預(yù)處理顯著地并且以劑量-依賴的方式降低inos和cox-2的水平(圖16)。

杯芳烴衍生物不僅作為載體實現(xiàn)其活性，還對受到lps的炎性應(yīng)激的巨噬細胞具有抗炎活性。進行的測試示出了以下抗炎活性：負載姜黃素的杯芳烴>>杯芳烴>>單獨的姜黃素。

為了驗證負載活性成分的杯芳烴體系對感興趣的眼部位的有效性，用葡萄膜炎模型在體內(nèi)進行實驗。在160g-180glewis大鼠中，通過在后足單次皮下注射200μg在0.2mlph7.4的pbs中稀釋的來自明尼蘇達沙門氏菌(salmonellaminnesota)的lps內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎。對照組僅在后足上接受0.2mlpbs。將大鼠分為處理組(杯芳烴體系、杯芳烴-水飛薊賓、單獨的水飛薊賓、杯芳烴-姜黃素和單獨的姜黃素)；在誘導(dǎo)葡萄膜炎前，通過局部施用進行預(yù)處理，持續(xù)三天，然后在處死的點，對于一些動物處死發(fā)生在注射內(nèi)毒素后16小時，對于其他動物，處死發(fā)生在注射內(nèi)毒素后72小時。摘除眼睛進行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。還取出房水用于蛋白質(zhì)定量。

來自注射過lps的動物的眼組織的組織學(xué)分析示出了伴隨中性粒細胞的強滲透的嚴(yán)重葡萄膜炎的跡象。在僅用載體處理的動物中，炎癥程度沒有降低。用水飛薊賓處理示出了降低但不顯著的眼部炎癥，而杯芳烴+水飛薊賓組合的體系減少了損傷。

然而，用姜黃素，特別是杯芳烴+姜黃素組合處理顯著減少了組織學(xué)損傷。在模擬組中未觀察到眼部炎癥。

而且，在16h和72h組之間沒有觀察到顯著差異。以示例的方式，示出了總結(jié)為不同組在時間72小時記錄的組織學(xué)得分的圖(圖17a)。在注射lps后16小時和72小時，在注射了lps的動物的房水中觀察到升高的蛋白質(zhì)水平。僅用載體處理不會導(dǎo)致眼組織中蛋白質(zhì)水平的降低。水飛薊賓處理的動物示出了趨勢但不顯著，而杯芳烴+水飛薊賓體系組合顯著降低了房水中蛋白質(zhì)的水平。然而，姜黃素和杯芳烴+水飛薊賓體系組合最有效地確定了眼組織中蛋白質(zhì)的減少。在16小時和72小時采集的樣品示出了所有實驗組中類似的趨勢，以示例的方式，示出了在時間72小時發(fā)現(xiàn)的各處理組的蛋白質(zhì)劑量的圖(圖17b)。

為了驗證負載拉坦前列素的杯芳烴體系的有效性，用通過鞏膜靜脈燒灼(evc)在棕色挪威大鼠中誘導(dǎo)的高眼壓模型建立體內(nèi)實驗。

通過滴注12μl/眼(左眼)，每天進行一次治療；對于含活性成分的載體體系的時程，實施方案包括單次施用治療，在此期間在1小時、3小時、5小時、7小時、24小時、30小時和48小時后進行眼內(nèi)壓(iop)的測量；和連續(xù)7天的長期施用，在此期間在下一次滴注前每24小時評價iop測量。

對于每個形成的治療組，其每一個由10只動物組成；將在不同時間點記錄的平均iop測量結(jié)果與之前計算的基線的平均值比較。圖(圖18a/b)示出了與商購產(chǎn)品(iopize)相比，用calix+拉坦前列素治療在時間過程的不同時間點單次施用之后(圖18a)和持續(xù)七天的長期治療(圖18b)后的降低眼內(nèi)壓(iop)的趨勢。

對于兩個治療，在杯芳烴-拉坦前列素體系的情況和在產(chǎn)品iopize的情況二者中，壓力變化的趨勢非常相似，在施用后緊接著第1個小時期間觀察到拉坦前列素的自相矛盾的效果，并且由iop的明顯上升組成，文獻中已知此效果在大鼠中常見(latanoprost-inducedchangesinratintraocularpressure:directorindirect？husains等人joculpharmacolther.(2008)；effectsoflatanoprostonrodentintraocularpressure.husains等人expeyeres.(2006))，隨后發(fā)生壓力的逐漸降低，其在僅24小時后達到峰值，然后趨于升高。每24小時施用的長期治療允許iop的降低，其在使用杯芳烴-拉坦前列素體系的第4天左右達到其拐彎的最高點。與商購產(chǎn)品相比，杯芳烴體系提供了從冷鏈釋放產(chǎn)品、不使用防腐劑配制產(chǎn)品同時保持活性成分的有效性的優(yōu)勢。