本申請(qǐng)要求于2015年4月24日提交的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)第PCT/US2015/027503號(hào)和于2015年5月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第62/156,833號(hào)的權(quán)益，其為了所有目的通過(guò)引用在此被并入，如同在本文充分陳述一樣。

發(fā)明背景

由于角膜炎、圓錐角膜(keratoconus)、其他疾病和損傷，今天世界上大量人口患有角膜失明(corneal blindness)。但是，由于供體角膜的有限的可獲得性，特別是在亞洲和非洲的發(fā)展中區(qū)域，不是所有個(gè)體都可以接受治療。

以下是現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的簡(jiǎn)述?，F(xiàn)有的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)包括現(xiàn)在可獲得的最佳角膜置換的供體角膜。但是，存在可獲得性、保存和分配的問(wèn)題。在臨床中也存在合成角膜或人工角膜(keratoprosthesis)諸如Boston Kpro或AlphaCor。但是，盡管它們可以成功地矯正受損角膜的屈光性質(zhì)，它們是基于合成的聚合物的，并且不支持組織重建或生物整合，引起并發(fā)癥。在臨床試驗(yàn)中存在生物工程角膜，諸如碳二亞胺交聯(lián)的RHCIII。這些顯示出廣闊的前景。但是，這些材料具有低縫合性和與角膜不匹配的膠原組織超微結(jié)構(gòu)(圖8)。

在角膜中觀察到的常規(guī)膠原組裝體中，存在大量蛋白聚糖諸如輔助三螺旋形成、原纖維排列和組織的核心蛋白聚糖(decorin)和光蛋白聚糖(lumican)。我們想在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境使用可以充當(dāng)人工伴侶蛋白并可以提供這些相同功能的分子重復(fù)此結(jié)果。發(fā)明人早期專(zhuān)注于將環(huán)糊精作為此類(lèi)分子(圖12)——在PCT/US2015/027503中詳述的根據(jù)環(huán)中的葡萄糖單體的數(shù)量分類(lèi)的小型環(huán)狀寡糖，該申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。之前，這些已經(jīng)在癌癥治療和用于藥物遞送的其他應(yīng)用被使用，并且被認(rèn)為是非常安全且生物相容的。

環(huán)糊精(CD)是包含6至8個(gè)葡萄糖分子的環(huán)的環(huán)狀寡聚物的家族。這些環(huán)狀分子的特征是可以與小分子或大的化合物的部分形成復(fù)合物的內(nèi)部疏水核和外部親水環(huán)。天然環(huán)糊精的溶解性非常差，并且起初這阻止環(huán)糊精成為有效的絡(luò)合劑。在20世紀(jì)60年代末，發(fā)現(xiàn)在2-、3-和6-羥基位點(diǎn)的化學(xué)取代將極大增強(qiáng)溶解性?；瘜W(xué)取代的程度和用于取代的基團(tuán)的性質(zhì)決定了環(huán)糊精在水性介質(zhì)中的最終的最大濃度。大多數(shù)化學(xué)改性的環(huán)糊精在水中能夠達(dá)到50％(w/v)濃度。另外，在羥基基團(tuán)的取代和反應(yīng)可以通過(guò)例如將該基團(tuán)轉(zhuǎn)化為酸、胺或其它來(lái)提供額外的官能度。另外，在羥基基團(tuán)的取代和反應(yīng)可以通過(guò)例如將該基團(tuán)轉(zhuǎn)化為酸、胺或其它來(lái)提供額外的官能度。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是由蛋白、蛋白聚糖和其他可溶性分子組成的復(fù)雜的大分子混合物。膠原(動(dòng)物中最豐富的蛋白)在多種生物應(yīng)用中被廣泛應(yīng)用。然而，由于獲得大量純化的蛋白聚糖的困難，對(duì)工程化包含膠原和蛋白聚糖二者的ECM支架做出了很少的努力。在天然角膜中，蛋白聚糖通過(guò)調(diào)節(jié)膠原原纖維(fibril)直徑和間距在角膜透明度中起至關(guān)重要的作用。因此，仍存在對(duì)蛋白聚糖的替代物的需求，以開(kāi)發(fā)仿生的基于膠原的ECM來(lái)解決與臨床應(yīng)用諸如角膜再生相關(guān)的富有挑戰(zhàn)的問(wèn)題。

發(fā)明概述

根據(jù)公開(kāi)的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于制備真正的角膜仿生結(jié)構(gòu)的組合物和方法。角膜是由上皮層和內(nèi)皮層組成的透明的多層組織，最厚的區(qū)域是角膜基質(zhì)(corneal stroma)，角膜基質(zhì)的大部分是基于膠原I的細(xì)胞外基質(zhì)，稀少地分布有角膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)可能的策略是開(kāi)發(fā)聚焦于復(fù)制基質(zhì)、之后可以增加其它層的角膜仿生物。然后，該復(fù)制的基質(zhì)被用作制造基于膠原的角膜植入物的基底，所述角膜植入物可以被調(diào)節(jié)以自組裝成角膜仿生結(jié)構(gòu)。目的是模仿天然健康角膜的超微結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種組合物或膜，所述組合物或膜包含排列的原纖維，所述排列的原纖維包含膠原和環(huán)糊精。組合物或膜可以包含玻璃化的基質(zhì)凝膠的排列的原纖維，所述玻璃化的基質(zhì)凝膠包含膠原和環(huán)糊精。

排列的原纖維與更隨機(jī)的取向截然不同，并且可以用方法諸如檢測(cè)排列的取向而非更隨機(jī)的構(gòu)型的樣品的透射電子顯微術(shù)評(píng)價(jià)來(lái)評(píng)估。

在本發(fā)明的組合物或膜中，可以適當(dāng)?shù)厥褂貌煌?lèi)型的膠原，包括I型、II型、III型和IV型膠原。對(duì)于某些組合物或膜，可以使用I型膠原。在某些組合物或膜中，可以?xún)?yōu)選組合物的膠原含量的大部分是I型膠原，例如，其中組合物或膜中的總膠原含量的40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％或100重量％是I型膠原。

還可以使用不同環(huán)糊精，包括α-環(huán)糊精(α-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)和γ-環(huán)糊精(γ-CD)。對(duì)于某些組合物或膜，可以?xún)?yōu)選α-CD，包括與I型膠原組合。在某些組合物或膜中，可以?xún)?yōu)選組合物或膜的環(huán)糊精含量的大部分是α-CD，例如，其中組合物或膜中的總環(huán)糊精含量的40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％或100重量％是α-環(huán)糊精(α-CD)，包括與I型膠原組合。

本發(fā)明的組合物或膜還可以包含一種或更多種另外的生物活性劑或治療劑，諸如例如吲哚美辛。

本發(fā)明的組合物或膜尤其可用于充當(dāng)延長(zhǎng)藥物向患者的釋放的藥物儲(chǔ)庫(kù)(drug reservoir)。

本發(fā)明的組合物或膜還可以適當(dāng)?shù)貫槎鄬拥?。組合物或膜可以形成不同的構(gòu)型，包括適用于用作人工角膜的形狀，和/或適用于用作角膜置換物、貼片(patch)或移植物的形狀。本發(fā)明的組合物和膜將具有作為多種其它生物材料的另外的用途。

根據(jù)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的發(fā)明人假設(shè)，與天然組織中的蛋白聚糖類(lèi)似，環(huán)糊精在膠原基質(zhì)中的摻入將調(diào)節(jié)膠原纖維發(fā)生，同時(shí)保持膠原三螺旋形成。具有原纖維結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)工程化的I型膠原基質(zhì)是不透明的，而包含無(wú)定形膠原網(wǎng)絡(luò)的透明凝膠則表現(xiàn)出不良的機(jī)械性能。預(yù)期環(huán)糊精可以作為蛋白聚糖替代物被添加至膠原基質(zhì)，并且將協(xié)助優(yōu)化用于角膜再生的光學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性質(zhì)。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含具有第一組分和第二組分的玻璃化基質(zhì)凝膠，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含具有第一組分和第二組分的玻璃化基質(zhì)凝膠，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精，并且所述組合物還包含至少一種生物活性劑。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種用于制造玻璃化基質(zhì)凝膠的方法，所述玻璃化基質(zhì)凝膠具有第一組分和第二組分，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精，所述方法包括：a)獲得膠原的水性溶液；b)獲得環(huán)糊精的水性溶液；c)將a)和b)的溶液合并；和d)使c)的合并的溶液脫水持續(xù)足以允許所述溶液玻璃化的一段時(shí)間。

根據(jù)又另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了以上描述的組合物作為用于修復(fù)哺乳動(dòng)物的組織的基質(zhì)的用途。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了以上描述的組合物作為用于修復(fù)哺乳動(dòng)物的眼角膜的基質(zhì)的用途。

根據(jù)另外的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了可以被制成分層的、每層具有不同的功能以更好地模仿角膜的眼用組合物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A描繪了包括以下的三種基于膠原的膜的差示掃描量熱法(DSC)第一加熱曲線：常規(guī)膠原玻璃質(zhì)凝膠(vitrigel)(CV)、本發(fā)明的α-CD-col組合物和交聯(lián)的CV。

圖1B示出了α-CD誘導(dǎo)多種膠原超微結(jié)構(gòu)(橫截面視圖)。

圖2是示出了本發(fā)明的α-CD-col組合物表現(xiàn)出優(yōu)異的透明度的圖，具有在550nm的高達(dá)96％的透光率。圖中的插圖示出了置于印刷的單詞“eye”上的濕膜的照片。

圖3是描繪了厚度分別為520μm和170μm的本發(fā)明的兩種α-CD-col組合物的縫合性(suturability)測(cè)試的荷載相對(duì)變形(displacement)的圖。圖中的插圖示出了較厚的膜在拉伸超過(guò)5.6mm后的照片。

圖4是在本發(fā)明的組合物的荷載測(cè)試中使用的裝置的照片。

圖5示出了細(xì)胞突起分析的示意圖和不同玻璃質(zhì)凝膠組合物膠原密度對(duì)牛角膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)物的作用。

圖6描繪了牛角膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中的三個(gè)不同的基因標(biāo)志物的基因表達(dá)如何被本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物的原纖維納米結(jié)構(gòu)所影響。

圖7是示出了不同環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)和它們?cè)谌芤褐腥绾闻c膠原原纖維相互作用的示意圖。環(huán)糊精分子中的空間可以被用作水不溶性藥物和生物活性劑的藥物儲(chǔ)庫(kù)。

圖8是描繪用于角膜修復(fù)和移植物的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)選項(xiàng)的示意圖。

圖9是描繪本發(fā)明的角膜仿生生物材料的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的研制的示意圖。示意圖描繪了本發(fā)明的基于膠原的生物材料如何模擬天然健康角膜的超微結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。

圖10是來(lái)自Biomaterials 34:9365-9372(2013)的圖像，示出了玻璃化如何導(dǎo)致具有高膠原密度、更好的強(qiáng)度和透明度的膠原玻璃質(zhì)凝膠的形成。

圖11a-11b是描繪了膠原裝配的現(xiàn)有技術(shù)方法和本發(fā)明的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案之間的對(duì)比的示意圖。11a)在體內(nèi)，I型膠原自組裝成有序的原纖維超微結(jié)構(gòu)涉及小蛋白聚糖諸如核心蛋白聚糖。11b)在體外，使用環(huán)糊精作為膠原三螺旋的分子伴侶蛋白可以獲得相似的超微結(jié)構(gòu)。

圖12是描繪了環(huán)糊精結(jié)構(gòu)的現(xiàn)有技術(shù)圖像。與在直鏈淀粉(amylose)(淀粉的片段)中一樣，環(huán)糊精包括5個(gè)或更多個(gè)1->4連接的α-D-吡喃型葡萄糖苷單元。5-元大環(huán)是非天然的。最近，良好表征的最大的環(huán)糊精包含32個(gè)1,4-脫水吡喃型葡萄糖苷單元，而作為沒(méi)有良好表征的混合物，還已知至少150-元的環(huán)狀寡糖。典型的環(huán)糊精在環(huán)中含有范圍從6-8個(gè)單元的數(shù)量的葡萄糖單體，形成錐形。

圖13示出了本發(fā)明的CD Col植入物實(shí)施方案的透明度。

圖14描繪了本發(fā)明的CD Col植入物實(shí)施方案的角膜仿生超微結(jié)構(gòu)。

圖15示出了本發(fā)明的βCD-COOH Col植入物的仿生超微結(jié)構(gòu)的特寫(xiě)顯微照片。

圖16描繪了角膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的顯微照片，示出了本發(fā)明的植入物組合物的生物相容性。

圖17描繪了H&E染色的截面，示出了本發(fā)明的植入物組合物的生物相容性。

圖18描繪了本發(fā)明的βCD CV植入物的體內(nèi)角膜移植的照片。

發(fā)明詳述

根據(jù)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的發(fā)明人使用環(huán)糊精用于作為蛋白聚糖替代物來(lái)工程化仿生的基于膠原的基質(zhì)組合物。所產(chǎn)生的環(huán)糊精在本發(fā)明的膠原組合物中的摻入增強(qiáng)了膠原熱穩(wěn)定性并降低了膠原纖維發(fā)生。結(jié)果，形成了厚的、透明的且機(jī)械強(qiáng)度高的基于膠原的組合物。這些環(huán)糊精-膠原組合物具有被用作用于角膜修復(fù)的治療性眼植入物的極大潛力。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含具有第一組分和第二組分的玻璃化基質(zhì)凝膠，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，膠原-環(huán)糊精組合物可以被塑造成多層的(multilayered)或多片層(multi-lamellar)的結(jié)構(gòu)，其中每層的厚度可以被控制。例如，人角膜為10-500微米厚。本發(fā)明可以被制成10-500、25-500；50-500；100-500；250-500(微米)的厚度。多層結(jié)構(gòu)支持多功能，并且因此，組合物比現(xiàn)有人工角膜、移植物或貼片與角膜更相似地起作用。另外，組合物可以在表面被包衣以增強(qiáng)生物作用。

根據(jù)本發(fā)明的組合物的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案，發(fā)明人使用膠原玻璃質(zhì)凝膠技術(shù)。膠原凝膠玻璃化是在受控的溫度和受控的濕度下的緩慢脫水過(guò)程，該過(guò)程引起具有高透明度和強(qiáng)度的膠原膜或膠原片的形成。結(jié)合水從膠原釋放導(dǎo)致熵的增加，驅(qū)使高密度原纖維的形成。膠原凝膠的玻璃化允許形成具有高膠原密度、更高強(qiáng)度和更高透明度的玻璃質(zhì)凝膠膜。(三步：凝膠化、玻璃化、再水合)以前，具有更大厚度(500um)的CV膜具有非常低的透明度(見(jiàn)圖9、10和11)

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“玻璃化”或“玻璃質(zhì)凝膠(vitrigel)”意指組合物包含一種或更多種膠原和一種或更多種環(huán)糊精的混合物的水性溶液，并且允許形成水凝膠。在一些實(shí)施方案中，組合物的凝膠化在37℃的溫度進(jìn)行。在形成水凝膠之后，通過(guò)脫水，諸如例如在特定溫度和濕度加熱水凝膠、持續(xù)允許玻璃化發(fā)生的特定時(shí)間長(zhǎng)度來(lái)使水凝膠玻璃化。在一些實(shí)施方案中，玻璃化在35℃至45℃的溫度和在約30％和50％相對(duì)濕度之間的濕度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃化在40℃的溫度和40％的相對(duì)濕度進(jìn)行。組合物的玻璃化所需的時(shí)間可以從數(shù)天至數(shù)周變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于組合物的玻璃化的時(shí)間為約1周至2周。

“凝膠”指介于液體和固體之間的物質(zhì)狀態(tài)，并且通常被定義為在液體介質(zhì)中膨脹的交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)。通常，凝膠是包含固體和液體二者的兩相膠體分散體，其中固體的量大于被稱(chēng)為“溶膠(sol.)”的兩相膠體分散體中的固體的量。如此，“凝膠”具有液體的一些特性(即，形狀是有彈性的且可變形的)和固體的一些特性(即，形狀足夠離散以在二維表面上維持三維)。

“水凝膠”意指可以吸收水以形成彈性凝膠的遇水膨脹的(water-swellable)聚合物基質(zhì)，其中“基質(zhì)”是通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或非共價(jià)交聯(lián)保持在一起的三維大分子網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)放置在水性環(huán)境中時(shí)，干燥的水凝膠通過(guò)獲取其中的液體而膨脹至交聯(lián)度所允許的程度。

本發(fā)明的組合物包含膠原。第一組分的膠原選自由I型、II型、III型和IV型膠原組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，用作組合物的第一組分的膠原是I型膠原。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在組合物和方法中使用的膠原可以包括多于一種類(lèi)型的膠原。

本發(fā)明的組合物還包含環(huán)糊精。第二組分的環(huán)糊精選自由α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，用作組合物的第二組分的環(huán)糊精是α-環(huán)糊精。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在組合物和方法中使用的環(huán)糊精可以包括多于一種類(lèi)型的環(huán)糊精。

根據(jù)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案，在本發(fā)明的組合物和方法中使用的環(huán)糊精具有能夠被另一個(gè)官能團(tuán)或部分化學(xué)取代的多個(gè)羥基。此類(lèi)官能團(tuán)或部分包括但不限于，疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)、肽、羥基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆羥基烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基氨基、二-C₁-C₆烷基氨基、C₁-C₆二烷基氨基C₁-C₆烷基、C₁-C₆硫代烷基、C₂-C₆硫代烯基、C₂-C₆硫代炔基、C₆-C₂₂芳氧基、C₂-C₆酰氧基、C₂-C₆硫代?；₁-C₆酰胺基、C₁-C₆磺酰胺基、C₁-C₆羧基及其衍生物，并且還可以包括膦酸鹽/酯(phosphonate)和砜類(lèi)。

如本文使用的，本發(fā)明的玻璃化組合物在使用前被水合。

本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物是光學(xué)上透明的并且適合于多種用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，玻璃質(zhì)凝膠組合物具有在550nm的約96％的光學(xué)透明度。

將理解，本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物可以被模制或形成適合于用作替代組織或組織填充物的任何特定形狀。本發(fā)明提供了形成支架等的離體聚合技術(shù)，所述支架等可以被模制以采取組織缺損所需要的形狀、通過(guò)刺激天然細(xì)胞修復(fù)促進(jìn)組織形成，并且可以通過(guò)微創(chuàng)注射(minimally invasive injection)被潛在地植入。

在一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物可以被塑形，用于用作受試者的人工角膜。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含具有第一組分和第二組分的玻璃化基質(zhì)凝膠，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精，并且所述組合物還包含至少一種生物活性劑。

本文中“活性劑”和“生物活性劑”可互換使用以指引起期望的藥理作用和/或生理作用的化學(xué)品或生物化合物，其中所述作用可以是預(yù)防性的或治療性的。該術(shù)語(yǔ)還包括本文具體提及的那些活性劑的藥學(xué)上可接受的、藥理上有活性的衍生物，包括但不限于鹽、酯、酰胺、前藥、活性代謝物、類(lèi)似物等。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“活性劑”、“藥理活性劑”和“藥物”被使用時(shí)，那么，應(yīng)理解本發(fā)明包括該活性劑本身以及藥學(xué)上可接受的、藥理學(xué)上有活性的鹽、酯、酰胺、前藥、代謝物、類(lèi)似物等。

當(dāng)提及治療劑、染料或其他物質(zhì)和聚合的組合物諸如本發(fā)明的組合物使用時(shí)，“摻入的(incorporated)”、“包封的(encapsulated)”和“包埋的(emtrapped)”是本領(lǐng)域公知的。在某些實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)包括將此類(lèi)劑摻入、配制或以其他方式包括在組合物中，所述組合物允許此類(lèi)劑在期望的應(yīng)用中緩釋。所述術(shù)語(yǔ)可構(gòu)思治療劑或其他物質(zhì)藉以被摻入基質(zhì)中的任何方式，包括例如分布在整個(gè)基質(zhì)中、附加到基質(zhì)表面(通過(guò)嵌入或其他結(jié)合相互作用)、包封在基質(zhì)內(nèi)部等。術(shù)語(yǔ)“共摻入”或“共包封”指治療劑或其他物質(zhì)和至少一種其他治療劑或其他物質(zhì)被摻入主題組合物中。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，可以制備包含玻璃質(zhì)凝膠組合物和一種或更多種生物活性劑的組合物。生物活性劑可以隨著組合物的預(yù)期目的而廣泛變化。術(shù)語(yǔ)“活性”是本領(lǐng)域公知的并且指的是為在受試者中局部或全身起作用的生物、生理、或藥理活性物質(zhì)的任何部分。生物活性劑(可以被稱(chēng)為“藥物”)的實(shí)例在公知的參考文獻(xiàn)諸如Merck Index、Physicians’Desk Reference和The Pharmacological Basis of Therapeutics中描述，并且它們包括但不限于藥物；維生素；礦物質(zhì)補(bǔ)充劑；用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或減輕疾病或疾患(illness)的物質(zhì)；影響身體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或前藥，所述前藥在將它們置于生理環(huán)境中后變?yōu)樯锘钚缘幕蚋谢钚缘??？梢允褂枚喾N形式的生物活性劑，所述多種形式的生物活性劑在施用至受試者之后能夠由玻璃質(zhì)凝膠組合物釋放到例如鄰近組織或體液中。在一些實(shí)施方案中，生物活性劑可以被用于例如治療、改善、抑制或預(yù)防與例如眼睛相關(guān)的疾病或癥狀。

生物活性劑的非限制性實(shí)例包括以下：腎上腺素能阻斷劑、同化劑、雄激素類(lèi)固醇、抗過(guò)敏物質(zhì)、抗膽堿能藥和擬交感神經(jīng)藥、抗高血壓劑、抗感染劑、抗炎劑諸如類(lèi)固醇、非類(lèi)固醇抗炎劑(NSAIDS)、退熱劑和止痛劑、抗組胺劑、生物制品(biological)、減充血?jiǎng)⒃\斷劑、雌激素、離子交換樹(shù)脂、抗有絲分裂劑、溶粘液劑(mucolytic agent)、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肌肉藥物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、外周血管擴(kuò)張劑、促孕劑、前列腺素、維生素、抗原物質(zhì)和前藥。

在本發(fā)明的組合物中使用的NSAIDS的實(shí)例可以包括甲滅酸(mefenamic acid)、阿司匹林、二氟尼柳(Diflunisal)、雙水楊酸酯(Salsalate)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、酮洛芬(Ketoprofen)、右旋酮洛芬(Dexketoprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、噁丙嗪(Oxaprozin)、洛索洛芬(Loxoprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、舒林酸(Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、酮咯酸(Ketorolac)、雙氯芬酸(Diclofenac)、萘丁美酮(Nabumetone)、吡羅昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替諾昔康(Tenoxicam)、屈噁昔康(Droxicam)、氯諾昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲氯芬那酸(Meclofenamic acid)、氟滅酸(Flufenamic acid)、鄰甲氯滅酸(Tolfenamic acid)、塞來(lái)昔布(Celecoxib)、羅非昔布(Rofecoxib)、伐地昔布(Valdecoxib)、帕瑞昔布(Parecoxib)、氯美昔布(Lumiracoxib)、依托昔布(Etoricoxib)、Firocoxib、磺酰苯胺類(lèi)(Sulphonanilides)、尼美舒利(Nimesulide)、尼氟滅酸(Niflumic acid)和利克飛龍(Licofelone)。

可以使用不同形式的生物活性劑。這些包括但不限于，諸如以下的形式：不帶電荷的分子、分子復(fù)合物、鹽、醚、酯、酰胺、前藥形式等，其當(dāng)被植入、注射或以其他方式置于受試者中時(shí)被生物活化。

玻璃質(zhì)凝膠組合物將以符合良好的醫(yī)療實(shí)踐的方式配制、計(jì)量(dosed)和施用。在此情況下考慮的因素包括待被治療的特定紊亂、待被治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、紊亂的原因、劑的遞送部位、施用方法、施用的時(shí)間表和醫(yī)療從業(yè)者已知的其他因素。待被施用的玻璃質(zhì)凝膠組合物的“治療有效量”將根據(jù)此類(lèi)考慮因素決定，并且可以是預(yù)防、改善或治療目的紊亂所必需的最小量。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指療法(例如，預(yù)防劑或治療劑)的量的等效短語(yǔ)，其足以降低疾病的嚴(yán)重度和/或持續(xù)時(shí)間、改善其一個(gè)或更多個(gè)癥狀、阻止疾病的發(fā)展或引起疾病消退，或其足以引起阻止疾病或其一個(gè)或更多個(gè)癥狀的發(fā)展、復(fù)發(fā)、發(fā)作或進(jìn)展、或增強(qiáng)或提高可用于治療疾病的另一個(gè)療法(例如，另一種治療劑)的預(yù)防和/或治療作用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，修復(fù)受損的組織可以在任何標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)程序(包括開(kāi)放式外科手術(shù)和腹腔鏡技術(shù))環(huán)境中進(jìn)行，以允許接近并修復(fù)組織。接近受損的組織之后，使本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物(如果需要，和任何外科手術(shù)上可接受的貼片或植入物一起)接觸受損的組織而放置。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種用于制造玻璃化基質(zhì)凝膠的方法，所述玻璃化基質(zhì)凝膠具有第一組分和第二組分，其中所述第一組分包含膠原，并且其中所述第二組分包含環(huán)糊精，所述方法包括：a)獲得膠原的水性溶液；b)獲得環(huán)糊精的水性溶液；c)將a)和b)的溶液合并；和d)使c)的合并的溶液脫水持續(xù)足以允許所述溶液玻璃化的一段時(shí)間。

如本文使用的，膠原的水性溶液是溶解于適合緩沖液的任何膠原溶液。膠原的濃度是可變的，然而，具有在1mg/ml至約10mg/ml范圍內(nèi)的濃度的膠原溶液可根據(jù)本發(fā)明的方法被使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，水性溶液中的膠原濃度為約5mg/ml。

如本文使用的，環(huán)糊精的水性溶液是溶解于適合緩沖液中的任何環(huán)糊精溶液。環(huán)糊精的濃度是可變的，然而，具有在2.5mg/ml至約10mg/ml的范圍內(nèi)的濃度的環(huán)糊精溶液可根據(jù)本發(fā)明的方法被使用。

根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的組合物的脫水和玻璃化包括在約5℃至40℃的溫度、在約30％至50％之間的相對(duì)濕度并且持續(xù)約3天至約28天的時(shí)間干燥包含膠原溶液和環(huán)糊精的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的玻璃化包括在39℃的溫度持續(xù)約7天加熱包含膠原溶液和環(huán)糊精的溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的玻璃化包括在39℃的溫度持續(xù)約14天加熱包含膠原溶液和環(huán)糊精的溶液。

術(shù)語(yǔ)“載體”指治療劑借助其而通過(guò)本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物提供的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類(lèi)生理學(xué)載體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物和合成來(lái)源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物被靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是適合的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可被用作液體載體，特別是用于可注射溶液。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊(chalk)、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，組合物還可以包含少量潤(rùn)濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。

緩沖液、酸和堿可以被摻入組合物中以調(diào)節(jié)pH。還可以包括增加從組合物中釋放的劑的擴(kuò)散距離的劑。

緩沖劑輔助維持pH在接近生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選地以從約2mM至約50mM的范圍的濃度存在。用于根據(jù)本發(fā)明使用的適合緩沖劑包括有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸二者以及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩沖液(例如，檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如，琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖液(例如，富馬酸-富馬酸單鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸單鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖液(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)?？梢允褂昧姿猁}緩沖液、碳酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、三甲基胺鹽諸如Tris、HEPES和其他此類(lèi)已知的緩沖液。

防腐劑可以被添加以阻礙微生物生長(zhǎng)，并且可以以從0.2％-1％(w/v)范圍的量被添加。用于根據(jù)本發(fā)明使用的適合防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、十八烷基二甲基芐基氯化銨、芐烷銨鹵化物(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、六甲氯銨、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。

存在等滲劑(isotonicifier)以確保本發(fā)明的液體組合物的生理等滲性并且包括多元糖醇，優(yōu)選地三元或更高級(jí)的糖醇，諸如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇?？紤]到其他成分的相對(duì)量，多元醇可以以按重量計(jì)約0.1％至約25％之間、優(yōu)選地1％至5％之間的量存在。

待被用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)例如通過(guò)無(wú)菌濾膜的過(guò)濾實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明的制劑可以通過(guò)過(guò)濾滅菌。

根據(jù)一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案，提供了包含本發(fā)明的組合物的眼用制劑，其中所述制劑適用于施用至受試者的眼睛。眼用制劑可以具有5.5和7之間的pH。在一些實(shí)施方案中，眼用制劑是水性制劑。在一些實(shí)施方案中，眼用制劑呈單一劑量單位的形式。在一些實(shí)施方案中，眼用制劑不包含防腐劑。眼用制劑可以還包含一種或更多種另外的治療劑，諸如抗氧化劑。眼用制劑可以還包含一種或更多種眼淚代替物。在一些實(shí)施方案中，眼淚代替物中的至少一種包含眼用潤(rùn)滑劑(例如，羥丙基甲基纖維素)。

多種眼淚代替物是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于：?jiǎn)误w多元醇，諸如甘油、丙二醇和乙二醇；聚合的多元醇諸如聚乙二醇；纖維素酯如羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素；右旋糖酐類(lèi)諸如右旋糖酐70；水溶性蛋白諸如明膠；乙烯基聚合物，諸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚維酮；以及卡波姆，諸如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940和卡波姆974P。許多此類(lèi)眼淚代替物是可商購(gòu)的，包括但不限于纖維素酯諸如BionTeargenTearsTears NaturalTears Naturale和以及聚乙烯醇類(lèi)諸如AkwaMoistureMurine和Visine眼淚代替物還可以包括石蠟，諸如可商購(gòu)的軟膏。被用作眼淚代替物的其他可商購(gòu)的軟膏包括LubrifreshMoisture Eyes和Refresh還可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。

實(shí)施例

按照三步順序制備摻入了不同環(huán)糊精的基于I型膠原的膜：凝膠化、玻璃化和再水合。測(cè)試并比較了3種環(huán)糊精，即α-CD、β-CD和γ-CD。

CD溶液的制備：用此處描述的過(guò)程制備含有不同CD(例如α、β和官能團(tuán)、COOH、叔丁基、SH、NH₂)的全部溶液：例如，加入含有20nM HEPES的dH₂O中的β-CD溶液(2.5mg/mL)(在50ml falcon管中，1mL HEPES、49mL H₂O和125mgβ-CD)并徹底渦旋以完全溶解。然后，使用氫氧化鈉(2N)溶液將此溶液的pH升高至11，過(guò)濾通過(guò)0.22μm針筒過(guò)濾器并保存在1℃-4℃。

β-CD膠原凝膠的制備：用此處描述的方法制備膠原和CD的多種凝膠：例如，將等體積的β-CD溶液(2.5mg/mL且如以上制備的)和膠原乙酸溶液(5mg/mL)混合到一起并在制備時(shí)一直保持在4℃或更低的溫度。特別注意防止由于混合形成氣泡。然后，將混合物轉(zhuǎn)移至凝膠模具并在37℃、100％RH培養(yǎng)箱保持2小時(shí)。

玻璃化和β-CD膠原的后處理：在37℃孵育2小時(shí)后，將凝膠轉(zhuǎn)移至5℃(40％RH)玻璃化室18小時(shí)。之后，將凝膠轉(zhuǎn)移至40℃玻璃化室(40％RH)一周。一周后，將脫水的β-CD膠原膜(玻璃質(zhì)凝膠)在dH₂O中再水合30分鐘。如果需要，在37℃使用于dH₂O中的0.1％EDAC和0.1％NHS使玻璃質(zhì)凝膠交聯(lián)30分鐘，用dH₂O洗滌玻璃質(zhì)凝膠至少5次以去除痕量的EDAC和NHS。親水官能團(tuán)誘導(dǎo)如在圖1B中示出的薄層結(jié)構(gòu)。

按照之前描述的方法(Biomaterials 34(2013)9365-9372)制備兩種膠原膜，即膠原玻璃質(zhì)凝膠和交聯(lián)的玻璃質(zhì)凝膠，作為對(duì)照。與常規(guī)玻璃質(zhì)凝膠相比，交聯(lián)的玻璃質(zhì)凝膠在凝膠化過(guò)程之前，通過(guò)在膠原介質(zhì)混合物中添加額外的0.6％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和0.6％N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)來(lái)制造。使用差示掃描量熱法(DSC,Perkin Elmer,Waltham,MA)評(píng)價(jià)膠原和CD之間的特異性相互作用。使用Synergy 2酶標(biāo)儀(BioTek,Winooski,VT)測(cè)量CD-col膜的吸光度。使用Electroforce 3200測(cè)試儀器(Bose,Eden Prairie,MN)用10-0尼龍縫線測(cè)試膜縫合性。

使用依序的(sequential)膠原酶(2型,Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)消化從全層角膜(full-thickness cornea)分離角膜細(xì)胞。收集經(jīng)消化的細(xì)胞并在1400rpm離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀物重懸并在一般組織培養(yǎng)板(TCP)或在CV覆蓋的板上在37℃和5％CO₂下培養(yǎng)。使用無(wú)血清培養(yǎng)基或基于血清的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基由DMEM/F-12、1％10U/mL青霉素-鏈霉素和0.5％1.25mg/mL兩性霉素B(Life Technologies,Carlsbad,CA)組成?；谘宓呐囵B(yǎng)基包含DMEM/F-12、10％FBS、1％10U/mL青霉素-鏈霉素和0.5％1.25mg/mL兩性霉素B。使用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞以5000細(xì)胞/cm²的濃度鋪板，而使用基于血清的培養(yǎng)基則將細(xì)胞以1000細(xì)胞/cm²的濃度鋪板。在成像和基因表達(dá)分析之前，將角膜細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過(guò)3周，或在基于血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天。通過(guò)用LIVE/生存力/細(xì)胞毒性試劑盒(Life Technologies)染色來(lái)檢查角膜細(xì)胞的形態(tài)。通過(guò)將玻璃化的膜浸泡在0.1％吲哚美辛滴眼液中一段時(shí)間將吲哚美辛包封于玻璃質(zhì)凝膠中。使用高效液相色譜(HPLC)測(cè)量吲哚美辛從玻璃質(zhì)凝膠中的洗脫。使用乙腈:水為51:49(v/v)的流動(dòng)相、C18柱和設(shè)定在318nm的UV/VIS檢測(cè)器測(cè)試釋放溶液。

實(shí)施例1

所有3種環(huán)糊精，特別是α-CD，表現(xiàn)出與I型膠原三螺旋的強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致透明的且機(jī)械強(qiáng)度高的CD-col膜的形成。如在圖1A中示出的，常規(guī)玻璃質(zhì)凝膠在熱流中在55℃表現(xiàn)出大且寬的吸熱峰，這表明膠原膜以40.8J/g的焓經(jīng)歷熱變性。相比之下，在交聯(lián)的玻璃質(zhì)凝膠的對(duì)照樣品中沒(méi)發(fā)現(xiàn)可辨別的峰，表明由于交聯(lián)反應(yīng)膠原膜的變性特征。與常規(guī)玻璃質(zhì)凝膠相比，在膠原膜中添加α-CD產(chǎn)生升高的變性溫度，表明增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。在α-CD-col中僅觀察到單個(gè)較窄的峰，這意味著基質(zhì)具有均勻結(jié)構(gòu)。如果我們假設(shè)，所有焓來(lái)自膠原三螺旋的熱轉(zhuǎn)化，α-CD-col的變性焓為來(lái)自常規(guī)玻璃質(zhì)凝膠的變性焓的70.1％，表明降低的膠原纖維發(fā)生。在β-CD-col和γ-CD-col中也觀察到相似的結(jié)果。

實(shí)施例2

與傳統(tǒng)膠原膜相比，CD-col膜示出了極大提高的透明度(圖2)，其可以用降低的膠原纖維發(fā)生來(lái)解釋。

開(kāi)發(fā)了具有用于角膜再生的最佳光學(xué)性質(zhì)和最佳機(jī)械性質(zhì)的I型膠原-CD膜。CD代表具有內(nèi)部疏水核和外部親水環(huán)的6至8個(gè)葡萄糖分子的環(huán)。全部3種環(huán)糊精，特別是α-CD，表現(xiàn)出與膠原三螺旋的強(qiáng)烈相互作用，導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度高的膠原-CD膜的形成。膠原-CD膜示出了比傳統(tǒng)膠原膜顯著更高的透明度，其可以通過(guò)與傳統(tǒng)膠原膜(～80nm)相比，膠原-CD膜中大大降低的膠原原纖維直徑(～20nm)解釋。另外，與顯示隨機(jī)原纖維組織的傳統(tǒng)膠原膜不同，可能是由于CD對(duì)膠原三螺旋的重新組織，膠原-CD膜在一些區(qū)域中展示了排列的原纖維。另外，發(fā)現(xiàn)膠原-CD膜可以從滴眼液中吸附眼用藥物吲哚美辛，然后緩慢釋放藥物最高達(dá)5小時(shí)。

在I型膠原膜中摻入環(huán)糊精調(diào)節(jié)了膠原原纖維發(fā)生(fibrillogenesis)和排列，并改善膜的光學(xué)、機(jī)械和藥物釋放性質(zhì)。

實(shí)施例3

本發(fā)明的組合物展示了優(yōu)越的機(jī)械性能。當(dāng)它們的厚度與人角膜的厚度相當(dāng)時(shí)(即～500μm)，它們變得足夠強(qiáng)韌以用于縫合。如在圖3中示出的，將尼龍縫線拉動(dòng)穿過(guò)具有520μm的厚度的α-CD-col膜中的孔。在縫線的壓力下，厚膜中的孔僅拉伸，而不是如在具有170μm的厚度的薄膜中觀察到的撕裂膜(圖4)。

實(shí)施例4

膠原納米結(jié)構(gòu)限定了細(xì)胞應(yīng)答。在具有低和高的膠原密度的玻璃質(zhì)凝膠組合物上培養(yǎng)牛角膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。如在圖5中示出的，當(dāng)與常規(guī)玻璃質(zhì)凝膠對(duì)照相比時(shí)，本發(fā)明的組合物的膠原密度允許角膜細(xì)胞在培養(yǎng)物中具有更大的突起面積。此外，角膜細(xì)胞的細(xì)胞突起的總數(shù)目隨著本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物的膠原密度的增加而顯著增加(圖5)。

實(shí)施例5

角膜細(xì)胞基因表達(dá)取決于原纖維結(jié)構(gòu)。在對(duì)照玻璃質(zhì)凝膠上或用本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物培養(yǎng)角膜細(xì)胞，其中玻璃質(zhì)凝膠在5℃或39℃溫度脫水。在基于血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)6天后，收獲細(xì)胞并分析角膜蛋白(keratocan)、醛脫氫酶(ALDH)和雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)的基因表達(dá)。通過(guò)以下分析這些基因的表達(dá)：使用TRIzol試劑(Life Technologies)從培養(yǎng)的角膜細(xì)胞分離總RNA，使用SuperScript II第一鏈合成試劑盒(Life Technologies)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并隨后在StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedLife Technologies)上使用實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)測(cè)試cDNA。如在圖6中示出的，當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)，當(dāng)細(xì)胞在于高溫下脫水的玻璃質(zhì)凝膠組合物上生長(zhǎng)時(shí)，角膜蛋白和ALDH的基因表達(dá)極大提高。在低溫和高溫兩種情況下，雙糖鏈蛋白聚糖的表達(dá)在玻璃質(zhì)凝膠組合物中當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)降低。

實(shí)施例6

本發(fā)明的玻璃質(zhì)凝膠組合物可以被用于遞送生物活性劑。如上所述制備玻璃質(zhì)凝膠組合物，并在使玻璃質(zhì)凝膠水合后，使用2滴持續(xù)10分鐘或在1mL滴眼液中浸泡過(guò)夜將乙醇中的商購(gòu)可得的0.1％吲哚美辛的滴眼液制劑的溶液添加至組合物，并使用HPLC測(cè)試釋放動(dòng)力學(xué)。發(fā)現(xiàn)玻璃質(zhì)凝膠組合物經(jīng)過(guò)5小時(shí)的時(shí)期從玻璃質(zhì)凝膠組合物釋放吲哚美辛。

開(kāi)發(fā)了本發(fā)明的I型膠原-CD組合物，所述I型膠原-CD組合物具有用于角膜再生的優(yōu)化的光學(xué)和機(jī)械性能。不限于任何特定理論，這些性能可能是由于環(huán)糊精摻入的膠原組合物中經(jīng)調(diào)節(jié)的膠原原纖維發(fā)生(圖7)。本發(fā)明的這些組合物具有被用作用于角膜修復(fù)和治療的治療性眼貼的極大潛力。本文公開(kāi)的組合物和方法也可以用于來(lái)源于形成原纖維的膠原的其它結(jié)締組織諸如軟骨、皮膚以及血管的再生。

實(shí)施例7

研究了膠原和環(huán)糊精的相互作用對(duì)膠原原纖維組織的作用。將于酸性溶液中的I型膠原和不同組成的環(huán)糊精溶液合并。然后此溶液可以被緩沖以升高pH來(lái)形成凝膠。然后在1周的時(shí)期使這些凝膠玻璃化，之后將CD-Col的干燥片再水合。進(jìn)行多種樣品表征以符合臨床上此類(lèi)植入物的要求。

如下所述制備材料：使用合適的緩沖液中的I型膠原和環(huán)糊精溶液形成水凝膠。在受控的溫度和相對(duì)濕度下，在1周的時(shí)期進(jìn)行玻璃化過(guò)程。將環(huán)糊精膠原玻璃質(zhì)凝膠植入物再水合。

樣品需要以下臨床性質(zhì)/試驗(yàn)：透光性；透射電鏡顯微術(shù)；機(jī)械測(cè)試；體外生物相容性研究；初步體內(nèi)研究。

這些制備的環(huán)糊精/膠原材料，即使在500微米的厚度也是透明的，特別是當(dāng)與不含環(huán)糊精的傳統(tǒng)玻璃質(zhì)凝膠相比時(shí)。此外，觀察到根據(jù)環(huán)糊精的類(lèi)型和官能團(tuán)，見(jiàn)到透明度的變化。這些植入物的大多數(shù)示出了與人角膜相當(dāng)?shù)耐该鞫?，即在可?jiàn)光范圍高于90％。有趣的是，還觀察到，用足夠的力量，可以將這些厚片一層一層地分成更薄的片(參見(jiàn)圖13)。這促使我們?cè)赥EM下使這些可視化，以了解這些層來(lái)自何處。觀察到多種超微結(jié)構(gòu)。特別吸引人的是具有COOH官能團(tuán)的CD，其顯示出與天然角膜基質(zhì)的片層(lamellae)相似的自組裝片層。它們不僅自組裝成片層，如可以在橫截面中觀察到的，而是每個(gè)片層中的膠原展示纖維排列，并且相鄰片層中的纖維彼此正交(參見(jiàn)圖15)。進(jìn)行機(jī)械測(cè)試以確定具有各種CD組分的植入物的強(qiáng)度，并且也觀察到CD類(lèi)型之間的廣泛區(qū)別。有趣的是，注意到β-CD膠原植入物具有最高的楊氏模量，并且如可以在下圖觀察到的——含CD的全部植入物展示了非常高的斷裂應(yīng)變——這表明這些材料是高度可延伸的，一種被觀察到直接轉(zhuǎn)化成抗斷裂性的性質(zhì)，或在此情形中，縫合性(參見(jiàn)圖16)。為了確定植入物是生物相容的，檢驗(yàn)角膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞二者與植入物的體外細(xì)胞培養(yǎng)。如可以觀察到的，植入物在這些表面上生長(zhǎng)沒(méi)有問(wèn)題(圖17)。另外，盡管有些非常規(guī)，還在皮下檢驗(yàn)了生物相容性。如果皮下植入物不引起任何不良免疫反應(yīng)，可以說(shuō)，最可能地，這些植入物對(duì)免疫豁免的角膜(immune privileged cornea)也將不具有副作用(圖18)。另外，這些植入物在特殊的模具中制成以適應(yīng)眼的彎曲度。如可以在右側(cè)觀察到的，植入物良好地位于角膜表面。

通過(guò)將這些角膜植入到兔眼睛進(jìn)行試驗(yàn)研究。普通中斷縫合(regular interrupt suture)能夠良好固定材料(圖19)。結(jié)論是，CD分子充當(dāng)人工伴侶蛋白，其指導(dǎo)膠原原纖維模擬天然角膜的組織的裝配。CD膠原植入物是生物相容的并且具有角膜仿生性質(zhì)。CD官能化調(diào)節(jié)超微結(jié)構(gòu)和宏觀性質(zhì)。由于高透明度、容易縫合和仿生的超微結(jié)構(gòu)，CD膠原植入物示出了作為角膜代替物的潛力。

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除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中(尤其是在以下權(quán)利要求書(shū)的上下文中)使用的術(shù)語(yǔ)“一(a)”和“一(an)”以及“該(the)”和相似的指示物，被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者。除非另外注明，否則術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“包含(containing)”被解釋為是開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否則本文列出的值的范圍僅僅預(yù)期用作單獨(dú)指示落在該范圍內(nèi)的各個(gè)單獨(dú)的值的簡(jiǎn)寫(xiě)方法，并且各個(gè)單獨(dú)的值被并入本說(shuō)明書(shū)，如同其在本文單獨(dú)列出。除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文描述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行。除非另外聲明，否則本文所提供的任何以及所有實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(例如，“諸如”)的使用僅僅預(yù)期更好地說(shuō)明本發(fā)明且對(duì)本發(fā)明的范圍不施加限制。本說(shuō)明書(shū)中的語(yǔ)言不應(yīng)解釋為指示任何未要求保護(hù)的要素作為對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐必不可少。

本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，包括本發(fā)明人已知用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳方式。在閱讀前述描述之后，那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變化形式對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以變得明顯。本發(fā)明人預(yù)期技術(shù)人員視需要采用此類(lèi)變化形式，并且本發(fā)明人預(yù)期本發(fā)明以不同于如本文具體描述的方式被實(shí)施。因此，本發(fā)明包括如被適用的法律允許的在此所附的權(quán)利要求書(shū)中列出的主題的所有修改形式和等同物。此外，除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則呈其所有可能的變化形式的上文描述的要素的任何組合被本發(fā)明包含。