專利名稱：生物誘導(dǎo)型活性人工角膜及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工角膜技術(shù)，特別涉及一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜及其使用方法。
背景技術(shù)：
角膜病是目前眼致盲的主要因素，全球患者約有1000萬人，我國也有約300萬角膜盲患者。但由于供體來源的匱乏，我國每年能進行的同種異體角膜移植術(shù)僅約為1000例，大量的患者因人體角膜的短缺得不到醫(yī)治，這是一個全球性長期未能解決的問題。由于眼免疫赦免現(xiàn)象和角膜的無血管特性，角膜移植術(shù)是全身組織器官移植中成功率最高的手術(shù)，因此，人工角膜及其移植優(yōu)于其他組織工程器官和組織的移植。目前已有的人工角膜有非活性人工角膜及無生物誘導(dǎo)性的組織工程人工角膜兩種，非活性人工角膜利用合成材料如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等制作的人工角膜，在進行人體移植時，雖可使人視力有所恢復(fù)，但視野范圍極小，人工合成材料難以和眼周圍組織相融合，植入后有異物感，容易出現(xiàn)角膜溶解、房水滲漏、人工角膜脫出以及眼內(nèi)炎等并發(fā)癥，給患者帶來很大的痛苦。而通常概念上的組織工程人工角膜是在體外強化的條件下，進行角膜細胞培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的細胞在支架材料上生長后，才使之具有生物活性；這種方法制作出的人工角膜雖然在與眼周圍組織相容性方面可能會有所改善，但由于它需要體外培養(yǎng)多種角膜細胞，而目前角膜細胞的獲得和培養(yǎng)的途徑和方法比較困難和不成熟，角膜細胞培養(yǎng)后的保存和傳代繁殖也存在問題，整個過程較復(fù)雜、費用高，異體角膜細胞在移植過程中的免疫排斥作用亦是面臨的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種與人眼組織具有良好的生物相容性、無須在體外進行細胞培養(yǎng)、使用方便、性能良好并可長期保存和長途輸運，便于進行規(guī)模生產(chǎn)和實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法和技術(shù)。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜包括如下組分——殼聚糖0.5％～3％膠原 0.5％～3％透明質(zhì)酸 0.1％～0.5％水93.5％～98.8％以上比例為重量百分比。
除上述組份外，為助于刺激自體生長因子富集的速度，本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜還可整合有角膜細胞生長因子如成纖細生長因子(FGF)，表皮細胞生長因子(EGF)和細胞轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)，用量為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺(EDC)交聯(lián)劑交聯(lián)，形成帶生長因子的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
制備上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的方法包括如下步驟(1)將殼聚糖溶于酸溶液，膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)混合各組分；(3)將混合液注入模具中并烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其達吸水平衡。
在步驟2的各組分混合均勻后可加入角膜細胞生長因子。
上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法是直接將本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜移植入人眼，在移植前，不需進行體外角膜細胞的培養(yǎng)；在移植入人眼之后，本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜與眼角膜組織相融合，誘導(dǎo)多種角膜細胞生長因子富集，刺激角膜細胞在其上生長繁殖，角膜細胞的生長與人工角膜材料的降解同步發(fā)展，最終整個人工角膜片長成為角膜組織。
具體地，上述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法包括下述步驟移植前將生物誘導(dǎo)型活性人工角膜預(yù)先在無菌蒸餾水浸泡12～48小時，使其達吸水平衡，再用消毒液浸泡2～3天，進行術(shù)前無菌消毒，然后根據(jù)臨床要求進行移植。
所述消毒液為生理鹽水與硫酸慶大霉素的混合液。
本發(fā)明的作用原理是人角膜組織主要由上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和膠原纖維及粘多糖構(gòu)成，膠原蛋白占角膜干重的75％，可從動物中大量提取，來源豐富且價格不貴，因此采用膠原作為本人工角膜支架的基質(zhì)材料。
從動物中提取的膠原，雖然在組成上與人體膠原相似，但在提取過程中其整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，提純后的膠原失去了強度，作為支架基質(zhì)材料，在體內(nèi)受膠原酶的作用，極易降解；為了彌補膠原的這些弱點，增強膠原的強度和控制其在體內(nèi)的降解率，采取加入殼聚糖的方法；殼聚糖是一種天然的生物氨基多糖，與角膜細胞間質(zhì)中的粘多糖有相似的結(jié)構(gòu)，成膜性好、強度高、外觀透明，在機體內(nèi)不被膠原酶降解，可緩慢地被溶菌酶降解，從而可以調(diào)節(jié)支架基質(zhì)材料的降解率，同時也可使用交聯(lián)劑對材料進行交聯(lián)，控制降解率。
透明質(zhì)酸屬粘多糖，它是構(gòu)成角膜細胞外和細胞間基質(zhì)的主要成分，具有粘彈性和大分子水合性，可促進和引導(dǎo)角膜細胞的生長繁殖，與膠原相結(jié)合形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)對角膜形態(tài)和正常生理狀態(tài)的維持具有重要作用，通過與角膜內(nèi)皮的結(jié)合，形成角膜組織表面的保護膜，控制體內(nèi)自由基對角膜細胞造成的損傷，透明質(zhì)酸分子中大量帶負電荷的羧基與眼表面的粘多糖成份中含有的羥基通過氫鍵結(jié)合，易于與眼表面親合。
生長因子對角膜細胞的培養(yǎng)、生長繁殖及與細胞外和細胞間基質(zhì)的結(jié)合有極大的影響，不同角膜細胞生長因子之間的協(xié)同效應(yīng)和用量對角膜細胞的生長繁殖可進行調(diào)控，其中成纖維細胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)，和表皮生長因子(EGF)對角膜細胞的生長繁殖、細胞間的正常融合及與基質(zhì)的結(jié)合均有促進作用。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(1)本發(fā)明生物誘導(dǎo)型活性人工角膜與眼組織具有優(yōu)良的相容性，與眼角膜細胞相融合，誘導(dǎo)多種角膜細胞生長因子富集，刺激角膜細胞在其上生長繁殖；在角膜移植和修復(fù)前，不需進行體外角膜細胞的培養(yǎng)，因而免除了體外培養(yǎng)角膜細胞的復(fù)雜過程和由異體角膜細胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)，以及由此而產(chǎn)生的各種并發(fā)癥，所以使用不但簡單方便，而且非常安全可靠，作用效果較好；(2)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的光學(xué)與力學(xué)特性，可根據(jù)有關(guān)要求進行各種加工成型，可作為人眼角膜較理想的替代品；已制作的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的光學(xué)力學(xué)指標與人角膜相似，如下所示材料透光率90～96％；材料折射率1.368～1.382(人眼角膜為1.377)；材料機械強度與人眼角膜相仿，其中濕態(tài)抗張強度4Mpa～8.6MPa；含水率55～75％；扯斷伸長率300％～350％；(3)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜比較適合成型加工，制作過程簡單、加工容易方便，所以可以大批量地制備使用；(4)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜易于長期保存和長途輸運，便于進行規(guī)模生產(chǎn)和實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；(5)本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的發(fā)明，不但對于人民健康有重要促進作用，可產(chǎn)生重要社會與經(jīng)濟效益，而且還為其它生物誘導(dǎo)型活性人工組織的研究開辟了道路，如采用類似的生物誘導(dǎo)方法可實現(xiàn)其它人工組織的直接植入，因而具有重要的科學(xué)意義。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步具體的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 2％膠原 2.5％透明質(zhì)酸 0.3％水 95.1％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于鹽酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖鹽酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌1.5小時，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.1％的碳二亞胺交聯(lián)劑，90ng/ml成纖細生長因子，35ng/ml表皮細胞生長因子和60ng/ml細胞轉(zhuǎn)化生長因子，再充分混合半小時；(4)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法是將生物誘導(dǎo)型活性人工角膜材料預(yù)先在無菌蒸餾水浸泡24h，使其達吸水平衡，用8mm直徑環(huán)鉆切剪成厚度0.3～0.5mm的小圓片，用生理鹽水與硫酸慶大霉素混合液浸泡2～3天，進行術(shù)前無菌消毒。然后根據(jù)臨床要求進行移植，移植時用碘酊消毒受體眼周圍，在其眼內(nèi)滴入1～2滴可卡因滴眼液麻藥進行局部麻醉；術(shù)后結(jié)膜下注射地塞米松和硫酸慶大霉素，結(jié)膜囊內(nèi)涂四環(huán)素可的松軟膏；術(shù)后每日滴涂硫酸慶大霉素滴眼液和四環(huán)素可的松軟膏，或結(jié)膜下注射地塞米松和硫酸慶大霉素，維持6～8周，8周后停藥，觀察時間為1～12個月，如發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)，即重復(fù)用藥。
實施例2本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1％膠原3％透明質(zhì)酸0.2％水 95.65％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)在混合均勻的混合液中加入0.15％的碳二亞胺交聯(lián)劑，5ng/ml成纖細生長因子，20ng/ml表皮細胞生長因子和10ng/ml細胞轉(zhuǎn)化生長因子，再充分混合半小時；(4)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法同實施例1。
實施例3本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖0.5％膠原 1.5％透明質(zhì)酸 0.3％水97.7％
以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法同實施例1。
實施例4本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜各組分的比例如下殼聚糖 1.5％膠原2％透明質(zhì)酸0.1％水 96.4％以上比例為重量百分比。
用上述各組分制備本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的過程包括如下步驟(1)按上述用量稱取各組分，將殼聚糖溶于醋酸溶液，將膠原和透明質(zhì)酸溶于水；(2)將殼聚糖醋酸溶液與膠原和透明質(zhì)酸的水溶液在室溫下攪拌2小時，使各組份充分混合均勻；(3)將混合液注入預(yù)制的角膜模具中，注滿角膜模具后將其放入烘箱內(nèi)烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除殘留雜質(zhì)，并使其在水中放置24～48小時以達到吸水平衡，然后取出即制得本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜。
本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法同實施例1。
觀察上述各實施例的移植結(jié)果可知植入的生物誘導(dǎo)型人工角膜材料能與角膜相容，角膜與材料之間相粘結(jié)，在與角膜相粘連的材料處可見角膜細胞并向材料內(nèi)部生長；材料兩個月在體內(nèi)的降解率約為30％。90天后取出染色作病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果表明角膜結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細胞，上皮無增厚及變薄，實質(zhì)層無水腫，內(nèi)皮結(jié)構(gòu)正常，材料基本都已長成角膜組織，與原角膜組織有良好的過渡，看不出差別。
權(quán)利要求
1.一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，包括如下組分殼聚糖 0.5％～3％膠原 0.5％～3％透明質(zhì)酸 0.1％～0.5％水 93.5％～98.8％以上比例為重量百分比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，其特征在于整合有角膜細胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，其特征在于所述角膜細胞生長因子為成纖細生長因子，表皮細胞生長因子和細胞轉(zhuǎn)化生長因子，用量分別為3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亞胺交聯(lián)劑交聯(lián)。
4.一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法，其特征在于不需進行體外角膜細胞的培養(yǎng)，直接將生物誘導(dǎo)型活性人工角膜移植入人眼，在體內(nèi)誘導(dǎo)自體角膜細胞長入，最終完全轉(zhuǎn)化成角膜組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法，其特征在于包括下述步驟移植前將生物誘導(dǎo)型活性人工角膜預(yù)先在無菌蒸餾水浸泡12～48小時，使其達吸水平衡，然后用消毒液浸泡2～3天，進行術(shù)前無菌消毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法，其特征在于所述消毒液為生理鹽水與硫酸慶大霉素的混合液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜，包括如下組分殼聚糖0.5％～3％、膠原0.5％～3％、透明質(zhì)酸0.1％～0.5％、水93.5％～98.8％，以上比例為重量百分比；為助于刺激自體生長因子富集速度，也可先在材料上整合角膜生長因子；一種生物誘導(dǎo)型活性人工角膜的使用方法，具體步驟為直接將生物誘導(dǎo)型活性人工角膜移植入人眼。本生物誘導(dǎo)型活性人工角膜具有與人眼角膜相似的特性，與眼組織的相容性好，適合成型加工，制作過程簡單，并易于長期保存和長途輸運，社會與經(jīng)濟效益較好；本人工角膜的使用方法簡單方便、安全可靠，作用效果較好，還為其它生物誘導(dǎo)型活性人工組織的研究開辟了道路，具有重要的科學(xué)意義。
文檔編號A61L27/50GK1461658SQ0211531
公開日2003年12月17日 申請日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者黃耀熊, 李沁華 申請人:暨南大學(xué)