專利名稱：B/e環(huán)取代水飛薊賓用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取 代的水飛薊賓酯或其可藥用鹽用于制備降低乙肝病毒表面抗原HBsAg和乙肝e抗原HBeAg、 抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。該黃酮木脂素具有確切的抑制 HBsAg和HBeAg活性，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg和HBeAg的強(qiáng)度分別為18. 5% 和23.0%，均超過陽性對照藥物(10000單位/毫升的α-干擾素)；同時，在該濃度時其 對HBV DNA顯示出23. 3%的抑制率。以上表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽同時具有抑制 HBsAg,HBeAg和HBV DNA的功效；可預(yù)期用于制備清除HBsAg和HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制、 治療乙型肝炎病毒感染疾病之非核苷類藥物的用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的傳染病。HBV是嗜肝DNA病毒科 hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動 物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長類動物黑猩猩體內(nèi)才能得以復(fù)制。該病毒通過乙 肝病毒攜帶者和乙肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進(jìn)行傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。乙 肝在我國廣泛流行，因其分為垂直傳播、水平傳播、家庭內(nèi)傳播、醫(yī)源性傳播和性傳播等多 種方式，對人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達(dá)到35%以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測陽性的 患者已經(jīng)達(dá)到1.89億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億，是當(dāng)前危害人民健康最 嚴(yán)重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少數(shù)病 人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外殼蛋白，HBsAg陽性是判斷HBV感染的金標(biāo) 準(zhǔn)。HBsAg陽性、但無肝炎癥狀出現(xiàn)者成為HBV病毒攜帶者。HBsAg滴度越大，其合并乙肝 核心抗原HBeAg、HBV DNA陽性和DNA多聚酶活性升高的幾率就越大，因而傳染性越強(qiáng)。同 理，抑制HBsAg的分泌和復(fù)制也是研發(fā)抗乙肝病毒藥物中的一個重要靶標(biāo)和檢測標(biāo)的。北 京地壇醫(yī)院吳淑云等報(bào)告乙肝HBsAg清除和乙肝閉環(huán)共價DNA(cccDNA)存在一定相關(guān)性， 清除HBsAg是cccDNA水平顯著降低的標(biāo)志。2002年，在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究結(jié) 果之研究者認(rèn)為對于CHB患者，如在肝硬化前獲HBsAg清除，則其肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生 率將降低60倍。美國肝病研究協(xié)會AASLD、亞太肝臟研究協(xié)會APASL和歐洲肝臟研究協(xié)會 EASL的指南中均將HBsAg血清清除作為治療終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)之一。據(jù)2008年歐洲肝臟研究學(xué)會年會報(bào)道聚乙二醇干擾素α -2a治療CHB患者48 周后停藥，隨訪1、2、3、4年，其HBsAg清除率分別為3%、6%、8%和11%，而單獨(dú)用拉米夫 定者對HBsAg清除率于停藥后1、2、3、4年僅為0%、0%、0%和3%。因而該干擾素被認(rèn)為 是治療HBeAg陰性CHB患者最佳治療選擇?？梢姲l(fā)現(xiàn)能夠高效清除HBsAg的藥物具有重大 的社會和經(jīng)濟(jì)效益。乙肝e抗原HBeAg是乙肝病毒HBV內(nèi)核的結(jié)構(gòu)蛋白，在乙肝病毒繁殖時大量產(chǎn)生。 乙肝病毒HBV具有所有已知DNA病毒中最小的基因組(僅3. 2kb)，其基因主要編碼五種蛋白(S、C、E、P、X)。C蛋白為病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成為乙肝e抗原 (HBeAg)，其是已經(jīng)編碼好但未組裝到病毒顆粒中的蛋白，在病毒復(fù)制時會分泌到患者血液 中去。臨床上，通常將血清HBeAg作為HBV復(fù)制、傳染性、病情嚴(yán)重程度以及對其進(jìn)行治療 應(yīng)答進(jìn)行評價的重要標(biāo)志物。該抗原與HBV DNA密切相關(guān)，是臨床上表達(dá)病毒復(fù)制非常實(shí) 用的血清標(biāo)志物。血清標(biāo)志物HBeAg陽性患者說明其體內(nèi)有HBV復(fù)制，故而有較高的傳染 性?；颊逪BeAg表達(dá)越高說明該患者傳染性越強(qiáng)。同理，抑制HBeAg的分泌和復(fù)制也是研 發(fā)抗乙肝病毒藥物中的一個重要靶標(biāo)和檢測標(biāo)的。HBeAg清除說明體內(nèi)有著持續(xù)的HBV抑 制，ALT正常，組織炎癥壞死減輕，肝硬化發(fā)生的幾率降低。因此，血清HBeAg被認(rèn)為能夠反 映更為穩(wěn)定的治療效果，HBeAg血清清除標(biāo)志著患者免疫系統(tǒng)開始發(fā)揮作用。2002年，在 《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究結(jié)果之研究者認(rèn)為對于CHB患者，如在肝硬化前獲HBeAg清 除，則其肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生率將降低10倍。美國肝病研究協(xié)會AASLD、亞太肝臟研究 協(xié)會APASL和歐洲肝臟研究協(xié)會EASL的指南中均將HBeAg血清清除作為治療終點(diǎn)判定標(biāo) 準(zhǔn)之一。所以，能夠抑制、降低HBeAg表達(dá)或活性的藥物也即屬于治療乙肝病毒感染有效藥 物。目前，對乙肝患者的用藥主要分為保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化和調(diào)節(jié)免疫等數(shù) 個大類。近些年來取得進(jìn)展的還是在于抗病毒藥物治療方面的研究。抗病毒是根本方法，而 保肝降酶只是輔助治療，多治標(biāo)而鮮見治本。然而，目前對于病毒性乙肝臨床上的治療方案 只能達(dá)到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，最主要藥物仍是核苷類藥物如拉米呋啶(3-TC)、恩替 卡韋、阿德福韋(ADV)、替比夫定等，還有處于臨床試驗(yàn)期中的emtricitabine、tenofovir、 clevuding等。在我國，拉米呋啶已經(jīng)成為醫(yī)保用藥，應(yīng)用于大批HBV患者。核苷類藥物部 分優(yōu)點(diǎn)為生物利用度高，口服較安全。然而，它們雖然能有效地控制病情，但一則售價昂 貴；二則長期使用均可出現(xiàn)耐藥性，以及停藥后出現(xiàn)HBV DNA、ALT及肝組織學(xué)的不同程度 的反彈；三是長期使用核苷類藥物出現(xiàn)的較為明顯的眾所周知的不良作用，例如腎臟損傷、 嬰兒致畸等。最為頭痛的是病毒耐藥的出現(xiàn)大大降低了治愈率，因?yàn)楹塑疹愃幬飳Σ《緩?fù) 制是可逆的，所以對大部分患者若欲達(dá)到最大療效，療程必須在一年以上，如此其耐藥性隨 之出現(xiàn)，就達(dá)不到預(yù)期之效果。且核苷類藥物還有難以清除cccDNA、治療一年后HBsAg難以 陰轉(zhuǎn)等不足之處。干擾素(α、β-干擾素)以及重組干擾素類等來源于人白細(xì)胞的生物工程類抗病 毒藥物近期成為研究和治療CHB熱點(diǎn)藥物，其具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用。其既可通 過抗病毒作用抑制病毒復(fù)制從而減輕肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損害，延緩病情發(fā)展 從而起到改善病人臨床癥狀和肝臟生理功能；又可以增強(qiáng)免疫作用，通過加強(qiáng)體內(nèi)自然殺 傷細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的作用，尤其是可以促進(jìn)殺傷T細(xì)胞去殺傷被病毒感染細(xì)胞，因此間 接起到抗病毒作用。干擾素治療CHB患者獲得的HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換比拉米呋啶更為持久， 2003年《消化道》雜志上一項(xiàng)研究顯示干擾素治療組HBsAg的3年復(fù)發(fā)率顯著低于拉米 呋啶組；且長效干擾素可以每周使用一次，較為方便。因此，干擾素日漸成為臨床上用于治 療慢性乙肝病毒的首選藥物之一，但其副作用和不良反應(yīng)報(bào)道較多，總有效率不高，價格昂 貴，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大，因而造成臨床上難以廣泛使用，且對失代償肝硬化患者不適宜應(yīng)用。近幾年隨著肝病的研究，發(fā)展了標(biāo)準(zhǔn)化的HBV DNA的分析，大大推進(jìn)了對乙肝患者 病情的了解。HBV-DNA的定量分析能預(yù)測乙肝的嚴(yán)重性及其預(yù)后，因?yàn)镠BV DNA持續(xù)陽性
5(即持續(xù)病毒血癥)容易使乙肝病情進(jìn)展和加重；高乙肝病毒(HBV DNA)含量容易促進(jìn)肝硬 化的形成；HBV DNA持續(xù)存在是肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的高危因素，特別是病毒含量較高、病 程較長、年齡較大或合并其它肝病者；持續(xù)高濃度的HBV DNA存在，可導(dǎo)致失償常性肝硬化 及原發(fā)性肝重癥的死亡率明顯增加。同時必須認(rèn)識到，HBV DNA水平與肝臟組織學(xué)的關(guān)系極 其密切文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)抗病毒治療，肝臟纖維化的改善和消除明顯；近期國際肝病會議報(bào)導(dǎo)， 強(qiáng)效和低耐藥性的抗病毒治療，隨著HBV DNA的降低和轉(zhuǎn)陰，而觀察到肝硬化可出現(xiàn)不同程 度的逆轉(zhuǎn)，因此現(xiàn)在主張肝硬化也應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療。因此，HBV DNA指標(biāo)在抗病毒治療中的應(yīng)用也起著舉足輕重的作用HBV DNA的水 平是決定慢性乙型用炎是否需要抗病毒治療的重要指標(biāo)；根據(jù)HBV DNA的不同情況分別制 定出HBeAg陽性或HBeAg陰性的不同治療標(biāo)準(zhǔn)和要求；在抗病毒治療中，根據(jù)HBVDNA的治 療反應(yīng)，判斷是否病毒學(xué)早期應(yīng)答進(jìn)而決定長期用藥的策略以取得持續(xù)性的病毒學(xué)應(yīng)答， 達(dá)到持續(xù)病毒抑制的目的；根據(jù)HBVDNA的病毒學(xué)的應(yīng)答情況，創(chuàng)造HBeAg血清學(xué)的轉(zhuǎn)換基 礎(chǔ)和條件，以達(dá)到其良好的中間治療目標(biāo)；根據(jù)HBV DNA持續(xù)抑制情況爭取病毒持續(xù)陰性， 以爭取達(dá)到抗病毒最終治療目標(biāo)；根據(jù)HBV DNA持續(xù)完全受到抑制，也顯示出了 cccDNA的 不同程度好轉(zhuǎn)和消失；在抗病毒治療中，以HBV DNA的變化來評估和預(yù)防抗病毒藥物所引 起的病毒變異及耐藥發(fā)生的風(fēng)險；一旦發(fā)生病毒變異或耐藥時，HBV DNA的變化是唯一的最 先的信號和診斷依據(jù)，也是治療耐藥和改變治療策略的指導(dǎo)和依據(jù)。綜上所述，對HBV DNA 的抑制程度在乙肝的進(jìn)一步診斷和治療上有著新的重大意義，對療效的觀察，對評估乙肝 預(yù)后及耐藥危險性均有較大的指導(dǎo)作用。由上述因素可知抑制乙肝病毒在體內(nèi)增殖的另外一個根本環(huán)節(jié)在于抑制HBV DNA的復(fù)制。HBV DNA水平的降低或者低于檢測水平是檢驗(yàn)抗病毒藥物的另外一把金鑰匙。 所以，亞太肝臟研究學(xué)會和歐洲肝臟研究學(xué)會均將HBV DNA檢測不到作為乙型肝炎病毒患 者治療終點(diǎn)之一。我國新藥開發(fā)指南中也將受測化合物對于HBV DNA的抑制強(qiáng)度視為必須 完成的測試項(xiàng)目之一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)效的抑 制HBV DNA復(fù)制之活性。因此既能抑制HBV DNA復(fù)制又能抑制HBsAg的化合物將更有希望 成為治療乙肝患者的創(chuàng)新性藥物。必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實(shí)只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接 殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會損傷宿主細(xì)胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還 存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點(diǎn)，因此開發(fā)新型抗病毒藥 物是當(dāng)今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。其對于治療我國大量的乙肝患者和病毒攜帶者、控制 傳染源等都有著極其重要的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義。所以，從民族民間長期使用的天然藥物 中發(fā)現(xiàn)新的非核苷類乙肝病毒抑制劑及此類能夠降低HBsAg、HBeAg或抑制HBV DNA復(fù)制的 先導(dǎo)化合物有著很大的指導(dǎo)性意義，并有著遼闊的發(fā)展前景。基于此目的，發(fā)明人以前曾完成多項(xiàng)抗乙肝病毒天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物 的專利和文章，發(fā)現(xiàn)了多種抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg或乙肝病毒e抗原HBeAg活性、 或抑制HBV DNA復(fù)制的化合物，從而說明從天然產(chǎn)物及其合成衍生物中篩選出能夠降低 HBsAg或HBeAg、防治乙肝病毒感染的創(chuàng)新性藥物是可行的[參見“一類對映桉烷醇類倍 半萜抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、劉光明、于榮敏、李海波等；ZL 200610053827. 4)； “2β-羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL200610053749. 8) ；“2 α，3 β - 二羥基_5，11(13) - 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥 用途”(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等；ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝 病毒的用途及其藥物組合物”(趙昱、李海波、楊雷香、周長新等；ZL 03153691.3)；“一種艾 里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其應(yīng)用”(趙昱、周長新、施樹云、王曉雨等；ZL 200610053575. 5)； “一種桉烷型倍半萜酸及其用途”(趙昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL 200610053579. 3)； “六棱菊屬植物提取物抑制單純皰疹病毒及乙肝病毒的用途”(趙昱、周長新、于榮敏、 白驊；CN 1989989Α) ；“ 1 β -氧代_5，11 (13)- 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用 途”(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN 1927197Α) ；“ 1 β -羥基冬青酸抑制乙肝病毒 的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美等；CN 1935131Α)；“對映艾里莫芬烷酸及 其抑制乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途”(黃可新、李校堃、王曉雨、趙昱等；CN 101239054)； “1-氧-取代苯甲?？崴峄衔锛捌湟种埔腋尾《居猛尽?李校堃、胡利紅、巫秀美、趙 昱等；CN101293836)；發(fā)明人已發(fā)表之抑制HBsAg、HBeAg以及HBV DNA等活性文章參見 “In Vitro Antiviral Activity of Three EnantiomericSesquiterpene Lactones from Senecio Species Against Hepatitis B Virus，，,Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou ( M 長新)，Xiumei Wu (巫秀美)，Yu Zhao* (趙昱)等，Antiviral Chemistry&Chemotherapy, 2005,16,277-282 ；"Evaluation of Antiviral Activity of Compounds Isolated fromRanunculus sieboldii Miq. and Ranunculus sceleratus L，，，Haibo Li (李海波)， Changxin Zhou(周長新)，Xiumei Wu(巫秀美)，Yu Zhao*(趙昱)等，Planta Medica，2005， 71(12),1128-1133；"Application ofhigh-speed counter-current chromatography for the isolation of antiviraleremophiIenolides from Ligularia atroviolacea", Shi, Shu-Yun (施樹云)，Hai-Bo (李海波)，Zhao, Yu (趙昱)等，Biomedical Chromatography, 2008,22(9),985-991；"Purification and identification of antiviralcomponents from Laggera pterodonta by high-speed counter-currentchromatography", Shuyun Shi(施樹云)，Yu Zhao ( MS )等，Journalof Chromatography B，2007，859，119-124]。毋 庸置疑，繼續(xù)從天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物中尋找能夠清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA 復(fù)制的先導(dǎo)化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國家科技部列為新藥研制重大專 項(xiàng)之一。 在上述治療CHB藥物中，還有一類是保肝類藥物，其臨床大量使用之典型為存在 于菊科植物水飛薊的種子中的水飛薊素。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在市場上其商品 名為Legalon 利肝隆或Flavobion ，其代表性化合物當(dāng)屬黃酮木脂素水飛薊賓。黃酮 木質(zhì)素化合物屬于雜木質(zhì)素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結(jié)合而成的一類天然產(chǎn) 物。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點(diǎn)(一)抗自由 基活性水飛薊素對于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護(hù) 作用。1990年Lotteron等人報(bào)道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代 謝引起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨(dú)引起的過氧化作用，這些都表明水飛薊素 為鏈中斷抗氧化劑或?yàn)樽杂苫宄齽?二)保護(hù)肝細(xì)胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維 持細(xì)胞膜的流動性，保護(hù)肝細(xì)胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與 肝細(xì)胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對肝細(xì)胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，中斷其肝腸循環(huán)，從而增 強(qiáng)肝細(xì)胞膜對于多種損害因素的抵抗力。(三)促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進(jìn)入細(xì)胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強(qiáng)肝細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合 酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進(jìn)DNA的合成，有利于肝 細(xì)胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤， 造成DNA損傷，進(jìn)而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治 療腫瘤的作用。三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora， K.等，Am. J. Gastroenterol, 1998,93,139-143 ；Sailer, R.等，Drugs, 2001, 61 (14)，
2035-2063 ；Gazak, R.等，Curr. Med. Chem. 2007，14，315-338 ；Svagera, Z.等，Phytother. Res. 2003，17，524-530 ； Gazak, R.等，Bioorg. Med. Chem. 2004，12，5677-5687 ；Varga, Z.等；Phytothe. Res. 2001，15，608—612. Singh, R. P.等，Curr. CancerDrug Tar. 2004，4， 1-11)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木質(zhì)素類化合物引起了越來越多的關(guān)注，如發(fā)明人 于2006-2009年間制備并報(bào)道的多個系列水飛薊賓類衍生物也具有顯著的抗氧化活性(楊 雷香、趙星等，"Design，synthesis andexamination of neuron protective properties of alkenylated and amidateddehydro-silybin derivatives", Journal of Medicinal Chemistry，2009，52(23)，7732-7752 ；汪峰，趙昱等，“Preparation of C-23 esterified silybinderivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitory and DNAprotective properties", Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17(17)， 6380-6389 ；楊雷香，等，"Synthesis and antioxidant propertiesevaluation of novel silybin analogues，，，Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry, 2006，21(4), 399-404 ；等等)。在發(fā)明人報(bào)道的上述文章中，經(jīng)發(fā)明人設(shè)計(jì)并合成出的多個 系列之A環(huán)、B環(huán)、E環(huán)、23位取代的黃酮木脂素類化合物都顯示出強(qiáng)效捕獲DPPH自由基和 超氧陰離子自由基的活性、抗氧化活性、以及保護(hù)PC12細(xì)胞的活性。但是顯而易見上述研 究僅集中于研究水飛薊賓類黃酮木脂素的抗氧化作用和細(xì)胞保護(hù)作用。近期(2006年)，謝軍報(bào)道了聯(lián)合應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用的干擾素 和保肝護(hù)肝的水飛薊賓磷脂復(fù)合物治療慢性乙肝的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對患者體內(nèi)ALT、 AST值降低比單獨(dú)用干擾素效果明顯，說明水飛薊賓磷脂復(fù)合物能加強(qiáng)干擾素的治療慢性 乙肝之作用。但是，類似的治療方案仍是將水飛薊賓等黃酮木脂素作為輔助用藥，且主要是 用于保護(hù)肝細(xì)胞膜而非直接用其實(shí)施抗病毒作用。左國營等(左國營，劉樹玲，徐貴麗，世 界華人消化雜志，2006年14卷13期，1241-1246頁)綜述了近20年來藥用植物成分體外抗 HBV活性的研究進(jìn)展，文中論及多種天然產(chǎn)物，其中并沒有報(bào)道任何黃酮木脂素類化合物具 有抗HBV活性的相關(guān)記錄，尤其是水飛薊賓類天然產(chǎn)物及其衍生物，國內(nèi)幾乎無人涉及，僅 由發(fā)明人團(tuán)隊(duì)對其進(jìn)行了前人未加注意的結(jié)構(gòu)改造和抗氧化活性研究。以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素化合物雖然具有以上所述之抗氧化療效，然而其 見報(bào)于抗病毒治療方面之文獻(xiàn)相對較少。黃酮木脂素類化合物治療DNA類病毒感染尤其是 其用于抗乙肝病毒方面(包括抑制HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制)的新用途尚未得到 有效開發(fā)，故此從黃酮木脂素中尋找抗乙肝病毒領(lǐng)域的活性化合物、也即將黃酮木脂素結(jié) 構(gòu)改造使其具有抗DNA類病毒活性是一個嶄新的領(lǐng)域。從其中發(fā)現(xiàn)清除HBsAg或HBeAg、抑 制HBV DNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物更是前人所未嘗試過的挑戰(zhàn)。為了探索這個領(lǐng)域，我們設(shè)計(jì)并 制備了與水飛薊賓結(jié)構(gòu)有所差異的一種新的黃酮木脂素衍生物，也即將原水飛薊賓之B環(huán) 引入一個乙氧基，而于E環(huán)引入一個甲氧基，改變整個分子共軛強(qiáng)度，同時引入新的氫鍵受體或給體，如此設(shè)計(jì)可以生成新型空間結(jié)構(gòu)不同于水飛薊賓的一類新型木質(zhì)素二氫黃酮醇 類化合物(也是一類新型黃酮木脂素化合物)。以期發(fā)現(xiàn)超乎尋常的清除HBsAg或HBeAg、 抑制HBV DNA復(fù)制的活性乃至先導(dǎo)化合物，從而將其進(jìn)一步開發(fā)成具有能清除HBsAg或 HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制、治療CHB的創(chuàng)新性藥物，據(jù)此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供式(1)所示的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯類 黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備清除HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒
性肝炎藥物中之新用途。 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4_羥基-3，5_ 二甲氧基苯 基)-2-羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯 并吡喃-4-酮。本發(fā)明的另一目的是提供了式(1)化合物的全合成方法，該方法的合成工藝路線 特征是以化合物2，4，6-三甲氧甲氧基苯乙酮(1-1)和3-乙氧基-4，5-甲氧甲氧基苯甲 醛(1-2)為起始物，在有機(jī)溶劑中以及堿水作用下縮合成查耳酮(1-3)，該查耳酮在堿性過 氧化氫作用下經(jīng)環(huán)氧化得到環(huán)氧查耳酮(1-4)，該環(huán)氧查耳酮在酸性有機(jī)溶劑中環(huán)合得到 二氫黃酮醇(1-5)，再于催化劑作用下，二氫黃酮醇與芥子醇(1-6)進(jìn)行自由基偶聯(lián)反應(yīng)生 成化合物(1)。其具體流程如下所示 其中R1為乙基，R2, R3均為甲氧基。本發(fā)明的另一個目的是提供了一種用于清除HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制、 治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其特征為由含有治療有效量的作為活性成分的式(1) 化合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注 射齊 、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以 采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯化合物(1)與天然黃酮木脂 素類化合物水飛薊賓相比較，具有諸多結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)上差異化的特征，包括其疏水性、芳 香性、吉布斯自由能、氫鍵受體、電性、分子間范德華力、以及3D構(gòu)象、伸展方向、分子重心、 共軛程度、電性分布中心等特質(zhì)均與水飛薊賓有著明顯不同；且化合物(1)分子量比水飛 薊賓增大了 74個質(zhì)量單位。上述特征都決定了式(1)所示化合物之三維構(gòu)象與HBsAg或 或HBeAg乃至HBV DNA之3D空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合之配體-受體結(jié)合復(fù)合物形態(tài)和結(jié)合方式都 可能產(chǎn)生較大的差別，其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式、其結(jié)合自由能等均會產(chǎn)生較大的改變，因而 可能在清除HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制方面有著意想不到的效果。我們測試了該化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長抑制作用，同時測試了其對 H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型HBsAg、HBeAg及對HBVDNA復(fù)制的抑制活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中合成得到的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲 氧基取代的水飛薊賓酯即(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥甲 基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃_4_酮 對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg具有確切的抑制活性，在100微克/毫升濃度下 其清除HBsAg和HBeAg的強(qiáng)度分別為18. 5%和23. 0%，均超過陽性對照藥物(10000單位/ 毫升的α-干擾素)；同時，在該濃度時其對HBV DNA顯示出23. 3%的抑制率。以上均說明 式(1)化合物有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預(yù)期其可以作為清除HBsAg或HBeAg、 抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎之活性化合物(hit)繼續(xù)開發(fā)。經(jīng)本發(fā)明人詳細(xì)的文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚無有關(guān)該化合物治療乙肝病毒感染 性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道。黃酮木脂素式⑴化合物對于HBsAg、HBeAg和HBV DNA強(qiáng)效抑制均屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著確切的原創(chuàng)性。綜上所述，我們合成的該水飛薊 賓酯類黃酮木脂素既有結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎性，并在抗乙肝 病毒活性測試中既發(fā)現(xiàn)了不尋常的抑制HBsAg的活性，又發(fā)現(xiàn)了顯著的抑制HBeAg之活性， 還發(fā)現(xiàn)其具有極強(qiáng)效的抑制HBV DNA復(fù)制活性；有望成為強(qiáng)效清除HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制及治療CHB之非核苷類藥物之先導(dǎo)化合物。本發(fā)明有益之處在于首次發(fā)現(xiàn)式(1)所示之B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水 飛薊賓酯類黃酮木脂素具有清除HBsAg或HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制的功效，以及其在防治 乙肝病毒感染疾病方面的成藥潛力，為開發(fā)成為治療乙肝病毒創(chuàng)新藥物、開發(fā)清除乙型肝 炎表面抗原HBsAg或乙肝e抗原HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制之非核苷類創(chuàng)新藥物提供了新的 物質(zhì)基礎(chǔ)。具有潛在巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明再一特點(diǎn)為本發(fā)明之合成起始 物來源方便，合成方便。其制備方法簡單易行，原料來源方便易得，成本低，污染小，利于節(jié) 能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。
10
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過化學(xué)合成，并通過多種層析手段純化得到該既能強(qiáng)效抑制乙肝 HBsAg和HBeAg的分泌又能有效抑制HBV DNA復(fù)制活性的一個B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取 代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素類活性化合物，又經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出 其化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，式(1)化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，而 對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙肝HBsAg和HBeAg的分泌以及HBV DNA的復(fù)制具有確切的抑 制作用，提示該化合物具有用藥安全、有效清除HBsAg或HBeAg、及有效抑制HBV DNA復(fù)制的 特點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明人的研究，發(fā)明人所設(shè)計(jì)并合成的式(1)所示之黃酮木脂素化合物 可以用于制備治療乙肝病毒感染性疾病的非核苷類藥物和用于治療乙肝病毒感染性疾病。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用式(1)化合物的制備及其對 H印G2. 2. 15細(xì)胞生長抑制作用以及對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg及HBV DNA復(fù) 制之抑制作用試驗(yàn)的結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。實(shí)施例給出了式(1)化合物的 部分合成、結(jié)構(gòu)鑒定、和活性數(shù)據(jù)，其中OMe是指甲氧基、OMOM是指甲氧甲氧基、OEt是指乙 氧基。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1 式⑴化合物(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4_羥基-3，5-二甲氧基苯 基)-2-羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-] -2，3- 二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯 并吡喃-4-酮的制備1. 1儀器與試劑紫外光譜用Shimadzu UV-240紫外分光光度計(jì)測定；核磁共振氫譜1H-NMR由 INOVA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIAN IN0VA-400MHz)測定(四甲基硅醚TMS為內(nèi)標(biāo))；電 噴霧質(zhì)譜ESI-MS由BrukerEsquire 3000+質(zhì)譜儀測定，柱層析用硅膠(100-200，200-300 和300-400目)以及薄層層析用硅膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產(chǎn)；所用試 劑均為分析純，薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠 Sephadex LH-20 采用瑞典 Amersham Pharmacia Biotech AB 公司產(chǎn)品；反相硅膠 RP-18 采 用日本Fuji Silysia Chemical公司的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日本三菱化工公司產(chǎn)品， 薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸 溶液。1. 2中間體1- (2,4,6_三甲氧甲氧基苯基)-3- (3,4- 二甲氧甲氧基_5_乙氧基苯
基)丙烯酮的制備 3. 2克3-乙氧基-4，5-二甲氧甲氧基苯甲醛和3. 5克2，4，6_三甲氧甲氧基苯乙 酮溶解在40毫升乙醇中，加入溶解有10克氫氧化鉀的20毫升水溶液，于室溫下攪拌15小 時。減壓蒸出乙醇，加入30毫升水，醋酸乙酯萃取三次，每次20毫升。合并有機(jī)相后，依次
11用飽和亞硫酸鈉(40毫升)和飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，經(jīng)硅 膠柱層析得到中間體1-(2，4，6_三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4_ 二甲氧甲氧基-5-乙氧基苯 基)丙烯酮化合物4.5克。Rf(石油醚/醋酸乙酯=2 1) 0.40;紫外(甲醇)λ _ = 210， 325nm ；核磁共振氫譜 1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ 1. 39 (三重峰，J = 7. 2Hz，3H，CH3)，
3.34 (單峰，6Η, OCH3)，3. 43 (單峰，3Η, OCH3)，3. 46 (單峰，3Η, OCH3)，3. 56 (單峰，3Η, OCH3)，
4.02 (四重峰，J = 7. 2Hz，2H，CH2)，5· 06 (單峰，4H，OCH2O)，5. 11 (單峰，4H，OCH2O)，5. 14 (單 峰，2H, OCH2O)，6. 51 (單峰，2H，H-3 ‘，5 ‘ )，6. 74 (雙峰，J=L 6Hz, 1H, H-2)，6. 80 (雙峰，J =16·0Ηζ，1Η，Η-α)，6·91(雙峰，J = 1. 6Hz，1Η，Η-6)，7. 17 (雙峰，J = 16. 0Hz，1Η，H-β )； 電噴霧質(zhì)譜 ESI-MS :m/z 553 [M+H]+。1. 3中間體化合物1- (2，4，6-三甲氧甲氧基苯基)-3- (3-乙氧基-4，5_ 二甲氧甲
氧基苯基)環(huán)氧丙酮的制備3克1.2中制備得到的化合物1-(2，4，6_三甲氧甲氧基苯基)-3-(3，4_ 二甲氧甲 氧基-5-乙氧基苯基)丙烯酮溶解于50毫升甲醇中，于攪拌狀態(tài)下加入2N氫氧化鈉4毫 升，30%過氧化氫4毫升，于室溫?cái)嚢?0小時，減壓蒸去溶劑，加入50毫升水，乙酸乙酯提 取(3X30毫升)。合并有機(jī)相后用飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃 縮得黃色油狀物2. 65克，可直接用于下一步反應(yīng)。Rf (石油醚/醋酸乙酯=2 1)0. 40； UV(甲醇)Amax = 206，281nm;核磁共振氫譜1HNMRGOOMHz,氘代氯仿)δ :1·39(三重峰， J = 7. 2Hz，3H，CH3)，3. 34(單峰，6Η，OCH3)，3. 43(單峰，3Η，OCH3)，3. 46(單峰，3Η，OCH3)，
3.56(單峰，3H，0CH3)，3· 91 (雙峰，J = 1. 6Ηζ, 1Η，Η_β )，3· 94(雙峰，J = 1. 6Ηζ, 1Η，Η_α )，
4.03 (四重峰，J = 7. 2Hz，2H，CH2)，5· 06 (單峰，4Η，OCH2O)，5· 11 (單峰，4Η，OCH2O)，5. 14 (單 峰，2Η, OCH2O)，6. 51 (單峰，2Η，Η-3 ‘，5 ‘ )，6. 74 (雙峰，J=L 6Hz, 1Η, H-2)，6· 91 (雙峰， J=L 6Hz, 1Η, Η-6) ；ESI-MS :m/z 569[M+H]+。1.4化合物5'-乙氧基-3，5，7，3' ,4'-五羥基二氫黃酮的制備 2. 8克1. 3中制備得到的1- (2,4,6_三甲氧甲氧基苯基)-3- (3-乙氧基-4，5_ 二 甲氧甲氧基苯基)環(huán)氧丙酮化合物溶解于35毫升甲醇和15毫升四氫呋喃中，向其中滴加5 毫升濃鹽酸，于50-55°C攪拌30分鐘，減壓蒸去溶劑，乙酸乙酯提取(3X30毫升)，合并有 機(jī)相后用飽和食鹽水(40毫升)洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，經(jīng)柱層析得黃色粉末
120.75克，收率45%。Rf (氯仿/甲醇=10 1)0. 15 ；核磁共振氫譜1H NMR(400MHz，氘代丙 酮)δ 1. 33 (三重峰，J = 7. 2Hz，3H，CH3)，4. 08 (四重峰，2Η，J = 7. 2Hz, CH2)，4. 62 (雙雙 峰，J = 12. 0,4. OHz, 1Η,Η-3) ,4. 68 (雙峰，J = 4. 0Hz，1Η，3-0Η)，4. 97 (雙峰，J = 12. OHz, 1Η，Η-2)，5. 93 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η，Η-6)，5. 97 (雙峰，J = 2. OHz, 1Η，Η_8)，6. 71 (雙峰，J =2. 0Hz, 1Η, Η-2' )，6.73(雙峰，J = 2. 0Hz，1Η，Η-6 ‘ )，11. 71 (單峰，1Η，5-0Η)；電噴霧 質(zhì)譜 ESI-MS :m/z 349 [M+H]+。1. 5化合物(1)的制備在干燥氮?dú)獗Ｗo(hù)的反應(yīng)瓶中加入化合物5'-乙氧基_3，5，7，3'，4'-五羥基二 氫黃酮0. 6克和化合物芥子醇0. 85克，用無水丙酮40毫升和無水苯120毫升溶解，再加入 1. 5克碳酸銀，于55-60°C攪拌20分鐘，過濾，母液濃縮，經(jīng)柱層析得淺黃色粉末0. 32克，收 率27%。Rf (氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/甲酸=11 0.5 1 1 0. 1)0.27 ；核 磁共振氫譜1H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ :1.34(三重峰，J = 7. 2Hz,3H, CH3)，3. 51 (多重 峰，1Η, H-23a)，3. 83 (單峰，6H, OCH3)，3. 99 (四重峰，J = 7. 2Hz,2H, CH2)，4. 06 (多重峰，1H, H-23b), 4. 17 (多重峰，1H，H-10)，4. 68 (雙峰，J = 12. OHz，1H，H_3)，4. 95 (雙峰，J = 8. OHz， 1H, H-11) ,5. 03 (雙峰，J = 12. OHz, 1H, H-2)，5. 93 (雙峰，J = 2. OHz, 1H, H-6)，5. 97 (雙 峰，J = 2. OHz，1H, H-8), 6. 75-6. 89(多重峰，4H，Ar-H)，11. 67 (單峰，1H，5-0H)；電噴霧質(zhì) 譜ESI-MS:m/z 557[M+H]+。實(shí)施例2 化合物(1)對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑 制作用2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將H印G2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升 鏈霉素，100微克/毫升G418的DMEM培養(yǎng)基中，置37°C，5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱
中培養(yǎng)。2. 2采用MTT法測定式(1)化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑制作用取對數(shù)生長期的H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1 X IO5個/毫升，接種 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小 時后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物(1)，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微 克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37°C，5% CO2,100% 相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄 去培養(yǎng)基，每孔加入DMS0200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD 值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。抑制率(％)=(對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對 照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測定化合物1對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用取對數(shù)生長期的
13H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IX IO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 毫升，在37°C，5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的樣 品，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度 設(shè)三個復(fù)孔，置于37°C，5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品 的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。用ELISA試劑 盒測定培養(yǎng)基中HBsAg濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1 (注拉米夫啶 測試濃度為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α-干擾素為陽性對照 2 (注α -干擾素測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，式(1)化合物(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4_羥基-3，5_ 二 甲氧基苯基)-2_羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三 羥基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮有確切的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其對 H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，但對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的HBsAg在第八天時高 劑量下抑制活性高于拉米呋啶和α-干擾素。表1.樣品第八天時對H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率 2. 4結(jié)果說明該實(shí)施例結(jié)果說明式⑴所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二 氫-3- (4-羥基-3，5- 二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)_6_] -2， 3- 二氫-3，5，7-三羥基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎表面抗 原(HBsAg)具有確切的抑制作用，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg的強(qiáng)度為18. 5%, 超過陽性對照藥物2 (10000單位/毫升的α-干擾素)；更超過陽性對照1拉米呋啶。可 見該黃酮木脂素有較強(qiáng)的抑制病毒分泌表面抗原活性。HBsAg清除是臨床上最接近治愈的狀態(tài)，對于乙肝患者，其HBsAg清除成為非常有 價值的CHB治療終點(diǎn)。因而式(1)所示之黃酮木脂素化合物可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎表 面抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的非核苷類創(chuàng)新藥物。實(shí)施例3 化合物(1)對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用3.1細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例2。3. 2采用MTT法測定式(1)化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑制作用方法同實(shí) 施例2。3.3測定化合物對乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用取對數(shù)生長期的 H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IX IO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 毫升，在37°C，5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的樣 品，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè) 三個復(fù)孔，置于37°C，5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的 培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。用ELISA試劑盒 測定培養(yǎng)基中乙型肝炎e抗原(HBeAg)濃度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照 1 (注拉米夫啶測試濃度為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α -干擾 素為陽性對照2 (注α -干擾素測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單 位/毫升)。3. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，式⑴化合物顯示出較為顯著的抑制乙型肝 炎e抗原(HBeAg)的作用。其于40微克/毫升濃度下對H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長無明顯抑制 作用，在100微克/毫升濃度下其清除HBeAg的強(qiáng)度為23. 0%，超過陽性對照藥物2 (10000 單位/毫升的α _干擾素)；而陽性對照1拉米呋啶對HBeAg抑制活性為零。表2.樣品第八天時對H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎e抗原抑制率 3.5結(jié)果說明式⑴所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4_羥 基-3，5- 二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-] -2，3- 二氫-3， 5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮于40微克/毫升濃度下對H印G2. 2. 15細(xì)胞的生長無 明顯抑制作用，但100微克/毫升濃度下對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎e抗原HBeAg 在第八天時抑制活性達(dá)到23.0%，超過陽性對照藥物2(10000單位/毫升的α-干擾素)； 而陽性對照1拉米呋啶在最高濃度(100微克/毫升)時對HBeAg抑制活性為零?？梢娫?黃酮木脂素有確切的抑制乙肝病毒分泌HBeAg活性，因而可預(yù)期發(fā)展為降低乙型肝炎e抗原、控制病毒性乙型肝炎癥狀的藥物。實(shí)施例4 式(1)化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸 (HBV DNA)復(fù)制的抑制作用4.1細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例2。4. 2采用MTT法測定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對H印G2. 2. 15細(xì)胞生長的抑 制作用方法同實(shí)施例2。4. 3測定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)復(fù)制的抑制作用取對數(shù)生長期的H印G2. 2. 15細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1 X IO5個 /毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相對濕度的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)所示之黃酮木脂素化合物，濃度分別為100微 克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37°C， 5% C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同 一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBV DNA定量PCR試劑盒 測定培養(yǎng)基中HBV DNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1 (注拉米呋啶測試濃度為 100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)，以α -干擾素為陽性對照2 (注α -干 擾素測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。4. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果舉例說明如表3所示，黃酮木脂素式(1)化合物具有一定 的抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸復(fù)制的作用。表3樣品第8天時對H印G2. 2. 15細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制的抑制率 4.5結(jié)果說明式⑴所示之黃酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4_羥 基-3，5- 二甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-] -2，3- 二氫-3，5， 7-三羥基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的復(fù)制具有一 定的抑制作用，在該濃度時其對HBV DNA顯示出23. 3%的抑制率。雖弱于陽性對照α-干 擾素和拉米呋啶，但屬于有一定效果的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，值得進(jìn)一步關(guān)注 和深入研究，并可預(yù)期進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)展為抑制乙肝病毒HBV DNA復(fù)制的非核苷類創(chuàng)新藥物。在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實(shí)施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實(shí)際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng) 用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途；式(1)化合物的名稱為(±) 2 [2，3 二氫 3 (4 羥基 3，5 二甲氧基苯基) 2 羥甲基 8 乙氧基 1，4 苯并二氧六環(huán) 6 ] 2，3 二氫 3，5，7 三羥基 4H 1 苯并吡喃 4 酮。FSA00000134483600011.tif
2.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或 其可藥用鹽用于制備降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg藥物之用途； 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥 甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡 喃-4-酮。
3.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或 其可藥用鹽用于制備清除乙肝e抗原HBeAg藥物之用途； 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥 甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡 喃-4-酮。
4.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯類黃酮木脂素或 其可藥用鹽用于制備抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBV DNA復(fù)制藥物之用途； 式(1)化合物的名稱為(士)-2-[2，3_ 二氫-3-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-2_羥 甲基-8-乙氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及B/E環(huán)取代水飛薊賓用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途，具體涉及一種B環(huán)乙氧基和E環(huán)甲氧基取代的水飛薊賓酯或其可藥用鹽用于制備清除乙肝病毒表面抗原和乙肝e抗原藥物、抑制HBV DNA復(fù)制藥物的用途，其具有確切的抑制HBsAg和抑制HBeAg活性，在100微克/毫升濃度下其清除HBsAg和HBeAg的強(qiáng)度分別為18.5％和23.0％，均超過陽性對照藥物α-干擾素；同時，在該濃度時其對HBV DNA顯示出23.3％的抑制率。以上表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽同時具有抑制HBsAg、HBeAg和HBV DNA的功效；可預(yù)期用于制備清除HBsAg和HBeAg、抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病之非核苷類藥物的用途。
文檔編號A61K31/357GK101919840SQ20101018145
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者巫秀美, 張榮平, 戴志明, 施貴榮, 汪峰, 熊軼, 竇輝, 趙昱 申請人:大理學(xué)院