專利名稱：一種人工組織工程化的生物角膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于構(gòu)建組織工程化生物角膜的構(gòu)建載體。
組織工程學(xué)是一門運(yùn)用工程學(xué)與生命科學(xué)的原理和方法，它通過(guò)不同的組織構(gòu)建方式使細(xì)胞與載體結(jié)合，構(gòu)成具有特定的三維結(jié)構(gòu)和生物活性的人工組織或器官，用于替代或修復(fù)人體的病損器官和組織，達(dá)到恢復(fù)組織形態(tài)與功能的目的。標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將超越組織和器官移植的舊模式，進(jìn)入人工制造組織和器官的時(shí)代，通過(guò)組織工程手段構(gòu)建人工組織工程化生物角膜將解決或緩解此供需矛盾。通過(guò)組織工程構(gòu)建組織的必需原料是構(gòu)建載體和種子細(xì)胞。
目前制約組織工程化生物角膜研究的瓶頸是構(gòu)建載體，由于角膜獨(dú)特的生理和光學(xué)特性，要求用于構(gòu)建生物角膜基質(zhì)必須具有(1)適合細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的微環(huán)境；(2)穩(wěn)定的角膜厚度和角膜曲率，以維持屈光度穩(wěn)定；(3)高透明度；(4)適度地強(qiáng)度和彈性；(5)良好的神經(jīng)支配。否則，將影響生物角膜的臨床應(yīng)用和效果。
但是目前構(gòu)建角膜或與角膜類似的組織工程化組織的載體高分子材料和膠原均不能滿足上述要求1)以高分子材料為載體構(gòu)建的角膜不但透明差，而且不能建立角膜神經(jīng)支配，如Mimami等(1993)用人工合成基質(zhì)構(gòu)建的三維牛角膜，就是由于人工基質(zhì)的缺陷(不透明和抗拉力弱)，不能用于移植(Mimami Y，et al.Reconstruction of cornea in three-dimensionalcollagen gel matrix culture.Invest Ophthalmol Vis Sci.1993；34(7)2316.)。研究也發(fā)現(xiàn)聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)類等材料的透明度和穩(wěn)定性差，需要進(jìn)一步改進(jìn)，若用于構(gòu)建組織工程化生物角膜需要進(jìn)一步改進(jìn)(商慶新、胡曉潔、曹宜林組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜基質(zhì)層的實(shí)驗(yàn)研究，中華眼科雜志，2001，37252)。
2)膠原合成基質(zhì)載體構(gòu)建的角膜強(qiáng)度更差。Griffith等(1999)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立“永生化”細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)室成功重組了功能、結(jié)構(gòu)與正常角膜相似的生物角膜，被“science”雜志譽(yù)為人類角膜生物組織工程和組織移植中的最大突破和里程碑(Griffith M，et al.Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.Science 1999；286(5447)2169-72.)，也是由于強(qiáng)度不夠，未能進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，離臨床應(yīng)用的要求相差就更遠(yuǎn)了，另外由于膠原易被膠原酶消化，因此不穩(wěn)定，進(jìn)而影響角膜的光學(xué)性能和移植細(xì)胞的長(zhǎng)期存活。
正常的角膜基質(zhì)是角膜細(xì)胞正常附著和長(zhǎng)期存活的基礎(chǔ)，健康的角膜緣基質(zhì)形成了穩(wěn)定的細(xì)胞“龕”，支持了角膜緣干細(xì)胞正常分化和增殖，這是高分子材料和膠原載體所不具備的優(yōu)勢(shì)。Lange等(1993)用牛Descemet′s膜為載體將角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植到新西蘭白兔，所有植片保持透明12-17天(Lange-TM，et al.Corneal endothelial celltransplantation using Descemet′s membrane as a carrier.J-Cataract-Refract-Surg.1993；19(2)232-5.)，Bohnke等(1998，1999)用Descemet′s膜為載體，也成功地將人和豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植到人眼(Bohnke-M，et al.Detection of neurone-specific enolase in long-termcultures of human corneal endothelium.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.1998；236(7)522-6.及Bohnke-M，et al.Transplantation ofcultured adult human or porcine corneal endothelial cells onto humanrecipients in vitro.Part IIEvaluation in the scanning electron microscope.Cornea.1999；18(2)207-13.)。自1994年開始，我們對(duì)異種角膜基質(zhì)免疫原性、移植后角膜神經(jīng)恢復(fù)、植床組織學(xué)變化、移植后不同時(shí)期角膜透明度、屈光度和厚度變化等方面進(jìn)行了系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)的免疫原性很低，異種移植后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長(zhǎng)入，角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細(xì)胞粘附牢固，細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)問(wèn)生理連接正常，將猴角膜基質(zhì)植入人角膜層間，已維持透明近10年，表明利用異種角膜基質(zhì)是目前最理想的構(gòu)建角膜載體。
構(gòu)建技術(shù)方面，目前國(guó)內(nèi)外構(gòu)建組織工程化生物角膜的主要方法是氣-液界面和三維立體培養(yǎng)，Zieske等(1994)報(bào)道重組的三維角膜移植后，細(xì)胞有半橋粒、錨纖維和連續(xù)的基底膜形成，α烯醇酶和K3的分布與正常角膜緣完全相同(Zieske JD，et al.Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cellsimportance ofculture environment and endothelial cell interaction.Exp Cell Res.1994；214621-33.)。Engelmann等(1999)分別取得豬和人內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)3,450/mm2和1,850/mm2的最大終密度(Engelmann K，et al.Transplantation of adult human or porcine comeal endothelial cells ontohuman recipients in vitro.Part ICell culturing and transplantationprocedure.Cornea.1999；18199-206.)。
本發(fā)明所述的人工組織工程化生物角膜，按照以下方法制備取新鮮、脫細(xì)胞處理或保存后的異種角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞后，在其表面分別種植相應(yīng)細(xì)胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。另外，使用顯微板層角膜切削刀、微型角膜車床或激光切削加工上述異種角膜基質(zhì)可以制作成為具有不同屈光度的角膜基質(zhì)片，用作構(gòu)建生物角膜的載體。
本發(fā)明的主要發(fā)明點(diǎn)在于以角膜基質(zhì)為載體，制得的人工組織工程化生物角膜，免疫原性很低，可以用于異種移植，移植后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長(zhǎng)入，角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細(xì)胞貼附牢固，細(xì)胞間和細(xì)胞與基底膜間生理連接正常。
利用新鮮、脫細(xì)胞處理或保存后的異種角膜基質(zhì)，如豬、羊、貓、猴、牛、馬、驢等動(dòng)物類或魚類的角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞后，在其表面分別種植相應(yīng)細(xì)胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。加工上述異種角膜基質(zhì)，使其具有不同的外部形狀(根據(jù)臨床需要的角膜形狀加工)和獲得不同的屈光度(屈光度可從-40D～+40D)后，可用于構(gòu)建人工組織工程化生物角膜。下面是本發(fā)明專利的最佳實(shí)施例子實(shí)施例子1取新鮮異種角膜，利用Dispase II消化法除去其前后表面的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，以此異種角膜基質(zhì)片為載體，以同種異體角膜緣細(xì)胞和“永生化”內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，利用微重力聯(lián)合氣液界面法使種子細(xì)胞與異種角膜基質(zhì)載體緊密附著，形成前表面為5～7層上皮細(xì)胞，后表面為單層內(nèi)皮細(xì)胞的生物角膜，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，根據(jù)移植后免疫、組織學(xué)恢復(fù)、視光學(xué)改變、手術(shù)方法等方面的研究觀察結(jié)果，改進(jìn)和完善構(gòu)建和移植方法。
實(shí)施例子2取干燥或冷凍保存的異種角膜，用激光消融除去異種角膜前后表面的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，然后使用顯微板層角膜切削刀、激光或微型角膜車床加工，使其具有一定的屈光度，以此異種角膜基質(zhì)片為載體，以誘導(dǎo)分化的胚胎干細(xì)胞源性角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，利用微重力和氣液界面法構(gòu)建生物角膜。
新構(gòu)建出的生物角膜內(nèi)皮細(xì)胞的密度達(dá)到2000個(gè)細(xì)胞/mm2以上，角膜上皮細(xì)胞達(dá)到5~7層。具有免疫原性低、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能正常，移植后厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長(zhǎng)入、角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細(xì)胞貼附牢固，細(xì)胞間和細(xì)胞與基底膜間生理連接正常。
實(shí)施例子3用激光消融除去異種角膜前后表面的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使用顯微板層角膜切削刀、激光或微型角膜車床加工，使其具有一定的屈光度，同時(shí)或單純?cè)谄淝昂蟊砻嫱坎几羲牧?如交聯(lián)的硅化合物等，要求材料與角膜基質(zhì)表面粘附性好、涂層透明度高，特別是具有與眼球良好的組織相容性和穩(wěn)定性)，使隔水材料在角膜基質(zhì)表面交聯(lián)，用于活體移植。
權(quán)利要求
1.一種人工組織工程化的生物角膜，按照以下方法制備取新鮮、脫細(xì)胞處理或保存后的同種異體或異種角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞后作為載體，在其表面分別種植相應(yīng)細(xì)胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。
2.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于所述的同種異體或異種角膜經(jīng)酶消化法或激光消融法處理，除去角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞，成為單純含有顯微膠原板層的角膜基質(zhì)載體。
3.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于制做角膜基質(zhì)載體的角膜可以是含有基質(zhì)細(xì)胞的新鮮角膜，也可以是經(jīng)過(guò)保存處理過(guò)的不含角膜基質(zhì)細(xì)胞的角膜。
4.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于角膜基質(zhì)經(jīng)顯微板層角膜切削刀和微型角膜車床加工制作成為具有不同屈光度的角膜基質(zhì)鏡片，用作構(gòu)建生物角膜的載體。
5.按權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于在載體表面種植的細(xì)胞是同種異體角膜緣細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞和誘導(dǎo)分化的胚胎干細(xì)胞源性角膜細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于細(xì)胞種植的方法采用微重力、氣液界面法、三微構(gòu)建法或聯(lián)合構(gòu)建法。
7.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于可以同時(shí)或單純?cè)谥谱龅慕悄せ|(zhì)載體前后表面涂布隔水材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工組織工程化的生物角膜。本發(fā)明利用同種異體或異種角膜基質(zhì)為載體，在其上面種植培養(yǎng)細(xì)胞后構(gòu)建組織工程化生物角膜。該載體可以不加工或預(yù)加工后使用。使用該載體構(gòu)建角膜具有免疫原性很低，移植后厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長(zhǎng)入、角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細(xì)胞貼附牢固，細(xì)胞間和細(xì)胞與基底膜間生理連接正常的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61F2/14GK1473551SQ0314011
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者王智崇, 葛堅(jiān), 陳冬 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山眼科中心