相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年11月11日提交的美國專利申請序列no.62/078221的優(yōu)先權(quán)，其公開的內(nèi)容通過引用并入本申請。

本發(fā)明涉及抑制鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2功能的產(chǎn)品和識別產(chǎn)物的方法，以及特異性抑制鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2激活或活性或用于激活鈣蛋白酶-1的方法，并涉及治療和預(yù)防易受分子治療的疾病的方法，該分子治療干擾鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的功能，或激活或增加鈣蛋白酶-1的活性。

背景技術(shù)：

通用的鈣蛋白酶抑制劑以及其治療疾病的用途作為治療劑并不成功(donkor，2011，通過引用并入本文)。本發(fā)明中，提供了鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑，或單獨(dú)的鈣蛋白酶-1抑制劑，或鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑和/或鈣蛋白酶-1激活劑的特殊用途的證據(jù)。文獻(xiàn)描述了對一種鈣蛋白酶而非另一種鈣蛋白酶具有更高選擇性的抑制劑的幾個(gè)實(shí)例(li等人，1996；li等人，1993，均通過引用并入本文)，但是這些公開的內(nèi)容承認(rèn)并不知道鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑的用途，并且需要額外的實(shí)驗(yàn)來確定這些化合物是否具有治療價(jià)值。

實(shí)際上，盡管鈣蛋白酶-1與鈣蛋白酶-2之間缺少差異，本領(lǐng)域已經(jīng)認(rèn)識到開發(fā)鈣蛋白酶選擇性抑制劑的一般需要。雖然通用的鈣蛋白酶抑制劑(其包括超過10種變體)已被成功用于動物模型中各種疾病的治療，但是沒有一種進(jìn)展到臨床試驗(yàn)，部分是由于缺乏選擇性。因此，對更多的選擇性鈣蛋白酶抑制劑以及更好地了解鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的功能，存在長期但不甚了解的需要。強(qiáng)調(diào)這樣一個(gè)結(jié)論的證據(jù)是基于鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2分辨能力之間的一些其他區(qū)別。例如，鈣蛋白酶-10基因(capn10)多態(tài)性與2型糖尿病(t2dm)相關(guān)；鈣蛋白酶-1(μ-鈣蛋白酶)、鈣蛋白酶-2(m-鈣蛋白酶)、鈣蛋白酶-3和鈣蛋白酶-5也與t2dm相關(guān)的代謝途徑相聯(lián)系(donkor，2011)。

在本公開之前，并未認(rèn)識到鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2與ltp、學(xué)習(xí)和記憶力、神經(jīng)退行性疾病、突觸功能障礙疾病、細(xì)胞保護(hù)性信號級聯(lián)(鈣蛋白酶-1)和細(xì)胞死亡級聯(lián)(鈣蛋白酶-2)有差異地相聯(lián)系。鈣蛋白酶-1激活與突觸nmda受體刺激相聯(lián)系，這說明了其在ltp誘導(dǎo)中的必要作用。它還參與由延長的突觸nmda受體刺激引起的神經(jīng)保護(hù)作用(參見圖1)。另一方面，鈣蛋白酶-2與突觸后nmda受體刺激相聯(lián)系，并參與神經(jīng)退行性疾病(參見圖1)。鈣蛋白酶-2也被bdnf—>erk介導(dǎo)的磷酸化激活，并限制θ節(jié)律刺激(tbs)后的ltp程度。因此，選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑可以同時(shí)是神經(jīng)保護(hù)和認(rèn)知增強(qiáng)劑。

相對于半胱氨酸蛋白酶如組織蛋白酶(cuerrier等人，2007，通過引用并入本文)或其它蛋白酶(sorimachi等人，2012，通過引用并入本文)，已經(jīng)顯著改善了鈣蛋白酶的選擇性。雖然文獻(xiàn)已經(jīng)描述了對鈣蛋白酶-2而不是鈣蛋白酶-1具有某種程度的選擇性的抑制劑，反之亦然，但直到現(xiàn)在也沒有創(chuàng)造出具有特定底物益處的抑制劑。鈣蛋白酶抑制劑iv(羧基芐基-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸-ch2-f)對鈣蛋白酶-1顯示出一些選擇性，但是效果似乎隨細(xì)胞類型變化(powers等人，2002，通過引用并入本文)。盡管有助于pten特異性的結(jié)構(gòu)元件的完全呈現(xiàn)可能難以在小分子中捕獲，但是對于特異性的全面記錄將為設(shè)計(jì)高度特異性的鈣蛋白酶-2抑制劑提供堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明描述了與同種型選擇性鈣蛋白酶抑制劑相關(guān)的組合物和方法。同種型選擇性抑制劑作用于鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2，并因此與其中另一種相比選擇性地降低其中一種同種型的活性。鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的選擇性抑制劑可以抑制催化活性，降低表達(dá)，選擇性降解、抑制或加速化學(xué)修飾，或影響與鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2相互作用的一種或多種蛋白質(zhì)之間的蛋白質(zhì)相互作用。鈣蛋白酶同種型的選擇性抑制劑也可以與試劑結(jié)合，該試劑影響抑制劑的靶向、穩(wěn)定性、遷移率、外顯率、生物利用度或濃度。

選擇性鈣蛋白酶抑制劑可以以多種不同的形式存在，包括核酸、肽、多肽、肽類似物、碳水化合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)或無機(jī)分子。根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2的各種選擇性抑制劑可以來自于鈣蛋白酶-2多肽底物pten(seqidno：1)。

本發(fā)明還描述了這樣的發(fā)現(xiàn)：通過不同的底物特異性和不同的亞細(xì)胞骨架，鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2有差異地與離散的細(xì)胞路徑相關(guān)。特別地，申請人提供這樣的證據(jù)：施用本發(fā)明所述的鈣蛋白酶-2抑制劑有助于抑制細(xì)胞死亡和增強(qiáng)認(rèn)知。實(shí)際上，鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2與誘導(dǎo)長期增強(qiáng)(ltp)、學(xué)習(xí)和記憶力的生理底物有差異地相聯(lián)系，因?yàn)殁}蛋白酶-1與誘導(dǎo)ltp直接相聯(lián)系。因此，在與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療相關(guān)的發(fā)明方面，鈣蛋白酶-1激活在誘導(dǎo)ltp中起積極作用。而同一過程中，鈣蛋白酶-2激活在ltp鞏固過程中起到制動作用，從而產(chǎn)生了ltp的閾值，并限制了鞏固期間ltp的程度。本發(fā)明還公開了鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞死亡中的特別的和差異的功能。

在各個(gè)方面，本發(fā)明還提供了識別對鈣蛋白酶-2有選擇性的抑制劑的方法。這些抑制劑用于i)抑制與細(xì)胞死亡和病理學(xué)相關(guān)的細(xì)胞活性，ii)降低維持ltp的閾值，iii)增加ltp，iv)增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性、學(xué)習(xí)、記憶力和認(rèn)知，和/或v)治療某些神經(jīng)退行性疾病。在本發(fā)明的方法中，選擇性抑制鈣蛋白酶-2的小分子抑制劑、蛋白質(zhì)、肽、多肽、修飾的肽和多肽以及核酸可以單獨(dú)施用，或與鈣蛋白酶-2功能的其它抑制劑或者鈣蛋白酶-1功能的激活劑結(jié)合，因?yàn)樯暾埲艘呀?jīng)發(fā)現(xiàn)與鈣蛋白酶-2相比，鈣蛋白酶-1尤其參與神經(jīng)保護(hù)和突觸可塑性的誘導(dǎo)。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)品和組合物，例如小分子抑制劑、多肽、肽、修飾的肽和核酸，其選擇性地單獨(dú)抑制鈣蛋白酶-2或與選擇性抑制鈣蛋白酶-2的其它分子結(jié)合，并對鈣蛋白酶-1具有降低的影響、很小的影響或測量不到的影響。在另一方面，本發(fā)明涉及物質(zhì)的產(chǎn)品和組合物，例如小分子抑制劑、多肽、肽、修飾的多肽和核酸，其選擇性地單獨(dú)激活或抑制鈣蛋白酶-1功能或與其它激活劑或選擇性抑制劑結(jié)合?？傊?，本發(fā)明提供了治療易被鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑或鈣蛋白酶-1選擇性激活劑或其結(jié)合抑制、改善、延遲、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防的疾病的方法。

附圖說明

圖1示出了鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在ltp和神經(jīng)退行疾病中的相應(yīng)作用。

圖2：在存在或不存在通用鈣蛋白酶抑制劑、鈣蛋白酶抑制劑iii(zval-phe-cho)的情況下，在急性大鼠海馬切片中區(qū)域ca1的輻射層中進(jìn)行的興奮性突觸后電位(epsp)的現(xiàn)場記錄。結(jié)果以10分鐘基線后平均值的百分比表示，并且是實(shí)驗(yàn)指定數(shù)量的平均±s.e.m。在ltp誘導(dǎo)前施用鈣激蛋白酶抑制劑iii時(shí)，其阻斷l(xiāng)tp。閉環(huán)(鈣蛋白酶抑制劑iii)與閉環(huán)(對照)相比較。

圖3a：在存在或不存在200nm式i的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑(圖中的m鈣蛋白酶-i)的情況下，在急性大鼠海馬切片中區(qū)域ca1的輻射層中進(jìn)行的興奮性突觸后電位(epsp)的現(xiàn)場記錄。用m鈣蛋白酶-i預(yù)孵育增強(qiáng)了ltp。結(jié)果以10分鐘基線后平均值的百分比表示并且是是實(shí)驗(yàn)指定數(shù)量的平均±s.e.m。

圖3b：用式i的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑(圖中的m鈣蛋白酶-i)孵育海馬切片，當(dāng)從tbs后10分鐘到tbs后1小時(shí)施加時(shí)，隨后的θ節(jié)律刺激(tbs)導(dǎo)致在ltp鞏固階段ltp增強(qiáng)。結(jié)果以10分鐘基線后平均值的百分比表示并且是實(shí)驗(yàn)指定數(shù)量的平均±s.e.m。

圖4：在存在或不存在200nm式i的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑(圖中的m鈣蛋白酶-i)、的情況下，在由雄性ubea突變小鼠(天使綜合征模型)或其野生型同窩同胞的急性海馬切片區(qū)域ca1中進(jìn)行的興奮性突觸后電位(epsp)的現(xiàn)場記錄。結(jié)果以10分鐘基線后平均值的百分比表示并且是實(shí)驗(yàn)指定數(shù)量的平均±s.e.m。

圖5：應(yīng)用式i的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑(圖中的m鈣蛋白酶-i)，以200nm至5μm的依賴性方式減少與突觸后nmda受體激活相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。結(jié)果用hoechst試劑陽性染色的神經(jīng)元的百分比表示，并且是3-4次實(shí)驗(yàn)(*p<0.01，t檢驗(yàn))的平均±s.e.m。

圖6：通用鈣蛋白酶抑制劑，鈣蛋白酶抑制劑iii(z-val-phe-cho)，但不是式i的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑(圖中的m鈣蛋白酶-i)，阻斷bic-和4-ap-誘導(dǎo)的對于培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中饑餓的神經(jīng)保護(hù)。通過hoechst染色觀察和定量神經(jīng)元死亡。在3-6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組對300-500個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。*p<0.05；ns，無顯著差異；單因素方差分析，隨后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。n＝3-6，誤差磅表示sem。

圖7a：鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑對恐懼狀況的影響。發(fā)現(xiàn)式i(圖中的m鈣蛋白酶-i)對恐懼狀況方案中的學(xué)習(xí)和記憶具有雙向作用。在訓(xùn)練學(xué)習(xí)語境或音調(diào)與痛苦的刺激之間的關(guān)聯(lián)前30分鐘，將各種劑量式i的化合物(圖中的m鈣蛋白酶-i)腹腔內(nèi)注射。24小時(shí)后對動物對語境的恐懼反應(yīng)進(jìn)行了測試，并且通過數(shù)小鼠呆滯的時(shí)間(其對恐懼的生物反應(yīng))定量記憶強(qiáng)度。產(chǎn)生增強(qiáng)和減少的劑量之間的比率與抑制鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1的kis之間的比率相匹配。實(shí)驗(yàn)是盲目的，因?yàn)榉治鼋Y(jié)果的人不知道組的治療。結(jié)果是8-10次實(shí)驗(yàn)的平均±s.e.m，*p<0.05(方差分析后是bonferroni測試)。

圖7b：鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑對恐懼狀況的影響。發(fā)現(xiàn)式1(圖中的m鈣蛋白酶-i)對恐懼狀況方案中的學(xué)習(xí)和記憶具有雙向作用。在訓(xùn)練學(xué)習(xí)語境或音調(diào)與痛苦的刺激之間的關(guān)聯(lián)前30分鐘，將各種劑量式1的化合物(m鈣蛋白酶-i)腹腔內(nèi)注射。48小時(shí)后對動物對語境的恐懼反應(yīng)進(jìn)行了測試，因?yàn)樗麄儗β曊{(diào)的恐懼反應(yīng)，并且通過數(shù)小鼠呆滯的時(shí)間(其對恐懼的生物反應(yīng))定量記憶強(qiáng)度。產(chǎn)生增強(qiáng)和減少的劑量之間的比率與抑制鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1的ki之間的比率相匹配。實(shí)驗(yàn)是盲試，因?yàn)榉治鼋Y(jié)果的人不知道組的治療。結(jié)果是8-10次實(shí)驗(yàn)的平均±s.e.m，*p<0.05(方差分析后是bonferroni測試)。

圖8a：示出了h&e染色的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和叢狀層：i)單純的視網(wǎng)膜；ii)pbs處理(玻璃體內(nèi)，2μl)或nmda處理(玻璃體內(nèi)，2mm的2.5mm)野生型小鼠的視網(wǎng)膜，該小鼠在nmda注射前30分鐘和nmda注射后6小時(shí)腹腔注射載體(20％dmso)、式i(圖中c2i，0.3mg/kg)或泛鈣蛋白酶抑制劑鈣蛋白(10mg/kg)。nmda注射后7天進(jìn)行h&e染色。

圖8b：定量分析野生型小鼠gcl中的細(xì)胞數(shù)量，該小鼠7天前在玻璃體內(nèi)注射2μlpbs或2μlnmda(2.5mm)。在nmda注射前30分鐘和nmda注射后6小時(shí)，腹腔注射載體(20％dmso)、式i(圖中c2i，0.3mg/kg)或泛鈣蛋白酶抑制劑鈣蛋白(10mg/kg)。柱子表示平均±s.e.m，n＝4-6，相對于nmda加載體注射組，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖8c：定量分析野生型小鼠ipl的厚度，該小鼠7天前在玻璃體內(nèi)注射2μlpbs或2μlnmda(2.5mm)。在nmda注射前30分鐘和注射nmda后6小時(shí)，腹腔注射載體(20％dmso)、式i(圖中c2i，0.3mg/kg)或泛鈣蛋白酶抑制劑鈣蛋白(10mg/kg)。柱子表示平均±s.e.m，n＝4-6，相對于nmda加載體注射組，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9a：玻璃體內(nèi)注射pbs(對照)或nmda(2μl2.5mm)后6小時(shí)，小鼠視網(wǎng)膜提取物中spectrin分解產(chǎn)物(sbdp)的水平的代表性免疫印跡、全長ph結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶1(phlpp1)α和akt。腹腔注射前在小鼠玻璃體內(nèi)注射載體(10％dmso)或c2i(0.3mg/kg)30分鐘。

圖9b：在nmda或pbs注射后6小時(shí)，在視網(wǎng)膜提取物中確定sbdp/akt比例的定量。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝4，*p<0.05，***p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9c：在nmda或pbs注射后6小時(shí)，在視網(wǎng)膜提取物中確定phlpp1α/akt比例的定量。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝4，*p<0.05，***p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9d：來自野生型(wt)小鼠的單純的、pbs-(對照)或nmda-(2μl2.5mm)處理的視網(wǎng)膜的代表性h&e染色。該小鼠在nmda注射前30分鐘和6小時(shí)候后腹腔內(nèi)注射載體(10％dmso)或c2i(0.3mg/kg)。nmda注射后7天進(jìn)行h&e染色?？潭龋?0μm。

圖9e：nmda注射后7天，定量分析野生型小鼠gcl中的細(xì)胞數(shù)量。分析從每只眼睛穿過視盤的六個(gè)部分。對距視盤的距離為500-1000μm的gcl中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對來自每只眼睛的6個(gè)部分的細(xì)胞密度進(jìn)行平均。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝4-8，*p<0.05，**p<0.01，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9f：nmda注射后7天，定量分析野生型小鼠ipl的厚度。分析從每只眼睛穿過視盤的六個(gè)部分。對距視盤的距離為500-1000μm的gcl中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對來自每只眼睛的6個(gè)部分的細(xì)胞密度進(jìn)行平均。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝4-8，*p<0.05，**p<0.01，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9g：鈣蛋白酶-1ko小鼠單純的、pbs-(對照)或nmda-(2μl2.5mm)處理的視網(wǎng)膜的代表性h&e染色，該小鼠在nmda注射前30分鐘和6小時(shí)后腹腔內(nèi)注射載體(10％dmso)或c2i(0.3mg/kg)。nmda注射后7天進(jìn)行h&e染色?？潭龋?0μm。

圖9h：nmda注射后7天，定量分析來自鈣蛋白酶-1ko小鼠的gcl中的細(xì)胞數(shù)量。分析從每只眼睛穿過視盤的六個(gè)部分。對距視盤的距離為500-1000μm的gcl中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對來自每只眼睛的6個(gè)部分的細(xì)胞密度進(jìn)行平均。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝6，*p<0.05，**p<0.01，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9i：nmda注射后7天，定量分析鈣蛋白酶-1小鼠的ipl厚度。分析從每只眼睛穿過視盤的六個(gè)部分。對距視盤的距離為500-1000μm的gcl中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對來自每只眼睛的6個(gè)部分的細(xì)胞密度進(jìn)行平均。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖9j：nmda處理以及沒有和有c2i處理的wt和ko小鼠中g(shù)cl細(xì)胞數(shù)的比較，n＝6，**p<0.01，雙尾t檢驗(yàn)。

圖10a：急性iop升高后視網(wǎng)膜中鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2激活的時(shí)間過程。在急性iop升高后0、2、4和6小時(shí)后，對wt、鈣蛋白酶-1ko和c2i注射的wt小鼠中的視網(wǎng)膜gcl和ipl進(jìn)行sbdp免疫染色(綠色)。部分用dapi復(fù)染(藍(lán)色)。在iop升高后2小時(shí)將c2i注射到wt小鼠?？潭龋?0μm。

圖10b：急性iop升高后視網(wǎng)膜中鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2激活的時(shí)間過程。在急性iop升高后0、2、4和6小時(shí)，對wt、鈣蛋白酶-1ko和c2i注射的wt小鼠的視網(wǎng)膜gcl和ipl進(jìn)行全長pten免疫染色(b，紅色)。部分用dapi復(fù)染(藍(lán)色)。在iop升高后2小時(shí)將c2i注射到wt小鼠?？潭龋?0μm。(c)定量ipl層中的sbdp染色，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3-5(眼睛)。對于每只眼睛，使用3個(gè)視網(wǎng)膜進(jìn)行定量。對于每個(gè)部分，選擇ipl層中的三個(gè)50×25μm的區(qū)域，測量并平均mfi(平均熒光強(qiáng)度)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001與同組中的對照組相比，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m。(d)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)定量pten染色，n＝3-5。*p<0.05，**p<0.01與對照組相同，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖10c：急性iop升高后0、2、4和6小時(shí)的wt，鈣蛋白酶-1ko和c2i注射的wt小鼠的視網(wǎng)膜ipl中，急性iop升高后鈣調(diào)蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在視網(wǎng)膜期激活的時(shí)間過程中ipl層中sbdp染色的定量。在iop升高后2小時(shí)將c2i注射到wt小鼠。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3-5只眼。對于每只眼睛，使用3個(gè)視網(wǎng)膜切片進(jìn)行定量。對于每個(gè)部分，選擇ipl層中的三個(gè)50×25μm的區(qū)域，測量并平均mfi(平均熒光強(qiáng)度)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001與同組中的對照組相比，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m。

圖10d：急性iop升高后0、2、4和6小時(shí)的wt、鈣蛋白酶-1ko和c2i注射的wt小鼠的視網(wǎng)膜ipl中，急性iop升高后鈣調(diào)蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在視網(wǎng)膜期激活的時(shí)間過程中ipl層中pten染色的定量。在iop升高后2小時(shí)將c2i注射到wt小鼠。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3-5。*p<0.05，**p<0.01與對照組相同，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖11a：鈣蛋白酶-2抑制減少而鈣蛋白酶-1淘汰加劇由急性iop升高誘導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中的細(xì)胞死亡。載體或c2i注射的野生型和鈣蛋白酶-1ko小鼠右眼進(jìn)行視網(wǎng)膜切片h&e染色，而左眼進(jìn)行假手術(shù)。在急性iop升高30分鐘前和2小時(shí)后腹腔內(nèi)注射載體10％dmso的pbs溶液。對于一次后注射組，在iop升高后2小時(shí)注射c2i。對于兩個(gè)后注射組，在iop升高后2和4小時(shí)注射c2i。手術(shù)后3天進(jìn)行h&e染色?？潭龋?0μm。

圖11b：定量圖11a所示的h&e染色。分析穿過每只眼睛的視盤的六個(gè)切片。對來自距視盤的距離為500-1000μm的gcl中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。平均來自每個(gè)眼睛的6個(gè)部分的細(xì)胞密度。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，對載體n＝7，注射前后n＝3，對于一個(gè)后注射n＝10，對于兩個(gè)后注射n＝6，對于kon＝4。ns，無顯著差異。***p<0.001，雙尾t檢驗(yàn)。

圖11c：如圖11a所述，比較來自載體或c2i注射的野生型和鈣蛋白酶-1ko小鼠的右眼和進(jìn)行假手術(shù)的左眼的gcl細(xì)胞存活率。對于每只小鼠計(jì)算存活率，作為iop升高的眼中g(shù)cl的細(xì)胞密度與假手術(shù)眼中g(shù)cl細(xì)胞密度之比。相對于載體，*p<0.05，**p<0.01，單因素方差分析后bonferroni檢驗(yàn)。

圖11d：在載體或c2i注射的wt小鼠的視網(wǎng)膜中brn-3a免疫染色。右眼進(jìn)行急性iop升高，左眼進(jìn)行假手術(shù)。急性iop升高后2h腹腔內(nèi)注射載體10％dmso或c2i(0.3mg/kg)。手術(shù)后3天進(jìn)行brn3a染色?？潭龋?0μm。

圖11e：定量如圖11d所示的brn3a染色。計(jì)數(shù)gcl中的brn3a陽性細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m。對于載體n＝4，對于c2i為n＝5。ns，無顯著性差異，**p<0.01假手術(shù)對iop升高，雙尾t檢驗(yàn)。

圖11f：存活率比較。對于載體n＝4，對于c2i為n＝5。**p<0.01載體與c2i對比，雙尾t檢驗(yàn)。

圖11g：在假手術(shù)或急性iop升高3小時(shí)后收集wt，鈣蛋白酶-1ko和c2i注射小鼠視網(wǎng)膜組織中phlpp1和step33的代表性免疫印跡。假手術(shù)或iop升高后2小時(shí)，全身注射c2i(0.3mg/kg)。

圖11h：phlpp1和step33水平的定量分析以及每組的pakt/akt比值。結(jié)果表示4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均±s.e.m。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns表示無顯著差異，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖12a：玻璃體腔內(nèi)注射鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑減少由急性iop升高引起的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中的細(xì)胞死亡。在急性iop升高和玻璃體內(nèi)注射載體或不同劑量的c2i后，在鈣蛋白酶-1ko小鼠的視網(wǎng)膜中進(jìn)行sbdp免疫染色。在iop升高后2小時(shí)，玻璃體內(nèi)注射載體(pbs中的10％dmso，1μl)或c2i(2-80μm，1μl)。在iop升高后4小時(shí)收集眼睛的sbdp染色?？潭龋?0μm。

圖12b：ipl層中sbdp染色的定量，如圖12a所述。每個(gè)濃度n＝3(眼睛)。在每只眼睛中，定量3個(gè)視網(wǎng)膜切片。在每個(gè)部分中，選擇ipl層中的三個(gè)50×25μm的區(qū)域，測量并平均sbdp信號的mfia。通過(mfi載體-mfic2i)/mfi載體％計(jì)算sbdp信號的抑制。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m。

圖12c：iop升高和玻璃體內(nèi)注射載體或c2i后，在wt小鼠視網(wǎng)膜切片中的h&e染色。在iop升高或假手術(shù)后2小時(shí)注射載體或c2i(20μm，1μl)。手術(shù)后3天收集眼睛用于h&e染色。刻度＝30μm。

圖12d：根據(jù)h&e染色定量gcl細(xì)胞數(shù)，如圖12c所示。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，對于單純的視網(wǎng)膜n＝7，對于載體n＝4，對于c2i，n＝6。*p<0.05，***p<0.001，雙尾t檢驗(yàn)。

圖12e：根據(jù)如圖12d所示的h&e染色，以對照組的百分比比較gcl存活率。*p<0.05，**p<0.01，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖12f：iop升高或假手術(shù)后3天測量眼睛的okr空間頻率閾值。在手術(shù)后2h玻璃體內(nèi)注射載體或c2i(20μm，1μl)。手術(shù)和注射總是在右眼(od)進(jìn)行。測量左眼(os)的okr作為對照。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝7。****p<0.0001，假手術(shù)加載體與iop升高加載體對比，**p<0.01，iop升高加載體與iop升高加c2i對比，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖12g：手術(shù)后21天重新測量okr，如圖12f所示。n＝7，****p<0.0001，*p<0.05。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖12h：手術(shù)后21天眼睛視網(wǎng)膜的rgc密度，如圖12f所示。手術(shù)后21天，okr測試后收集眼睛。在眼睛的視網(wǎng)膜切片中進(jìn)行brn-3a免疫染色。計(jì)數(shù)gcl中的brn-3a陽性細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m。對于iop升高+c2in＝7。對于其他組n＝4，***p<0.001，**p<0.01，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖13：急性iop升高后wt和鈣蛋白酶-1ko小鼠的視網(wǎng)膜oct。經(jīng)歷眼壓升高的動物眼睛的代表性圖像。左上圖顯示在升高的iop之前(第0天)在麻醉的小鼠中獲得的圖像。白色箭頭指向與正常角膜解剖和前房的開放角度。右上圖顯示1天后誘導(dǎo)iop升高1小時(shí)的前房圖像；前房同步體是可見的(白色箭頭)以及前房增加的高反射率(紅色箭頭)，表明由前房中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞引起的血液水屏障的分解。還要注意增加的角膜厚度(黃色箭頭)。這些特征通常在急性閉角型發(fā)作中看到。左下圖顯示第2天的圖像，與第1天相比，角膜厚度和前外傾反射率均降低，但仍然存在前同步體。右下圖是第3天的圖像，顯示角膜厚度和前房反射率明顯降低，現(xiàn)在同步體斷開了。

圖14a：急性iop升高后wt和鈣蛋白酶-1ko小鼠的視網(wǎng)膜oct。在iop升高前(第0天)和后(第3天)，來自wt和鈣蛋白酶-1ko小鼠的iop升高的眼睛的代表性視網(wǎng)膜oct圖像?？潭龋?00μm。

圖14b：定量手術(shù)后0-3天wt小鼠iop升高和假手術(shù)眼視網(wǎng)膜的厚度。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝6，*p<0.05，2或3天與0天對比，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖14c：定量手術(shù)后0-3天鈣蛋白酶-1ko小鼠iop升高和假手術(shù)眼的視網(wǎng)膜的厚度。數(shù)據(jù)表示平均±s.e.m，n＝4，*p<0.05，2或3天與0天對比，單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖15a：小鼠的okr檢驗(yàn)。在小鼠中設(shè)置okr分析。左圖，鼠頭被固定在自制的頭部限制器中，其位于旋轉(zhuǎn)光柵的中心。右圖，通過紅外攝像機(jī)記錄由旋轉(zhuǎn)光柵觸發(fā)的掃視瞳孔運(yùn)動。

圖15b：手術(shù)后21天測量okr空間頻率閾值和rgc密度的線性回歸分析。黑色符號，假眼+載體組；藍(lán)色，假眼+c2i；紅色，iop升高+載體；綠色，iop升高+c2i。n＝19，r2＝0.86

圖16a：用鈣蛋白酶-1c-末端肽處理培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元導(dǎo)致akt和erk激活和神經(jīng)保護(hù)對抗饑餓和氧化應(yīng)激。代表性的免疫印跡表明，用鈣蛋白酶-1c-末端肽(1.5μm)處理培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元30分鐘增加了akt和erk磷酸化。用鈣蛋白酶抑制劑iii(10μm)預(yù)處理阻斷了鈣蛋白酶-1肽對akt和erk的作用。

圖16b：定量分析pakt與總akt和perk與總erk的比值：(i)用鈣蛋白酶-1c-末端肽(1.5μm30分鐘)處理培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元；(ii)用鈣蛋白酶抑制劑iii(10μm)預(yù)處理；或(iii)鈣蛋白酶-2c-末端肽(1.5μm)。用鈣蛋白酶-2c-末端肽進(jìn)行預(yù)處理對akt和erk的水平無影響。柱子表示平均±s.e.m，n＝3-6，*p<0.05。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖16c：用鈣蛋白酶-1c-末端肽(1.5μm)孵育培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元導(dǎo)致抵抗饑餓的神經(jīng)保護(hù)。柱子表示平均±s.e.m，n＝4，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖16d：用鈣蛋白酶-1c-末端肽(1.5μm)孵育培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元導(dǎo)致抵抗h2o2損害的神經(jīng)保護(hù)。柱子表示平均±s.e.m，n＝4，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。

圖17：stargazinγ-2的氨基酸序列中潛在的鈣蛋白酶-2切割位點(diǎn)以下劃線和粗體顯示。

圖18：pten的氨基酸序列中潛在的鈣蛋白酶-2切割位點(diǎn)以下劃線和粗體顯示。

具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明描述了與同種型選擇性鈣蛋白酶抑制劑有關(guān)的組合物和方法。在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例中，同種型選擇性抑制劑針對鈣蛋白酶-1(其替代性單體通過也稱為μ-鈣蛋白酶)或鈣蛋白酶-2(其替代性單體通常也稱為m-鈣蛋白酶)。特別地，鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2是指哺乳動物形式，該形式包括seqidno：(2-6)的鈣蛋白酶-1示例和seqidno：(69-73)的鈣蛋白酶-2示例或其催化片段。鈣蛋白酶在本領(lǐng)域中稱為鈣激活的中性蛋白酶，并且包括一系列相關(guān)分子(baudry等人，2013)。催化片段包含等于或大于鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的前300個(gè)氨基酸。

通常，術(shù)語“抑制劑”涉及小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸或其修飾物。例如，鈣蛋白酶-2的選擇性抑制劑降低其活性并對鈣蛋白酶-1具有減小的、更小的抑制作用。另一方面，鈣蛋白酶-1的選擇性抑制劑降低其活性并且對鈣蛋白酶-2具有減小的抑制作用。鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的抑制劑包括選擇性地抑制催化活性，競爭性、非競爭性、選擇性降低其表達(dá)，選擇性加速其降解，抑制或加速其化學(xué)修飾或選擇性影響鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2及其一種或多種相互作用蛋白之間的蛋白質(zhì)的相互作用。抑制劑還可以包含影響達(dá)到鈣蛋白酶-1或-2有效功能空間的靶向、穩(wěn)定性、遷移率、外顯率、生物利用度或濃度的結(jié)合物、組合物或制劑。

特別地，“鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑”或“選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑”是小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)或其修飾物，這些物質(zhì)的鈣蛋白酶-2抑制常數(shù)(ki)等于或比鈣蛋白酶-1的ki高10倍。例如，對于0.1μm或更低的鈣蛋白酶-2的ki和對于1μm或更高的鈣蛋白酶-1的ki將滿足“鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑”的定義。優(yōu)選地，高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑呈現(xiàn)出比鈣蛋白酶-1的抑制常數(shù)ki至少低20倍的抑制常數(shù)ki。鈣蛋白酶-1選擇性抑制劑是小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)或其修飾物，這些物質(zhì)具有與鈣蛋白酶-2抑制常數(shù)(ki)相等或高于7倍的鈣蛋白酶-1抑制常數(shù)(ki)。高選擇性鈣蛋白酶-1抑制劑是小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)或其修飾物，這些物質(zhì)具有與鈣蛋白酶-2抑制常數(shù)ki相等或高于20倍的鈣蛋白酶-1抑制常數(shù)(ki)。本領(lǐng)域公開了至少4種高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑。li等人在1996年公開了分子18、19和56，并且在美國專利6235929第14欄列表i中公開了z-leu-phe-conh-npr是最高選擇性的鈣蛋白酶-2抑制劑，其對鈣蛋白酶-1的ki為15μm而對鈣蛋白酶-2的ki為0.05μm。然而，該文獻(xiàn)還描述了z-leu-phe-conh-npr對鈣蛋白酶-2的ki為0.35μm，而對鈣蛋白酶-1的ki為0.05μm(美國專利6235929和li等人，1996年)。因此，文獻(xiàn)中公開的關(guān)于高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑的結(jié)構(gòu)信息有些不可預(yù)測，4種已知的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑之一具有不確定的選擇性。

在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例中，鈣蛋白酶抑制劑是“小分子”。“小分子”是指分子量小于5kd的組合物，更優(yōu)選小于約4kd，最優(yōu)選小于1kd。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽類似物、碳水化合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)分子。

本發(fā)明所用的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換，并且被定義為由通過肽鍵連接的氨基酸組成的生物分子。這包括在一端具有胺或酰胺鍵連接的或單獨(dú)的化合物，可變地具有兩個(gè)氫原子或者一個(gè)氫原子和一個(gè)r基團(tuán)或兩個(gè)r基團(tuán)的α-碳，在另一端與該α-碳原子連接的羧酸基團(tuán)，或連接所述氨基酸與另一氨基酸的另外的酰胺鍵。本發(fā)明的多肽包含天然發(fā)生的氨基酸r基團(tuán)，包括甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組胺、精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。

在本發(fā)明的各種蛋白質(zhì)的實(shí)施例中，選擇性鈣蛋白酶抑制劑是抑制鈣蛋白酶-2的抗體。例如，本發(fā)明包含抗體，該抗體抑制底物與鈣蛋白酶-2結(jié)合，其阻斷鈣蛋白酶-2對底物的進(jìn)入，或其抑制鈣蛋白酶-2的絲氨酸50的磷酸化(shiraha等人，2002；zadran等人，2010，通過引用并入本文)，通過鈣蛋白酶-2的空間掩蔽或變構(gòu)調(diào)節(jié)，或結(jié)合鈣蛋白酶-2使其被抑制。抗體可以是多克隆、單克隆、單鏈、抗獨(dú)特型、嵌合或這些抗體的人源化形式或其片段?？贵w可以來自能夠引起免疫應(yīng)答的任何物種。

還考慮了選擇性阻斷m-鈣蛋白酶的絲氨酸50磷酸化的抗體、肽、多肽和修飾的肽，例如在usppn2003/0148264中所述的那些，其通過引用并入本文。這些可以使用本領(lǐng)域中定義的技術(shù)來制備，例如噬菌體展示，一種在噬菌體顆粒表面顯示的蛋白質(zhì)外殼上產(chǎn)生高度變異的肽庫作為融合蛋白的技術(shù)(clackson等，1991；cwirla等，1990，均通過引用并入)。從噬菌體展示庫識別的融合蛋白可以針對肽靶標(biāo)進(jìn)行篩選，例如針對鈣蛋白酶-2未磷酸化的絲氨酸50進(jìn)行。通過結(jié)合和空間掩蔽磷酸化位點(diǎn)，這樣的多肽可以用于選擇性地阻斷絲氨酸50的磷酸化，從而治療本發(fā)明公開的ltp損傷的疾病。

“修飾”是指肽或多肽中不存在具有任何或全部天然存在的氨基酸的連接或未連接特征的肽或多肽中的變化。氨基末端或羧基末端或r基團(tuán)的修飾用于增加或降低肽或多肽對鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的親和力，或增加或減少半衰期，或提高生物利用度，或增加其在鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2目標(biāo)空間中的濃度。

變體包括由于誘變而在氨基酸序列上不同的多肽。本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白質(zhì)是生物活性的，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)所需的生物學(xué)活性，即保留活性。在一些實(shí)施例中，相對于天然蛋白，變體具有提高的活性。在進(jìn)一步的“變體”概念中，認(rèn)識到可以通過各種方法改變蛋白質(zhì)的dna序列，并且認(rèn)識到這些改變可以導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的dna序列具有不同于由本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼的氨基酸序列。

實(shí)際上，在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例中，多肽抑制劑可以以各種方式改變，包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失、截?cái)嗪筒迦搿＠?，在某些?shí)施例中，seqidno：1-6和69-73的多肽可以包括至多到1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30和約35或更多的氨基酸取代、缺失、截?cái)嗷虿迦?。在另一方面，本發(fā)明所述的序列包含本發(fā)明所述序列上c和/或n末端區(qū)域的1、約2、約3、約4、約5、約10、或約20個(gè)添加或截?cái)?。在非限制性方面，它們的包封提供在seqidno：1-6和69-73一個(gè)或多個(gè)c和/或n末端區(qū)域中含有1、約2、約3、約4、約5、約10或約20添加或缺失的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步了解，可以通過本發(fā)明的核苷酸序列的突變引入變化，由此導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化，而不改變蛋白質(zhì)的生物活性。因此，變體分離的核酸分子可以通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失引入本發(fā)明公開的相應(yīng)核苷酸序列中，使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的蛋白質(zhì)中。突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，如定點(diǎn)誘變和pcr介導(dǎo)的誘變。這樣的變體核苷酸序列也包括在本發(fā)明中。

可以在根據(jù)本發(fā)明的多肽鈣蛋白酶抑制劑的一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守性氨基酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢詮牡鞍踪|(zhì)的野生型序列改變而不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需要的。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的成員已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些成員包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。

一方面，可以在保留功能的非保守區(qū)域中進(jìn)行氨基酸取代。通常，這種取代不會對保守的氨基酸殘基或位于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行，其中這些殘基對于蛋白質(zhì)活性是必需的。保守的并且對于蛋白質(zhì)活性可能是必需的殘基的示例包括，例如在與本發(fā)明的序列相似或相關(guān)毒素的比對中包含的所有蛋白質(zhì)之間相同的殘基。保守但可允許保守氨基酸取代并仍然保留活性的殘基的實(shí)例包括，例如在與本發(fā)明的序列相似或相關(guān)的毒素的比對中包含所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守取代的殘基(例如，在對準(zhǔn)同源蛋白質(zhì)中包含的所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守取代的殘基)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，功能性變體在保守殘基中可能具有次要的保守或非保守改變。

一方面，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)或多肽，其與本發(fā)明描述的任何序列的氨基酸序列具有至少約60％、65％、約70％、75％、約80％、85％、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)或多肽，其與所述seqidno：1-194和201-22的任何序列的氨基酸序列具有至少約60％、65％、約70％、75％、約80％、85％、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

另一方面，變體可以包括由核酸分子編碼的多肽，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交。變體包括由于誘變而在氨基酸序列上不同的多肽。本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白質(zhì)具有生物活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)所需的生物活性，即保留活性。在一些實(shí)施例中，變體相對于天然蛋白具有提高的活性。

認(rèn)識到蛋白質(zhì)的dna序列可以通過各種方法改變，并且這些改變可以導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的dna序列具有與本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼的氨基酸序列不同的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)可以以各種方式改變，包括seqidno：1-6和69-73一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失、截?cái)嗪筒迦?，包括至?、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30和約35或更多的氨基酸取代、缺失、截?cái)嗷虿迦?。在另一方面，本發(fā)明所述的序列包含本發(fā)明所述序列上c和/或n末端區(qū)域的1、約2、約3、約4、約5、約10或約20個(gè)添加或截?cái)?。在非限制性方面，所公開內(nèi)容提供了在seqidno：1-6和69-73一個(gè)或多個(gè)c和/或n末端區(qū)域包含1、約2、約3、約4、約5、約10或約20個(gè)添加或缺失的序列。

核酸序列修飾

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含編碼蛋白質(zhì)或多肽或其生物活性部分的核苷酸序列的分離或重組核酸分子，以及足以用作雜交探針以識別編碼具有序列同源性區(qū)域的蛋白質(zhì)的核酸分子的核酸分子。如本發(fā)明所用，術(shù)語“核酸分子”旨在包括使用核苷酸類似物產(chǎn)生的dna分子(例如，重組dna、cdna或基因組dna)和rna分子(例如mrna)以及dna或rna的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈dna。本發(fā)明使用的“分離的”或“重組的”核酸序列(或dna)是指不在其天然環(huán)境中的核酸序列(或dna)，例如在體外或重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，分離或重組的核酸在衍生核酸的生物體的基因組dna中不含有天然在核酸(即位于核酸的5'和3'末端的序列)側(cè)翼的序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)用于指核酸分子時(shí)，“分離的”不包括分離的染色體。

鈣蛋白酶-2底物stargazin

stargazinγ-2，參與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(ampa)受體運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)，是另一種鈣蛋白酶-2的特異性底物。特別地，如圖17所示的細(xì)胞質(zhì)c-末端，競爭性地抑制鈣蛋白酶-2，比對鈣蛋白酶-1的抑制高約100倍。

鈣蛋白酶-2底物pten

本發(fā)明公開了人腫瘤抑制蛋白pten(seqidno：1)，因?yàn)槠渚哂锈}蛋白酶-2特異性切割位點(diǎn)。因此，pten是鈣蛋白酶-2的特異性底物。雖然文獻(xiàn)公開了鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2特異性底物的一些實(shí)例(即，ki大于10倍)，但是通常教導(dǎo)了鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2底物沒有差異，盡管鈣蛋白酶需要或“閱讀”大面積的底物并且不會切割缺少結(jié)構(gòu)信息的小肽的事實(shí)(goll等人，2003，通過引用并入本文)。pten是第一個(gè)鈣蛋白酶底物，與鈣蛋白酶-1相比，其具有對鈣蛋白酶-2的顯著差異敏感性的位點(diǎn)。潛在的pten鈣蛋白酶-2切割位點(diǎn)用下劃線及粗體顯示在圖17中。

在本公開內(nèi)容之前，鈣蛋白酶-1與鈣蛋白酶-2之間的靶蛋白/底物特異性通常未被識別。已經(jīng)提供了鈣蛋白酶-1(pal等人，2003，通過引用并入本文)和鈣蛋白酶-2(hosfield等人，1999，通過引用并入)的晶體結(jié)構(gòu)，用于鈣蛋白酶抑制劑的設(shè)計(jì)，但是使用所述晶體結(jié)構(gòu)與抑制劑共結(jié)晶的的鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑的公開并沒有教導(dǎo)選擇性(cuerrier等人，2006，通過引用并入)。本發(fā)明公開了在體內(nèi)和體外對鈣蛋白酶-2敏感但對鈣蛋白酶-1不敏感的多肽切割位點(diǎn)。在其它實(shí)施例中，pten或pten的多肽片段或pten的修飾的多肽片段是鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑。如seqidno：1或seqidno：146-194所述的pten的多肽片段，也是本發(fā)明的實(shí)施例。

多肽發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例包含與seqidno：1、146-194的肽具有至少約80％、約90％、約95％、約98％、約99％或100％序列同一性的多肽。肽可以包含另外的修飾或結(jié)構(gòu)域，例如那些增加靶向bbb、或增加體內(nèi)或體外半衰期、或增加生物利用度、或其修飾或其他多肽結(jié)合域的組合，例如，轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段。預(yù)期pten的鈣蛋白酶-2選擇性切割位點(diǎn)的肽或多肽片段或修飾的多肽片段對鈣蛋白酶-2抑制，由ki測量，大于對鈣蛋白酶-1的抑制，由ki測量。

在各個(gè)其它的實(shí)施例中，多肽鈣蛋白酶抑制劑含有至少350個(gè)連續(xù)的鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的氨基酸，其中片段小于全長天然形式并具有蛋白水解活性。在各個(gè)其它的實(shí)施例中，多肽鈣蛋白酶抑制劑含有鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的至少四個(gè)連續(xù)的氨基酸。

在本發(fā)明的多肽抑制劑的各個(gè)實(shí)施例中，多肽被r1和r2基團(tuán)取代，其中r1和r2通過共價(jià)鍵連接。在各個(gè)其它實(shí)施例中，r1是多肽片段或修飾的多肽片段，其是鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的選擇性抑制劑，或鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的高選擇性抑制劑，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子(例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段)；并且r2是多肽或修飾的多肽，其是鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的選擇性抑制劑，或鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2的高選擇性抑制劑，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的多肽片段或修飾的多肽片段，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段。

在各個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2的選擇性抑制劑是基于下式的分子：

其中：m1是-o、-n、-s或-c被取代以共價(jià)連接選自y1-phch2-、y1-ph(ch2)2-、phch2-y1或ph(ch2)2-y1-的封閉基團(tuán)，其中y1是共價(jià)連接到分子的多肽或修飾的多肽，該分子改善半衰期、生物利用度或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或者其中y1是-h，用于連接小分子、多肽或修飾的多肽部分的取代，用于改善半衰期、生物利用度或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或者y1是連接多肽的-o、-n、-s或-c取代，所述多肽改善膜的滲透性或血腦屏障通道，選自(seqidnos：195-200)，改善半衰期、生物利用度或靶向的分子，如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段，或者，m1是-o、-n、-s或-c被取代以共價(jià)連接小分子、多肽或修飾的多肽，這些物質(zhì)改善膜的滲透性或血腦屏障通道，選自seqidno：(195-200)的多肽，改善半衰期、生物利用度或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；r1是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，所述α-碳具有l(wèi)取向，并具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；且r2是-ch3、-ch2ch3、-(ch2)2ch3、-ch(ch3)2、-ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、–c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)、c6h4(2-oh)、c6h4(2-ch3)、c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)、c6h4(2-och3)、-c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)、c6h4(2-nh2)、c6h4(3-nh2)、c6h4(4-nh2)、c6h4(2-nhch3)、c6h4(3-nhch3)、c6h4(4-nhch3)、c6h4(2-n(ch3)2)、c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；r3是-h、-och3、＝nh、-nh2、-sh、＝o、＝s、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、-sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-f、-cl、–br、-i；x1是-c6h3(3,5-r4,r5)、-chr6-c6h3-(3,5-r4,r5)、-2-吡啶、-2-吡啶(3,5，r4,r5),–chr6-2-吡啶(3,5,r4,r5)、-3-吡啶(3,5,r4,r5)、-chr6-3-吡啶(3,5,r4,r5),-4-吡啶(3,5,r4,r5)或-chr6-4-吡啶(3,5,r4,r5)；其中r4是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br或-i；r5是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br或-i；且r6是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、-sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br或-i。

在各個(gè)其它實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的選擇性鈣蛋白酶-2是基于下式的分子：

其中：r1是x1-phch2-或x1-ph(ch2)2-；其中x1是-h或用于連接小分子、多肽、修飾的多肽部分的取代，其中所述小分子、多肽、修飾的多肽部分改善半衰期、生物利用度或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；r2是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，所述具有l(wèi)取向，并具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；r3是-ch3、-ch2ch3、-(ch2)2ch3、-ch(ch3)2-ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)、c6h4(2-oh)、c6h4(2-ch3)、c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)、c6h4(2-och3)、c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)、c6h4(2-nh2)、c6h4(3-nh2)、c6h4(4-nh2)、c6h4(2-nhch3)、c6h4(3-nhch3)、c6h4(4-nhch3)、c6h4(2-n(ch3)2)、c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；r4是-h或-och3、＝nh、-nh2、-sh、＝o、＝s、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-f、-cl、-br或-i；r5是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br、-i；且r6是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br或-i。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑是基于以下結(jié)構(gòu)式i的分子：

其中由圓指示的手性中心1是左旋(l)，并且其中手性中心2是d-或l-或外消旋混合物。式1分子的兩個(gè)實(shí)施例是在手性中心1具有l(wèi)-和在手性中心2處具有l(wèi)-的純化形式，或者分別在手性中心1具有l(wèi)-型并在手性中心2具有d-型。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑是基于以下結(jié)構(gòu)式ⅱ的分子：

其中由圓指示的手性中心1是左旋(l)，并且其中所述手性中心2為d-或l-或外消旋混合物，并且其中手性中心3為d-或l-或外消旋混合物。該分子四個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是在手性中心1是l-在手性中心2是l-型和在手性中心3是l-型的純化形式；或分別為手性中心1是l-型和手性中心2是d-型且手性中心3為l-型；或分別在手性中心1是l-型，在手性中心2是d-型且在手性中心3是d-型；或分別在手性中心1是l-型和在手性中心2使l-型，以及在手性中心3是d-型。

如上所述，本發(fā)明適用于這樣的化合物，其具有選擇性抑制鈣蛋白酶-2的能力，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍。例如，在各個(gè)實(shí)施例中，能夠抑制鈣蛋白酶-2的化合物具有比鈣蛋白酶-1的ki至少低10倍的ki，其具有以下結(jié)構(gòu)式iii的結(jié)構(gòu)：

其中由圓指示的手性中心1是左旋(l)，并且其中手性中心2是d-或l-或外消旋混合物，并且其中手性中心3是d-或l-或外消旋混合物。上述分子的四個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是在手性中心1是l-、在手性中心2是l-型且在手性中心3是l-型的純化形式；或分別在手性中心1是l-型和在手性中心2是d-型以及在手性中心3是l-型的純化形式；或分別在手性中心1是l-型和在手性中心2是d-型以及在手性中心3是d-型的純化形式；或分別在手性中心1是l-型和在手性中心2是l-型以及在手性中心3是d-型的純化形式。

在化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，該化合物能夠抑制鈣蛋白酶-2，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，其具有以下結(jié)構(gòu)式iv的結(jié)構(gòu)：

其中由圓指示的手性中心1是左旋(l)，并且其中手性中心2是d-或l-或外消旋混合物。上述分子兩個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是在手性中心1是l-型且在手性中心2是l-型的純化形式，或分別在手性中心1是l-型且在手性中心2是d-型的純化形式。

在化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，該化合物能夠選擇性地抑制鈣蛋白酶-2，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，其具有如下結(jié)構(gòu)式v的結(jié)構(gòu)：

其中：r1是x1-phch2-或x1-ph(ch2)2-；其中x1是-h或改善半衰期、生物利用度或靶向的小分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；并且其中r2是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，該α-碳具有l(wèi)取向，并具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；并且r3是-ch3、-ch2ch3、-(ch2)2ch3、-ch(ch3)2-ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)、c6h4(2-oh)、c6h4(2-ch3)、c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)、c6h4(2-och3)、c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)、c6h4(2-nh2)、c6h4(3-nh2)、c6h4(4-nh2)、c6h4(2-nhch3)、c6h4(3-nhch3)、c6h4(4-nhch3)、c6h4(2-n(ch3)2)、c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；且r4是-h或-och3、＝nh、-nh2、-sh、＝o、＝s、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-f、-cl、-br或-i；r5是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br、-i；且r6是-h、-och3、-och2ch3、-o(ch2)2ch3、-och(ch3)2、-sch3、sch2ch3、-s(ch2)2ch3、-sch(ch3)2、-oh、-ch3、-ch2ch3、-cn、-chnh、-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-f、-cl、-br或-i。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式vi的結(jié)構(gòu)：

其中r1是phch2-或ph(ch2)2-；并且其中r2是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，該α-碳具有l(wèi)取向，并且具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；并且r3是-ch3或-ch2ch3或-(ch2)2ch3或-ch(ch3)2或-ch2ch(ch3)2或-ch(ch3)ch2ch3或-c6h5,、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)或c6h4(2-oh)或c6h4(2-ch3)或c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)或c6h4(2-och3)或c6h4(3-och3),c6h4(4-och3)或c6h4(2-nh2)或c6h4(3-nh2)或c6h4(4-nh2)或c6h4(2-nhch3)或c6h4(3-nhch3)或c6h4(4-nhch3)或c6h4(2-n(ch3)2)或c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；并且r4是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；且r5是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；并且r6是-h或-och3或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-cn或-chnh或-nh2或-nhch3或-n(ch3)2或-f或-cl或-br或-i；r7是-h或-och3或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-cn或-chnh或-nh2或-nhch3或-n(ch3)2或-f或-cl或-br或-i或嘌呤。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式vii的結(jié)構(gòu)：

其中r1是phch2-或ph(ch2)2-；并且其中r2是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，α-碳其具有l(wèi)取向并且具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；且r3是-ch3或-ch2ch3或-(ch2)2ch3或-ch(ch3)2或-ch2ch(ch3)2或-ch(ch3)ch2ch3或-c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)或c6h4(2-oh)或c6h4(2-ch3)或c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)或c6h4(2-och3)或c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)或c6h4(2-nh2)或c6h4(3-nh2)或c6h4(4-nh2)或c6h4(2-nhch3)或c6h4(3-nhch3)或c6h4(4-nhch3)或c6h4(2-n(ch3)2)或c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；且r4是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；且r5是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或–i；且r6是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；且r7是-h或-och3或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-cn或-chnh或-nh2或-nhch3或-n(ch3)2或-f或-cl或-br或-i；且r8是–h或-och3或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-cn或-chnh或-nh2或-nhch3或-n(ch3)2或-f或-cl或-br或-i或嘌呤。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式viii的結(jié)構(gòu)：

其中m1是y1-phch2-或y1-ph(ch2)2-或phch2-y1-或ph(ch2)2-y1-，其中y1是共價(jià)結(jié)合的多肽或修飾多肽，其改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或其中y1是-h或用于連接小分子、多肽或修飾的多肽部分的取代，用于改善半衰期、生物利用度或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或y1是-o、-n、-s或-c取代以連接多肽，該多肽改善膜滲透性或血腦屏障通道，例如seqidno：195-200的那些，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；并且其中r2是與α-碳共價(jià)鍵合的官能團(tuán)，該α-碳具有l(wèi)取向并且具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；并且r3是-ch3或-ch2ch3或-(ch2)2ch3或-ch(ch3)2或-ch2ch(ch3)2或-ch(ch3)ch2ch3或-c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)或c6h4(2-oh)或c6h4(2-ch3)或c6h4(3-ch3),c6h4(4-ch3)或c6h4(2-och3)或c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)或c6h4(2-nh2)或c6h4(3-nh2)或c6h4(4-nh2)或c6h4(2-nhch3)或c6h4(3-nhch3)或c6h4(4-nhch3)或c6h4(2-n(ch3)2)或c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；且r4是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；r5是-h或-och3、＝nh或-nh2或-sh或＝o或＝s或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或-sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-f或-cl或-br或-i；其中x1是-c6h3(3,5-r6,r7)或-2-吡啶或-2-吡啶(3,5,r6,r7)或-3-吡啶(3,5,r6,r7)或-4-吡啶(3,5,r6,r7)；其中r6是-h或-och3或-och2ch3或-o(ch2)2ch3或-och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或-oh或-ch3或-ch2ch3或-cn或-chnh或-nh2或-nhch3或-n(ch3)2或-f或-cl或-br或–i；且r7是-h或–och3或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn或–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl或–br或–i。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式ix的結(jié)構(gòu)：

其中m1是-o、-n、-s或-c被取代以連接阻斷基團(tuán)，例如y1-phch2-或y1-ph(ch2)2-或phch2-y1-或ph(ch2)2-y1-，其中y1是共價(jià)連接的多肽，其改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或其中y1是-h或用于連接分子的取代，該分子改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；或y1是-o、-n、-s或-c取代以連接多肽，該多肽改善膜滲透性或血腦屏障通道，例如seqidno：195-200的那些，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段，或m1是-o、-n、-s或-c被取代以共價(jià)連接其他小分子多肽或修飾的多肽，其改善膜通透性或血腦屏障通道，例如seqidno：195-200的那些，或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽片段、或胰島素片段或ldl結(jié)合蛋白片段、或狂犬病病毒糖蛋白片段，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；并且其中r1是與α-碳共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)，α-碳具有l(wèi)取向并且具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；r2是-ch3或-ch2ch3或-(ch2)2ch3或-ch(ch3)2或-ch2ch(ch3)2或-ch(ch3)ch2ch3或-c6h5、-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)或c6h4(2-oh)或c6h4(2-ch3)或c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)或c6h4(2-och3)或c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)或c6h4(2-nh2)或c6h4(3-nh2)或c6h4(4-nh2)或c6h4(2-nhch3)或c6h4(3-nhch3)或c6h4(4-nhch3)或c6h4(2-n(ch3)2)或c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；且r3是-h或-och3、＝nh或–nh2或–sh或＝o或＝s或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–f或–cl或–br或–i；其中x1是-c6h3(3,5-r4,r5)或–chr6-c6h3-(3,5-r4,r5)或-2-吡啶或-2-吡啶(3,5,r4,r5)或–chr6-2-吡啶(3,5,r4,r5)或-3-吡啶(3,5,r4,r5)、–chr6-3-吡啶(3,5,r4,r5)或-4-吡啶(3,5,r4,r5)或–chr6-4-吡啶(3,5,r4,r5)；其中r4是–h或–och3或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl–br或–i；且r5是–h或–och3或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn或–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl或–br或–i；其中r6是–h或–och3或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn或–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl或–br或–i。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式xi的結(jié)構(gòu)：

其中m1是-o、-n、-s或-c被取代以連接阻斷基團(tuán)如y1-phch2-或y1-ph(ch2)2-或phch2-y1-或ph(ch2)2-y1-，其中y1是多肽或修飾的多肽共價(jià)連接以改善半衰期、生物利用度或靶向；或其中y1是-h或用于連接小分子、多肽或修飾的多肽部分的取代，用于改善半衰期、生物利用度或靶向，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病毒糖蛋白片段；或y1是-o、-n、-s或-c被取代以共價(jià)連接改善膜滲透性或血腦屏障通道的多肽，例如seqidno：195-200的那些，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段，或m1是-o、-n、-s或-c被取代以共價(jià)連接改善膜通透性或血腦屏障通道的其它小分子多肽或修飾的多肽，或諸如seqidno：195-200的那些，或改善吸收、生物利用度、半衰期或靶向的分子，例如轉(zhuǎn)移多肽片段、胰島素片段、ldl結(jié)合蛋白片段、狂犬病病毒糖蛋白片段；并且其中r1是與α-碳共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)，α-碳具有l(wèi)取向并且具有亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈或修飾的氨基酸側(cè)鏈；且r2是-ch3或–ch2ch3或–(ch2)2ch3或–ch(ch3)2或-ch2ch(ch3)2或–ch(ch3)ch2ch3或–c6h5,-c6h4(4-oh)、c6h4(3-oh)或c6h4(2-oh)或c6h4(2-ch3)或c6h4(3-ch3)、c6h4(4-ch3)或c6h4(2-och3)或c6h4(3-och3)、c6h4(4-och3)或c6h4(2-nh2)或c6h4(3-nh2)或c6h4(4-nh2)或c6h4(2-nhch3)或c6h4(3-nhch3)或c6h4(4-nhch3)或c6h4(2-n(ch3)2)或c6h4(3-n(ch3)2)或c6h4(4-n(ch3)2)；其中x1是-c6h3(3,5-r3,r4)或-2-吡啶或-2-吡啶(3,5,r3,r4)或-3-吡啶(3,5,r3,r4)或-4-吡啶(3,5,r3,r4)；其中r3是–h或–och3或–och2ch3或o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn或–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl或–br或–i；且r4是–h或–och3或–och2ch3或-o(ch2)2ch3或–och(ch3)2、-sch3或sch2ch3或-s(ch2)2ch3或–sch(ch3)2或–oh或–ch3或–ch2ch3或–cn或–chnh或–nh2或–nhch3或–n(ch3)2或–f或–cl或–br或–i。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式xii的結(jié)構(gòu)：

該實(shí)施例中的化合物的特征在于對鈣蛋白酶-1的ki為15μm且對鈣蛋白酶-2的ki為0.05μm，如6235929中表i第14列中的，并且li等人在1996年公開了相同的化合物，其具有相同的發(fā)明人，其具有μ-鈣蛋白酶ki為35μm而m-鈣蛋白酶ki為0.05μm(li等人，1996，第4092頁的化合物53)。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式xiii的結(jié)構(gòu)：

其中z是碳或氮。

在能夠選擇性抑制鈣蛋白酶-2的化合物的另一個(gè)實(shí)施例中，其對鈣蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低至少10倍，具有以下結(jié)構(gòu)式xvi的結(jié)構(gòu)：

其中，r8是

識別同種型特異性鈣蛋白酶底物的方法

本發(fā)明還公開識別m-鈣蛋白酶特異性底物的方法。該方法包括使底物pten(seqidno：1)或其片段或修飾的片段與活化的μ-鈣蛋白酶或另一種蛋白或可被鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2或兩者切割的另一種前瞻性蛋白質(zhì)接觸，以及確定底物是否對鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2是特異性的。如果鈣蛋白酶-1但不是鈣蛋白酶-2切割了底物，則底物是鈣蛋白酶-1特異性底物。如果鈣蛋白酶-2但不是鈣蛋白酶-1切割了底物，則底物是鈣蛋白酶-2特異性底物。底物切割的速率也可以表明底物是特異性的，或?qū)︹}蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2是高度特異性的。例如，可以在標(biāo)記的底物預(yù)期底物的存在下，或在潛在特異性底物和第二標(biāo)記的非特異性底物的存在下測定kcat或km或ki。kcat或km或抑制常數(shù)(ki)或本領(lǐng)域已知的限定底物切割速率的另一種測量可用于指示底物的切割速率，或在對鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2不是選擇性的另一種底物存在下底物的抑制性質(zhì)。

在一個(gè)實(shí)施例中，如果底物的km對于鈣蛋白酶-1比對于鈣蛋白酶-2至少低約7倍，則確定其為鈣蛋白酶-1的特異性底物。這些底物具有作為鈣蛋白酶-1特異性抑制劑的潛力。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果鈣蛋白酶-2的催化速率km比鈣蛋白酶-1低至少約20倍，則確定其是高特異性的鈣蛋白酶-2底物。這中底物具有作為鈣蛋白酶-2高特異性抑制劑的潛力。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果底物的km對于鈣蛋白酶-2比對鈣蛋白酶-1低至少約10倍，則確定其為鈣蛋白酶-1特異性底物。這種底物具有作為鈣蛋白酶-1特異性抑制劑的潛力。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果的km對于鈣蛋白酶-1比鈣蛋白酶-2低至少約20倍，則確定其是高特異性的鈣蛋白酶-1底物。這中底物具有作為鈣蛋白酶-1的高度選擇性抑制劑的潛力。

識別同種型特異性鈣蛋白酶切割位點(diǎn)的方法

在本發(fā)明的各個(gè)方面，基于pten切割位點(diǎn)可以識別或設(shè)計(jì)對鈣蛋白酶-2而非鈣蛋白酶-1高選擇性的化合物抑制劑。因此，本發(fā)明還公開了識別鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑的方法。這些方法包括使底物，例如pten(seqidno：1)或其片段或修飾片段與活性鈣蛋白酶-1(seqidno：2-6)或鈣蛋白酶-2(seqidno：69-73)或其片段接觸，并確定切割速率，或kcat。純化的蛋白質(zhì)、多肽或修飾的多肽可以與組合物接觸，該組合物包含鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2或純化或純化重組的鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2。蛋白水解后，通過凝膠電泳分析片段，收集并進(jìn)行埃德蒙德降解，或者通過2-d凝膠和埃德蒙德降解進(jìn)行分析，或者通過質(zhì)譜測定本發(fā)明多肽的精確的切割位點(diǎn)。可以使用多肽片段、模擬多肽片段的小分子、或含有模擬切割位點(diǎn)的切割位點(diǎn)的多肽修飾物或在切割位點(diǎn)側(cè)翼的肽或多肽作為抑制劑。

識別鈣蛋白酶-2特異性切割位點(diǎn)

識別鈣蛋白酶切割位點(diǎn)的各種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，定點(diǎn)誘變可用于確定鈣蛋白酶切割位點(diǎn)的基本元件(stabach等人，1997，并入本文)。可以使用切割片段的分離和隨后的埃德蒙德降解(xu等人，2007)或質(zhì)譜(chou等人，2011)。如果片段被識別為通過鈣蛋白酶-2比鈣蛋白酶-1更快地切割，則可以使用這種片段來抑制特異性底物的切割(xu等人，2007)。在另一個(gè)實(shí)施例中，這種片段可以用作特異性鈣蛋白酶同種型的抑制劑。

對鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2具有特異性的蛋白質(zhì)的識別方法

在iptg(pet15載體)存在下，重組pten可以在具有g(shù)st-標(biāo)記的大腸桿菌bl-21細(xì)胞中表達(dá)，并用谷胱甘肽結(jié)合的珠或柱純化。在各個(gè)實(shí)施例中，重組pten可以被純化、分離并分別暴露于鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2中，并且可以通過測量切割產(chǎn)物的外觀來確定每種切割的速率，或者切割速率可以在琥珀酰-亮氨酸-酪氨酸-amc或另一種熒光或多熒光多肽序列的存在下測量，該多熒光多肽序列對鈣蛋白酶-2或鈣蛋白酶-1是非選擇性的?？梢酝ㄟ^比較暴露于鈣蛋白酶-2或鈣蛋白酶-1的非選擇性底物的變化來測試被懷疑顯示鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2特異性的蛋白質(zhì)的ki。

鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域

文獻(xiàn)表明，鈣蛋白酶在通過突觸后nmda受體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)信號傳導(dǎo)中起直接作用(li&ju，2012，通過引用并入本文)，而初步數(shù)據(jù)表明nmda受體的突觸激活，其誘導(dǎo)ltp，也導(dǎo)致erk途徑的激活和神經(jīng)保護(hù)。因此，鈣蛋白酶參與競爭和相反的途徑。對這些雙重、不同的作用的解釋是，像其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一樣，鈣蛋白酶活性通過鈣蛋白酶及其各種底物的離散骨架而被制成特異性。因此，例如，即使常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可以被差異地骨架以產(chǎn)生離散的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在酵母高滲透摩爾濃度和交配的mapk通路中描述了其中的一個(gè)重要實(shí)例，其含有常見的mapkkk蛋白。每個(gè)途徑的mapkkk的差異化骨架介導(dǎo)了每個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，沒有串?dāng)_(park等人，2003，通過引用并入本文)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)pdz蛋白是分離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和消除串?dāng)_的核心(good等人，2011，通過引用并入本文)。

各種細(xì)胞類型中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分散已被證明是使特定信號或信號級聯(lián)彼此離散的手段。骨架或通過物理結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件捆綁以產(chǎn)生不串?dāng)_的離散信號級聯(lián)已被證明是通過含有pdz結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的(good等，2011)。不知道鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2具有pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且被骨架化以產(chǎn)生用于鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的單獨(dú)的信號級聯(lián)。本發(fā)明還識別了鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性肽，該肽從其各蛋白質(zhì)骨架中取代鈣蛋白酶：對于鈣蛋白酶-2，tiqldliswlsfsvl或其片段或修飾。

如上所述，鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1都具有pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域。鈣蛋白酶-2與鈣蛋白酶-1的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域彼此顯著不同，鈣蛋白酶-2是i類pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域而鈣蛋白酶-1結(jié)構(gòu)域符合ii類pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的要求，因此他們可能沒有共享pdz域結(jié)合伙伴。自從20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)它們以來(kornau等人，1995；woods&bryant，1991，全部通過引用并入本發(fā)明)，pdz蛋白在真核生物體中幾乎普遍存在，但在脊椎動物中更普遍。鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1氨基酸序列的檢查表明，在鈣蛋白酶-2中，例如i型pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域保存在廣泛的脊椎動物中。注意，例如，虹鱒魚(oncorhynchusmykiss)和斑馬魚(daniorerio)相比哺乳動物和禽類脊椎動物呈現(xiàn)出不同的c-末端序列，但是它們?nèi)匀槐Ａ袅薸型pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的要求((kang等人，2003，通過引用并入本發(fā)明))。還要注意，各種物種鈣蛋白酶-1的ii型pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的強(qiáng)保守性(見表1)。因此，這些序列在脊椎動物中強(qiáng)烈保守，這表明了關(guān)鍵的功能作用。

表1：鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在脊椎動物中的c-末端結(jié)構(gòu)域

可以容易地設(shè)計(jì)干擾鈣蛋白酶-pdz蛋白締合的肽，并且該肽是本發(fā)明的實(shí)施例。鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2骨架的肽抑制劑的實(shí)例在本發(fā)明中包括seqidno：7-68和74-145，并且用于本發(fā)明公開的施用方法中。

解脫鈣蛋白酶-2

在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例中，鈣蛋白酶-2的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于非骨架化鈣蛋白酶-2或鈣蛋白酶-2的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域磷酸模擬(用天冬氨酸或谷氨酸替代絲氨酸/蘇氨酸)的方法中。在另一個(gè)實(shí)施例中，由鈣蛋白酶-2pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域(seqidno：74-145)或其肽類似物或鈣蛋白酶-2的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸模擬物構(gòu)成的多肽或是可以用于本發(fā)明所述的治療方法中的產(chǎn)品。肽類似物在本領(lǐng)域中被理解為不是常規(guī)多肽而是特異性結(jié)合特定多肽的相同蛋白質(zhì)的分子。鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1的骨架化有助于限制強(qiáng)化的突觸后腔室空間。本發(fā)明描述了解脫鈣蛋白酶-2和通過施用鈣蛋白酶-2pdz結(jié)構(gòu)域的方法。在其它實(shí)施例中，鈣蛋白酶-2pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用于治療如本文所述的ltp損害疾病的方法。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例是通過施用由鈣蛋白酶-2或肽類似物的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的多肽來治療ptsd的方法。用于治療本文教導(dǎo)的疾病和病癥的產(chǎn)品是肽、多肽、其修飾物，或鈣蛋白酶-2的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽類似物。pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域與多肽和修飾的多肽，或小分子組合或脂質(zhì)體或包封物結(jié)合以增強(qiáng)器官靶向、亞細(xì)胞靶向、生物利用度、半衰期或效力。pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以與選擇性抑制劑或高選擇性抑制劑連接，或與選擇性抑制劑或高度選擇性抑制劑配制。

解脫鈣蛋白酶-1

在各種實(shí)施例中，鈣蛋白酶-1的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于非骨架化鈣蛋白酶-1的方法中。在另一個(gè)實(shí)施例中，多肽由鈣蛋白酶-1pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域(seqidno：7-68)或其肽類似物或鈣蛋白酶-1的pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的磷酸模擬物組成。在本領(lǐng)域中肽類似物被理解為非常規(guī)多肽而是特異性結(jié)合特定多肽的相同蛋白質(zhì)的分子。鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1的骨架化限定了被強(qiáng)化的突觸后腔室。實(shí)際上，骨架化正在參與限定由激活的鈣蛋白酶-1與激活的鈣蛋白酶-2產(chǎn)生的ltp空間。具有鈣蛋白酶-1pdz-肽的非骨架化鈣蛋白酶-1導(dǎo)致大鼠海馬切片中較大的ltp，通過erk/akt途徑激活進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)，以及保護(hù)培養(yǎng)物中的血清饑餓和過氧化氫(圖15，實(shí)施例10)。用于治療本文教導(dǎo)的疾病和障礙的產(chǎn)品是肽、多肽、其修飾物或m-鈣蛋白酶pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽類似物。鈣蛋白酶-1pdz結(jié)合結(jié)構(gòu)域或肽類似物將用于治療以ltp受損為特征的疾病。

其他多肽域

包含本發(fā)明的融合蛋白的其他多肽改善了本發(fā)明的小分子多肽、核酸、修飾的多肽或修飾的核酸穿過血腦屏障釋放、生物利用度和穩(wěn)定性。鈣蛋白酶同種型選擇性抑制劑的其它實(shí)施例是通過肽連接或其它修飾連接的小分子修飾和多肽序列。任選地，將改善進(jìn)入細(xì)胞的小分子、多肽或修飾的多肽加入本發(fā)明中，以改善本發(fā)明鈣蛋白酶-1選擇性抑制劑或鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑的生物利用度。任選地，還加入改善跨血腦屏障遞送的小分子、多肽或修飾的多肽?？梢酝ㄟ^肽鍵或其他修飾任選加入的多肽包括但不限于seqidno：195-200的多肽。最大化遞送到腦的方法任選地也是本發(fā)明的同種型選擇性鈣蛋白酶抑制劑的一部分(bertrand等人，2010；dufes等人，2013；gabathuler，2009；gabathuler，2010a；gabathuler，2010b)，通過引用并入本發(fā)明。這種多肽包括來自胰島素、igf-1、igf-2和轉(zhuǎn)鐵蛋白、ldl結(jié)合肽、狂犬病病毒糖蛋白的多肽片段。

脂質(zhì)體、包封物、容器及其結(jié)合物

具有或不具有改善細(xì)胞或器官靶向的結(jié)合物的脂質(zhì)體、納米容器和包封制劑也是本發(fā)明的實(shí)施例，該結(jié)合物包含本發(fā)明的小分子、多肽或修飾多肽。在本領(lǐng)域中描述了用于靶向穿過血腦屏障的脂質(zhì)體和結(jié)合物，例如在美國專利6759058、6761901、6849269、7387791、uspn2011/0305751a1和(schnyder&huwyler，2005，所有這些都通過引用并入本文)，其內(nèi)容通過引用并入本文。在另一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的小分子、多肽和修飾的多肽與載體分子例如脂質(zhì)體或其它所述的容器或封裝劑組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的小分子、多肽、核酸、修飾的核酸或修飾的多肽與藥學(xué)上可接受的納米容器結(jié)合，所述納米容器包含用于跨血腦屏障遞送的谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白配體、胰島素片段、胰島素樣生長因子(igf)片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白片段、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體的人源化抗體、人源化抗e選擇抗體、低密度脂蛋白(ldl)受體結(jié)合蛋白片段或狂犬病糖蛋白多肽片段。

鈣蛋白酶-2的核酸抑制劑

與鈣蛋白酶-2mrna的編碼或非翻譯的5'或3'區(qū)域雜交的核酸也是本發(fā)明的實(shí)施例。核酸是shrna、microrna、反義dna寡核苷酸或其修飾。將核酸遞送到腦中和鈣蛋白酶-2mrna的操作空間的位點(diǎn)的修飾是優(yōu)選的修飾，并且包括但不限于本發(fā)明公開的多肽和脂質(zhì)體結(jié)合物。用所述核酸治療的方法也是本發(fā)明的實(shí)施例，并且包括增強(qiáng)ltp、增強(qiáng)ltp的固化、增強(qiáng)通常不誘導(dǎo)ltp的刺激的鞏固、改善記憶力、治療記憶力障礙、治療所述精神和本文公開的神經(jīng)學(xué)的方法。

治療方法

鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑在培養(yǎng)的神經(jīng)元中保護(hù)神經(jīng)，并增強(qiáng)急性海馬切片中的長期增強(qiáng)(ltp)(學(xué)習(xí)和記憶力的細(xì)胞模型)。鈣蛋白酶-2抑制劑用作增強(qiáng)ltp的方法，以及增強(qiáng)ltp固化的方法。根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑用于改善學(xué)習(xí)和減少神經(jīng)退行。因此，預(yù)期它們有效地用于治療與突觸功能障礙、突觸變性或神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的疾病，包括阿爾茨海默病和帕金森病的獨(dú)特型和家族性形式，以及癡呆、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、癲癇發(fā)作、腦炎、中風(fēng)、血管痙攣、血容量不足性休克、創(chuàng)傷性休克、創(chuàng)傷性腦損傷、再灌注損傷、多發(fā)性硬化、艾滋病相關(guān)性癡呆、神經(jīng)毒性、頭部創(chuàng)傷和脊髓損傷、青光眼、開角型青光眼、閉角型青光眼、正常緊張性青光眼、先天性青光眼、色素性青光眼、假性剝脫性青光眼、創(chuàng)傷性青光眼、新生血管性青光眼、眼角膜內(nèi)皮綜合征、眼睛缺血、視網(wǎng)膜缺血。

在各個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑用于有效地治療聽力損失，包括由于聽覺神經(jīng)的損傷引起的耳毒性的聽力損失，例如由于藥物或毒素的副作用。在各個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑用于有效地治療由于神經(jīng)退行而引起的聽力損失。

在各個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑用于有效地治療wolfram綜合征1，而在其它實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑用于有效地治療wolfram綜合征2。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑通過抑制鈣蛋白酶-2活性來治療與wolfram綜合征1或2相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，包括由于wsf1或wsf2基因表達(dá)失調(diào)而增加的鈣蛋白酶-2活性。

在各個(gè)實(shí)施例中，將有效量的根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑施用于有需要的患者以抑制神經(jīng)元細(xì)胞死亡。在各個(gè)其它實(shí)施例中，將有效量的根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑施用于有需要的患者以增強(qiáng)記憶力力。在其他實(shí)施例中，將有效量的根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑施用于有需要的患者以治療神經(jīng)障礙。在另一個(gè)實(shí)施例中，將有效量的根據(jù)本發(fā)明的鈣蛋白酶-2抑制劑施用于有需要的患者以治療青光眼。

在本發(fā)明的各個(gè)其它實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明，有效量的的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑用于有效地治療突觸和行為功能障礙疾病，其包括但不限于精神分裂癥、自閉癥譜系障礙、雙向疾病、藥物誘發(fā)的精神病、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(ptsd)、抑郁癥和自殺念頭、恐懼癥、強(qiáng)迫癥、21三體、adhd和add。自閉癥譜系障礙包括自閉癥(經(jīng)典自閉癥)、安格曼綜合征、阿斯伯格障礙(asperger綜合征)、無其他規(guī)定的普遍性發(fā)育障礙(pdd-nos)、rett氏障礙(rett綜合征)、兒童解體障礙(cdd)。

組合物

本發(fā)明的藥物組合物可以通過藥物制劑領(lǐng)域已知的方法制備，例如參見雷明頓藥學(xué)科學(xué)，(remington'spharmaceuticalsciences)，第22版，(藥物出版社，2012(pharmaceuticalpress,2012))，其通過引用并入本文。在固體劑型中，本發(fā)明的化合物可以與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣混合，或(a)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合劑，例如纖維素衍生物、淀粉、凝膠、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠，(c)保濕劑，例如甘油，(d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、復(fù)合硅酸鹽和碳酸鈉，(e)溶液緩凝劑，例如石蠟，(f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物，(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇、甘油單硬脂酸酯、硬脂酸鎂等(h)吸附劑，例如高嶺土和膨潤土，和(i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉，或它們的混合物。在膠囊、片劑和丸劑的中，劑型還可以包含緩沖劑。

藥物制劑領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的佐劑也可用于本發(fā)明的藥物組合物中。這些包括但不限于保存劑、潤濕劑、懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、增香劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^包含各種抗菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來確保預(yù)防微生物的作用。還可以包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。如果需要，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、ph緩沖劑、抗氧化劑等，例如檸檬酸、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。

如上所述的固體劑型可以制備有包衣和殼，如制藥領(lǐng)域已知的腸溶衣和其他。它們可以含有安撫劑，也可以是這樣的組合物，即它們以延遲的方式在腸道的某一部分中釋放活性化合物或化合物?？梢允褂玫那度虢M合物的非限制性實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟。如果合適，活性化合物也可以是一種或多種上述賦形劑的微囊形式。

除了活性化合物之外，懸浮液可以含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃蓍膠或這些物質(zhì)的混合物等。液體劑型可以是水性的，可以含有藥學(xué)上可接受的溶劑以及本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)液體劑形，其包括但不限于緩沖劑、調(diào)味劑、甜味劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。

除了上述局部施用方法之外，還有多種方法將本發(fā)明的化合物局部施用于予肺。一種這樣的方法可以包括由本發(fā)明的化合物組成的可呼吸顆粒的干粉吸入劑制劑，其被治療的患者吸入。干粉制劑通常包括載體顆粒，化合物顆?？筛街捷d體顆粒上。載體顆?？梢允侨魏慰山邮艿乃幚矶栊圆牧匣虿牧系慕M合。例如，載體顆?？梢杂梢环N或多種材料構(gòu)成，該材料選自糖醇；多元醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇或木糖醇和結(jié)晶糖，包括單糖和二糖；無機(jī)鹽如氯化鈉和碳酸鈣；有機(jī)鹽如乳酸鈉；和其它有機(jī)化合物如尿素、多糖例如環(huán)糊精和糊精。載體顆?？梢允墙Y(jié)晶糖，如單糖例如葡萄糖或阿拉伯糖，或二糖如麥芽糖、蔗糖、葡萄糖或乳糖。本發(fā)明的化合物將分散到呼吸道中，隨后以藥學(xué)的有效量接觸下肺。

除了上述的局部施用方法之外，還有通過這些方法全身施用本發(fā)明化合物的各種方法。一種這樣的方法將涉及由本發(fā)明的化合物組成的可吸入顆粒的氣溶膠懸浮液，其被治療的患者吸入。化合物將通過肺以藥學(xué)上有效的量被吸收到血液中。可吸入顆?？梢允且后w或固體，其粒度足夠小以在吸入時(shí)通過口和喉。

可以使用口服給藥的劑型，其包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑和混懸劑?？梢允褂糜糜诜尾拷o藥的劑型，其包括計(jì)量吸入器、干粉吸入器或氣溶膠制劑。在這種固體劑型中，活性化合物可以與至少一種惰性的藥學(xué)上可接受的賦形劑(也稱為藥學(xué)上可接受的載體)混合。

根據(jù)本發(fā)明的化合物也可用于配制液體或可注射的藥物組合物。以純形式或合適的藥物組合物施用本發(fā)明化合物可以通過任何所接受的給藥模式或用于服用類似療效的藥劑來進(jìn)行。因此，施用可以是例如口服、口腔、鼻、肺、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下)、局部地、經(jīng)皮內(nèi)、陰道內(nèi)、膀胱內(nèi)、全身內(nèi)、眼睛或直腸，以固體、半固體、凍干粉末或液體劑型、例如片劑、栓劑、丸劑、軟彈性和硬明膠膠囊、粉末、溶液、懸浮液或氣溶膠等，例如，單位劑型適合簡單的精確劑量給藥。一種給藥途徑可以是口服給藥，使用方便的日劑量方案，其可以根據(jù)待治療病癥的嚴(yán)重程度來調(diào)節(jié)。

實(shí)施例1對鈣蛋白酶-2具有高選擇性的小分子/修飾的多肽

式1，在該實(shí)例中中手性中心1是l-形式，并且在該實(shí)施例中手性中心2是d-和l-的外消旋混合物，以不同濃度(從1nm至10μm)引入體外混合，包括琥珀酰-亮氨酸-酪氨酸-amc和鈣蛋白酶-1或鈣蛋白酶-2(sasaki等人，1984)，并且測定每種鈣蛋白酶熒光損失的動力學(xué)(powers等人，2000)。文獻(xiàn)中獲得的化合物的ki值對鈣蛋白酶-1為2.3μm，對鈣蛋白酶-2為0.22μm(li等，1996)。然而，本發(fā)明重新確定了鈣蛋白酶-1的ki為1.29μm±0.7μm，鈣蛋白酶-2的ki被確定為0.025μm±0.02μm。因此，本文所述的選擇性評估與以前的教導(dǎo)不同。該化合物對鈣蛋白酶-2是高選擇性的抑制劑，因?yàn)槠鋵︹}蛋白酶-2的ki比對鈣蛋白酶-1的ki低50倍以上。

實(shí)施例2：在ltp誘導(dǎo)前施用時(shí)，通用鈣蛋白酶抑制劑阻斷l(xiāng)tp。在急性大鼠海馬切片中去區(qū)ca1的輻射層中進(jìn)行興奮性突觸后電位(epsp，圖2)的現(xiàn)場記錄。10μm鈣蛋白酶抑制劑iii(z-val-phe-cho，對鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的ki為約8nm)，其同時(shí)抑制鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2，在θ節(jié)律刺激(tbs，100hz的4脈沖的10節(jié)律，節(jié)律間隔為200ms)之前加入，其可用于引出ltp(capocchi等人，1992)。當(dāng)與對照相比時(shí)(比較空心圓和填充圓)，預(yù)孵育非選擇性鈣蛋白酶抑制劑(鈣調(diào)蛋白酶抑制劑iii)沒有阻止短期增強(qiáng)(tbs后的fepsps增加)，但是阻止了ltp的形成。

實(shí)施例3：鈣蛋白酶2-選擇性抑制劑增強(qiáng)ltp。在acsf中制備并浸泡急性海馬切片。在能夠引發(fā)ltp(參見圖3a的線#1，為施用的時(shí)間相關(guān))的θ節(jié)律刺激之前施用200nm式1的鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑，其對鈣蛋白酶-2的抑制比鈣蛋白酶-1高50-100倍。與非選擇性鈣蛋白酶抑制劑如鈣蛋白酶抑制劑iii的施用意想不到的相反，預(yù)孵育鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑預(yù)孵育不抑制ltp(圖3a)；而是增強(qiáng)了ltp。θ節(jié)律刺激(tbs)后用相同的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑孵育海馬切片也導(dǎo)致在ttp固化階段當(dāng)從tbs后10分鐘到tbs后1小時(shí)施用時(shí)的ltp增強(qiáng)。

實(shí)施例4：鈣蛋白酶2-特異性抑制劑從angelman綜合征的小鼠模型中拯救海馬切片中的ltp受損。在雄性ubea突變體小鼠或其野生型同窩的急性海馬切片中，在區(qū)域ca1的輻射層中進(jìn)行興奮性突觸后電位(epsp)的現(xiàn)場記錄。在基線記錄20分鐘后，將θ節(jié)律刺激(tbs，圖4的箭頭)應(yīng)用于schaffer側(cè)支途徑以誘導(dǎo)ltp。應(yīng)用實(shí)施例1(200nm)的特異性的鈣蛋白酶-2抑制劑(mcal-1)如水平實(shí)線所示(圖4)，雖然對tbs引起的fepsp的初始增加沒有影響，但是它將ltp量值恢復(fù)到野生型小鼠切片中發(fā)現(xiàn)的水平。結(jié)果為從3-4只動物的6-7切片的平均±s.e.m.。

實(shí)施例5：選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑阻斷由突觸后nmda受體激活介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。處理皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)物(14div)以誘導(dǎo)突觸后nmda受體的選擇性活化，這導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。以200nm至5μm的劑量依賴性方式應(yīng)用式1的高選擇性鈣蛋白酶-2抑制劑降低了與突觸后nmda受體激活相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡(圖5)。

實(shí)施例6：高選擇性鈣蛋白酶2抑制劑不干擾導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)的突觸活性。鈣蛋白酶抑制劑-iii(其不是選擇性鈣蛋白酶抑制劑)，而不是mcalp-i(200nm)阻斷bic-和4-ap誘導(dǎo)抵抗在培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中饑餓的神經(jīng)保護(hù)。通過hoechst染色觀察和定量神經(jīng)元死亡。在次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組對300-500個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。*p<0.05，ns，無顯著差異；單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni檢驗(yàn)。n＝3–6，誤差磅表示sem(圖6)。

實(shí)施例7：式1增強(qiáng)記憶力。發(fā)現(xiàn)式1對恐懼狀況方案中的學(xué)習(xí)和記憶力具有雙重作用。在該方案中，訓(xùn)練小鼠學(xué)習(xí)語境或音調(diào)與疼痛刺激之間的關(guān)聯(lián)。訓(xùn)練前30分鐘，腹腔內(nèi)注射各種劑量的式1化合物(mcalp-1)。24小時(shí)后在語境中測試動物(圖7a)，48小時(shí)后用音調(diào)測試(圖7b)。24小時(shí)或48小時(shí)后，對于語境或音調(diào)的恐懼反應(yīng)進(jìn)行測試時(shí)，記憶力力通過小鼠呆滯(對恐懼的生物反應(yīng))的時(shí)間進(jìn)行量化。產(chǎn)生增強(qiáng)和減少的劑量之間的比率與抑制鈣蛋白酶-2和鈣蛋白酶-1的kis之間的比率相匹配。實(shí)驗(yàn)盲目的進(jìn)行，因?yàn)榉治鼋Y(jié)果的人不知道組治療。結(jié)果是8-10個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均±s.e.m，*p<0.05(方差分析后進(jìn)行bonferroni測試)。

實(shí)施例8：腹腔內(nèi)注射鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑防止nmda誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。野生型小鼠的視網(wǎng)膜中腹腔內(nèi)注射2μlpbs或2μlnmda(2.5mm)，在30min前或注射nmda6小時(shí)候后，該小鼠腹腔內(nèi)注射載體(20％dmso)、鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑(c2i，z-leu-abu-conh-ch2-c6h3(3,5-(ome)2)13,14-0.3mg/kg)或泛鈣蛋白酶抑制劑(10mg/kg)。nmda注射后7天進(jìn)行h&e染色。參見圖8a。還進(jìn)行了nmda注射后7天gcl和ipl細(xì)胞數(shù)量的定量分析。分別參見圖7b和7c。

實(shí)施例9：鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在在玻璃體內(nèi)nmda注射誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷中起相反作用。鈣蛋白酶活性涉及由nmda受體(r)激活誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。為了測試這一過程中鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的具體作用，玻璃體內(nèi)注射nmda30min前，野生型(wt)小鼠全身注射鈣蛋白酶-2選擇性抑制劑(c2i)、z-leu-abu-conh-ch2-c6h33，5-(ome)2)13,14，如實(shí)例8所述。在nmda注射后6小時(shí)，在視網(wǎng)膜提取物中測定了血漿蛋白酶分解產(chǎn)物(sbdp)的水平，鈣蛋白酶-1和-2的剪切的產(chǎn)物，ph域和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白磷酸酶1(phlpp1)，nmdar活化后被鈣蛋白酶-1降解的蛋白質(zhì)(圖8(ac))。還測量akt水平作為加載對照。與對照(pbs玻璃體內(nèi)注射)相比，nmda注射后sbdp水平顯著升高，phlpp1水平降低，表明在nmda注射后鈣蛋白酶被激活。全身(腹腔內(nèi)，i.p.)注射c2i顯著抑制在sbdp而不是phlpp1中nmda誘導(dǎo)的變化，表明c2i全身注射選擇性地抑制玻璃體內(nèi)nmda注射后視網(wǎng)膜中的鈣蛋白酶-2而不是鈣蛋白酶-1激活。

對wt小鼠玻璃體內(nèi)注射nmda或pbs后6天，制備冷凍的視網(wǎng)膜切片并進(jìn)行h&e染色，以評價(jià)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(gcl)中的細(xì)胞密度和內(nèi)部叢狀層(ipl)的厚度，其含有rgc的樹突。nmda注射(nmda+載體)顯著降低了gcl的細(xì)胞密度和ipl厚度，而pbs注射(pbs+載體)對這些參數(shù)沒有影響(新圖9d)。nmda注射30min前及6小時(shí)后，全身注射c2i顯著抑制gcl細(xì)胞密度和ipl厚度的降低(新圖9e-f)，表明鈣蛋白酶-2激活有助于gcl中nmda誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

在鈣蛋白酶-1ko小鼠中，gcl細(xì)胞密度和ipl厚度不受載體注射影響。然而，nmda注射對gcl細(xì)胞密度和ipl厚度的影響大于wt小鼠(比較新圖9d與新的圖9g)。nmda注射后在鈣蛋白酶-1ko小鼠中g(shù)cl細(xì)胞死亡明顯比wt小鼠更嚴(yán)重(比較新圖9h和新圖9j)，表明在nmda注射后，鈣蛋白酶-1支持gcl中的細(xì)胞存活。向鈣蛋白酶-1ko小鼠全身注射c2i部分但顯著地逆轉(zhuǎn)nmda誘導(dǎo)的gcl細(xì)胞密度和ipl厚度的降低(分別為圖8i和8j)。在ko小鼠中c2i對gcl細(xì)胞存活的作用低于wt小鼠(圖9j)，進(jìn)一步支持鈣蛋白酶-1在nmda誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜興奮性毒性損傷中的前生存作用。

實(shí)施例10：在急性iop升高后，視網(wǎng)膜中鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2的順序激活。使用急性閉角型青光眼模型進(jìn)行以下iop升高研究，該急性閉角型青光眼模型包括通過將連接到升高的鹽水儲存器的針插入前房來增加眼內(nèi)壓(iop)至110mmhg60分鐘。該模型重現(xiàn)了急性閉角型青光眼的幾個(gè)特征，包括視網(wǎng)膜和虹膜缺血，如不存在紅色反射和瞳孔對光的反應(yīng)所指出的。導(dǎo)致虹膜和角膜之間的狹窄角度和粘連的前房合并癥增加了前房腔室中的細(xì)胞增加和耀斑，并且由于角膜水腫增加了角膜厚度。其中一些變化持續(xù)了超過3天的觀察。在iop升高后0、2、4和6h收集眼睛，制備視網(wǎng)膜冷凍切片，并用sbdp抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。在wt小鼠中，iop升高后2、4和6小時(shí)，sbdp明顯存在于ipl中。然而，在鈣蛋白酶-1ko小鼠中，sbdp僅在4和6小時(shí)而非2小時(shí)在ipl中明顯(圖10a和c)。這些結(jié)果表明，在iop升高后，ipl中鈣蛋白酶-2激活比鈣蛋白酶-1激活慢。為了測試c2i的作用，在iop升高后2小時(shí)給wt小鼠腹腔內(nèi)注射0.3mg/kg的c2i。c2i注射在4和6小時(shí)時(shí)顯著降低ipl中的sbdp信號(圖10a和c)，表明視網(wǎng)膜ipl中的鈣蛋白酶-2激活被全身注射c2i抑制。該結(jié)果還表明wt小鼠ipl中4和6小時(shí)的鈣蛋白酶活性主要是鈣蛋白酶-2激活的結(jié)果。

為了驗(yàn)證增加iop后視網(wǎng)膜中鈣蛋白酶-2激活的時(shí)間過程，用針對全長pten(鈣蛋白酶-2而不是鈣蛋白酶-117的底物)的抗體對視網(wǎng)膜切片進(jìn)行免疫染色。在wt和鈣蛋白酶-1ko小鼠中，ipl中的pten免疫反應(yīng)性在2小時(shí)內(nèi)不變，但在iop升高后4和6小時(shí)顯著降低(圖10a和d)，證實(shí)了在iop升高后鈣蛋白酶-2在4和6小時(shí)而非2小時(shí)被激活。在iop升高后2小時(shí)將c2i注射到wt小鼠時(shí)，4和6h的pten降解完全被阻斷(圖10a和d)?？傊?，這些結(jié)果表明，在急性iop升高后，鈣蛋白酶-1在rgc樹突中短暫活化，而相同樹突中的鈣蛋白酶-2激活被延遲和延長。

實(shí)施例11：鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2在由急性iop升高誘導(dǎo)的rgc死亡中起相反的作用。為了評估升高的iop誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷，將右眼的iop升高至110mmhg60分鐘，而在左眼進(jìn)行假手術(shù)。術(shù)后3天收集視網(wǎng)膜切片用于h&e染色(圖11a和b)。在用載體(10％dmso的pbs)注射(i.p.)的wt小鼠中，右gcl中的細(xì)胞計(jì)數(shù)為62.1±5.6個(gè)細(xì)胞/mm，而左眼為113.4±7.1個(gè)細(xì)胞/mm(n＝7)。我們使用三種不同的方案來檢驗(yàn)c2i的影響。第一，在急性iop升高前30分鐘和2小時(shí)候注射(i.p.)c2i(0.3mg/kg)。假手術(shù)和iop升高眼中g(shù)cl的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為125.1±10.5和105.8±4.5個(gè)細(xì)胞/mm(n＝3，假手術(shù)和iop無顯著性差異(ns))。第二，在iop升高后2小時(shí)注射(i.p.)c2i(1次后注射)。假手術(shù)和iop升高的眼的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為110.6±3.6和86.4±7.0個(gè)細(xì)胞/mm(n＝10，ns)。第三，在iop升高后2和4h(2次后注射)后注射(i.p.)c2i。假手術(shù)和iop升高的眼的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為118.6±3.7和96.1±6.3個(gè)細(xì)胞/mm(n＝6，ns)。在所有三個(gè)c2i注射組中，與載體注射組相比，細(xì)胞存活率(iop升高眼的細(xì)胞計(jì)數(shù)與假手術(shù)眼的細(xì)胞計(jì)數(shù)比)顯著增加(圖11c)。這些結(jié)果表明，鈣調(diào)蛋白酶-2激活在iop升高后的gcl細(xì)胞死亡中起重要作用，c2i全身注射對iop升高誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用。

在鈣蛋白酶-1ko小鼠中，iop升高的眼中g(shù)cl細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于假手術(shù)眼(37.7±10.4比130.3±7.0個(gè)細(xì)胞/mm，n＝4)。重要的是，在鈣蛋白酶-1ko小鼠中的細(xì)胞存活率顯著低于wt小鼠(圖11c)，表明鈣調(diào)蛋白酶-1支持iop升高后gcl中的細(xì)胞存活。為了進(jìn)一步評估wt和ko小鼠中iop誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷，在手術(shù)后0-3天，在wt小鼠和鈣蛋白酶-1ko小鼠的iop升高和假眼中進(jìn)行sd-oct。通常，wt和ko小鼠在第3天的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與第0天的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)略有不同(圖14a)。視網(wǎng)膜oct圖像中視網(wǎng)膜厚度的定量表明，與ko小鼠第0天相比，iop升高的眼睛第2天和第3天的視網(wǎng)膜厚度顯著降低，而wt小鼠的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖14b和c)，與wt小鼠相比，再次表明鈣蛋白酶-1ko小鼠視網(wǎng)膜損傷加重。

為了特異性地檢查c2i對構(gòu)成小鼠gcl18中細(xì)胞約40％的rgc的影響，用針對brn-3a的抗體(選擇性rgc標(biāo)記19(圖11d))對視網(wǎng)膜切片進(jìn)行免疫染色，該視網(wǎng)膜切片來自急性iop升高后的2小時(shí)注射了載體或c2i的wt小鼠。在注射載體的wt小鼠中，假手術(shù)和iop升高的眼的rgc計(jì)數(shù)分別為40.9±5.2和19.9±3.4個(gè)細(xì)胞/mm(p<0.01，假手術(shù)比iop，n＝4)。在注射c2i的wt小鼠中，假手術(shù)眼和iop升高的眼的rgc計(jì)數(shù)分別為45.2±5.0和37.1±2.5個(gè)細(xì)胞/mm(假手術(shù)比iop，n＝5)(圖11e)。與載體注射相比，注射c2i的rgc的存活率顯著改善(圖11f)，表明c2i全身注射保護(hù)rgc免受iop誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

為了探究鈣蛋白酶-1和鈣蛋白酶-2下游信號通路的性質(zhì)，在iop升高或假手術(shù)后3h收集wt、鈣蛋白酶-1ko和c2i注射的wt小鼠的視網(wǎng)膜，勻漿并等分處理western印跡(圖11g-h)。在wt小鼠中，phlpp1(鈣蛋白酶-1下游磷酸酶)水平顯著降低，而可以通過phlpp1去磷酸化的磷酸化aktser473(pakt)的水平在iop升高后顯著增加。在鈣蛋白酶-1ko小鼠中不存在phlpp1和pakt的這些變化，但存在于c2i注射的wt小鼠中，這表明鈣調(diào)蛋白酶-1而非鈣蛋白酶-2介導(dǎo)了iop升高后視網(wǎng)膜中的phlpp1降解和ak激活。step33，鈣蛋白酶-2介導(dǎo)的紋狀體富含蛋白酪氨酸磷酸酶切割(step)13的產(chǎn)物，存在于wt和鈣蛋白酶-1ko小鼠中，但不存在與iop增加后注射c2i的wt小鼠中，表明鈣蛋白酶-2而非鈣蛋白酶-1介導(dǎo)iop升高后的step切割。這些結(jié)果表明，在iop升高后，鈣蛋白酶-1/phlpp1/akt原始存活途徑和鈣蛋白酶-2/step前體死亡途徑13均存在于視網(wǎng)膜中，且c2i選擇性抑制鈣蛋白酶-2/step前體死亡途徑。

實(shí)施例12：玻璃體內(nèi)注射c2i降低gcl中的細(xì)胞死亡并防止由急性iop升高引起的視力喪失。我們使用玻璃體內(nèi)c2i注射，以便將c2i局部傳遞給視網(wǎng)膜。首先，我們在鈣蛋白酶-1ko小鼠iop升高后2小時(shí)玻璃體內(nèi)注射不同劑量的c2i并在4小時(shí)分析ipl中的sbdp水平來測試傳遞效率(圖12a和b)。觀察到明顯的劑量依賴性抑制sbdp形成，為c2i提供明顯的8μm的ic50。在所有隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用20μm(1μl)來檢查玻璃體內(nèi)c2i注射的神經(jīng)保護(hù)作用。手術(shù)后3天收集眼睛進(jìn)行h&e染色。載體注射后(10％dmso在pbs中)，假手術(shù)眼和iop升高眼的rgc計(jì)數(shù)為132.3±4.5和62.0±5.7個(gè)細(xì)胞/mm(p<0.001假手術(shù)比iop，n＝4)。在c2i處理的眼中，在假手術(shù)眼和iop升高眼的rgc計(jì)數(shù)為128.1±7.2和101.3±9.2個(gè)細(xì)胞/mm(無明顯差異，假手術(shù)對iop，n＝5)(圖12c和d)。與載體注射相比，c2i注射的生存率明顯改善(80.8±8.4％比47.2±5.4％，p<0.01)(圖5e)，表明iop升高后2h玻璃體內(nèi)c2i注射gcl中iop誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有神經(jīng)保護(hù)作用。

為了檢查青光眼后小鼠的視力，我們測試了小鼠中的視動反射(okr)(圖15a)。okr是由鼠眼前的光柵移動觸發(fā)的眼球運(yùn)動。改變光柵的頻率并確定觸發(fā)okr的最低頻率，允許分析每只眼睛的視力。在右眼(od)中進(jìn)行急性iop升高或假手術(shù)。左眼(os)作為原始的控制。手術(shù)后2小時(shí)進(jìn)行玻璃體內(nèi)c2i或車輛注射。術(shù)后3天和21天，確定兩眼的okr(圖5f、5g)。注射載體的假手術(shù)眼的視力在第3天為0.47±0.11cpd(平均±sem，n＝7)，第21天為0.41±0.16(n＝7)，與公布的結(jié)果20、21一致性良好。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加iop后，視力顯著降低，其通過c2i注射顯著改善。與載體注射相比，假手術(shù)眼睛的c2i注射不影響視力。在第21天的okr試驗(yàn)后處死小鼠，并用視網(wǎng)膜切片中的brn-3a免疫染色分析rgc密度(圖12h)。如預(yù)期的那樣，在載體注射的iop升高的眼中rgc密度顯著降低，但是在c2i注射的iop升高的眼中恢復(fù)。此外，視力與存活的rgc的數(shù)量高度相關(guān)(圖15b)，進(jìn)一步支持了增加iop后鈣蛋白酶-2在觸發(fā)rgc死亡中的突出作用。

實(shí)施例13：式1的非對映同種型具有非常不同的抑制活性

使用作為分離非對映同種型的公知方法的方法，將手性中心1為s-型并且手性中心2為s-型的式1a與s-r-形式(式1b)分離。式1a也稱為化合物18a，在本實(shí)例中以各種濃度引入到包含琥珀酰-亮氨酸-酪氨酸-amc和μ-鈣蛋白酶或m-鈣蛋白酶的體外混合物中(sasaki等人，1984)，并測定了每個(gè)鈣蛋白酶的熒光損失的動力學(xué)。對于μ-鈣蛋白酶，式1a的ki確定為對鈣蛋白酶-1為181±73nm，鈣蛋白酶-2的ki確定為7.8±2.5nm(參見表i)。相比之下，本文測定式1b(本文也稱為化合物18b)的ki對鈣蛋白酶-1的ki確定為514±151μm，且對鈣蛋白酶-2的ki確定為15.6±9.2μm。這表示兩種非對映同種型之間相對于抑制鈣蛋白酶-2的活性的意想不到的2000倍差異。

表1

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序列：

pten智人，seqidno1：

mtaiikeivsrnkrryqedgfdldltyiypniiamgfpaerlegvyrnniddvvrfldskhknhykiynlcaerhydtakfncrvaqypfedhnppqlelikpfcedldqwlseddnhvaaihckagkgrtgvmicayllhrgkflkaqealdfygevrtrdkkgvtipsqrryvyyysyllknhldyrpvallfhkmmfetipmfsggtcnpqfvvcqlkvkiyssnsgptrredkfmyfefpqplpvcgdikveffhkqnkmlkkdkmfhfwvntffipgpeetsekvengslcdqeidsicsieradndkeylvltltkndldkankdkanryfspnfkvklyftktveepsnpeassstsvtpdvsdnepdhyrysdttdsdpenepfdedqhtqitkv

μ-鈣蛋白酶智人，seqidno2：

mseeiitpvyctgvsaqvqkqrarelglgrhenaikylgqdyeqlrvrclqsgtlfrdeafppvpqslgykdlgpnssktygikwkrptellsnpqfivdgatrtdicqgalgdcwllaaiasltlndtllhrvvphgqsfqngyagifhfqlwqfgewvdvvvddllpikdgklvfvhsaegnefwsallekayakvngsyealsggstsegfedftggvtewyelrkapsdlyqiilkalergsllgcsidissvldmeaitfkklvkghaysvtgakqvnyrgqvvslirmrnpwgevewtgawsdsssewnnvdpyerdqlrvkmedgefwmsfrdfmreftrleicnltpdalksrtirkwnttlyegtwrrgstaggcrnypatfwvnpqfkirldetddpddygdresgcsfvlalmqkhrrrerrfgrdmetigfavyevppelvgqpavhlkrdfflanasrarseqfinlrevstrfrlppgeyvvvpstfepnkegdfvlrffseksagtvelddqiqanlpdeqvlseeeidenfkalfrqlagedmeisvkelrtilnriiskhkdlrtkgfslescrsmvnlmdrdgngklglvefnilwnrirnylsifrkfdldksgsmsayemrmaiesagfklnkklyeliitrysepdlavdfdnfvcclvrletmfrffktldtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶小家鼠，seqidno3：

mteelitpvyctgvsaqvqkkrdkelglgrhenaikylgqdyetlrarclqsgvlfqdeafppvshslgfkelgphssktygikwkrptelmsnpqfivdgatrtdicqgalgdcwllaaiasltlnetilhrvvpygqsfqdgyagifhfqlwqfgewvdvviddllptkdgklvfvhsaqgnefwsallekayakvngsyealsggctseafedftggvtewydlqkapsdlyqiilkalergsllgcsinisdirdleaitfknlvrghaysvtgakqvtyqgqrvnlirmrnpwgevewkgpwsdssyewnkvdpyereqlrvkmedgefwmsfrdfireftkleicnltpdalksrtlrnwnttfyegtwrrgstaggcrnypatfwvnpqfkirleevddaddydnresgcsfllalmqkhrrrerrfgrdmetigfavyqvprelagqpvhlkrdfflanasraqsehfinlrevsnrirpppgeyivvpstfepnkegdfllrffsekkagtqelddqiqanlpdekvlseeeiddnfktlfsklagddmeisvkelqtilnriiskhkdlrtngfslescrsmvnlmdrdgngklglvefnilwnrirnyltifrkfdldksgsmsayemrmaieaagfklnkklheliitrysepdlavdfdnfvcclvrletmfrffklldtdlngvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶，牛.seqidno：4

maeefitpvyctgvsaqvqkqrakelglgrhenaikylgqdyeqlrvhclqrgalfrdeafppvpqslgfkelgpnssktygikwkrptelfsnpqfivdgatrtdicqgalgdcwllaaiasltlndtllhrvvphgqsfqdgyagifhfqlwqfgevvvdvvvddllptkdgklvfvhsaqgnefwsallekayakvngsyealsggstsegfedftggvtewyelrkapsdlyniilkalergsllgcsidissildmeavtfkklvkghaysvtgakqvnyqgqmvnlirmrnpwgevewtgawsdgssewngvdpymreqlrvkmedgefwmsfrdfmreftrleicnltpdalksqrfrnwnttlyegtwrrgstaggcrnypatfwvnpqfkirleetddpdpddyggresgcsfllalmqkhrrrerrfgrdmetigfavyevppelmgqpavhlkrdfflsnasrarseqfinlrevstrfrlppgeyvvvpstfepnkegdfvlrffseksagtqelddqvqanlpdeqvlseeeidenfkslfrqlagedmeisvkelrtilnriiskhkdlrttgfslescrsmvnlmdrdgngklglvefnilwnrirnylsifrkfdldksgsmsayemrmaiefagfklnkklyeliitrysepdlavdfdnfvcclvrletmfrffktldtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶，褐家鼠.seqidno：5

maeelitpvyctgvsaqvqkqrdkelglgrhenaikylgqdyenlrarclqngvlfqddafppvshslgfkelgpnssktygikwkrptellsnpqfivdgatrtdicqgalgdcwllaaiasltlnetilhrvvpygqsfqegyagifhfqlwqfgewvdvvvddllptkdgklvfvhsaqgnefwsallekayakvngsyealsggctseafedftggvtewydlqkapsdlyqiilkalergsllgcsinisdirdleaitfknlvrghaysvtdakqvtyqgqrvnlirmrnpwgevewkgpwsdnsyewnkvdpyereqlrvkmedgefwmsfrdfireftkleicnltpdalksrtlrnwnttfyegtwrrgstaggcrnypatfwvnpqfkirleevddaddydsresgcsfllalmqkhrrrerrfgrdmetigfavyqvprelagqpvhlkrdfflanasraqsehfinlrevsnrirlppgeyivvpstfepnkegdfllrffsekkagtqelddqiqanlpdekvlseeeiddnfktlfsklagddmeisvkelqtilnriiskhkdlrtngfslescrsmvnlmdrdgngklglvefnilwnrirnyltifrkfdldksgsmsayemrmaieaagfklnkklheliitrysepdlavdfdnfvcclvrletmfrffkildtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶，野豬.seqidno：6

maeevitpvyctgvsaqvqklrakelglgrhenaikylgqdyeqlrahclqsgslfrdeafppvpqslgfkelgpnssktygvkwkrptelfsnpqfivdgatrtdicqgalgdcwllaaiasltlndtllhrvvphgqsfqngyagifhfqlwqfgewvdvvvddllptkdgklvfvhsaqgnefwsallekayakvngsyealsggstsegfedftggvtewyelrkapsdlysiilkalergsllgcsidissvldmeavtfkklvkghaysvtgakqvnyqgqmvnlirmrnpwgevewtgawsdgssewngvdpyqrdqlrvrmedgefwmsfrdflreftrleicnltpdalksqrvrnwnttlyegtwrrgstaggcrnypatfwvnpqfkirleetddpeddyggresgcsfvlalmqkhrrrerrfgrdmetigfavyevppelvgqpvhlkrdfflanasrarseqfinlrevstrfrlppgeyvvvpstfepnkegdfvlrffsekkagtqelddqvqailpdeqvlseeeidenfkalfrqlagedmeisvrelrtilnriiskhkdlrtkgfslescrsmvnlmdrdgngklglvefnilwnrirnylsifrkfdldksgsmsayemrmaiesagfklnkklfeliitrysepdlavdfdnfvcclvrletmfrffktldtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno7：ldtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno8：dtdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno9：tdldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno10：dldgvvtfdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno11：ldgvvtfdlfkwlqltmfa

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μ-鈣蛋白酶片段，seqidno15：vtfdlfkwlqltmfa

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μ-鈣蛋白酶片段，seqidno17：fdlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno18：dlfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno19：lfkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno20：fkwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno21：kwlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno22：wlqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno23：lqltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno24：qltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno25：ltmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno26：tmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno27：ldtdldgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno28：dtdldgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno29：tdldgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno30：dldgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno31：ldgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidn032：dgvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno33：gvvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno34：vvtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno35：vtfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno36：tfdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno37：fdlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno38：dlfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno39：lfkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno40：fkwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno41：kwlqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno42：wlqldmfa

u-鈣蛋白酶片段，seqidno43：lqldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno44：qldmfa

u-鈣蛋白酶片段，seqidno45：ldmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno46：ldtdldgvvtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno47：dtdldgvvtfdlfkwlqlemfa

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μ-鈣蛋白酶片段，seqidno50：ldgvvtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno51：dgvvtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno52：gvvtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno53：vvtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno54：vtfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno55：tfdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno56：fdlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno57：dlfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno58：lfkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno59：fkwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno60：kwlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno61：wlqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno62：lqlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno63：qlemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno64：lemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno65：emfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno66：dmfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno67：lemfa

μ-鈣蛋白酶片段，seqidno68：ldmfa

m-鈣蛋白酶.智人，seqidno69：

magiaaklakdreaaeglgsheraikylnqdyealrnecleagtlfqdpsfpaipsalgfkelgpyssktrgiewkrpteicadpqfiiggatrtdicqgalgdcwllaaiasltlneeilarvvplnqsfqenyagifhfqfwqygewvevvvddrlptkdgellfvhsaegsefwsallekayakingcyealsggattegfedftggiaewyelkkpppnlfkiiqkalqkgsllgcsiditsaadseaitfqklvkghaysvtgaeevesngslqklirirnpwgevewtgrwndncpswntidpeererltrrhedgefwmsfsdflrhysrleicnltpdtltsdtykkwkltkmdgnwrrgstaggcrnypntfwmnpqylikleeededeedgesgctflvgliqkhrrrqrkmgedmhtigfgiyevpeelsgqtnihlsknffltnrarersdtfinlrevlnrfklppgeyilvpstfepnkdgdfcirvfsekkadyqavddeieanleefdiseddiddgfrrlfaqlagedaeisafelqtilrrvlakrqdiksdgfsietckimvdmldsdgsgklglkefyilwtkiqkyqkiyreidvdrsgtmnsyemrkaleeagfkmpcqlhqvivarfaddqliidfdnfvrclvrletlfkifkqldpentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶小家鼠.seqidno70：

magiaiklakdreaaeglgsheraikylnqdyetlrnecleagalfqdpsfpalpsslgykelgpyssktrgiewkrpteicadpqfiiggatrtdicqgalgdcwllaaiasltlneeilarvvppdqsfqenyagifhfqfwqygewvevvvddrlptkdgellfvhsaegsefwsallekayakingcyetlsggattegfedftggiaewyelrkpppnlfkiiqkalekgsllgcsiditsaadseavtyqklvkghaysvtgaeevessgslqklirirnpwgqvewtgkwndncpswntvdpevranlterqedgefwmsfsdflrhysrleicnltpdtltcdsykkwkltkmdgnwrrgstaggcrnypntfwmnpqylikleeededeedggrgctflvgliqkhrrrqrkmgedmhtigfgiyevpeeltgqtnihlgknfflttrarersdtfinlrevlnrfklppgeyvlvpstfephkdgdfcirvfsekkadyqavddeieanieeidaneediddgfrrlfvqlagedaeisafelqtilrrvlakrqdiksdgfsietckimvdmldedgsgklglkefyilwtkiqkyqkiyreidvdrsgtmnsyemrkaleeagfklpcqlhqvivarfaddeliidfdnfvrclvrletlfkifkqldpentgtiqlnlaswlsfsvl

m-鈣蛋白酶野豬，seqidno71：

magiaaklakdreaaeglgsheravkylnqdyaelrdqcleagalfqdpsfpalpsslgfkelgpysgktrgiewkrpteicdnpqfiiggatrtdicqgalgdcwllaaiasltlneevlarvvpldqsfqenyagifrfqfwqygewvevvvddrlptkdgellfvhsaegsefwsallekayakingcyealsggattegfedftggiaewyelrkappnlfkiiqkalqkgsllgcsiditsaadseavtfqklvkghaysvtgaeevesrgslqklirirnpwgevewtgqwndncpnwntvdpevresltrrhedgefwmsfsdflrhysrleicnltpdtltsdsykkwkltkmdgnwrrgstaggcrnypntfwmnpqylikleeededqedgesgctflvgliqkhrrrqrkmgedmhtigfgiyevpeeltgqtnihlsknfflthrarersdtfinlrevlnrfklppgeyilvpstfepnkdgdfcirvfsekkadyqvvddeieadleendaseddiddgfrrlfaqlagedaeisafelqtilrrvlakrqdiksdgfsietckimvdmldsdgsaklglkefyilwtkiqkyqkiyreidvdrsgtmnsyemrkaleeagfklpcqlhqvivarfaddqliidfdnfvrclvrletlfriskqldsentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶褐家鼠seqidno72：

magiamklakdreaaeglgsheraikylnqdyetlrnecleagalfqdpsfpalpsslgfkelgpyssktrgiewkrpteicadpqfiiggatrtdicqgalgdcwllaaiasltlneeilarvvpldqsfqenyagifhfqfwqygewvevvvddrlptkdgellfvhsaegsefwsallekayakingcyealsggattegfedftggiaewyelrkpppnlfkiiqkalekgsllgcsiditsaadseavtyqklvkghaysvtgaeevessgslqklirirnpwgqvewtgkwndncpswntvdpevranlterqedgefwmsfsdflrhysrleicnltpdtltcdsykkwkltkmdgnwrrgstaggcrnypntfwmnpqylikleeededdedgergctflvgliqkhrrrqrkmgedmhtigfgiyevpeeltgqtnihlsknfflttrarersdtfinlrevlnrfklppgeyvlvpstfephkngdfcirvfsekkadyqtvddeieanieeieaneedigdgfrrlfaqlagedaeisafelqtilrrvlakrediksdgfsietckimvdmldedgsgklglkefyilwtkiqkyqkiyreidvdrsgtmnsyemrkaleeagfklpcqlhqvivarfaddeliidfdnfvrclvrleilfkifkqldpentgtiqldliswlsfsvl

m-鈣蛋白酶牛.seqidno73：

magiaaklakdreaaeglgsheravkylnqdyaalrdecleagalfqdpsfpalpsslgfkelgpyssktrgiewkrpteicdnpqfitggatrtdicqgalgdcwllaaiasltlneeilarvvpldqsfqenyagifhfqfwqygewvevvvddrlptkdgellfvhsaegsefwsallekayakingcyealsggattegfedftggiaewyelrkappnlfriiqkalqkgsllgcsiditsaadseaitfqklvkghaysvtgaeevesrgslqklirirnpwgevewtgqwndncpnwntvdpevretltrqhedgefwmsfndflrhysrleicnltpdtltsdsykkwkltkmdgnwrrgstaggcrnypntfwmnpqylikleeededqedgesgctflvgliqkhrrrqrkmgedmhtigfgiyevpeeltgqtnihlskkfflttrarersdtfinlrevlnrfklppgeyivvpstfepnkdgdfcirvfsekkadyqvvddeieanideidiseddiddgfrrlfaqlagedaeisafelqtilrrvlakrqdiksdgfsietckimvdmldsdgsgklglkefyilwtkiqkyqkiyreidvdrsgtmnsyemrkaleeagfkmpcqlhqvivarfadddliidfdnfvrclirletlfrifkqldpentgmiqldliswlsfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno74：kqldpentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno75：qldpentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno76：ldpentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno77：dpentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno78：pentgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno79：entgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno80：ntgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno81：tgtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno82：gtieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno83：tieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno84：ieldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno85：ieldliswlcfdvl

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m-鈣蛋白酶片段，seqidno87：eldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno88：ldliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno89：dliswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno90：ldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno91：ldliswlcfevl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno92：liswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno93：iswlcfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno94：kqldpentgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno95：qldpentgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno96：ldpentgtieldllswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno97：dpentgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno98：pentgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno99：entgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno100：ntgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno101：tgtieldliswlcfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno102：gtieldliswlcfdvl

m鈣蛋白酶片段，seqidno103：tieldliswlcfdvl

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m-鈣蛋白酶片段，seqidno115：ntgtieldliswlcfevl

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m-鈣蛋白酶片段，seqidno138：lcfdvl

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m-鈣蛋白酶片段，seqidno140：cfsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno141：cfdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno142：cfevl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno143：fsvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno144：fdvl

m-鈣蛋白酶片段，seqidno145：fevl

磷酸酶結(jié)構(gòu)域和脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的連接

pten片段，seqidno146：ipsqrryvyyysyllknhldyrpv

下劃線為α-螺旋；藍(lán)色是暴露的接頭；紅色是m-鈣蛋白酶切割位點(diǎn)

eradndkeylvltltkndldkankdkanryfspnfkvklyftktveepsnpe

下劃線為脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域：紅色為m-鈣蛋白酶切割位點(diǎn)

膜轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

7-mer，seqidno194：-rrmkwkk-

運(yùn)輸seqidno195：-gwtlnsagyllgkinlkalaalakisil-amidepenatrin，seqidno196：-rqikiwfqnrrmkwkk-

聚精氨酸，seqidno197：-rrrrrrrrrr-

map，seqidno198：-lliilrrrirkqahahsk-

rdp，seqidno199：-ksvrtwneiipskgclrvggrchphvngggrrrrrrrrr-hiv-tatseqidno200：-rkkrrqrrr

更多的pten衍生的m-鈣蛋白酶選擇性多肽

seqidno201：nryfspnfkvklyftktveepsnp

seqidno202：ryfspnfkvklyftktveepsnp

seqidno203：ryfspnfkvklyftktveepsn

seqidno204：yfspnfkvklyftktveepsn

seqidno205：yfspnfkvklyftktveeps

seqidno206：fspnfkvklyftktveeps

seqidno207：fspnfkvklyftktveep

seqidno208：spnfkvklyftktveep

seqidno209：spnfkvklyftktvee

seqidno210：pnfkvklyftktvee

seqidno211：pnfkvklyftktve

seqidno212：nfkvklyftktve

seqidno213：nfkvklyftktv

seqidno214：fkvklyftktv

seqidno215：fkvklyftkt

seqidno216：kvklyftkt

seqidno217：kvklyftk

seqidno218：vklyftk

seqidno219：vklyft

seqidno220：klyft

seqidno221：klyf

seqidno222：lyf

序列表

<110>健康科學(xué)西部大學(xué)（westernuniversityofhealthsciences）

<120>同種型特異性鈣蛋白酶抑制劑及其識別方法和用途

<130>029.0028-wo01

<160>221

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>403

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

metthralaileilelysgluilevalserargasnlysargargtyr

151015

glngluaspglypheaspleuaspleuthrtyriletyrproasnile

202530

ilealametglypheproalagluargleugluglyvaltyrargasn

354045

asnileaspaspvalvalargpheleuaspserlyshislysasnhis

505560

tyrlysiletyrasnleucysalagluarghistyraspthralalys

65707580

pheasncysargvalalaglntyrprophegluasphisasnpropro

859095

glnleugluleuilelysprophecysgluaspleuaspglntrpleu

100105110

sergluaspaspasnhisvalalaalailehiscyslysalaglylys

115120125

glyargthrglyvalmetilecysalatyrleuleuhisargglylys

130135140

pheleulysalaglnglualaleuaspphetyrglygluvalargthr

145150155160

argasplyslysglyvalthrileproserglnargargtyrvaltyr

165170175

tyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasptyrargprovalala

180185190

leuleuphehislysmetmetphegluthrileprometphesergly

195200205

glythrcysasnproglnphevalvalcysglnleulysvallysile

210215220

tyrserserasnserglyprothrargarggluasplysphemettyr

225230235240

pheglupheproglnproleuprovalcysglyaspilelysvalglu

245250255

phephehislysglnasnlysmetleulyslysasplysmetphehis

260265270

phetrpvalasnthrphepheileproglyproglugluthrserglu

275280285

lysvalgluasnglyserleucysaspglngluileaspserilecys

290295300

serilegluargalaaspasnasplysglutyrleuvalleuthrleu

305310315320

thrlysasnaspleuasplysalaasnlysasplysalaasnargtyr

325330335

pheserproasnphelysvallysleutyrphethrlysthrvalglu

340345350

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355360365

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385390395400

thrlysval

<210>2

<211>714

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>2

metserglugluileilethrprovaltyrcysthrglyvalserala

151015

glnvalglnlysglnargalaarggluleuglyleuglyarghisglu

202530

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354045

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505560

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65707580

tyrglyilelystrplysargprothrgluleuleuserasnprogln

859095

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100105110

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115120125

thrleuleuhisargvalvalprohisglyglnserpheglnasngly

130135140

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145150155160

aspvalvalvalaspaspleuleuproilelysaspglylysleuval

165170175

phevalhisseralagluglyasngluphetrpseralaleuleuglu

180185190

lysalatyralalysvalasnglysertyrglualaleuserglygly

195200205

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210215220

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245250255

valleuaspmetglualailethrphelyslysleuvallysglyhis

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325330335

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340345350

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thrleutyrgluglythrtrpargargglyserthralaglyglycys

370375380

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385390395400

leuaspgluthraspaspproaspasptyrglyaspargglusergly

405410415

cysserphevalleualaleumetglnlyshisargargarggluarg

420425430

argpheglyargaspmetgluthrileglyphealavaltyrgluval

435440445

proprogluleuvalglyglnproalavalhisleulysargaspphe

450455460

pheleualaasnalaserargalaargsergluglnpheileasnleu

465470475480

arggluvalserthrargpheargleuproproglyglutyrvalval

485490495

valproserthrphegluproasnlysgluglyaspphevalleuarg

500505510

phepheserglulysseralaglythrvalgluleuaspaspglnile

515520525

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530535540

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545550555560

ileservallysgluleuargthrileleuasnargileileserlys

565570575

hislysaspleuargthrlysglypheserleuglusercysargser

580585590

metvalasnleumetaspargaspglyasnglylysleuglyleuval

595600605

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610615620

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675680685

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690695700

phelystrpleuglnleuthrmetpheala

705710

<210>3

<211>713

<212>prt

<213>小家鼠

<400>3

metthrglugluleuilethrprovaltyrcysthrglyvalserala

151015

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202530

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serhisserleuglyphelysgluleuglyprohisserserlysthr

65707580

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thrileleuhisargvalvalprotyrglyglnserpheglnaspgly

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tyralaglyilephehispheglnleutrpglnpheglyglutrpval

145150155160

aspvalvalileaspaspleuleuprothrlysaspglylysleuval

165170175

phevalhisseralaglnglyasngluphetrpseralaleuleuglu

180185190

lysalatyralalysvalasnglysertyrglualaleuserglygly

195200205

cysthrserglualaphegluaspphethrglyglyvalthrglutrp

210215220

tyraspleuglnlysalaproseraspleutyrglnileileleulys

225230235240

alaleugluargglyserleuleuglycysserileasnileserasp

245250255

ileargaspleuglualailethrphelysasnleuvalargglyhis

260265270

alatyrservalthrglyalalysglnvalthrtyrglnglyglnarg

275280285

valasnleuileargmetargasnprotrpglygluvalglutrplys

290295300

glyprotrpseraspsersertyrglutrpasnlysvalaspprotyr

305310315320

gluarggluglnleuargvallysmetgluaspglygluphetrpmet

325330335

serpheargasppheilearggluphethrlysleugluilecysasn

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370375380

argasntyrproalathrphetrpvalasnproglnphelysilearg

385390395400

leuglugluvalaspaspalaaspasptyraspasnargglusergly

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cysserpheleuleualaleumetglnlyshisargargarggluarg

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proarggluleualaglyglnprovalhisleulysargaspphephe

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proserthrphegluproasnlysgluglyasppheleuleuargphe

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565570575

lysaspleuargthrasnglypheserleuglusercysargsermet

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<212>prt

<213>牛

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385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

gluvalproprogluleumetglyglnproalavalhisleulysarg

450455460

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465470475480

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485490495

valvalvalproserthrphegluproasnlysgluglyasppheval

500505510

leuargphepheserglulysseralaglythrglngluleuaspasp

515520525

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530535540

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545550555560

metgluileservallysgluleuargthrileleuasnargileile

565570575

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580585590

argsermetvalasnleumetaspargaspglyasnglylysleugly

595600605

leuvalglupheasnileleutrpasnargileargasntyrleuser

610615620

ilephearglyspheaspleuasplysserglysermetseralatyr

625630635640

glumetargmetalailegluphealaglyphelysleuasnlyslys

645650655

leutyrgluleuileilethrargtyrsergluproaspleualaval

660665670

asppheaspasnphevalcyscysleuvalargleugluthrmetphe

675680685

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aspleuphelystrpleuglnleuthrmetpheala

705710715

<210>5

<211>713

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>5

metalaglugluleuilethrprovaltyrcysthrglyvalserala

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100105110

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115120125

thrileleuhisargvalvalprotyrglyglnserpheglnglugly

130135140

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145150155160

aspvalvalvalaspaspleuleuprothrlysaspglylysleuval

165170175

phevalhisseralaglnglyasngluphetrpseralaleuleuglu

180185190

lysalatyralalysvalasnglysertyrglualaleuserglygly

195200205

cysthrserglualaphegluaspphethrglyglyvalthrglutrp

210215220

tyraspleuglnlysalaproseraspleutyrglnileileleulys

225230235240

alaleugluargglyserleuleuglycysserileasnileserasp

245250255

ileargaspleuglualailethrphelysasnleuvalargglyhis

260265270

alatyrservalthraspalalysglnvalthrtyrglnglyglnarg

275280285

valasnleuileargmetargasnprotrpglygluvalglutrplys

290295300

glyprotrpseraspasnsertyrglutrpasnlysvalaspprotyr

305310315320

gluarggluglnleuargvallysmetgluaspglygluphetrpmet

325330335

serpheargasppheilearggluphethrlysleugluilecysasn

340345350

leuthrproaspalaleulysserargthrleuargasntrpasnthr

355360365

thrphetyrgluglythrtrpargargglyserthralaglyglycys

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argasntyrproalathrphetrpvalasnproglnphelysilearg

385390395400

leuglugluvalaspaspalaaspasptyraspserargglusergly

405410415

cysserpheleuleualaleumetglnlyshisargargarggluarg

420425430

argpheglyargaspmetgluthrileglyphealavaltyrglnval

435440445

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450455460

leualaasnalaserargalaglnsergluhispheileasnleuarg

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<210>6

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<212>prt

<213>野豬

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ala

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151015

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protyrserserlysthrargglyileglutrplysargprothrglu

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ilecysglnglyalaleuglyaspcystrpleuleualaalaileala

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glnserpheglngluasntyralaglyilephehispheglnphetrp

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glntyrglyglutrpvalgluvalvalvalaspaspargleuprothr

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<211>700

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<213>小家鼠

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<213>野豬

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<213>褐家鼠

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<213>牛

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<400>101

thrglythrilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspval

151015

leu

<210>102

<211>16

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>102

glythrilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

151015

<210>103

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>103

thrilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

151015

<210>104

<211>14

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>104

ilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>105

<211>14

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>105

ilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>106

<211>13

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>106

gluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>107

<211>12

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>107

leuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>108

<211>11

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>108

aspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>109

<211>24

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>109

lysglnleuaspprogluasnthrglythrilegluleuaspleuile

151015

sertrpleucysphegluvalleu

20

<210>110

<211>23

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>110

glnleuaspprogluasnthrglythrilegluleuaspleuileser

151015

trpleucysphegluvalleu

20

<210>111

<211>22

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>111

leuaspprogluasnthrglythrilegluleuaspleuilesertrp

151015

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20

<210>112

<211>21

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>112

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151015

cysphegluvalleu

20

<210>113

<211>20

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>113

progluasnthrglythrilegluleuaspleuilesertrpleucys

151015

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20

<210>114

<211>19

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>114

gluasnthrglythrilegluleuaspleuilesertrpleucysphe

151015

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<210>115

<211>18

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>115

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151015

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<210>116

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>116

thrglythrilegluleuaspleuilesertrpleucyspheaspval

151015

leu

<210>117

<211>16

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>117

glythrilegluleuaspleuilesertrpleucysphegluvalleu

151015

<210>118

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>118

thrilegluleuaspleuilesertrpleucysphegluvalleu

151015

<210>119

<211>14

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>119

ilegluleuaspleuilesertrpleucysphegluvalleu

1510

<210>120

<211>14

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>120

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1510

<210>121

<211>13

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>121

gluleuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>122

<211>12

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>122

leuaspleuilesertrpleucyspheaspvalleu

1510

<210>123

<211>11

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>123

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1510

<210>124

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>124

leuilesertrpleucyspheservalleu

1510

<210>125

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>125

ilesertrpleucyspheservalleu

15

<210>126

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>126

ilesertrpleucyspheaspvalleu

15

<210>127

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>127

ilesertrpleucysphegluvalleu

15

<210>128

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>128

sertrpleucyspheservalleu

15

<210>129

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>129

sertrpleucyspheaspvalleu

15

<210>130

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>130

sertrpleucysphegluvalleu

15

<210>131

<211>7

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>131

trpleucyspheservalleu

15

<210>132

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>132

ilesertrpleucyspheaspvalleu

15

<210>133

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>133

ilesertrpleucysphegluvalleu

15

<210>134

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>134

sertrpleucyspheservalleu

15

<210>135

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>135

sertrpleucyspheaspvalleu

15

<210>136

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>136

sertrpleucysphegluvalleu

15

<210>137

<211>7

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>137

trpleucyspheservalleu

15

<210>138

<211>6

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>138

leucyspheaspvalleu

15

<210>139

<211>6

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>139

leucysphegluvalleu

15

<210>140

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>140

cyspheservalleu

15

<210>141

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>141

cyspheaspvalleu

15

<210>142

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>142

cysphegluvalleu

15

<210>143

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>143

pheservalleu

1

<210>144

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>144

pheaspvalleu

1

<210>145

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>145

phegluvalleu

1

<210>146

<211>24

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>146

ileproserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulys

151015

asnhisleuasptyrargproval

20

<210>147

<211>22

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>147

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleuasptyrargpro

20

<210>148

<211>22

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>148

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleuasptyrargpro

20

<210>149

<211>21

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>149

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleuasptyrarg

20

<210>150

<211>20

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>150

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleuasptyr

20

<210>151

<211>18

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>151

serglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhis

151015

leuasp

<210>152

<211>19

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>152

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleuasp

<210>153

<211>18

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>153

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

hisleu

<210>154

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>154

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

his

<210>155

<211>16

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>155

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

151015

<210>156

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>156

proserglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulys

151015

<210>157

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>157

serglnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhis

151015

leu

<210>158

<211>16

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>158

glnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhisleu

151015

<210>159

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>159

glnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhis

151015

<210>160

<211>14

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>160

glnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasn

1510

<210>161

<211>13

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>161

glnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulys

1510

<210>162

<211>12

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>162

argargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulys

1510

<210>163

<211>18

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>163

glnargargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhisleu

151015

asptyr

<210>164

<211>17

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>164

argargtyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasp

151015

tyr

<210>165

<211>15

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>165

tyrvaltyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasptyr

151015

<210>166

<211>13

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>166

tyrtyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasptyr

1510

<210>167

<211>12

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>167

tyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasptyr

1510

<210>168

<211>11

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>168

tyrsertyrleuleulysasnhisleuasptyr

1510

<210>169

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>169

sertyrleuleulysasnhisleuasptyr

1510

<210>170

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>170

tyrleuleulysasnhisleuasptyr

15

<210>171

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>171

leuleulysasnhisleuasptyr

15

<210>172

<211>11

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>172

tyrtyrsertyrleuleulysasnhisleuasp

1510

<210>173

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>173

tyrsertyrleuleulysasnhisleu

15

<210>174

<211>7

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>174

sertyrleuleulysasnhis

15

<210>175

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>175

tyrleuleulysasn

15

<210>176

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>176

tyrleuleulysasnhisleuasp

15

<210>177

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>177

tyrleuleulys

1

<210>178

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>178

leuleulysasn

1

<210>179

<211>52

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>179

gluargalaaspasnasplysglutyrleuvalleuthrleuthrlys

151015

asnaspleuasplysalaasnlysasplysalaasnargtyrpheser

202530

proasnphelysvallysleutyrphethrlysthrvalgluglupro

354045

serasnproglu

50

<210>180

<211>25

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>180

asnargtyrpheserproasnphelysvallysleutyrphethrlys

151015

thrvalglugluproserasnproglu

2025

<210>181

<211>41

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>181

lysglutyrleuvalleuthrleuthrlysasnaspleuasplysala

151015

asnlysasplysalaasnargtyrpheserproasnphelysvallys

202530

leutyrphethrlysthrvalgluglu

3540

<210>182

<211>25

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>182

gluargalaaspasnasplysglutyrleuvalleuthrleuthrlys

151015

asnaspleuasplysalaasnlysasp

2025

<210>183

<211>12

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>183

lysglutyrleuvalleuthrleuthrlysasnasp

1510

<210>184

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>184

glutyrleuvalleuthrleuthrlysasn

1510

<210>185

<211>9

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>185

glutyrleuvalleuthrleuthrlys

15

<210>186

<211>10

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>186

lysglutyrleuvalleuthrleuthrlys

1510

<210>187

<211>8

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>187

tyrleuvalleuthrleuthrlys

15

<210>188

<211>6

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>188

leuvalleuthrleuthr

15

<210>189

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>189

valleuthrleuthr

15

<210>190

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>190

valleuthrleu

1

<210>191

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>191

leuthrleuthr

1

<210>192

<211>5

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>192

glutyrleuvalleu

15

<210>193

<211>4

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>193

glutyrleuval

1

<210>194

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>7-mer

<400>194

argargmetlystrplyslys

15

<210>195

<211>33

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>運(yùn)輸

<400>195

glytrpthrleuasnseralaglytyrleuleuglylysileasnleu

151015

lysalaleualaalaleualalysileserileleualametileasp

202530

glu

<210>196

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>penatrin

<400>196

argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys

151015

<210>197

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>聚精氨酸

<400>197

argargargargargargargargargarg

1510

<210>198

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>map

<400>198

leuleuileileleuargargargilearglysglnalahisalahis

151015

serlys

<210>199

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rdp

<400>199

lysservalargthrtrpasngluileileproserlysglycysleu

151015

argvalglyglyargcyshisprohisvalasnglyglyglyargarg

202530

argargargargargargarg

35

<210>200

<211>9

<212>prt

<213>人免疫缺陷病毒

<400>200

arglyslysargargglnargargarg

15

<210>201

<211>24

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>201

asnargtyrpheserproasnphelysvallysleutyrphethrlys

151015

thrvalglugluproserasnpro

20

<210>202

<211>23

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>202

argtyrpheserproasnphelysvallysleutyrphethrlysthr

151015

valglugluproserasnpro

20

<210>203

<211>22

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>203

argtyrpheserproasnphelysvallysleutyrphethrlysthr

151015

valglugluproserasn

20

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20

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<213>智人（homosapiens）

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20

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<213>智人（homosapiens）

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151015

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<213>智人（homosapiens）

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