專利名稱：添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種用于食品安 全的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
PCR，英文polymerase chain reaction的縮寫，是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。單 核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種重要的食源性致病菌， 為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，廣泛分布于自然界，并可在低溫下(4-8'C)生長(zhǎng)，單核細(xì)胞增 生李斯特菌主要是通過(guò)食品(特別是動(dòng)物性食品)傳播、感染人體。與其它食源 性致病菌例如沙門氏菌引起的疾病相比，食源性李斯特菌病是一種十分嚴(yán)重的疾 病，其死亡率高達(dá)20—30% ，被WHO食品安全工作計(jì)劃列為重點(diǎn)檢測(cè)的四大食源 性致病菌(沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7、副溶血弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌) 之一。我國(guó)食源性疾病監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)單核細(xì)胞增生李斯特菌中毒的 發(fā)生規(guī)模和單核細(xì)胞增生李斯特菌人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重地阻礙著 經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和影響人民的健康。因此，通過(guò)發(fā)展快速的檢測(cè)技術(shù)來(lái)解決食品安全 問(wèn)題是國(guó)家的迫切需求。我國(guó)目前對(duì)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方 法還是采用一些傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，這些方法存在操作過(guò)程復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、很難 及時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果等諸多缺陷，己不能滿足食品生產(chǎn)與消費(fèi)中對(duì)致病菌快速檢測(cè) 的需要。
在1990年，Bessesen MT等人率先以單核細(xì)胞增生李斯特菌帶有的編碼溶血 素0基因(Hemolytic factor gene，簡(jiǎn)稱hly基因)設(shè)計(jì)引物，用于單核細(xì)胞增 生李斯特菌的PCR檢測(cè)，詳見(jiàn)Bessesen MT， Luo QA, Rotbart HA， et al. "D etection of Listeria monocytogenes by using the polymerase chain react ion，， . Applied and Environmental Microbiology. 1990, 56(9): 2930-2932. (Bessesen MT， Luo QA， Rotbart HA, et al,等."運(yùn)用PCR方法檢測(cè)單核細(xì) 胞增生李斯特菌"，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，1990, 56(9): 2930-2932頁(yè))。此后，
針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的PCR檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始廣泛應(yīng)用，用于檢測(cè)的基因不斷 的增多，設(shè)計(jì)的引物也日益多樣。
目前，PCR方法在不同的實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)部門所檢測(cè)的目的基因和操作流程有
一定的差異，沒(méi)有形成標(biāo)準(zhǔn)，得到的檢測(cè)結(jié)果也不盡相同。近年來(lái)的實(shí)踐應(yīng)用表
明，食品和培養(yǎng)基中存在的抑制劑可影響PCR反應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。盡管P CR方法在不斷的改進(jìn)和完善，卻不能有效地阻止假陰性結(jié)果的發(fā)生。
有些學(xué)者開(kāi)始認(rèn)識(shí)到在PCR反應(yīng)體系放置指示假陰性的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(internal amplification control, IAC)是必要的。在2003年，Malomy等人利用分子克隆的 方法，人工構(gòu)建的一條157bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)片段，并在試驗(yàn)結(jié)果中能夠指示出假陰 性的發(fā)生。詳見(jiàn)Malomy B， Hoorfar J, Bunge C， et al. Multicenter Validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: toward an international standard. Applied and environment microbiology. 2003, 69(1): 290-296. (Malomy B, Hoorf ar J, Bunge C，等.多渠道確證沙門氏菌PCR檢測(cè)的正確性期望形成一項(xiàng)國(guó)際 標(biāo)準(zhǔn).應(yīng)用與環(huán)境微生物.2003， 69(1): 290-296.)。
2005年Rodriguez-Ldzaro D等首次將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)運(yùn)用于單核細(xì)胞增生李斯特 菌的熒光定量PCR檢測(cè)，詳見(jiàn)Rodriguez-Ldzaro D, Pla M， Scortti M， et al.
"A novel real—time PCR for Listeria monocytogenes that monitors anal ytical performance via an internal amplification control". Applied and Environmental Microbiology. 2005， 71(12): 9008-9012. (Rodriguez-Ldzaro D， PlaM， Scortti M，等."一種含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌熒光定量 PCR檢測(cè)方法"，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，2005, 71(12): 9008-9012頁(yè))。但是熒 光定量方法對(duì)儀器設(shè)備要求很高，需另外設(shè)計(jì)熒光探針，并且試驗(yàn)試劑及探針成 本昂貴，不利于普及運(yùn)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種添有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì) 胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明利用生物信息技術(shù)的方法，重新根據(jù)hly 基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，同時(shí)人工合成了一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列用于單核細(xì)胞增生 李斯特菌的普通PCR檢測(cè)，在確保檢測(cè)準(zhǔn)確性與高效性的同時(shí)大大降低檢測(cè)成本， 進(jìn)一步推動(dòng)單核細(xì)胞增生李斯特菌的PCR.檢測(cè)技術(shù)成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明具體步驟如下
(1) 構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，即人工合成一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的特異引物；
(2) 通過(guò)對(duì)MgCl2濃度和退火溫度Tm值進(jìn)行優(yōu)化選擇，使PCR反應(yīng)體系處于 最優(yōu)的反應(yīng)條件；
所述的對(duì)MgCl2濃度和退火溫度Tm值進(jìn)行優(yōu)化選擇，具體為根據(jù)引物設(shè)計(jì) 時(shí)推薦的Tm值，在Tm土5"C范圍內(nèi)以rC間隔設(shè)置溫度梯度，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電 泳圖中的亮度來(lái)選擇退火溫度，'在確定退火溫度后，在反應(yīng)體系中設(shè)置一系列的 Mg2+濃度的梯度，從1. Ommol/L到3. Omraol/L，間隔0. 5ramol/L，同樣根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn) 物在電泳圖中的亮度來(lái)選擇PCR反應(yīng)體系的Mg"濃度。
(3) 首先經(jīng)過(guò)測(cè)定的單核細(xì)胞增生李斯特菌總DNA溶液用無(wú)菌水作10倍梯度 稀釋至10—8，以稀釋的DNA溶液為模板，分別取5 u L加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR 檢測(cè)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA模板作陰性對(duì)照，以無(wú)菌水代替DNA模 板作空白對(duì)照，確定PCR的檢測(cè)靈敏度；然后，取帶有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的載體，添加到 PCR反應(yīng)體系中通過(guò)向反應(yīng)體系中添加不同稀釋濃度的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)DNA或菌 株的靈敏度，選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度影響最小且能夠明確指示假陰性的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的濃 度作為添加濃度；
(4) 提取不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特菌和不同種屬的非單核細(xì)胞增生 李斯特菌菌株的DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定引物的特異性及擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)在非單核細(xì)胞 增生李斯特菌樣品檢測(cè)中是否能夠正常擴(kuò)增；
(5) 通過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)和人工污染實(shí)驗(yàn)對(duì)所建立的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)通
過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)判斷PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)定性；通過(guò)檢測(cè)人工污染樣品判斷擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)
是否指示假陰性，以此來(lái)評(píng)價(jià)建立的PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確。 所述的抗干擾實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)方法為-
將金黃色葡萄球菌(S.aureus)、沙門氏菌(S. choleraesuis)、和大腸桿菌(E.coli) 作為干擾菌株，提取它們的DNA加入到單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)體系中， 以檢測(cè)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)靈敏度的影響。
所述的人工污染樣品，其檢測(cè)方法為 (1)取單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC54002菌液lml接入100ml UVM改良李斯 特菌增菌液，設(shè)空白對(duì)照；(2) 采集40份雞肉樣品，無(wú)菌取樣品25g (mL)放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋 中，加225mL UVM改良李斯特菌增菌液，充分均質(zhì)。在37'C的搖床中增菌培養(yǎng)， 并且在增菌8h后取樣；
(3) 每份樣品取樣lmL，放入1. 5mL離心管中，12 000r/min離心lmin， 收集單核細(xì)胞增生李斯特菌菌體；
(4) 用無(wú)菌雙蒸水洗滌一次，12 000r/min離心lmin;然后加入100uL無(wú) 菌超純水重懸菌體，在沸水浴中煮10min;從沸水浴中取出后，立即在-2(TC放置 lOmin;
(5) 解凍后，12 000r/min離心5min，上清液為PCR模板DNA溶液，分別取 5yL加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA模板 作陰性對(duì)照，以無(wú)菌水代替DNA模板作空白對(duì)照。
所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)DNA序列是人工合成的，在確保擴(kuò)增效率的同時(shí)與單核細(xì)胞 增生李斯特菌及其它細(xì)菌的基因組非同源。在此DNA序列的兩端分別含有檢測(cè)引 物的序列。其用途是顯示假陰性的發(fā)生，提高PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確率。
所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，是指人工設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，減少了非單核細(xì)胞增生李 斯特菌(綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、西爾李斯特菌、格 氏李斯特菌、墨氏李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血弧 菌等)的DNA對(duì)PCR檢測(cè)的干擾，同時(shí)也避免了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)目的基因的同源交聯(lián) 干擾。降低擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)目的基因在檢測(cè)過(guò)程中的干擾，增加檢測(cè)的準(zhǔn)確率。
所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的構(gòu)建方法，具體如下采用序列分析、基因比對(duì)的手段選 擇用于構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的特異基因序列，并與檢 測(cè)的目的基因的同源性極低；將所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列人工合成，并克隆到載體 中；采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移上述帶有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的載體到大腸桿菌(E. coli 5a )中， 然后涂布于選擇性平板(90mm培養(yǎng)皿，100mg/ml氨芐青霉素10u 1， 20°/。的IPTG 溶液1， 2%的X-gal溶液40u 1)上，37。C培養(yǎng)12h。用滅菌的牙簽從選擇性平 板上挑取白色菌落，接菌到裝有5ml LB培養(yǎng)液的PA瓶中，再在37'C下以150r/min 培養(yǎng)8h，提取質(zhì)粒pMD-hlys的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，確定獲得轉(zhuǎn)化子。
所述的載體，其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，在實(shí)例中它是大腸桿菌，其中包含有擴(kuò)增 內(nèi)標(biāo)的DNA片段。
所述的特異引物，是指 一對(duì)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的PCR檢測(cè)的檢測(cè)
引物(hlysF/sR)，進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，其能擴(kuò)增到單核細(xì)胞增生李斯特菌種菌株特
有的檢測(cè)基因，或者是PCR體系中添加的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)。
所述的一段用于構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的DNA序列，此序列是人工設(shè)計(jì)合成的。 所述的目的基因，是指單核細(xì)胞增生李斯特菌的hly基因。 所述的假陰性，是指PCR反應(yīng)受到了食品或培養(yǎng)基等物質(zhì)中存在的抑制劑的
影響而沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)，或者是由于操作人員的操作失誤導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)陰性。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘
粒等。將用于作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的基因序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而帶有擴(kuò)
增內(nèi)標(biāo)的載體。
本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法是在普通PCR方法的基礎(chǔ)上添加了一條擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的片 段，采用生物信息技術(shù)的方法，在同一PCR擴(kuò)增過(guò)程中，可以用同一檢測(cè)引物與 目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)樣品中含有單核細(xì)胞增生李斯特菌的DNA含量高于檢 測(cè)靈敏度時(shí)，電泳結(jié)果中含有目的基因的擴(kuò)增片段，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；當(dāng)樣品中 不含或者低于檢測(cè)靈敏度時(shí)，電泳結(jié)果中只含有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增片段，檢測(cè)結(jié)果 為陰性；當(dāng)電泳結(jié)果中不含有任何擴(kuò)增片段時(shí)，檢測(cè)結(jié)果即為假陰性。該方法有 助于PCR檢測(cè)體系能夠顯示假陰性的發(fā)生，避免了因樣品中存在的抑制劑或操作 失誤所導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性而作出的結(jié)果誤判，從而提高PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確率， 為滿足檢疫執(zhí)法過(guò)程中所急需的對(duì)食源性致病菌調(diào)査和檢測(cè)提供有效可靠的技術(shù) 手段。


圖1未添加IAC時(shí)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)的靈敏度示意圖
圖中電泳泳道1 7:每個(gè)PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為
7.30ng/uL， 730pg/uL, 73.0pg/uL， 7.30pg/uL, 730fg/uL， 73.0fg/uL，
7. 30fg/ u L;電泳泳道8:陰性對(duì)照(金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA)，電泳泳道9:空
白對(duì)照(朋20)。 M: 100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2添加IAC8. 02X 104拷貝時(shí)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)靈敏度示意圖 圖中電泳泳道1 7:每個(gè)PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為
7.30ng/pL， 730pg/uL, 73.0pg/ixL， 7.30pg/uL, 730fg/uL， 73.0fg/ixL,
7. 30fg/ n L;電泳泳道8:陰性對(duì)照(金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA)，電泳泳道9:空 白對(duì)照(朋20)。 M: 100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3單核細(xì)胞增生李斯特菌菌落靈敏度的檢測(cè)示意圖
圖中電泳泳道1 6:每個(gè)PCR反應(yīng)中所含有的單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌
落數(shù)依次為1. 16X106 cfu/uL， 1. 16X105cfu/uL， 1. 16X 104 cfu/u L， 1. 16X103 cfu/nL， 116 cfu/ixL， 11.6cfu/uL;電泳泳道7:陰性對(duì)照(金黃色葡萄球菌 標(biāo)準(zhǔn)株DNA)，電泳泳道8:空白對(duì)照(dH20)。 M: lOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 圖4單核細(xì)胞增生李斯特菌抗干擾實(shí)驗(yàn)示意圖
圖中電泳泳道1 7: 每個(gè)PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為
7.30ng/uL， 730pg/uL， 73.0pg/uL， 7.30pg/uL， 730fg/uL， 73. Ofg/uL，
7.30fg/uL;電泳泳道8:陰性對(duì)照(金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA)，電泳泳道9:空
白對(duì)照(朋20)。 M: 100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí) 施例。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例
一、檢測(cè)體系初步建立 1.選取檢測(cè)的目的基因
利用生物信息學(xué)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的已知特異基因進(jìn)行分析，從中選 出用于檢測(cè)的目的基因hly。通過(guò)Genbank中公用的BLAST軟件(為現(xiàn)有技術(shù)，共 用免費(fèi))，將hly基因的序列與其他微生物進(jìn)行比對(duì)，選出特異性較高的序列區(qū)段。 然后用軟件Primer 5.0 (為現(xiàn)有技術(shù)，市售，Premier公司，加拿大)在這段特 異序列中設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物。引物序列如下
hlysF: 5， - TATCCAGGTGCTCTCGT -3，
hlysR: 5， -ACTGTAAGCCATTTCGTC _3，
(a) 檢測(cè)目的基因的序列特征 *長(zhǎng)度264堿基對(duì) *類型核酸
*鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(b) 分子類型DNA
(C) 最初來(lái)源單核細(xì)胞增生李斯特菌
(d) 序列描述SEQ ID NO. 1:
TCAAGCTTATCCCAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGT 序列中下劃線部分的字母代表引物hlysF和hlysR的位置。 2. PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
通過(guò)對(duì)退火溫度和Mg2+濃度的優(yōu)化，確定的反應(yīng)體系如下
10 X buffer 2.5iU
MgCV溶液(25 mM) 1. 5ix 1
dNTP (2.5 mM) l.Oy 1
上下游引物(各10uM) 0.5u1+0.5p1
Taq DNA聚合酶(1 U/p 1) 1 u 1
模板 5. 0 1
補(bǔ)無(wú)菌水至 25 ul
PCR循環(huán)參數(shù)為在95。C預(yù)變性3min，接著作35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序 包括95。C變性30s，退火溫度56。C，退火時(shí)間為30s，然后在72。C延伸30s，循 環(huán)結(jié)束后在72'C延伸10min，最后降溫至4'C，結(jié)束所有操作程序。
二、擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的制備
1.選取用于制備擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的基因序列
所述的構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，是指人工設(shè)計(jì)合成的一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列，減少了非 單核細(xì)胞增生李斯特菌(綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、西 爾李斯特菌、格氏李斯特菌、墨氏李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門 氏菌、副溶血弧菌等)的DNA對(duì)PCR檢測(cè)的干擾，同時(shí)也避免了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)目的
基因的同源交聯(lián)干擾。使擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)降低對(duì)目的基因在檢測(cè)過(guò)程中的干擾，增加檢 測(cè)的準(zhǔn)確率。
(a) 構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的基因序列特征 *長(zhǎng)度184堿基對(duì)
*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形
(b) 分子類型DNA
(C)最初來(lái)源人工合成
(d) 序列描述SEQ ID NO. 2:
GTGACTGCGAGCGAATTACTATTTGAATTCGACGAMTGGCTTACAGT
序列中下劃線部分的字母代表引物hlysF和hlysR的位置，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度 184bp。
2. 連接 .
按PCR回收Kit說(shuō)明書(shū)回收擴(kuò)增產(chǎn)物片段?；厥盏臄U(kuò)增產(chǎn)物片段與pMD18-T 載體在Ligation Solution I作用下16。C過(guò)夜。
3. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌
用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用藍(lán)白斑篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽(yáng)性克隆。
4. 檢測(cè)
利用特異引物(hlysF和hlysR)對(duì)篩選的大腸桿菌陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)， 并對(duì)PCR檢測(cè)所確定的大腸桿菌陽(yáng)性克隆抽取質(zhì)粒pMD-hlys的DNA進(jìn)一步進(jìn)行測(cè) 序驗(yàn)證。
三、模板DNA的靈敏度測(cè)定1. 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)及單核細(xì)胞增生李斯特菌純培養(yǎng)總DNA的定量測(cè)定 純化的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)和單核細(xì)胞增生李斯特菌純培養(yǎng)的總DNA,經(jīng)DU-800紫外分光
光度計(jì)(Beckman Coulter)測(cè)量，其含量分別為24. 9ng/n L和36. 5ng/u L。根據(jù)
計(jì)算公式N Copies/uL=PCR片段的質(zhì)量(g/uU / (660g/molX堿基
數(shù))X (6. 023X lCn可以得至Ul u L擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的拷貝數(shù)為8 . 02X 109。
2. 未添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)時(shí)的檢測(cè)靈敏度
將上述經(jīng)過(guò)測(cè)定的單核細(xì)胞增生李斯特菌總DNA溶液用無(wú)菌水作10倍梯度稀 釋，從36.5ng/uL-36. 5fg/uLDNA溶液中分別取5uL加入PCR反應(yīng)體系，使每 個(gè)PCR反應(yīng)體系(25uL)分別含DNA為7. 30ng/u L， 730pg/wL, 73.0pg/"， 7. 30pg/nL， 730fg/uL， 73.0fg/yL， 7. 30fg/yL。擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，只是 含7. 64f g/ w L DNA的PCR反應(yīng)體系沒(méi)有目標(biāo)序列擴(kuò)增帶，而其他PCR反應(yīng)體系均 有目標(biāo)序列擴(kuò)增帶。因此，其檢測(cè)靈敏度為73.0fg/wL (如圖l所示)。
3. 添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)后的檢測(cè)靈敏度
純化的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)先用無(wú)菌水作10倍梯度稀釋，從8.02X 106拷貝/pL-802 拷貝/wL。然后在上述的PCR檢測(cè)體系中分別加入擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，研究擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)靈 敏度的影響。當(dāng)PCR反應(yīng)體系添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的量為8 . 02X 104拷貝時(shí)，其檢測(cè)靈敏 度仍然為73.0fg/wL，且擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰(如圖2所示)。當(dāng)PCR 反應(yīng)體系添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的量小于8.02X104拷貝時(shí)，由于擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒 光強(qiáng)度較弱，達(dá)不到指示假陰性結(jié)果的目的而沒(méi)有采用。因此，添加8.02X104 拷貝的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)上述PCR檢測(cè)體系的靈敏度幾乎沒(méi)有影響，在本實(shí)施例建立的 PCR檢測(cè)體系中則采用8 . 02 X 104拷貝的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)。
4. 菌落靈敏度的檢測(cè)
從試管斜面或平板上，挑取單核細(xì)胞增生李斯特菌接入U(xiǎn)VM改良李斯特菌增 菌液中，經(jīng)8小時(shí)增菌之后，用生理鹽水作10倍梯度稀釋，共稀釋了9個(gè)梯度， 同時(shí)用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算副溶血弧菌的菌落濃度。經(jīng)計(jì)算，APW液體培養(yǎng)基中單核細(xì) 胞增生李斯特菌的菌落濃度為5. 8X 108 cfu/mL。經(jīng)PCR擴(kuò)增之后，每個(gè)PCR反應(yīng) 體系(25yL)中可檢測(cè)到的菌落靈敏度為116cfu/yL (如圖3所示)。
四、特異性檢測(cè)
采用本實(shí)施例建立的PCR檢測(cè)體系對(duì)6株單核細(xì)胞增生李斯特菌和66株非單
核細(xì)胞增生李斯特菌分別進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA為模 板皆能擴(kuò)增出264bp的目標(biāo)序列特異產(chǎn)物和184bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物，而以非單核 細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA為模板時(shí)只能擴(kuò)增出184bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物。 五、PCR檢測(cè)體系評(píng)價(jià)
1. 抗干擾實(shí)驗(yàn)
將金黃色葡萄球菌(S.aureus)、沙門氏菌(S. choleraesuis )、和大腸桿菌(E.coli) 作為干擾菌株，提取它們的DNA加入到單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)體系中(每 個(gè)PCR反應(yīng)體系分別含單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA為7. 30ng/u L， 730pg/u L， 73. Opg/uL， 7.30pg/", 730fg/uL， 73.0fg/uL， 7.30fg/yL)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，在金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、和大腸桿菌的干擾下，單核細(xì)胞增生 李斯特菌DNA檢測(cè)靈敏度不受影響，仍為73.0fg/txL (如圖4所示)，具有良 好的穩(wěn)定性。
2. 人工污染樣品的檢測(cè)
取單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC54002菌液1ml接入100mlUVM改良李斯特菌增 菌液，設(shè)空白對(duì)照；采集40份雞肉樣品，無(wú)菌取樣品25g (mL)放入滅菌均質(zhì)杯 或均質(zhì)袋中，加225mLUVM改良李斯特菌增菌液，充分均質(zhì)。在37'C的搖床中增菌 培養(yǎng)，并且在增菌8h后取樣。提取單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢 測(cè)結(jié)果中有38份為陽(yáng)性，2份假陰性(沒(méi)有目標(biāo)序列和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物)，陰 性對(duì)照與空白對(duì)照僅有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物。出現(xiàn)假陰性的 樣品經(jīng)過(guò)重新純化DNA后，再次進(jìn)行檢測(cè)，假陰性樣品均顯示為陽(yáng)性結(jié)果。這說(shuō) 明從這2份假陰性樣品中提取得到的模板DNA溶液中存在干擾因子，本實(shí)施例建 立的檢測(cè)體系在進(jìn)行大量樣品檢測(cè)時(shí)確實(shí)能夠指示假陰性，有助于提高檢測(cè)的準(zhǔn) 確率。
權(quán)利要求
1、一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)人工合成一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的特異引物；(2)通過(guò)對(duì)MgCl2濃度和退火溫度Tm值進(jìn)行優(yōu)化選擇；(3)首先經(jīng)過(guò)測(cè)定的單核細(xì)胞增生李斯特菌總DNA溶液用無(wú)菌水作10倍梯度稀釋至10-8，以稀釋的DNA溶液為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA模板作陰性對(duì)照，以無(wú)菌水代替DNA模板作空白對(duì)照，然后，取帶有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的載體，檢測(cè)DNA或菌株的靈敏度，選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度影響最小且能夠明確指示假陰性的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的濃度作為添加濃度；(4)提取不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特菌和不同種屬的非單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株的DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定引物的特異性及擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)在非單核細(xì)胞增生李斯特菌樣品檢測(cè)中是否能夠正常擴(kuò)增；(5)通過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)和人工污染實(shí)驗(yàn)對(duì)所建立的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)通過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)判斷PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，通過(guò)檢測(cè)人工污染樣品判斷擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是否指示假陰性，以此來(lái)評(píng)價(jià)建立的PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確。
2、 如權(quán)利要求1所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟(2)中所述的對(duì)MgCl2濃度和退火溫度Tm值進(jìn)行優(yōu)化選擇，具體為根據(jù)引物設(shè)計(jì)時(shí)推薦的Tm值，在Tm土5-C范圍內(nèi)以rC間隔設(shè)置溫度梯度，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳圖中的亮度來(lái)選擇退火溫度，在確定退火溫度后，在反應(yīng)體系中設(shè)置一系列的Mg"濃度的梯度，從1.0mmol/L到3.0mmol/L，間隔0.5國(guó)ol/L，同樣根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳圖中的亮度來(lái)選擇PCR反應(yīng)體系的Mg"濃度。
3 、如權(quán)利要求1所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟(4)中所述的抗干擾實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)方法為將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、和大腸桿菌作為干擾菌株，提取它們的DNA加入到單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)體系中，以檢測(cè)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)靈敏度的影響。
4、如權(quán)利要求1所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟(5)中所述的人工污染樣品，其檢測(cè)方法為(1) 取單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC54002菌液lml接入100ml UVM改良李斯 特菌增菌液，設(shè)空白對(duì)照；(2) 采集40份雞肉樣品，無(wú)菌取樣品25g放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，加 225mL UVM改良李斯特菌增菌液，充分均質(zhì)。在37°C的搖床中增菌培養(yǎng)，并且在 增菌8h后取樣；(3) 每份樣品取樣lmL，放入1. 5mL離心管中，12 000r/min離心lmin， 收集單核細(xì)胞增生李斯特菌菌體；(4) 用無(wú)菌雙蒸水洗滌一次，12 000r/min離心lmin;然后加入100uL無(wú) 菌超純水重懸菌體，在沸水浴中煮10min;從沸水浴中取出后，立即在-2(TC放置 10miru(5) 解凍后，12 000r/min離心5min，上清液為PCR模板DNA溶液，分別取 5nL加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA模板 作陰性對(duì)照，以無(wú)菌水代替DNA模板作空白對(duì)照。
5、 如權(quán)利要求1所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法， 其特征是，所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，是指人工設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，減少了非單核細(xì)胞 增生李斯特菌的DNA對(duì)PCR檢測(cè)的干擾，同時(shí)也避免了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)目的基因的同 源交聯(lián)干擾。
6、 如權(quán)利要求1或者5所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR 檢測(cè)方法，其特征是，所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的構(gòu)建方法，具體如下采用序列分析、 基因比對(duì)的手段選擇用于構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的特異 基因序列，并與檢測(cè)的目的基因的同源性極低；將所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列人工合 成，并克隆到載體中；采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移上述帶有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的載體到大腸桿菌 中，然后涂布于選擇性平板上，37'C培養(yǎng)12h，用滅菌的牙簽從選擇性平板上挑取 白色菌落，接菌到裝有5ml LB培養(yǎng)液的PA瓶中，再在37。C下以150r/min培養(yǎng) 8h，提取質(zhì)粒pMD-hlys的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，確定獲得轉(zhuǎn)化子。
7、 如權(quán)利要求1或者5所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR 檢測(cè)方法，其特征是，所述的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，DNA序列是人工合成的，DNA序列的兩 端分別含有檢測(cè)引物的序列。
8、如權(quán)利要求1所述的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法， 其特征是，所述的假陰性，是指PCR反應(yīng)受到了食品或培養(yǎng)基等物質(zhì)中存在的抑 制劑的影響而沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)，或者是由于操作人員的操作失誤導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域用于食品安全的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR檢測(cè)方法。包括以下步驟人工合成一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的特異引物；通過(guò)對(duì)MgCl₂濃度和退火溫度Tm值進(jìn)行優(yōu)化選擇；進(jìn)行PCR檢測(cè)、對(duì)照，選擇對(duì)檢測(cè)靈敏度影響最小且能夠明確指示假陰性的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的濃度作為添加濃度；確定引物的特異性及擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)在非單核細(xì)胞增生李斯特菌樣品檢測(cè)中是否能夠正常擴(kuò)增；通過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)判斷PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，通過(guò)檢測(cè)人工污染樣品判斷擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是否指示假陰性，以此來(lái)評(píng)價(jià)建立的PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確。本發(fā)明提高PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確率，為滿足檢疫執(zhí)法過(guò)程中所急需的對(duì)食源性致病菌調(diào)查和檢測(cè)提供有效可靠的技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101177714SQ20071017042
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者史賢明, 張忠明, 施春雷, 峰 潘, 飛 龍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)