專利名稱：探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)的基因的探針和探針組，其用于檢測(cè)和鑒定傳染性疾病的致病性生物；固定有探針的載體，所述探針或探針組被固定在它上面；使用該固定有探針的載體的基因檢測(cè)方法；和用于該方法的基因檢測(cè)試劑盒。
相關(guān)技術(shù)的描述 迄今，已提出在分析物中快速并準(zhǔn)確地檢測(cè)傳染性疾病的致病性生物的試劑和方法。例如，日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_(kāi)平H08-089254中公開(kāi)了具有特定的堿基序列的寡核苷酸(其能分別用作探針和引物以用于檢測(cè)念珠菌病和曲霉病的病原性細(xì)菌)和使用此類寡核苷酸檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的方法。另外，相同的專利文件還公開(kāi)了用于通過(guò)PCR同時(shí)擴(kuò)增多種目標(biāo)細(xì)菌的引物組。換言之，這些引物被用于在分析物中對(duì)作為多種目標(biāo)的來(lái)自真菌的核酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？梢允褂锰禺愑诟鱾€(gè)真菌的探針和經(jīng)由各個(gè)引物擴(kuò)增的核酸片段進(jìn)行雜交分析以檢測(cè)序列的特定部分的存在，從而鑒定分析物中的目標(biāo)真菌種類。
另一方面，作為能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)具有不同堿基序列的寡核苷酸的方法，已知使用探針陣列的方法，其中將具有與各個(gè)堿基序列互補(bǔ)的序列的探針間隔地排列在固相支撐物上 (日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_(kāi)平2004-313181)。
發(fā)明概述 不過(guò)，設(shè)計(jì)特異性地檢測(cè)樣品中傳染性疾病病原性細(xì)菌基因的探針不是一件容易的工作。因?yàn)?，除了目?biāo)基因，樣品可能進(jìn)一步含有其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。因此，設(shè)計(jì)特異性地檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因并同時(shí)禁止交叉污染的探針不是一件容易的工作，所述交叉污染是其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因的存在而造成的影響。在這種情況下，本發(fā)明人為獲得如下所述的探針進(jìn)行了研究，所述探針在維持低水平交叉污染的同時(shí)，甚至當(dāng)使用其中存在不同細(xì)菌的基因的樣品時(shí)，允許精確檢測(cè)后面提到的傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人最終發(fā)現(xiàn)了能精確檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌的基因的多個(gè)探針。
本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)是提供探針和探針組，它們能從其中同時(shí)存在多種細(xì)菌的分析物中精確鑒定目標(biāo)細(xì)菌的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供固定有探針的載體，它能被用于從其中同時(shí)存在多種細(xì)菌的分析物中精確地鑒定目標(biāo)細(xì)菌。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的基因檢測(cè)方法，它能從分析物中的多種細(xì)菌中(當(dāng)它們存在其中時(shí))快速并精確地檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌；和用于這種方法的試劑盒。
本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌的基因的探針具有下述堿基序列(1)到(4)中的任一個(gè) (1)TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA(SEQ ID NO.70)或它的互補(bǔ)序列； (2)AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT(SEQ ID NO.71)或它的互補(bǔ)序列； (3)ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT(SEQ ID NO.72)或它的互補(bǔ)序列；和 (4)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70到72的序列和它們的互補(bǔ)序列中的任一個(gè)上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。
此外，本發(fā)明的用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌的基因的探針組包括選自下述(A)到(L)中的至少兩個(gè)探針 (A)具有TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA(SEQ ID NO.70)所示的堿基序列的探針； (B)具有AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT(SEQ ID NO.71)所示的堿基序列的探針； (C)具有ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT(SEQ ID NO.72)所示的堿基序列的探針； (D)具有SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (E)具有SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (F)具有SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (G)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (H)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (I)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (J)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (K)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和 (L)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。
本發(fā)明的固定有探針的載體的特征性特點(diǎn)是，上述探針(A)到(L)中的至少一個(gè)被固定在固相載體上，并且當(dāng)使用多個(gè)探針時(shí)，各個(gè)探針被間隔排列。
通過(guò)使用本發(fā)明的固定有探針的載體在分析物中檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌的基因的方法，包括步驟 (i)讓分析物和具有上述構(gòu)成的固定有探針的載體反應(yīng)；和 (ii)檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。
本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-棲牙普雷沃氏菌的試劑盒的特征性特點(diǎn)是，包括上述探針(A)到(L)中的至少一個(gè)，和檢測(cè)探針與目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)分析物被上述致病性細(xì)菌感染時(shí)，細(xì)菌能被更快速并精確地從分析物中鑒定出，即使該分析物同時(shí)并且復(fù)雜地被上述細(xì)菌之外的其它細(xì)菌感染。特別地，可以檢測(cè)出棲牙普雷沃氏菌，同時(shí)精確區(qū)分它和可能引起交叉污染的大腸埃希氏桿菌。
參照下述例示性實(shí)施方案的描述和附圖，本發(fā)明的進(jìn)一步特點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是闡述第一PCR(1st PCR)操作流程的圖。
圖2是闡述第二PCR(2nd PCR)操作流程的圖。
實(shí)施方案的描述 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從各個(gè)保藏機(jī)構(gòu)獲得了到目前為止幾乎所有的被認(rèn)為是敗血病病原性細(xì)菌的細(xì)菌(由下述(1)到(80)表示)，并鑒定了所有這些細(xì)菌的16S rRNA的基因序列。
隨后，在比較所有鑒定的序列時(shí)，詳細(xì)研究了棲牙普雷沃氏菌的探針序列，并且最終找出本發(fā)明的能夠鑒定棲牙普雷沃氏菌的探針。
(1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC12600) (2)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (ATCC14990) (3)大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) (ATCC11775) (4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiella pneumoniae) (ATCC13883) (5)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (ATCC10145) (6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ATCC13380) (7)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (ATCC33400) (8)流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) (ATCC33391) (9)陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) (ATCC13047) (10)糞腸球菌(Enterococcus faecalis) (ATCC19433) (11)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) (ATCC29970) (12)人葡萄球菌(Staphylococcus hominis) (ATCC27844) (13)腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus) (ATCC15305) (14)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(ATCC13813) (15)變異鏈球菌(Streptococcus mutans)(ATCC25175) (16)化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (ATCC12344) (17)血鏈球菌(Streptococcus sanguis) (ATCC10556) (18)鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)(JCM8722) (19)屎腸球菌(Enterococcus faecium) (ATCC19434) (20)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) (ATCC13525) (21)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC12633) (22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)(JCM5964) (23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC13637) (24)鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii) (ATCC19606) (25)乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) (ATCC23055) (26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacter xylosoxidans) (ATCC27061) (27)創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus) (ATCC27562) (28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonella choleraesuis) (JCM1651) (29)弗勞地氏檸檬桿菌(Citrobacter freundii) (ATCC8090) (30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) (ATCC13182) (31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes) (ATCC13048) (32)蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei) (ATCC13337) (33)液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens) (ATCC27592) (34)奇異變形菌(Proteus mirabilis) (ATCC29906) (35)普通變形菌(Proteus vulgaris)(ATCC33420) (36)摩氏摩根(氏)菌(Morganella morganii) (ATCC25830) (37)雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri) (JCM1675) (38)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) (JCM1027) (39)溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria) (ATCC43979) (40)陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis) (ATCC14018) (41)白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae) (ATCC2701) (42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila) (ATCC33152) (43)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) (ATCC14579) (44)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC6051) (45)堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)(ATCC12478) (46)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare) (ATCC13950) (47)龜分支桿菌(Mycobacterium chelonae) (ATCC35752) (48)星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides) (ATCC19247) (49)脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)(JCM11019) (50)多形類桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)(JCM5827) (51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile) (ATCC51695) (52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens) (JCM1290) (53)遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) (JCM10763) (54)壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum) (JCM3718) (55)核粒梭桿菌(Fusobacterium nucleatum) (ATCC25586) (56)嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophilus) (ATCC4356) (57)普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii) (JCM6490) (58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)(JCM8143) (59)不解糖卟啉單胞菌(Porphyromonas asaccharolytica) (JCM6326) (60)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)(JCM8525) (61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola)(ATCC38184) (62)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes) (JCM6473) (63)約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii) (ATCC17909) (64)瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii) (ATCC17908) (65)舒氏氣單胞菌(Aeromonas schubertii) (ATCC43700) (66)維羅納氣單胞菌(Aeromonas veronii) (ATCC35624) (67)吉氏類桿菌(Bacteroides distasonis) (ATCC8503) (68)普通類桿菌(Bacteroides vulgatus)(ATCC8482) (69)大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)(ATCC33559) (70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacter hyointestinalis) (ATCC35217) (71)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) (ATCC33560) (72)水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile) (ATCC11947) (73)水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii) (ATCC33299) (74)黑色消化球菌(Peptococcus niger) (ATCC27731) (75)親合丙酸桿菌(Propionibacterium avidum) (ATCC25577) (76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)(ATCC6207) (77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum) (ATCC25564) (78)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum) (ATCC13949) (79)Flavobacterium hydatis (NBRC14958) (80)約氏黃桿菌(Flavobacterium johnsoniae) (NBRC14942) 所獲得的細(xì)菌菌種的保藏號(hào)示于上述右側(cè)的各個(gè)括號(hào)中。具有以“ATCC”、“JCM”和“NBRC”開(kāi)頭的保藏號(hào)的細(xì)菌菌種分別得自于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)、日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms，RIKENBioResource Center)和美國(guó)呼吸治療協(xié)會(huì)(National Board forRespiratory Care)。
本發(fā)明提供了鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌的寡核苷酸探針(在下文中，簡(jiǎn)稱為探針)和包括兩種或更多種探針的組合的探針組。使用這種探針或探針組能檢測(cè)通過(guò)感染來(lái)引起炎癥的下述細(xì)菌。
[細(xì)菌名稱] 棲牙普雷沃氏菌 就是說(shuō)，本發(fā)明的探針能檢測(cè)上述細(xì)菌的基因中的16S rRNA基因序列，包含下述的序列 (A)具有TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA(SEQ ID NO.70)所示的堿基序列的探針； (B)具有AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT(SEQ ID NO.71)所示的堿基序列的探針； (C)具有ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT(SEQ ID NO.72)所示的堿基序列的探針； (D)具有SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (E)具有SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (F)具有SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針； (G)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (H)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (I)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (J)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的； (K)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和 (L)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。
探針組可以使用這些探針中的至少兩種來(lái)形成。
這些探針的功能顯著依賴每個(gè)探針序列對(duì)感興趣的目標(biāo)核酸序列的特異性。探針序列的特異性可以通過(guò)目標(biāo)核酸序列和探針序列的堿基一致性程度來(lái)評(píng)估。進(jìn)一步地，當(dāng)多種探針組成探針組時(shí)，探針間解鏈溫度的變化可以影響探針組的性能。
為了設(shè)計(jì)探針序列，選擇不管菌株的任何差異而對(duì)感興趣的特定細(xì)菌菌種顯示高特異性的區(qū)域。該區(qū)域含有3個(gè)或更多個(gè)和其它任意細(xì)菌菌種序列中的對(duì)應(yīng)堿基不一致的堿基。設(shè)計(jì)該探針序列，使在該探針序列和感興趣的特定細(xì)菌菌種對(duì)應(yīng)序列間的解鏈溫度與在該探針序列和任意其它細(xì)菌菌種對(duì)應(yīng)序列間的解鏈溫度相差10℃或更多。進(jìn)一步地，可以缺失或增加一個(gè)或多個(gè)堿基，使固定在單個(gè)載體上的各個(gè)探針可以具有預(yù)定范圍內(nèi)的解鏈溫度。
本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果80％或更多的堿基序列連續(xù)保守，探針的雜交強(qiáng)度將不會(huì)顯著降低。因此根據(jù)該發(fā)現(xiàn)可以得出結(jié)論，如果探針80％或更多的堿基序列連續(xù)保守，從公開(kāi)在說(shuō)明書中的探針序列修飾而得的任意序列將具有足夠的探針功能。
上述修飾的序列可以包括任意變體，只要它不損害探針功能；或任何變體，只要它和作為檢測(cè)目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。尤其是，希望包括任何變體，只要它能在嚴(yán)格條件下和作為檢測(cè)目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。優(yōu)選的界定所述變體的雜交條件包括下述實(shí)施例中的那些。此處使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)目標(biāo)”可以是包括在樣品中的、將被用于雜交的序列，其可以是傳染性疾病病原性細(xì)菌獨(dú)有的堿基序列、或可以是獨(dú)有序列的互補(bǔ)序列。進(jìn)一步地，變體可以是在使它保持作為探針的功能的范圍內(nèi)通過(guò)缺失、置換或添加至少一個(gè)堿基所獲得的修飾的序列。
這些探針序列僅特異性于編碼上述細(xì)菌16S rRNA的DNA序列，因此即使是在嚴(yán)格條件下也能期望獲得對(duì)該序列的足夠的雜交靈敏度。此外，即使探針序列被固定在設(shè)計(jì)成產(chǎn)生優(yōu)良結(jié)果的載體上時(shí)，這些探針序列中的任一個(gè)通過(guò)和目標(biāo)分析物的雜交反應(yīng)形成穩(wěn)定的雜交產(chǎn)物。
進(jìn)一步地，通過(guò)在載體上的預(yù)定位置供給探針并將探針固定其上，能夠獲得上面具有本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針的固定有探針的載體(例如DNA芯片)?？梢允褂枚喾N方法來(lái)供給探針到載體上。其中，例如，一種能被適當(dāng)使用的方法是保持表面狀態(tài)能讓探針通過(guò)化學(xué)結(jié)合(例如共價(jià)結(jié)合)固定在載體上，并且隨后通過(guò)噴墨方法在預(yù)定位置上提供含有探針的液體。這種方法讓探針難以從載體上脫離，并具有增強(qiáng)靈敏度的附加效果。換句話說(shuō)，當(dāng)使用常規(guī)使用的并被稱為Stanford方法的壓印方法制備DNA芯片時(shí)，產(chǎn)生的DNA芯片具有所施用的DNA趨于脫落的缺點(diǎn)。另一個(gè)形成DNA芯片的方法是通過(guò)在載體表面上合成DNA來(lái)進(jìn)行探針排列(例如來(lái)自于Affymetrix公司的DNA芯片)。在這種在載體上合成探針的方法中，難以為每個(gè)探針序列制備相等數(shù)量的合成DNA。因此，對(duì)應(yīng)于每個(gè)探針來(lái)說(shuō)每個(gè)固定區(qū)域(點(diǎn))的固定的探針數(shù)量趨于很大的變化。這種各個(gè)固定的探針數(shù)量的變化會(huì)引起對(duì)于采用那些探針的檢測(cè)結(jié)果的錯(cuò)誤評(píng)價(jià)?；谶@一事實(shí)，優(yōu)選使用上述噴墨方法來(lái)制備本發(fā)明的探針載體。上述噴墨方法具有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即探針能被穩(wěn)定地固定在載體上并難以脫離載體，從而有效地提供能高靈敏度和高準(zhǔn)確度地進(jìn)行檢測(cè)的探針載體。
此外，探針組可以包括選自于一組序列中的至少兩個(gè)，所述一組序列含有上述SEQ ID NO.70到72、它們的互補(bǔ)序列和通過(guò)在這些序列上在使之保持檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加所獲得的序列。這樣，檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌基因的準(zhǔn)確度能進(jìn)一步提高。
在下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。
待使用探針載體(例如DNA芯片)進(jìn)行檢測(cè)的測(cè)試對(duì)象包括源自人和動(dòng)物(例如家畜)的那些，在所述探針載體中本發(fā)明的探針被固定在載體上。例如，測(cè)試對(duì)象是可能含有細(xì)菌的那些中的任何一個(gè)，包括任意體液，例如血液、腦脊液、咳出液、胃液、陰道分泌物和口腔粘膜液；和排泄物，例如尿和糞。也可以使用DNA芯片對(duì)能被細(xì)菌污染的所有介質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。此類介質(zhì)包括食物、飲用水和天然環(huán)境中的水，例如溫泉水，其能通過(guò)污染引起食物中毒；空氣清潔器等的濾膜等。進(jìn)/出口中應(yīng)該檢疫的動(dòng)物和植物也可用作感興趣的分析物。
當(dāng)上述樣品能被直接用于和DNA芯片反應(yīng)時(shí)，它被用作和DNA芯反應(yīng)的分析物并且隨后分析反應(yīng)的結(jié)果?？蛇x擇地，當(dāng)樣品不能直接和DNA芯片反應(yīng)時(shí)，如果需要，可對(duì)樣品進(jìn)行抽提、純化和其它處理來(lái)獲得目標(biāo)物質(zhì)，并隨后提供作為分析物來(lái)和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。例如，當(dāng)樣品含有目標(biāo)核酸時(shí)，從樣品中制備提取物(所述提取物假定含有這種目標(biāo)核酸)，并隨后清洗、稀釋或等等來(lái)獲得分析物溶液，隨后和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。進(jìn)一步，當(dāng)目標(biāo)核酸包括在通過(guò)進(jìn)行多種擴(kuò)增操作(例如PCR擴(kuò)增)獲得的分析物中時(shí)，該目標(biāo)核酸可以被擴(kuò)增并隨后和DNA芯片反應(yīng)。擴(kuò)增的核酸的此類分析物包括如下 (a)通過(guò)使用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)16S rRNA基因的PCR反應(yīng)引物制備的擴(kuò)增的分析物。
(b)通過(guò)額外的PCR反應(yīng)等從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中制備的擴(kuò)增的分析物。
(c)通過(guò)PCR之外的擴(kuò)增方法制備的分析物。
(d)通過(guò)各種不同標(biāo)記方法中的任一種方法進(jìn)行標(biāo)記以便可視化的分析物。
進(jìn)一步，用于制備固定有探針的載體(例如DNA芯片)的載體可以是滿足進(jìn)行感興趣的固相/液相反應(yīng)的特性的那些載體中的任意一個(gè)。載體的例子包括平坦基板例如玻璃基板、塑料基板和硅片；具有不規(guī)則表面的三維結(jié)構(gòu)；和球形體例如珠，和竿、帶和絲狀結(jié)構(gòu)。載體的表面可以被處理，這樣探針能固定在它上面。特別地，從重復(fù)性的觀點(diǎn)上看，通過(guò)在其表面引入官能團(tuán)使其能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而制備的載體具有較好的形式，因?yàn)樵陔s交反應(yīng)過(guò)程中探針被穩(wěn)定地結(jié)合。
可以使用多種方法固定探針。此類方法的一個(gè)例子是使用馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和巰基(-SH)基團(tuán)的組合。在這個(gè)方法中，巰基(-SH)基團(tuán)結(jié)合到探針末端，并且事先進(jìn)行加工以使載體(固體)表面具有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。由此，供給到載體表面上的探針的巰基和載體表面上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，由此探針被固定。
能利用如下過(guò)程引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)首先讓玻璃基板和氨基硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，并隨后通過(guò)氨基基團(tuán)和EMCS試劑(N-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購(gòu)自Dojindo公司)反應(yīng)將馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板上。能在通過(guò)自動(dòng)DNA合成儀合成DNA時(shí)使用5′-巰基-修飾物C6(購(gòu)自Glen Research公司)將巰基引入到DNA上。
代替巰基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的上述組合，還可以使用，例如環(huán)氧基(在固相上)和氨基(核酸探針末端)的組合作為官能團(tuán)的組合用于固定。使用不同種類的硅烷偶聯(lián)試劑進(jìn)行表面處理也是有效的。使用其中引入了能和通過(guò)硅烷偶聯(lián)試劑引入的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)的探針。還可以使用施用帶有官能團(tuán)的樹(shù)脂的方法。
能通過(guò)基因檢測(cè)方法，使用本發(fā)明的固定有探針的載體對(duì)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因進(jìn)行檢測(cè)，所述基因檢測(cè)方法包括步驟 (i)讓分析物和上面固定有本發(fā)明的探針的固定有探針的載體反應(yīng)； (ii)檢測(cè)分析物中的核酸和固定有探針的載體上的探針之間的反應(yīng)存在與否，或檢測(cè)分析物中的核酸和固定有探針的載體上的探針之間的雜交反應(yīng)強(qiáng)度；和 (iii)當(dāng)檢測(cè)到探針和分析物中的核酸的反應(yīng)時(shí)，指明已經(jīng)和分析物中的核酸反應(yīng)的探針，并且根據(jù)探針的核酸序列指明傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。
固定在固定有探針的載體上的探針是上述(A)到(L)中的至少一個(gè)。在載體上，根據(jù)檢測(cè)目的，用于檢測(cè)除棲牙普雷沃氏菌以外的其他細(xì)菌菌種的探針可以作為其它探針被固定。此時(shí)，其它探針可以是能檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌以外的菌菌種而不引起交叉污染的那些探針，并且使用這樣的探針能同時(shí)高準(zhǔn)確性地檢測(cè)多種細(xì)菌菌種。
進(jìn)一步，如上所述，當(dāng)通過(guò)PCR擴(kuò)增分析物中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的16S rRNA基因序列，并且將其提供為和探針載體反應(yīng)的樣品時(shí)，可以使用用于檢測(cè)所述傳染性疾病病原性細(xì)菌的引物組。該引物組適當(dāng)?shù)匕ㄟx自下述(1)到(21)所示的寡核苷酸中的至少一個(gè)，和選自下述(22)到(28)所示的寡核苷酸中的至少一個(gè)，更合適地包括下述(1)到(28)所示的所有寡核苷酸 (1)具有5’gcggcgtgcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO1)的堿基序列的寡核苷酸； (2)具有5’gcggcaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO2)的堿基序列的寡核苷酸； (3)具有5’gcggcaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO3)的堿基序列的寡核苷酸； (4)具有5’gcggtaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO4)的堿基序列的寡核苷酸； (5)具有5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO5)的堿基序列的寡核苷酸； (6)具有5’gcgggatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO6)的堿基序列的寡核苷酸； (7)具有5’gcggcatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO7)的堿基序列的寡核苷酸； (8)具有5’gcggcatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO8)的堿基序列的寡核苷酸； (9)具有5’gcggcgtgcttaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO9)的堿基序列的寡核苷酸； (10)具有5’gcggcaggcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO10)的堿基序列的寡核苷酸； (11)具有5’gcgggatgctttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO11)的堿基序列的寡核苷酸； (12)具有5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO12)的堿基序列的寡核苷酸； (13)具有5’gcggcgtgcataacacatgcaag 3’(SEQ ID NO13)的堿基序列的寡核苷酸； (14)具有5’gcggcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO14)的堿基序列的寡核苷酸； (15)具有5’gcggcgcgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO15)的堿基序列的寡核苷酸； (16)具有5’gcggcgcgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO16)的堿基序列的寡核苷酸； (17)具有5’gcgtcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO17)的堿基序列的寡核苷酸； (18)具有5’gcgataggct taacacatgcaag 3’(SEQ ID NO18)的堿基序列的寡核苷酸； (19)具有5’gcgacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO19)的堿基序列的寡核苷酸； (20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO20)的堿基序列的寡核苷酸； (21)具有5’acagaatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO21)的堿基序列的寡核苷酸； (22)具有5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO22)的堿基序列的寡核苷酸； (23)具有5’atccaaccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO23)的堿基序列的寡核苷酸； (24)具有5’atccagccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO24)的堿基序列的寡核苷酸； (25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO25)的堿基序列的寡核苷酸； (26)具有5’atccagcgccaggttcccctag 3’(SEQ ID NO26)的堿基序列的寡核苷酸； (27)具有5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO27)的堿基序列的寡核苷酸；和 (28)具有5’atccagccgcacgttcccgtac 3’(SEQ ID NO28)的堿基序列的寡核苷酸。
在它們中，設(shè)計(jì)用于使棲牙普雷沃氏菌擴(kuò)增的引物是下述引物組 (20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO20)的堿基序列的寡核苷酸；和 (25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO25)的堿基序列的寡核苷酸。
為了檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌，至少可以包括這樣的引物。
通過(guò)對(duì)SEQ ID NO.1到28的每個(gè)序列與包括棲牙普雷沃氏菌ATCC 38184(SEQ ID NO.95)的16S rRNA編碼區(qū)的DNA序列進(jìn)行比較，能評(píng)價(jià)和驗(yàn)證各個(gè)引物(1)到(28)對(duì)于棲牙普雷沃氏菌的擴(kuò)增的效用。
使用至少一種如上所述的探針和用于檢測(cè)該探針和分析物中的核酸的反應(yīng)的試劑，可以構(gòu)建用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的試劑盒。試劑盒中的探針可以優(yōu)選地被提供為如上所述的固定有有探針的載體。進(jìn)一步地，檢測(cè)試劑可以含有標(biāo)記物以檢測(cè)反應(yīng)或含有用于進(jìn)行作為預(yù)處理的擴(kuò)增的引物。
實(shí)施例 在下文中，通過(guò)使用用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針以檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
(實(shí)施例1) 在這個(gè)實(shí)施例中，將描述使用兩步PCR的微生物檢測(cè)。
1.探針DNA的制備 示于表1的核酸序列被設(shè)計(jì)作為用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的探針。具體而言，下面的探針堿基序列選自于編碼棲牙普雷沃氏菌16srRNA基因的基因組部分。這些探針堿基序列被設(shè)計(jì)為它們能具有對(duì)所述細(xì)菌的非常高的特異性，并且可以期望在探針堿基序列沒(méi)有變化的情況下具有足夠的雜交靈敏度。探針堿基序列不必總是與表1所示的那些完全匹配。除了具有表1所示堿基序列的探針以外，還可以使用包括表1所示堿基序列的具有20到30個(gè)堿基長(zhǎng)度的探針。不過(guò)，應(yīng)該確保在這樣的探針中的除表1所示部分以外的其它堿基序列部分對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性沒(méi)有影響。
表1 對(duì)于具有表1所示堿基序列的每種探針，在依照常規(guī)方法進(jìn)行合成后在核酸的5′末端引入作為用于將探針固定在DNA芯片上的官能團(tuán)的巰基。在引入官能團(tuán)后，進(jìn)行純化和凍干。用作內(nèi)標(biāo)物的凍干的探針儲(chǔ)存于-30℃冰箱。
2.PCR引物的制備 2-1.制備用于分析物擴(kuò)增的PCR引物 作為用于病原性細(xì)菌檢測(cè)的16S rRNA基因(目標(biāo)基因)擴(kuò)增PCR引物，設(shè)計(jì)了如下面的表2所示的核酸序列。具體地，設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增編碼16S rRNA的基因組部分的引物組，即，位于堿基長(zhǎng)度為1400到1700的16S rRNA編碼區(qū)的兩個(gè)末端部分的、特定解鏈溫度盡可能相等的引物。為了同時(shí)擴(kuò)增列于下述(1)到(80)的多個(gè)不同細(xì)菌菌種、突變體或基因組中的多個(gè)16S rRNA基因，設(shè)計(jì)了多種類型的引物。注意，引物組不局限于表2所示的引物組，只要該引物組能共同地?cái)U(kuò)增幾乎全長(zhǎng)的所述病原性細(xì)菌16S rRNA基因即可。
表2 (1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (2)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (3)大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) (4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiella pneumoniae) (5)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens) (7)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (8)流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) (9)陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) (10)糞腸球菌(Enterococcus faecalis) (11)溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus) (12)人葡萄球菌(Staphylococcus hominis) (13)腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus) (14)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (15)變異鏈球菌(Streptococcus mutans) (16)化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (17)血鏈球菌(Streptococcus sanguis) (18)鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium) (19)屎腸球菌(Enterococcus faecium) (20)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) (21)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) (22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia) (23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) (24)鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii) (25)乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) (26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacter xylosoxidans) (27)創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus) (28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonella choleraesuis) (29)弗勞地氏檸檬桿菌(Citrobacter freundii) (30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) (31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes) (32)蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei) (33)液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens) (34)奇異變形菌(Proteus mirabilis) (35)普通變形菌(Proteus vulgaris) (36)摩氏摩根(氏)菌(Morganella morganii) (37)雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri) (38)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) (39)溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria) (40)陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis) (41)白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae) (42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila) (43)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) (44)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (45)堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacterium kansasii) (46)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare) (47)龜分支桿菌(Mycobacterium chelonae) (48)星狀諾卡氏菌(Nocardiaa steroides) (49)脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis) (50)多形類桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron) (51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile) (52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens) (53)遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) (54)壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum) (55)核粒梭桿菌(Fusobacterium nucleatum) (56)嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophilus) (57)普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii) (58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus) (59)不解糖卟啉單胞菌(Porphyromonas asaccharolytica) (60)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis) (61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotella denticola) (62)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes) (63)約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii) (64)瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter junii) (65)舒氏氣單胞菌(Aeromonas schubertii) (66)維羅納氣單胞菌(Aeromonas veronii) (67)吉氏類桿菌(Bacteroides distasonis) (68)普通類桿菌(Bacteroides vulgatus) (69)大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli) (70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacter hyointestinalis) (71)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) (72)水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile) (73)水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii) (74)黑色消化球菌(Peptococcus niger) (75)親合丙酸桿菌(Propionibacterium avidum) (76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii) (77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum) (78)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum) (79)Flavobacterium hydatis (80)約氏黃桿菌(Flavobacterium johnsoniae) 在合成后通過(guò)高效液相色譜(HPLC)純化表2所示引物。將21個(gè)正向引物和7個(gè)反向引物混合并溶于TE緩沖液，每個(gè)引物的終濃度為10pmol/μl。
2-2.標(biāo)記式PCR引物的制備 采用和上述分析物擴(kuò)增引物相似的方式，具有如下面表3所示的序列的寡核苷酸用作用于進(jìn)行標(biāo)記的引物。
表3 用熒光染料Cy3標(biāo)記表3所示引物。合成后通過(guò)高效液相色譜(HPLC)純化引物。將所述6個(gè)標(biāo)記的引物混合并溶于TE緩沖液中，使每個(gè)引物的終濃度為10pmol/μl。
3.棲牙普雷沃氏菌基因組DNA(模型分析物)的提取 3-1.微生物培養(yǎng)和基因組DNA提取 首先，按照常規(guī)方法培養(yǎng)棲牙普雷沃氏菌(ATCC 38184)。使用核酸純化試劑盒(FastPrep FP100A FastDNA Kit，F(xiàn)unakoshi公司制造)對(duì)這種微生物培養(yǎng)基施行基因組DNA的提取和純化。
3-2.收集的基因組DNA的檢測(cè) 按照常規(guī)方法對(duì)收集的微生物棲牙普雷沃氏菌的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳和260/280nm吸收測(cè)定。因此，檢測(cè)了質(zhì)量(低分子核酸的混入量和分解程度)和收集量。在這個(gè)實(shí)施例中，大約收集了10μg的基因組DNA。沒(méi)有觀察到基因組DNA的降解或rRNA污染。收集的基因組DNA以50ng/μl的終濃度溶于TE緩沖液中，并用于下面的實(shí)驗(yàn)。
4.DNA芯片的制備 4-1.清潔玻璃基板 將合成石英制備的玻璃基板(尺寸25mm×75mm×1mm，購(gòu)自Iiyama Precision Glass公司)放在耐熱和堿的架子中并浸泡在已經(jīng)調(diào)節(jié)到具有預(yù)定濃度的清潔溶液中進(jìn)行超聲波清洗。玻璃基板在清潔溶液中持續(xù)浸泡一夜并用超聲波清洗20分鐘。取出基板，用純水輕輕沖洗，并在高純水中用超聲波清洗20分鐘。將該基板在加熱到80℃的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。再次用純水清洗和用高純水清洗。如此制備了DNA芯片的石英玻璃基板。
4-2.表面處理 硅烷偶聯(lián)試劑KBM-603(購(gòu)自Shin-Etsu Silicone公司)以1重量％(wt％)的濃度溶于純水，并在室溫下攪拌2小時(shí)。清潔的玻璃基板浸泡到硅烷偶聯(lián)試劑水溶液中并在室溫下持續(xù)放置20分鐘。取出玻璃基板。用純水輕輕沖洗其表面，并通過(guò)噴射氮?dú)庵粱宓膬蓚€(gè)表面上來(lái)進(jìn)行干燥。干燥的基板在烘箱中以120℃烘烤1小時(shí)來(lái)完成偶聯(lián)試劑處理，由此氨基基團(tuán)被引入到基板表面上。下一步，N-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基琥珀酰亞胺(下文簡(jiǎn)寫為EMCS)溶于二甲亞砜和乙醇的1∶1(體積比)溶劑混合物中，以獲得0.3mg/ml的終濃度。結(jié)果，制備了EMCS溶液。此處，EMCS是N-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購(gòu)自Dojindo。
烘烤的玻璃基板保持靜置并冷卻，并在室溫下浸泡到制備好的EMCS溶液中2小時(shí)。通過(guò)這個(gè)處理，通過(guò)硅烷偶聯(lián)試劑引入到基板表面上的氨基基團(tuán)和EMCS中的琥珀酰亞胺基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，將馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板表面上。使用上述溶有EMCS的溶劑混合物清洗從EMCS溶液中取出的玻璃基板。用乙醇進(jìn)一步清洗玻璃基板并在氮?dú)夥諊懈稍铩?br> 4-3.探針DNA 將在實(shí)施例1的階段1(探針DNA的制備)中制備的微生物檢測(cè)探針溶于純水。溶液配制為終濃度(溶解在墨水中時(shí))為10μM。隨后，溶液被凍干以去除水。
4-4.用BJ打印機(jī)吐出DNA并結(jié)合到基板上 制備含有7.5-wt％丙三醇、7.5-wt％硫二甘醇、7.5-wt％尿素和1.0-wt％Acetylenol EH(購(gòu)自Kawaken Fine Chemicals公司)的水溶液。事先制備的三種探針(表1)中的每種探針按特定濃度溶于該溶劑混合物中。用所得到的DNA溶液充滿噴墨打印機(jī)(商品名BJF-850，購(gòu)自Canon公司)的墨盒，并安裝到打印頭上。
此處所用的噴墨打印機(jī)事先已經(jīng)被改良，能在平板上打印。當(dāng)根據(jù)預(yù)定的文件創(chuàng)建方法輸入打印模式時(shí)，可將大約5皮升DNA溶液以大約120μm的間距點(diǎn)樣。
通過(guò)使用改良的噴墨打印機(jī)來(lái)對(duì)一片玻璃基板進(jìn)行打印操作以制備陣列。在確證打印已經(jīng)確實(shí)完成后，玻璃基板在潮濕的倉(cāng)室中靜置30分鐘，讓玻璃基板表面上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和核酸探針末端的巰基基團(tuán)反應(yīng)。
4-5.清洗 反應(yīng)30分鐘后，使用含有100mM NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)清洗表面殘留的DNA溶液，由此獲得DNA芯片，在該芯片中單鏈DNA被固定在玻璃基板的表面上。
5.分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記 5-1.分析物的擴(kuò)增第一PCR 提供作為分析物的微生物基因的擴(kuò)增反應(yīng)(第一PCR)和標(biāo)記反應(yīng)(第二PCR)如下面表4所示。
表4 使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖1所示的操作流程進(jìn)行具有上述的組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用純化柱(QIAquick PCRPurification Kit，購(gòu)自QIAGEN公司)純化引物。隨后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的定量測(cè)定。
5-2.標(biāo)記反應(yīng)第二PCR 使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖2所示操作流程進(jìn)行具有表5所示組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。
表5 反應(yīng)結(jié)束后，使用純化柱(QIAquick PCR Purification Kit，購(gòu)自QIAGEN)純化引物來(lái)獲得標(biāo)記的分析物。
6.雜交 使用在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片和在階段5(分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記)制備的標(biāo)記的分析物進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。
6-1.DNA芯片的封閉 牛血清白蛋白(BSA，F(xiàn)raction V購(gòu)自Sigma公司)溶于100mMNaCl/10mM磷酸鹽緩沖液中，獲得1wt％的溶液。隨后，在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片在室溫下在所述溶液中浸泡2小時(shí)以進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，使用如下所述的清洗溶液清洗芯片，用純水沖洗，并用旋轉(zhuǎn)式干燥機(jī)脫水。
清洗溶液含有0.1wt％十二烷基硫酸鈉(SDS)的2×SSC溶液(NaCl 300mM，檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉二水合物，C6H5Na3·2H2O)30mM，pH 7.0)。
6-2.雜交 脫水的DNA芯片置于雜交儀(Hybridization Station，購(gòu)自Genomic Solutions公司)。在雜交溶液中在下述條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。
6-3.雜交溶液 6×SSPE/10％甲酰胺/目標(biāo)(所有第二PCR產(chǎn)物)/0.05wt％(6×SSPENaCl 900mM，NaH2PO4H2O 50mM，EDTA 6mM，pH，7.4) 6-4.雜交條件 65℃3分鐘，55℃ 4小時(shí)，用2×SSC/0.1％SDS在50℃下清洗，用2×SSC/0.1％SDS在20℃下清洗(用H2O沖洗手工)，并旋轉(zhuǎn)甩干。
7.微生物基因組檢測(cè)(熒光測(cè)定法) 雜交反應(yīng)結(jié)束后用DNA芯片熒光檢測(cè)器(GenePix 4000B，購(gòu)自Axon公司)對(duì)DNA芯片進(jìn)行熒光測(cè)定。結(jié)果，能夠具有足夠信號(hào)地、可高重復(fù)性地檢測(cè)出棲牙普雷沃氏菌。熒光測(cè)定結(jié)果顯示于下面的表6。
表6 8.和其它細(xì)菌菌種的雜交 為了證實(shí)表1所示探針組能特異性地只和棲牙普雷沃氏菌雜交這一事實(shí)，和大腸埃希氏桿菌(JCM 1649)的雜交反應(yīng)的結(jié)果顯示于下面的表7。
表7 9.結(jié)果 如從上面的描述可以看出的，制備了固定有能以特異性的方式只檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的探針組的DNA芯片。進(jìn)一步地，使用這種DNA芯片能鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌，因此來(lái)自于微生物的DNA探針的問(wèn)題能被解決。換句話說(shuō)，所述寡核苷酸探針能被大量地化學(xué)制備，同時(shí)它的純化或濃縮能被控制。此外，對(duì)于微生物菌種的分類，能夠提供探針組，所述探針組能匯總性地檢測(cè)相同屬的菌株，并能將它們從其它屬細(xì)菌中區(qū)別性地檢測(cè)出來(lái)。
進(jìn)一步地，除了如上述的大腸埃希氏桿菌以外，對(duì)提取自上述(1)到(80)所示的細(xì)菌的每種核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)。其結(jié)果證實(shí)，除了棲牙普雷沃氏菌以外，對(duì)于那些細(xì)菌中的每種細(xì)菌，和大腸桿菌相似，沒(méi)有觀察到實(shí)質(zhì)上的反應(yīng)。
列于上述(1)到(80)的細(xì)菌是敗血病病原性細(xì)菌，并且它們幾乎覆蓋了過(guò)去在人血液中檢測(cè)到的所有的病原性細(xì)菌。因此，通過(guò)使用本實(shí)施方案的引物，血液中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的核酸能被提取出來(lái)并隨后和本發(fā)明的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此能夠以高準(zhǔn)確性進(jìn)行棲牙普雷沃氏菌的鑒定。
進(jìn)一步地，根據(jù)上述的實(shí)施例，通過(guò)完全地檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的16S rRNA基因，能夠以高準(zhǔn)確性且有效地確定傳染性疾病病原性細(xì)菌的存在。
(實(shí)施例2)能同時(shí)確定多種細(xì)菌菌種的DNA芯片的制備 按照和實(shí)施例1的階段1(探針DNA的制備)相似的方式，制備具有顯示于下面表8的堿基序列的探針。
表8 這些探針能特異性地檢測(cè)列于表中左欄的特定細(xì)菌菌種(或?qū)?，正如實(shí)施例1中的能特異性地針對(duì)棲牙普雷沃氏菌的探針一樣。
進(jìn)一步地，這些探針被設(shè)計(jì)為它們具有和目標(biāo)相同的Tm值、和非目標(biāo)序列相同的反應(yīng)性等，因此在相同的反應(yīng)條件下，感興趣的細(xì)菌菌種的核酸能被特異性地檢測(cè)。
對(duì)于各個(gè)探針，按照和實(shí)施例1的階段4-3相似的方式制備探針溶液。隨后，使用在實(shí)施例1的階段4-4中使用的噴墨打印機(jī)將每個(gè)探針溶液吐出到相同的基板上，形成具有以大約120μm的間隔排列的各個(gè)探針的點(diǎn)的多個(gè)DNA芯片。
按照和實(shí)施例1的階段6相似的方式將所述DNA芯片之一用于和提取自棲牙普雷沃氏菌的核酸雜交。結(jié)果，特異性檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的探針點(diǎn)顯示出和實(shí)施例1幾乎相等的熒光強(qiáng)度。相反，其它探針的點(diǎn)顯示非常低的熒光強(qiáng)度。
進(jìn)一步，使用其它制備的DNA芯片和表8所列的除棲牙普雷沃氏菌以外的細(xì)菌雜交。結(jié)果，棲牙普雷沃氏菌的點(diǎn)顯示非常低的熒光強(qiáng)度，同時(shí)針對(duì)感興趣的細(xì)菌菌種的探針的點(diǎn)顯示非常高的熒光強(qiáng)度。因此，證實(shí)了本實(shí)施例制備的DNA芯片還能同時(shí)測(cè)定列于表8的除棲牙普雷沃氏菌以外的15個(gè)細(xì)菌菌種和7個(gè)屬。通過(guò)同時(shí)使用針對(duì)目標(biāo)種和相應(yīng)屬(例如丙酸桿菌屬和痤瘡丙酸桿菌)的探針，能夠高度準(zhǔn)確地鑒定目標(biāo)種或同時(shí)鑒定相同屬的多個(gè)目標(biāo)種。
(實(shí)施例3) 當(dāng)分析物中存在多種細(xì)菌菌種時(shí)，嘗試了使用實(shí)施例2所制備的DNA芯片進(jìn)行檢測(cè)。
制備其中培養(yǎng)有棲牙普雷沃氏菌和遲緩埃格特菌的培養(yǎng)基，并進(jìn)行和實(shí)施例1相同的處理來(lái)和DNA芯片反應(yīng)。
結(jié)果，只有具有SEQ ID NO.49、50、51、70、71和72的探針點(diǎn)顯示高熒光強(qiáng)度，因此能同時(shí)證實(shí)這些細(xì)菌的共同存在。
本發(fā)明不局限于上述實(shí)施例，并且在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以進(jìn)行多種改變和修飾。因此為了向公眾通告本發(fā)明的范圍，指定了下面的權(quán)利要求。
<110>佳能株式會(huì)社
<120>探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測(cè)方法
<130>10048383CN01
<150>JP2006-306007
<151>2006-11-10
<160>95
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
gcggcgtgcc taatacatgc aag23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gcggcaggcc taacacatgc aag23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
gcggcaggct taacacatgc aag23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
gcggtaggcc taacacatgc aag23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gcggcgtgct taacacatgc aag23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gcgggatgcc ttacacatgc aag23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
gcggcatgcc ttacacatgc aag23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
gcggcatgct taacacatgc aag23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
gcggcgtgct taatacatgc aag23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
gcggcaggcc taatacatgc aag23
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gcgggatgct ttacacatgc aag23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
gcggcgtgcc taacacatgc aag23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
gcggcgtgca taacacatgc aag23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
gcggcatgcc taacacatgc aag23
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
gcggcgcgcc taacacatgc aag23
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
gcggcgcgct taacacatgc aag23
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
gcgtcatgcc taacacatgc aag23
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
gcgataggct taacacatgc aag23
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
gcgacaggct taacacatgc aag23
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
gctacaggct taacacatgc aag23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
acagaatgct taacacatgc aag23
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
atccagccgc accttccgat ac 22
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
atccaaccgc aggttcccct ac 22
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
atccagccgc aggttcccct ac 22
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
atccagccgc accttccggt ac 22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
atccagcgcc aggttcccct ag 22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
atccagccgc aggttctcct ac 22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
atccagccgc acgttcccgt ac 22
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
taccttgtta cgacttcacc cca23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
taccttgtta cgacttcgtc cca23
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
taccttgtta cgacttagtc cca23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
taccttgtta cgacttagcc cca23
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
taccttgtta cgacttagtc cta23
<210>34
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
taccttgtta cgacttagcc cta23
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>35
tcatcttgag gtatggaagg gaaagtgg 28
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>36
gtgttaggtg tctggaataa tctgggtg 28
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>37
accaagtctt gacatattac ggcgg 25
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>38
aaggattccg gtaaaggatg gggatg 26
<210>39
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>39
tggaaacatg tcagtgagca atcacc 26
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>40
aagaatttcg gttatcgatg gggatgc27
<210>41
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>41
aagttttcca cgtgtggaat tttgtatgt 29
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>42
aaggcagcta cctggtgaca ggat 24
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>43
aatatcaaag gtgagccagt acaggatgga 30
<210>44
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>44
ccgtagtaag ctcttgaaac tgggagac 28
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>45
tcccaatgac atctccttaa tcggagag 28
<210>46
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>46
aaccaaagga gcaatccgct atgagat27
<210>47
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>47
gagcgtaggc ggatgattaa gtggg 25
<210>48
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>48
cccttgcatt actcttaatc gaggaaatc 29
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>49
ggaaagccca gacggcaagg ga 22
<210>50
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>50
cctctcaagc gggatctcta atccga 26
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>51
tgccccatgt tgccagcatt agg23
<210>52
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>52
ttttcgcatg gaggaatcat gaaagcta 28
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>53
agatgcgccg gtgccctttc g 21
<210>54
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>54
agtcgggaag aagtcagtga cggtac 26
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>55
gagtacgtgc gcaagcatga aact 24
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>56
gaagactgcc cgcaagggtt gtaa 24
<210>57
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>57
gtgtactgga ggtacgtgga acgtg 25
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>58
gcatgaggct gagaggtctc ttcc 24
<210>59
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>59
ttatagctgt aagataggca tgcgtccc 28
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>60
aacgggcgat acgagtattg cattga 26
<210>61
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>61
atataccgtc aagcttccac agcga 25
<210>62
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>62
tttgaaaggc gcttttgcgt cactg 25
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>63
caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg 30
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>64
caaggatgag agtagaatgt tcatcccttg 30
<210>65
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>65
cctgggaatg gcatctaaga ctggtca27
<210>66
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>66
gaggaaggcg ttgatgctaa tatcatca 28
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>67
gagcaaagca ggggaacttc ggtc 24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>68
gttggggcct ttgaggcttt agtg 24
<210>69
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>69
tgggagagga tggtagaatt ccaggt 26
<210>70
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>70
tcgatgacgg catcagattc gaagca 26
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>71
aatgtaggcg cccaacgtct gact 24
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>72
atgttgaggt ccttcgggac tcct 24
<210>73
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>73
ggaagtaact agaatatgta gtgtagcggt g 31
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>74
gccagtgcaa actgtgagga aggt 24
<210>75
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>75
gggtaggggt cctgagaggg agatc 25
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>76
gagtgccttc gggaatcaga acac 24
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>77
ctgcaagcta gcgatagtga gcga 24
<210>78
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>78
cgatggatag gggttctgag aggaa 25
<210>79
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>79
tgcggctcaa ccgtaaaatt gcagt 25
<210>80
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>80
tgtggctcaa ccatagaatt gccgt 25
<210>81
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>81
gtacctgtaa gaaagacggc cttcgt 26
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>82
ctgccgagtg atgtaatgtc acttttc27
<210>83
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>83
tcggaggttt caagaccgtc gg 22
<210>84
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>84
accaaaggag caatccgcta tgagatg27
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>85
atcaaaggtg agccagtaca ggatgg 26
<210>86
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>86
attaaaggag taatccgcta tgagatggac c 31
<210>87
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>87
gggctaatac cggataggag ctcctg 26
<210>88
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>88
aagcgtgagt gacggtaatg ggtaaa 26
<210>89
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>89
atcgcgtcgg aagtgtaatc ttggg 25
<210>90
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>90
tggagcaaat ctataaaata tgtcccagt 29
<210>91
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>91
acagtggaat cagcgactgg gg 22
<210>92
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>92
gcctaatacg tatcaactgt gacgttac 28
<210>93
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>93
gcctaatacg tgtcaactgt gacgttac 28
<210>94
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>94
gctttcgata cgggttgact tgaggaa27
<210>95
<211>1493
<212>DNA
<213>棲牙普雷沃氏菌<Prevotella denticola)
<400>95
ctcaggatga acgctggcta caggcttaac acatgcaagt cgaggggaaa cggcattgag60
tgcttgcact gaatggacgt cgaccggcgc acgggtgagt aacgcgtatc caaccttccc120
gttactgcgg gataacctgc cgaaaggcag actaataccg catgttcttc gatgacggca180
tcagattcga agcaaagaty crtcggtaac ggagggggat gcgtctgatt agctagttgg240
cggggcgaeg gcccaccaag gckacgatca gtaggggttc tgagaggaag gtcccccaca300
ttggaactga gacacggtcc aaactcctac gggaggcagc agtgaggaat attggtcaat360
gggcggaagc ctgaaccagc caagtagcgt gcaggakgac ggccctacgg gttgtaaact420
gcttttatgc ggggataaag tgagggacgy gtcccttttt gcaggtaccg catgaataag480
gaccggctaa ttccgtgcca gcagccgcgg taatacggaa ggtccgggcg ttatccggat540
ttattgggtt taaagggagc gtaggccggg gattaagtgt gttgtgaaat gtaggcgccc600
aacgtctgac ttgcagcgca tactggttcc cttgagtacg cgcaacgccg gcggaattcg660
tcgtgtagcg gtgaaatgct tagatatgac gaagaacccc gattgcgaag geagccggcg720
ggagcgcaac tgacgctgaa gctcgaaggt gcgggtatcg aacaggatta gataccctgg780
tagtccgcac ggtaaacgat ggatgcccgc tgtcggcgcc ttgcgccggc ggccaagcga840
aagcgttaag catcccacct ggggagtacg ccggcaacgg tgaaactcaa aggaattgac900
gggggcccgc acaagcggag gaacatgtgg tttaattcga tgatacgcga ggaaccttac960
ccgggcttga atygcaggag aacgatacag agatgttgag gtccttcggg actcctgcga1020
aggtgctgca tggttgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt cggctyaagt gccataacga1080
gcgcaacccc tctccccagt tgccatcggg tgatgccggg cactccgggg acactgccgc1140
cgcaaggtgc gaggaaggcg gggaygacgt caaatcagca cggcccttac gtccggggct1200
acacacgtgt tacaatggcc ggcacagagy gcyggtgcgg ygcgagccgc atcyaatctt1260
gaaaaccggt ctcagttcgg actggggtct gcaacccgac cccacgaagc tggattcgct1320
agtaatcgcg catcagccac ggcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc1380
gtcaagccat gaaagccggg ggtgcctgaa gtccgtgacc gcgaggatcg gcctagggca1440
aaactggtga ttggggctaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg cgg 149權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌棲牙普雷沃氏菌(Prevotelladenticola)的基因的探針，所述探針具有下述(1)到(4)中的任一個(gè)堿基序列
(1)TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA(SEQ ID NO.70)或它的互補(bǔ)序列；
(2)AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT(SEQ ID NO.71)或它的互補(bǔ)序列；
(3)ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT(SEQ ID NO.72)或它的互補(bǔ)序列；和
(4)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70到72的序列和它們的互補(bǔ)序列中的任一個(gè)上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。
2.固定有探針的載體，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的第一探針被排列在固相載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體，其中固定有探針的載體包含至少一個(gè)具有在說(shuō)明書中提到的SEQ ID NO.35到94中任一個(gè)的堿基序列的、固定在與第一探針相分開(kāi)的位置上的第二探針。
4.用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的試劑盒，包含
根據(jù)權(quán)利要求1的探針；和
用于檢測(cè)探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述試劑含有用于擴(kuò)增棲牙普雷沃氏菌的基因的引物，并且該引物包括
(20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO20)的堿基序列的寡核苷酸；和
(25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO25)的堿基序列的寡核苷酸。
6.基因檢測(cè)試劑盒，包含
根據(jù)權(quán)利要求3的固定有探針的載體；和
用于檢測(cè)探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑，
其中該試劑含有引物，所述引物包括選自下述(1)到(21)中的至少一個(gè)寡核苷酸和選自下述(22)到(28)中的至少一個(gè)寡核苷酸
(1)具有5’gcggcgtgcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO1)的堿基序列的寡核苷酸；
(2)具有5’gcggcaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO2)的堿基序列的寡核苷酸；
(3)具有5’gcggcaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO3)的堿基序列的寡核苷酸；
(4)具有5’gcggtaggcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO4)的堿基序列的寡核苷酸；
(5)具有5’gcggcgtgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO5)的堿基序列的寡核苷酸；
(6)具有5’gcgggatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO6)的堿基序列的寡核苷酸；
(7)具有5’gcggcatgccttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO7)的堿基序列的寡核苷酸；
(8)具有5’gcggcatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO8)的堿基序列的寡核苷酸；
(9)具有5’gcggcgtgcttaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO9)的堿基序列的寡核苷酸；
(10)具有5’gcggcaggcctaatacatgcaag 3’(SEQ ID NO10)的堿基序列的寡核苷酸；
(11)具有5’gcgggatgctttacacatgcaag 3’(SEQ ID NO11)的堿基序列的寡核苷酸；
(12)具有5’gcggcgtgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO12)的堿基序列的寡核苷酸；
(13)具有5’gcggcgtgcataacacatgcaag 3’(SEQ ID NO13)的堿基序列的寡核苷酸；
(14)具有5’gcggcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO14)的堿基序列的寡核苷酸；
(15)具有5’gcggcgcgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO15)的堿基序列的寡核苷酸；
(16)具有5’gcggcgcgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO16)的堿基序列的寡核苷酸；
(17)具有5’gcgtcatgcctaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO17)的堿基序列的寡核苷酸；
(18)具有5’gcgataggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO18)的堿基序列的寡核苷酸；
(19)具有5’gcgacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO19)的堿基序列的寡核苷酸；
(20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO20)的堿基序列的寡核苷酸；
(21)具有5’acagaatgcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO21)的堿基序列的寡核苷酸；
(22)具有5’atccagccgcaccttccgatac 3’(SEQ ID NO22)的堿基序列的寡核苷酸；
(23)具有5’atccaaccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO23)的堿基序列的寡核苷酸；
(24)具有5’atccagccgcaggttcccctac 3’(SEQ ID NO24)的堿基序列的寡核苷酸；
(25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO25)的堿基序列的寡核苷酸；
(26)具有5’atccagcgccaggttcccctag 3’(SEQ ID NO26)的堿基序列的寡核苷酸；
(27)具有5’atccagccgcaggttctcctac 3’(SEQ ID NO27)的堿基序列的寡核苷酸；和
(28)具有5’atccagccgcacgttcccgtac 3’(SEQ ID NO28)的堿基序列的寡核苷酸。
7.用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌棲牙普雷沃氏菌的基因的探針組，包括選自下述(A)到(L)的至少兩個(gè)探針
(A)具有TCGATGACGGCATCAGATTCGAAGCA(SEQ ID NO.70)所示的堿基序列的探針；
(B)具有AATGTAGGCGCCCAACGTCTGACT(SEQ ID NO.71)所示的堿基序列的探針；
(C)具有ATGTTGAGGTCCTTCGGGACTCCT(SEQ ID NO.72)所示的堿基序列的探針；
(D)具有SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；
(E)具有SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；
(F)具有SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；
(G)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；
(H)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；
(I)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；
(J)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.70所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；
(K)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.71所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和
(L)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQ ID NO.72所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)棲牙普雷沃氏菌的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。
8.固定有探針的載體，包含組成根據(jù)權(quán)利要求7的探針組的多個(gè)第一探針，其中所述多個(gè)第一探針互相間隔地排列在固相載體上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的固定有探針的載體，其中該固定有探針的載體包含至少一個(gè)具有在說(shuō)明書中提到的SEQ ID NO.35到94中任一個(gè)的堿基序列的、固定在與所述多個(gè)第一探針相分開(kāi)的位置上的第二探針。
10.使用固定有探針的載體檢測(cè)分析物中的棲牙普雷沃氏菌的基因的方法，包括步驟
(i)使分析物和根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體反應(yīng)；和
(ii)檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)使用包括下述寡核苷酸的引物進(jìn)行分析物中的目標(biāo)核酸的PCR擴(kuò)增的步驟
(20)具有5’gctacaggcttaacacatgcaag 3’(SEQ ID NO20)的堿基序列的寡核苷酸；和
(25)具有5’atccagccgcaccttccggtac 3’(SEQ ID NO25)的堿基序列的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供用于病原性細(xì)菌菌種分類的、能匯總性地檢測(cè)相同菌種的菌株和將它們從其它細(xì)菌菌種中區(qū)別性地檢測(cè)出來(lái)的核酸探針。使用SEQ ID NO.70到72所示的堿基序列、和其互補(bǔ)序列或其修飾的序列中的任意一個(gè)，或它們中的至少兩個(gè)的組合來(lái)檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101177709SQ20071017004
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者福井壽文, 吉井裕人, 栗林英人 申請(qǐng)人:佳能株式會(huì)社