專(zhuān)利名稱(chēng)：一種全層生物角膜及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物工程中的醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其涉及以異種角膜脫細(xì)胞 基質(zhì)為載體在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)構(gòu)建而成的全層生物角膜,這種生物角膜可用于 生理、藥理和病理學(xué)基礎(chǔ)研究，又可作為供體應(yīng)用于角膜移植和屈光手術(shù)。
背景技術(shù)：
角膜疾病是一種發(fā)病率高、治療困難的頑固性致盲眼病，各種原因所致的角 膜損傷、潰瘍、瘢痕及水腫混濁是當(dāng)今世界致盲的主要原因之一。目前治療角膜 混濁的主要方法是板層或穿透性角膜移植，但受到了角膜供體來(lái)源缺乏、角膜供
體老齡化、術(shù)后并發(fā)癥以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等現(xiàn)狀的限制。高分子PMMA等材 料的臨床應(yīng)用推動(dòng)了人工角膜的發(fā)展，使其成為繼供體來(lái)源角膜移植后另一種治 療途徑，但異質(zhì)性材料與生物組織之間的相容性問(wèn)題尚未完全解決，由此引起排 異、滲漏感染等嚴(yán)重的并發(fā)癥，其設(shè)計(jì)和植入方式還不夠成熟。
利用新興的生物工程和組織工程技術(shù)為體外構(gòu)建出全層生物角膜以替代供體 角膜移植提供了新的思路和和方法。然而生物角膜的構(gòu)建由于缺乏合適的載體和 近似生理的培養(yǎng)條件，使其研究停留在初步階段，雖然體外構(gòu)建人工角膜模型已 初具正常組織結(jié)構(gòu)和功能，但還不能用于移植。最早20世紀(jì)90年代Minami等以 膠原混合角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建出基質(zhì)層后再種角膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，得到初具角膜 三層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的雛形，近年來(lái)Griffith等用戊二醛交聯(lián)的膠原作為人工角膜的支 架，角膜成纖維細(xì)胞混合在膠原中培養(yǎng)，將上皮細(xì)胞培養(yǎng)在支架表層，內(nèi)皮細(xì)胞 培養(yǎng)在膠原支架的底層，從而構(gòu)建出與人角膜形態(tài)、結(jié)構(gòu)和組織特性功能相似的 角膜等效物。而中國(guó)專(zhuān)利CN 1579342A也公開(kāi)了"一種無(wú)細(xì)胞異種角膜基質(zhì)及制 備方法和用途"，其提供了一種可用于人工角膜構(gòu)建的無(wú)細(xì)胞異種角膜基質(zhì)。
已有研究用于生物角膜構(gòu)建的載體材料包括天然的細(xì)胞外基質(zhì)、天然和合成 高分子材料的復(fù)合物、有機(jī)材料同無(wú)機(jī)材料的復(fù)合物。常見(jiàn)的有膠原，聚乳酸、 甲殼素、殼聚糖、納米材料等，但尚未仿生制備出與角膜相近似的纖維板層結(jié)構(gòu)。 角膜構(gòu)建常用的這些載體也因透明性、機(jī)械強(qiáng)度、降解速度等參數(shù)并非最佳，構(gòu)建出的角膜都不夠理想。
要構(gòu)建出全層生物角膜，其核心是建立角膜細(xì)胞與生物材料的三維空間復(fù)合 體，載體支架是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場(chǎng)所，其形態(tài)和功能直接影響構(gòu)成的 組織形態(tài)與功能。角膜特有的結(jié)構(gòu)是維持角膜透明、屈光、通透性等正常生理功 能的重要因素，通過(guò)生物化學(xué)方法將細(xì)胞成分去除而保留正常組織的細(xì)胞外基質(zhì) 成份及結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞組織基質(zhì)作為支架，具有良好的生物學(xué)特性，而且來(lái)源廣泛。 脫細(xì)胞角膜基質(zhì)可保留正常角膜板層排列結(jié)構(gòu)，并具有良好的韌性和適合細(xì)胞生 長(zhǎng)的生理微環(huán)境，同時(shí)豬的角膜基質(zhì)雖為異種的天然同質(zhì)材料，但具有良好的生 物相容性，尤其是脫細(xì)胞處理后抗原性極低，是構(gòu)建生物角膜的良好載體。
傳統(tǒng)的角膜構(gòu)建方法都是在培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)，不利于組織和細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng) 交換和新陳代謝，而近年來(lái)生物反應(yīng)器在體外細(xì)胞培養(yǎng)和組織重建研究領(lǐng)域中發(fā) 揮越來(lái)越重要的作用，通過(guò)模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供不斷新鮮的營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)并帶走代謝產(chǎn)物，從而改善離體細(xì)胞的培養(yǎng)條件；同時(shí)細(xì)胞及組織在動(dòng)態(tài)中 更有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；細(xì)胞在生物反應(yīng)器中有一定程 度的三維空間自由，有利于細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間按組織學(xué)特性相互接觸，且 不易形成壞死中心。生物反應(yīng)器的上述特點(diǎn)使之成為組織工程化器官和組織體外 重建的理想裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的可用于移植的全層生物角膜，該全層生物角膜 以動(dòng)物角膜脫細(xì)胞基質(zhì)為載體，在所述脫細(xì)胞基質(zhì)上還有體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的動(dòng)物 角膜基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種全層生物角膜的構(gòu)建方法，該方法通過(guò)以 下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
(l)作為載體的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備取新鮮動(dòng)物角膜，機(jī)械法去除上皮層、 撕除后彈力層后，浸于含l%TritonX-100， 4匸振蕩72小時(shí)脫細(xì)胞，再用PBS 緩沖液反復(fù)振洗，組織采取切除前板層和后板層，保留中間三分之一厚基質(zhì)層， 靜置-80'C凍存過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入真空干燥處理24小時(shí)，所述脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用前分別 在PBS緩沖液和無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中復(fù)水，4。C保存?zhèn)溆茫?2) 基質(zhì)、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增無(wú)菌取另一動(dòng)物角膜，顯微鏡
下剝離所述角膜上皮層、基質(zhì)層，沿Descemet膜撕下內(nèi)皮層，取角膜緣上皮 lmmxlmm組織塊，貼壁法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM: F12=l: 1的培養(yǎng) 基中；基質(zhì)層用3%11型膠原酶，消化法制成細(xì)胞懸液種植于培養(yǎng)皿；胰酶消化 后彈力層上角膜內(nèi)皮細(xì)胞，種植培養(yǎng)基中；各細(xì)胞靜置37i:， 5。/。C02飽和濕度 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液，細(xì)胞生長(zhǎng)大于80%融合時(shí)，胰酶消化、離心，制成細(xì) 胞懸液，按1 : 2或1 :3分配接種于新的培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融 合后重復(fù)上述步驟依次傳代消化、傳代培養(yǎng)；
(3) 生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)三維角膜基質(zhì)層將角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋 白基因，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后制成濃度為2xl(^個(gè)/ml的細(xì)胞懸液于離心 管中，將制備的脫細(xì)胞基質(zhì)載體置入，抽真空使載體浸于細(xì)胞懸液中，2小時(shí)后 取出細(xì)胞載體復(fù)合物置于24孔板，再次制角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液，以lmlOT針筒 注入載體中央部位，為0.1ml/載體，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器；
(4) 角膜內(nèi)皮和上皮細(xì)胞種植于基質(zhì)及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)首先將生物反 應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)一周的基質(zhì)層取出置24孔板，內(nèi)皮面向上，將角膜內(nèi)皮細(xì)胞制細(xì)胞 懸液，滴加于內(nèi)皮面上，靜置培養(yǎng)大于4小時(shí)后轉(zhuǎn)入反應(yīng)器內(nèi)旋轉(zhuǎn)，20轉(zhuǎn)/分， 再次培養(yǎng)一周時(shí)取出，上皮面向上于培養(yǎng)皿，將角膜上皮細(xì)胞懸液滴加表面， 同樣靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)一周后終止。
本發(fā)明的再一目的是全層生物角膜在角膜移植、角膜屈光手術(shù)中作為醫(yī)用 材料的應(yīng)用。
本發(fā)明的主要特點(diǎn)在于通過(guò)生物化學(xué)方法制備的異種角膜脫細(xì)胞基質(zhì)在形 態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生物相容性是作為體外構(gòu)建生物角膜的良好載體，通過(guò)分別種植角 膜基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在生物反應(yīng)器中模擬體內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，可 在體外構(gòu)建出近似正常組織結(jié)構(gòu)和特性的全層生物角膜，這種生物角膜可用于模 擬生理性角膜進(jìn)行生理、病理和藥理學(xué)的基礎(chǔ)研究，同時(shí)也可作為供體直接用于 治療性角膜移植。


圖1顯示了制備的豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)載體支架結(jié)構(gòu)；圖2顯示了異種脫細(xì)胞基質(zhì)載體植入兔角膜基質(zhì)板層后宿主角膜； 圖3顯示了脫細(xì)胞基質(zhì)載體植片于宿主角膜基質(zhì)層間融合良好；
圖4顯示了構(gòu)建的三維基質(zhì)層內(nèi)GFP標(biāo)記的角膜基質(zhì)細(xì)胞鑲嵌于基質(zhì)支架內(nèi)
部；
圖5顯示了構(gòu)建的全層生物角膜組織大體形態(tài)；
圖6顯示了全層角膜具復(fù)層扁平上皮層，基質(zhì)板層和單層內(nèi)皮細(xì)胞； 圖7顯示了掃描電鏡下生物角膜表面上皮細(xì)胞呈疊層生長(zhǎng)，排列緊密； 圖8顯示了掃描電鏡下生物角膜內(nèi)皮細(xì)胞呈單層的多角形細(xì)胞鑲嵌排列； 圖9顯示了透射電鏡下角膜基質(zhì)細(xì)胞貼附于載體膠原纖維上，并分泌細(xì)胞外 基質(zhì)；
圖10顯示了生物角膜上皮層細(xì)胞特異性角蛋白CK3表達(dá)陽(yáng)性； 圖11顯示了生物角膜內(nèi)角膜基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白vimentin表達(dá)陽(yáng)性； 圖12顯示了生物角膜內(nèi)皮細(xì)胞水通過(guò)道蛋白AQP1表達(dá)陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例1豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其生物相容性
取新鮮豬角膜，機(jī)械法去除上皮層、撕除后彈力層后，浸于含l%TritonX-100， 4。C振蕩72小時(shí)脫細(xì)胞，再用PBS緩沖液反復(fù)振洗，組織采取切除前板層和后板 層，保留中間三分之一厚基質(zhì)層,靜置-80。C凍存過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入真空干燥處理24小 時(shí)。脫細(xì)胞基質(zhì)在應(yīng)用前分別在PBS緩沖液和無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中復(fù)水，4'C 保存?zhèn)溆?。制備的豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)維持角膜原有的基本形態(tài)和韌性，呈水腫的 半透明狀，掃描電鏡下基質(zhì)縱切面板層膠原纖維排列較整齊，波浪狀，較致密， 纖維間可見(jiàn)大小不等的孔隙(見(jiàn)圖1)。
將制備的豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)植片植入新西蘭大白兔角膜基質(zhì)囊袋中:將白兔 以速眠新2mg/kg肌注全身麻醉，配以2%利多卡因lml球后注射麻醉；以直徑為 7mm的環(huán)鉆在角膜表面作標(biāo)記，于角膜上方11點(diǎn)到1點(diǎn)鐘位置標(biāo)記處切開(kāi)角膜 深度約達(dá)1/3 1/2角膜厚度，然后在此板層平面作層間分離，鈍性分離基質(zhì)板層 間邊界達(dá)標(biāo)記處，形成一囊袋狀，用生理鹽水沖洗植床；將脫細(xì)胞基質(zhì)制成0.3mm厚、直徑為5mm的移植片，從切口處移入兔角膜囊袋中，虹膜恢復(fù)器將植片展平， 10-0尼龍線(xiàn)間斷縫合切口 。術(shù)后結(jié)膜下注射慶4萬(wàn)單位大霉素和2.5mg地塞米松， 涂四環(huán)素可的松眼藥膏。
移植后一周內(nèi)動(dòng)物角膜移植區(qū)有水腫，4周后角膜透明度逐漸恢復(fù)，觀(guān)察到 術(shù)后6個(gè)月角膜保持透明，未發(fā)生明顯的排斥反應(yīng)，亦無(wú)新生血管長(zhǎng)入(見(jiàn)圖2)。 通過(guò)取材角膜組織學(xué)觀(guān)察，脫細(xì)胞基質(zhì)植入受體后一直于基質(zhì)板層間，與宿主角 膜基質(zhì)融合較好，植入第8周時(shí)即可見(jiàn)宿主角膜基質(zhì)細(xì)胞于植入物上下兩端長(zhǎng)入 脫細(xì)胞基質(zhì)纖維內(nèi)(見(jiàn)圖3)，之后植入組織與宿主角膜板層逐漸融合難以觀(guān)察出 邊分界線(xiàn)。
實(shí)施例2兔角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
無(wú)菌取兔角膜，顯微鏡下剝離兔角膜上皮、基質(zhì)層，沿Descemet膜撕下內(nèi)皮 層。組織塊種植法培養(yǎng)原代角膜上皮細(xì)胞去除淺層上皮細(xì)胞后將角膜緣切成 lmmx2mm組織塊，上皮面朝下貼于培養(yǎng)皿底，孵箱中干燥半小時(shí)后加少量含10% 胎牛血清的DMEM/F12 (1: 1)培養(yǎng)基剛剛浸沒(méi)組織塊為好，過(guò)夜后添加培養(yǎng)液。 原代基質(zhì)細(xì)胞獲取采用聯(lián)合消化和組織塊法基質(zhì)層組織塊剪碎，置離心管中， 加入3%11型膠原酶熱消化，于37。C振搖40min左右。當(dāng)顯微鏡下觀(guān)察到組織塊松 散、形成網(wǎng)狀膠原絲，其間漂浮著圓圓透亮的細(xì)胞時(shí)即終止消化，加5倍體積的 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)靹蛘袷幤骱笥陔x心機(jī)中1500r/min離心5分鐘，棄上清液， 再加入PBS緩沖液洗滌，再次離心5分鐘，棄上清液，然后加入10%FBS的 DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)基，吹打混勻重懸，將細(xì)胞懸液和殘留未消化的組織塊 都接種于培養(yǎng)皿，先加少許培養(yǎng)基讓細(xì)胞和組織塊貼壁，次日添加培養(yǎng)基。通過(guò) 消化后彈力層上的內(nèi)皮細(xì)胞獲取原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)將撕下的后彈力層置 于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，內(nèi)皮面向上展平后加入含血清培養(yǎng)基，先置培養(yǎng)箱中孵育1天 后棄去培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液洗滌一次，然后加入0.25W胰酶-0.02。/。EDTA混 合消化液，37'C消化15min左右。顯微鏡下觀(guān)察到透明的后彈力層上六邊形細(xì)胞 鑲嵌排列，邊界清晰，逐漸細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙變大，當(dāng)搖晃培養(yǎng)皿，大部分細(xì) 胞從后彈力層上脫落時(shí)，加含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后于離心機(jī) 1500r/min離心5分鐘，棄上清液，再加入PBS緩沖液洗滌，再次離心5分鐘，棄上清液，加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)基制成2><104 3><104個(gè)/1111細(xì)胞懸液種植 直徑為35mm培養(yǎng)皿中。各細(xì)胞靜置37'C, 5%<:02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換 液。細(xì)胞生長(zhǎng)大于80%融合時(shí)，胰酶消化、離心，制成細(xì)胞懸液，按l :2或1 : 3分配接種于新的培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合后重復(fù)上述步驟依次傳 代。
培養(yǎng)的各角膜細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖良好，上皮細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞間相互銜接 鑲嵌，呈馬賽克狀；角膜基質(zhì)細(xì)胞為梭形的細(xì)胞排列緊密，譜呈旋渦狀、放射編 織狀圖案；內(nèi)皮細(xì)胞為六角形或多角形，細(xì)胞間鑲嵌緊密，呈鋪路石狀鋪于培養(yǎng) 皿底。各細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)增殖旺盛，可傳至10代以上，細(xì)胞形態(tài)和增殖率仍與原 代基本相似，足夠數(shù)量作為種子細(xì)胞種植載體，構(gòu)建全層生物角膜。
實(shí)施例3生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)三維角膜基質(zhì)層
首先將角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)， 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。角膜基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)近70% 80%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液， 將新鮮培養(yǎng)液和GFP重組腺病毒液以2: l的比例加入培養(yǎng)皿，置37"C， 5%C02 飽和濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日棄去混合液，用PBS緩沖液洗滌兩次，去除殘留病 毒顆粒，然后再次加入新鮮含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，熒光顯微鏡下觀(guān)察 細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光后，可用于種植角膜脫細(xì)胞基質(zhì)載體。
將GFP標(biāo)記的角膜基質(zhì)細(xì)胞消化、離心后制成濃度為2xl06/ml的細(xì)胞懸液， 以lmlOT針筒注入載體中央部位，約O.lml/載體，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生物反 應(yīng)器，生物反應(yīng)器內(nèi)角膜組織在旋轉(zhuǎn)輪帶動(dòng)下，在培養(yǎng)液中輕微浮動(dòng)。培養(yǎng)一周 后，取出細(xì)胞-支架復(fù)合組織，于激光共集焦顯微鏡下觀(guān)察基質(zhì)細(xì)胞與載體的三維 結(jié)構(gòu)，通過(guò)GFP標(biāo)記角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光，可見(jiàn)基質(zhì)細(xì)胞鑲嵌在載體支 架內(nèi)，較均勻的生長(zhǎng)，分布于不同板層間，形成三維立體結(jié)構(gòu)的基質(zhì)層(見(jiàn)圖4)。
實(shí)施例4角膜內(nèi)皮和上皮細(xì)胞種植于基質(zhì)及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)
首先將生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)一周的基質(zhì)層取出置培養(yǎng)皿中，內(nèi)皮面向上，然后 將培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞制細(xì)胞懸液，滴加于內(nèi)皮面上，靜置培養(yǎng)大于4小時(shí)后轉(zhuǎn) 入反應(yīng)器內(nèi)懸浮動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。再次培養(yǎng)一周時(shí)取出，此時(shí)將復(fù)合物上皮面朝上于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞懸液滴加其表面，同樣靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生
物反應(yīng)器懸浮動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)一周后終止。
終止培養(yǎng)后，取出重建角膜組織，肉眼觀(guān)察其大體形態(tài)透明度和厚度情況。
部分組織用中性福爾馬林固定24小時(shí)，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片HE染色， 光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察重建角膜組織結(jié)構(gòu)。掃描電鏡觀(guān)察上皮和內(nèi)皮面細(xì)胞在脫細(xì)胞 基質(zhì)載體上生長(zhǎng)形態(tài)結(jié)構(gòu)，透射電鏡觀(guān)察基質(zhì)細(xì)胞在載體板層間生長(zhǎng)及活力情況。 對(duì)重建角膜組織各層細(xì)胞分泌蛋白進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，上皮層檢測(cè)角膜上皮特異 性角蛋白CK3;對(duì)基質(zhì)層細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白vimentin檢測(cè)；對(duì)內(nèi)皮層檢測(cè)與角膜 內(nèi)皮細(xì)胞泵功能密切相關(guān)的水通道蛋白AQP1 。
生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建的全層生物角膜薄而透明，為圓盤(pán)狀，有一定的曲率和彎 度，直徑8-10mm，厚度400-600pm，與正常哺乳動(dòng)物角膜組織形態(tài)基本相同(見(jiàn) 圖5)。通過(guò)組織切片HE染色對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)以角膜脫細(xì)胞基質(zhì)載體構(gòu) 建出的角膜組織初具角膜的全層結(jié)構(gòu)，上皮層為復(fù)層扁平細(xì)胞層，基質(zhì)層為膠原 纖維板層及其間鑲嵌生長(zhǎng)的梭形基質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮面為一單層連續(xù)的扁平細(xì)胞層， 組織學(xué)上更近似正常角膜組織結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖6)。對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的生物角膜各 層細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀(guān)察可見(jiàn)，在脫細(xì)胞基質(zhì)載體的上皮表面，細(xì)胞呈多層重 疊生長(zhǎng)，排列整齊，細(xì)胞為扁平形，體態(tài)飽滿(mǎn)，相互緊密連接，并在形態(tài)上向梭 形變異，有的細(xì)胞表面有微絨毛(見(jiàn)圖7);在載體內(nèi)皮面生長(zhǎng)的細(xì)胞為單層的多 角形細(xì)胞鑲嵌排列，呈現(xiàn)典型的內(nèi)皮細(xì)胞鑲嵌樣外觀(guān)，細(xì)胞形態(tài)較飽滿(mǎn)，細(xì)胞間 相互連接緊密(見(jiàn)圖8);角膜基質(zhì)細(xì)胞貼附于載體膠原纖維上，細(xì)胞內(nèi)多內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 等細(xì)胞器，并可見(jiàn)吞噬顆粒，細(xì)胞旁有細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分(見(jiàn)圖9)。對(duì) 全層生物角膜各層細(xì)胞分泌蛋白進(jìn)行檢測(cè)，角膜上皮層細(xì)胞表達(dá)角膜上皮特異性 角蛋白CK3 (見(jiàn)圖10);基質(zhì)層細(xì)胞，胞漿中有棕色顆粒，即表達(dá)波形蛋白(見(jiàn) 圖11);對(duì)內(nèi)皮層檢測(cè)與泵功能相關(guān)的水通道蛋白AQP1，免疫組化結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性， 角膜內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)水通道蛋白(見(jiàn)圖12)。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信閱讀了本發(fā)明上述公開(kāi)的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明，可作各種改動(dòng)或修改，因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理 解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1、一種全層生物角膜，以動(dòng)物角膜脫細(xì)胞基質(zhì)為載體，其特征在于，在所述脫細(xì)胞基質(zhì)上還有體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的動(dòng)物角膜基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。
2、 如權(quán)利要求1所述的全層生物角膜的制備方法，其特征在于通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1) 作為載體的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備:取新鮮動(dòng)物角膜，機(jī)械法去除上皮層、撕除后彈力層后，浸于含l%TritonX-100， 4"C振蕩72小時(shí)脫細(xì)胞，再用PBS 緩沖液反復(fù)振洗，組織采取切除前板層和后板層，保留中間三分之一厚基質(zhì)層, 靜置-80'C凍存過(guò)夜后，轉(zhuǎn)入真空干燥處理24小時(shí)，所述脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用前分別 在PBS緩沖液和無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中復(fù)水，4t:保存?zhèn)溆茫?2) 基質(zhì)、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增無(wú)菌取另一動(dòng)物角膜，顯微鏡 下剝離所述角膜上皮層、基質(zhì)層，沿Descemet膜撕下內(nèi)皮層，取角膜緣上皮 lmmxlmm組織塊，貼壁法培養(yǎng)于含10%胎牛血清且DMEM: F12=l: 1的培養(yǎng) 基中；基質(zhì)層用3%11型膠原酶，消化法制成細(xì)胞懸液種植于培養(yǎng)皿；胰酶消化 后彈力層上角膜內(nèi)皮細(xì)胞，種植培養(yǎng)基中；各細(xì)胞靜置37"， 5。/。C02飽和濕度 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液，細(xì)胞生長(zhǎng)大于80%融合時(shí)，胰酶消化、離心，制成細(xì) 胞懸液，按1 : 2或1 : 3分配接種于新的培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融 合后重復(fù)上述步驟依次傳代消化、傳代培養(yǎng)；(3) 生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)三維角膜基質(zhì)層將角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋 白基因，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后制成濃度為2xl()S個(gè)/ml的細(xì)胞懸液于離心 管中，將制備的脫細(xì)胞基質(zhì)載體置入，抽真空使載體浸于細(xì)胞懸液中，2小時(shí)后 取出細(xì)胞載體復(fù)合物置于24孔板，再次制角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液，以lmlOT針筒 注入載體中央部位，為0.1ml/載體，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器；(4) 角膜內(nèi)皮和上皮細(xì)胞種植于基質(zhì)及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)首先將生物反 應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)一周的基質(zhì)層取出置24孔板，內(nèi)皮面向上，將角膜內(nèi)皮細(xì)胞制細(xì)胞 懸液，滴加于內(nèi)皮面上，靜置培養(yǎng)大于4小時(shí)后轉(zhuǎn)入反應(yīng)器內(nèi)旋轉(zhuǎn)，20轉(zhuǎn)/分， 再次培養(yǎng)一周時(shí)取出，上皮面向上于培養(yǎng)皿，將角膜上皮細(xì)胞懸液滴加表面， 同樣靜置培養(yǎng)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)一周后終止。
3、 如權(quán)利要求l所述的全層生物角膜，其在角膜移植、角膜屈光手術(shù)中作為醫(yī)用材料的應(yīng)用。
4、如權(quán)利要求2所述的全層生物角膜制備方法制備的全層生物角膜，其在 角膜移植、角膜屈光手術(shù)中作為醫(yī)用材料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種新的可用于移植的全層生物角膜，該全層生物角膜以動(dòng)物角膜脫細(xì)胞基質(zhì)為載體，在所述脫細(xì)胞基質(zhì)上還有體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的動(dòng)物角膜基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明的主要特點(diǎn)在于通過(guò)生物化學(xué)方法制備的異種角膜脫細(xì)胞基質(zhì)在形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生物相容性是作為體外構(gòu)建生物角膜的良好載體，通過(guò)分別種植角膜基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在生物反應(yīng)器中模擬體內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，可在體外構(gòu)建出近似正常組織結(jié)構(gòu)和特性的全層生物角膜，這種生物角膜可用于模擬生理性角膜進(jìn)行生理、病理和藥理學(xué)的基礎(chǔ)研究，同時(shí)也可作為供體直接用于治療性角膜移植。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101433478SQ20071017040
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2007年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者瑤 傅, 范先群 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院