專利名稱：：探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測(cè)方法探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)(^//e,o6ac"/)的基因的探針和探針組，其用于檢測(cè)和鑒定傳染性疾病的致病性生物；固定有探針的載體，所述探針或探針組被固定在它上面；使用該固定有探針的載體的基因檢測(cè)方法；和用于該方法的基因檢測(cè)試劑盒。相關(guān)
背景技術(shù)：
：迄今，已提出在分析物中快速并準(zhǔn)確地檢測(cè)傳染性疾病的致病性生物的試劑和方法。例如，日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平H08-089254中公開了具有特定的堿基序列的寡核苷酸(其能分別用作探針和引物以用于檢測(cè)念珠菌病和曲霉病的病原性細(xì)菌)和使用此類寡核苷酸檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的方法。另外，相同的專利文件還公開了用于通過(guò)PCR同時(shí)擴(kuò)增多種目標(biāo)細(xì)菌的引物組。換言之，這些引物被用于在分析物中對(duì)作為多種目標(biāo)的來(lái)自真菌的核酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？梢允褂锰禺愑诟鱾€(gè)真菌的探針和經(jīng)由各個(gè)引物擴(kuò)增的核酸片段進(jìn)行雜交分析以檢測(cè)序列的特定部分的存在，從而鑒定分析物中的目標(biāo)真菌種類。另一方面，作為能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)具有不同堿基序列的寡核苷酸的方法，已知使用探針陣列的方法，其中將具有與各個(gè)堿基序列互補(bǔ)的序列的探針間隔地排列在固相支撐物上(日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平2004-313181)。發(fā)明概述不過(guò)，設(shè)計(jì)特異性地檢測(cè)樣品中傳染性疾病病原性細(xì)菌基因的探針不是一件容易的工作。因?yàn)椋四繕?biāo)基因，樣品可能進(jìn)一步含有其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。因此，設(shè)計(jì)特異性地檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因并同時(shí)禁止交叉污染的探針不是一件容易的工作，所述交叉污染是其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因的存在而造成的影響。在這種情況下，本發(fā)明人為獲得如下所述的探針進(jìn)行了研究，所述探針在維持低水平交叉污染的同時(shí)，甚至當(dāng)使用其中存在不同細(xì)菌的基因的樣品時(shí)，允許精確檢測(cè)后面提到的傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人最終發(fā)現(xiàn)了能精確檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)的基因的多個(gè)探針。本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)是提供探針和探針組，它們能從其中同時(shí)存在多種細(xì)菌的分析物中精確鑒定目標(biāo)細(xì)菌的基因。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供固定有探針的載體，它能被用于從其中同時(shí)存在多種細(xì)菌的分析物中精確地鑒定目標(biāo)細(xì)菌。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的基因檢測(cè)方法，它能從分析物中的多種細(xì)菌中(當(dāng)它們存在其中時(shí))快速并精確地檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌；和用于這種方法的試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針具有下述堿基序列(l)到(3)中的任一個(gè)(1)GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG(SEQIDNO.68)或它的互補(bǔ)序列；(2)TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT(SEQIDNO.69)或它的互補(bǔ)序列；和(3)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68到69的序列和它們的互補(bǔ)序列中的任一個(gè)上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。此外，本發(fā)明的用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針組包括選自下述(A)到(H)中的至少兩種探針(A)具有GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG(SEQIDNO.68)所示的堿基序列的探針；(B)具有TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT(SEQIDNO.69)所示的堿基序列的探針；(C)具有SEQIDNO.68所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(D)具有SEQIDNO.69所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(E)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(F)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.69所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(G)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和(H)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.69所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。本發(fā)明的固定有探針的載體的特征性特點(diǎn)是，上述探針(A)到(H)中的至少一個(gè)被固定在固相載體上，并且當(dāng)使用多個(gè)探針時(shí)，各個(gè)探針被間隔排列。通過(guò)使用本發(fā)明的固定有探針的載體在分析物中檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)的基因的方法，包括步驟讓分析物和具有上述構(gòu)成的固定有探針的載體反應(yīng)；和檢測(cè)閨定有探針的栽體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌-不動(dòng)桿菌(屬)的試劑盒的特征性特點(diǎn)是，包括上述探針(A)到(H)中的至少一個(gè)，和檢測(cè)探針與目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)分析物被上述致病性細(xì)菌感染時(shí)，細(xì)菌能被更快速并精確地從分析物中鑒定出，即使該分析物同時(shí)并且復(fù)雜地被上述細(xì)菌之外的其它細(xì)菌感染。特別地，可以檢測(cè)出不動(dòng)桿菌(屬)，同時(shí)精確區(qū)分它和可能引起交叉污染的大腸埃希氏桿菌。參照下述例示性實(shí)施方案的描述和附圖，本發(fā)明的進(jìn)一步特點(diǎn)將變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖1是闡述第一PCR(lstPCR)操作流程的圖。圖2是闡述第二PCR(2ndPCR)操作流程的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從各個(gè)保藏機(jī)構(gòu)荻得了到目前為止幾乎所有的被認(rèn)為是敗血病病原性細(xì)菌的細(xì)菌(由下述(l)到(80)表示)，并鑒定了所有這些細(xì)菌的16SrRNA的基因序列。隨后，在比較所有鑒定的序列時(shí)，詳細(xì)研究了不動(dòng)桿菌(屬)的探針序列，并且最終找出本發(fā)明的能夠鑒定不動(dòng)桿菌(屬)的探針。(1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC12600)(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidi's)(ATCC14990)(3)大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)(ATCC11775)(4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)(ATCC13883)(5)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC10145)(6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)(ATCC13380)(7)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)(ATCC33400)(8)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(ATCC33391)(9)陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)(ATCC13047)(10)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(ATCC19433)(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemoly"cus)(ATCC29970)(12)人葡萄球菌(Staphylococcushorainis)(ATCC27844)(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)(ATCC15305)(14)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(ATCC13813)(15)變異鏈球菌(Streptococcusmutans)(ATCC25175)(16)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(ATCC12344)(17)血鏈球菌(Streptococcussanguis)(ATCC10556)(18)鳥腸球菌(Enterococcusavium)(JCM8722)(19)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)(ATCC19434)(20)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(ATCC13525)(21)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(ATCC12633)(22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)(JCM5964)(23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC13637)(24)鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)(ATCC19606)(25)乙酸45不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(ATCC23055)(26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacterxylosoxidans)(ATCC27061)(27)創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)(ATCC27562)(28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonellacholeraesuis)(JCM1651)(29)弗勞地氏檸檬桿菌(Citrobacterfreundii)(ATCC8090)(30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(ATCC13182)(31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)(ATCC13048)(32)蜂房p合夫尼菌(Hafniaalvei)(ATCC13337)(33)液化沙雷氏菌(Serratia1iquefaciens)(ATCC27592)(34)奇異變形菌(Proteusmirabilis)(ATCC29906)(35)普通變開j菌(Proteusvulgaris)(ATCC33420)(36)摩氏摩根(氏)菌(Morganellamorganii)(ATCC25830)(37)雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)(JCM1675)(38)嗜7Jc氣單胞菌(Aeromonashydrophila)(JCM1027)(39)溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(ATCC43979)(40)陰道力口德纟內(nèi)氏菌(Gardnerellavaginalis)(ATCC14018)(41)白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(ATCC2701)(42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)(ATCC33152)(43)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)(ATCC14579)(44)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(ATCC6051)(45)堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)(ATCC12478)(46)胞內(nèi)分枝桿菌(MycobacterU邁intracellulare)(ATCC13950)(47)龜分支桿菌(Mycobacteriumchelonae)(ATCC35752)(48)星狀諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)(ATCC19247)(49)脆弱類桿菌(Bacteroidesfragiiis)(JCM11019)(50)多形類桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)(JCM5827)(51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)(ATCC51695)(52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)(JCM1290)(53)遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)(JCM10763)(54)壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)(JCM3718)(55)核粒梭桿菌(Fusobacteriumnueleatura)(ATCC25586)(56)嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)(ATCC4356)(57)普氏厭氧球菌(Anaerococcusprevotii)(JCM6490)(58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)(JCM8143)(59)不解糖p卜淋單胞菌(Porphyroraonasasaccharolytica)(JCM6326)(60)牙齦吟淋單胞菌(Porphyromonasgingivalis)(JCM8525)(61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotelladenticola)(ATCC38184)(62)痤裔丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)(JCM6473)(63)約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohiisonii)(ATCC17909)(64)瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)(ATCC17窗)(65)舒氏氣單胞菌(Aeroraonasschubertii)(ATCC43700)(66)維羅納氣單胞菌(Ae謹(jǐn)onasveronii)(ATCC35624)(67)吉氏類桿菌(Bacteroidesdistasonis)(ATCC8503)(68)普通類桿菌(Bacteroidesvulgatus)(ATCC8482)(69)大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)(ATCC33559)(70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis)(ATCC35217)(71)空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)(ATCC33560)(72)水生黃桿菌(Flavobacteriumaquatile)(ATCC11947)(73)水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)(ATCC33299)(74)黑色消化球菌(Peptococcusniger)(ATCC27731)(75)親合丙酸桿菌(Propionibacteriumavidum)(ATCC25577)(76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)(ATCC6207)(77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacteriumgranulosus)(ATCC25564)(78)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)(ATCC13949)(79)Flavobacteriumhydatis(NBRC14958)(80)約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)(麗C14942)所獲得的細(xì)菌菌種的保藏號(hào)示于上述右側(cè)的各個(gè)括號(hào)中。具有以"ATCC"、"JCM"和"NBRC"開頭的保藏號(hào)的細(xì)菌菌種分別得自于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)、曰本微生物保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms,RI薩BioResourceCenter)和美國(guó)呼吸治療協(xié)會(huì)(NationalBoardforRespiratoryCare)。本發(fā)明提供了鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌的寡核苷酸探針(在下文中，筒稱為探針)和包括兩種或更多種探針的組合的探針組。使用這種探針或探針組能檢測(cè)通過(guò)感染來(lái)引起炎癥的下述細(xì)菌。[細(xì)菌名稱]不動(dòng)桿菌(屬)就是說(shuō)，本發(fā)明的探針能檢測(cè)上述細(xì)菌的基因中的16SrRNA基因序列，包含下述的序列(A)具有GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG(SEQIDNO.68)所表示的堿基序列的探針；(B)具有TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT(SEQIDNO.69)所表示的堿基序列的探針；(C)具有SEQIDNO.68所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(D)具有SEQIDNO.69所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(E)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68所表示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(F)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.69所表示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而荻得的；(G)具有修飾的序列的探針，所述的修飾的序列是在SEQIDNO.68所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和(H)具有修飾的序列的探針，所述的修飾的序列是在SEQIDNO.69所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。探針組可以使用這些探針中的至少兩種來(lái)形成。這些探針的功能顯著依賴每個(gè)探針序列對(duì)感興趣的目標(biāo)核酸序列的特異性。探針序列的特異性可以通過(guò)目標(biāo)核酸序列和探針序列的堿基一致性程度來(lái)評(píng)估。進(jìn)一步地，當(dāng)多種探針組成探針組時(shí)，探針間解鏈溫度的變化可以影響探針組的性能。為了設(shè)計(jì)探針序列，選擇不管菌林的任何差異而對(duì)感興趣的特定細(xì)菌菌種顯示高特異性的區(qū)域。該區(qū)域含有3個(gè)或更多個(gè)和其它任意細(xì)菌菌種序列中的對(duì)應(yīng)堿基不一致的堿基。設(shè)計(jì)該探針序列，使在該探針序列和感興趣的特定細(xì)菌菌種對(duì)應(yīng)序列間的解鏈溫度與在該探針序列和任意其它細(xì)菌菌種對(duì)應(yīng)序列間的解鏈溫度相差io'c或更多。進(jìn)一步地，可以缺失或增加一個(gè)或多個(gè)堿基，使固定在單個(gè)載體上的各個(gè)探針可以具有預(yù)定范圍內(nèi)的解鏈溫度。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果80%或更多的堿基序列連續(xù)保守，探針的雜交強(qiáng)度將不會(huì)顯著降低。因此根據(jù)該發(fā)現(xiàn)可以得出結(jié)論，如果探針80%或更多的堿基序列連續(xù)保守，從公開在說(shuō)明書中的探針序列修飾而得的任意序列將具有足夠的探針功能。上述修飾的序列可以包括任意變體，只要它不損害探針功能；或任何變體，只要它和作為檢測(cè)目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。尤其是，希望包括任何變體，只要它能在嚴(yán)格條件下和作為檢測(cè)目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。優(yōu)選的界定所述變體的雜交條件包括下述實(shí)施例中的那些。此處使用的術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)目標(biāo)"可以是包括在樣品中的、將被用于雜交的序列，其可以是傳染性疾病病原性細(xì)菌獨(dú)有的堿基序列、或可以是獨(dú)有序列的互補(bǔ)序列。進(jìn)一步地，變體可以是在使它保持作為探針的功能的范圍內(nèi)通過(guò)缺失、置換或添加至少一個(gè)堿基所獲得的修飾的序列。這些探針序列僅特異性于編碼上述細(xì)菌16SrRNA的DNA序列，因此即使是在嚴(yán)格條件下也能期望獲得對(duì)該序列的足夠的雜交靈敏度。此外，即使探針序列被固定在設(shè)計(jì)成產(chǎn)生優(yōu)良結(jié)果的載體上時(shí)，這些探針序列中的任一個(gè)通過(guò)和目標(biāo)分析物的雜交反應(yīng)形成穩(wěn)定的雜交產(chǎn)物。進(jìn)一步地，通過(guò)在栽體上的預(yù)定位置供給探針并將探針固定其上，能夠獲得上面具有本發(fā)明的檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針的固定有探針的載體(例如DNA芯片)?？梢允褂枚喾N方法來(lái)供給探針到載體上。其中，例如，一種能被適當(dāng)使用的方法是保持表面狀態(tài)能讓探針通過(guò)化學(xué)結(jié)合(例如共價(jià)結(jié)合)固定在載體上，并且隨后通過(guò)噴墨方法在預(yù)定位置上提供含有探針的液體。這種方法讓探針難以從載體上脫離，并具有增強(qiáng)靈敏度的附加效果。換句話說(shuō)，當(dāng)使用常規(guī)使用的并被稱為Stanford方法的壓印方法制備DNA芯片時(shí)，產(chǎn)生的DNA芯片具有所施用的DNA趨于脫落的缺點(diǎn)。另一個(gè)形成DNA芯片的方法是通過(guò)在載體表面上合成DNA來(lái)進(jìn)行探針排列(例如來(lái)自于Affymetrix公司的DNA芯片)。在這種在載體上合成探針的方法中，難以為每個(gè)探針序列制備相等數(shù)量的合成DNA。因此，對(duì)應(yīng)于每個(gè)探針來(lái)說(shuō)每個(gè)固定區(qū)域(點(diǎn))的固定的探針數(shù)量趨于很大的變化。這種各個(gè)固定的探針數(shù)量的變化會(huì)引起對(duì)于采用那些探針的檢測(cè)結(jié)果的錯(cuò)誤評(píng)價(jià)?；谶@一事實(shí)，優(yōu)選使用上述噴墨方法來(lái)制備本發(fā)明的探針載體。上述噴墨方法具有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即探針能被穩(wěn)定地固定在載體上并難以脫離載體，從而有效地提供能高靈敏度和高準(zhǔn)確度地進(jìn)行檢測(cè)的探針載體。此外，探針組可以包括選自于一組序列中的至少兩個(gè)，所述一組序列含有上述SEQIDNO.68到69、它們的互補(bǔ)序列和通過(guò)在這些序列上在使之保持檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加所獲得的序列。這樣，檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)基因的準(zhǔn)確度能進(jìn)一步提高。在下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。待使用探針載體(例如DNA芯片)進(jìn)^f亍檢測(cè)的測(cè)試對(duì)象包括源自人和動(dòng)物(例如家畜)的那些，在所述探針載體中本發(fā)明的探針被固定在載體上。例如，測(cè)試對(duì)象是可能含有細(xì)菌的那些中的任何一個(gè)，包括任意體液，例如血液、腦脊液、咳出液、胃液、陰道分泌物和口腔粘膜液；和排泄物，例如尿和糞。也可以使用DNA芯片對(duì)能被細(xì)菌污染的所有介質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。此類介質(zhì)包括食物、飲用水和天然環(huán)境中的水，例如溫泉水，其能通過(guò)污染引起食物中毒;空氣清潔器等的濾膜等。進(jìn)/出口中應(yīng)該檢疫的動(dòng)物和植物也可用作感興趣的分析物。當(dāng)上述樣品能被直接用于和DNA芯片反應(yīng)時(shí)，它被用作和DNA芯反應(yīng)的分析物并且隨后分析反應(yīng)的結(jié)果?？蛇x擇地，當(dāng)樣品不能直接和DNA芯片反應(yīng)時(shí)，如果需要，可對(duì)樣品進(jìn)行抽提、純化和其它處理來(lái)獲得目標(biāo)物質(zhì)，并隨后提供作為分析物來(lái)和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。例如，當(dāng)樣品含有目標(biāo)核酸時(shí)，從樣品中制備提取物(所述提取物假定含有這種目標(biāo)核酸)，并隨后清洗、稀釋或等等來(lái)獲得分析物溶液，隨后和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。進(jìn)一步，當(dāng)目標(biāo)核酸包括在通過(guò)進(jìn)行多種擴(kuò)增操作(例如PCR擴(kuò)增)獲得的分析物中時(shí)，該目標(biāo)核酸可以被擴(kuò)增并隨后和DNA芯片反應(yīng)。擴(kuò)增的核酸的此類分析物包括如下通過(guò)使用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)16SrRNA基因的PCR反應(yīng)引物制備的擴(kuò)增的分析物。通過(guò)額外的PCR反應(yīng)等從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中制備的擴(kuò)增的分析物。通過(guò)PCR之外的擴(kuò)增方法制備的分析物。通過(guò)各種不同標(biāo)記方法中的任一種方法進(jìn)行標(biāo)記以便可視化的分析物。進(jìn)一步，用于制備固定有探針的載體(例如DNA芯片)的載體可個(gè)。載體的例子包括平坦基板例如玻璃基板、塑料基板和硅片；具有不規(guī)則表面的三維結(jié)構(gòu)；和球形體例如珠，和竿、帶和絲狀結(jié)構(gòu)。載體的表面可以被處理，這樣探針能固定在它上面。特別地，從重復(fù)性的觀點(diǎn)上看，通過(guò)在其表面引入官能團(tuán)使其能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而制備的載體具有較好的形式，因?yàn)樵陔s交反應(yīng)過(guò)程中探針被穩(wěn)定地結(jié)合?？梢允褂枚喾N方法固定探針。此類方法的一個(gè)例子是使用馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和巰基(-SH)基團(tuán)的組合。在這個(gè)方法中，巰基(-SH)基團(tuán)結(jié)合到探針末端，并且事先進(jìn)行加工以使載體(固體)表面具有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。由此，供給到載體表面上的探針的巰基和載體表面上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，由此探針被固定。能利用如下過(guò)程引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)首先讓玻璃基板和氨基硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，并隨后通過(guò)氨基基團(tuán)和EMCS試劑(N-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購(gòu)自Dojindo公司)反應(yīng)將馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板上。能在通過(guò)自動(dòng)DNA合成儀合成DNA時(shí)使用5'-巰基-修飾物C6(購(gòu)自GlenResearch公司)將巰基引入到DNA上。代替巰基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的上述組合，還可以使用，例如環(huán)氧基(在固相上)和氨基(核酸探針末端)的組合作為官能團(tuán)的組合用于固定。使用不同種類的硅烷偶聯(lián)試劑進(jìn)行表面處理也是有效的。使用其中引入了能和通過(guò)硅烷偶聯(lián)試劑引入的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)的探針。還可以使用施用帶有官能團(tuán)的樹脂的方法。能通過(guò)基因檢測(cè)方法，使用本發(fā)明的固定有探針的載體對(duì)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因進(jìn)行檢測(cè)，所述基因檢測(cè)方法包括步驟(i)讓分析物和上面固定有本發(fā)明的探針的固定有探針的載體反應(yīng)；(ii)檢測(cè)分析物中的核酸和固定有探針的栽體上的探針之間的反應(yīng)存在與否，或檢測(cè)分析物中的核酸和固定有探針的載體上的探針之間的雜交反應(yīng)強(qiáng)度；和(iii)當(dāng)檢測(cè)到探針和分析物中的核酸的反應(yīng)時(shí)，指明已經(jīng)和分析物中的核酸反應(yīng)的探針，并且根據(jù)探針的核酸序列指明傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。固定在固定有探針的載體上的探針是上述(A)到(H)中的至少一個(gè)。在載體上，根據(jù)檢測(cè)目的，用于^^測(cè)除不動(dòng)桿菌(屬)以外的其他細(xì)菌菌種的探針可以作為其它探針被固定。此時(shí)，其它探針可以是能檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)以外的菌菌種而不引起交叉污染的那些探針，并且使用這樣的探針能同時(shí)高準(zhǔn)確性地檢測(cè)多種細(xì)菌菌種。進(jìn)一步，如上所述，當(dāng)通過(guò)PCR擴(kuò)增分析物中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的16SrRM基因序列，并且將其提供為和探針載體反應(yīng)的樣品時(shí)，可以使用用于檢測(cè)所述傳染性疾病病原性細(xì)菌的引物組。該引物組適當(dāng)?shù)匕ㄟx自下述(l)到(21)所示的寡核苷酸中的至少一個(gè)，和選自下述(22)到(28)所示的寡核苦酸中的至少一個(gè)，更合適地包括下述(1)到(28)所示的所有寡核苷酸(1)具有5，gcggcgtgcctaatacatgcaag3，(SEQIDNO:1)的堿基序列的寡核苷酸；(2)具有5，gcggcaggcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(3)具有5，gcggcaggctUacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(4)具有5，gcggUggccUacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(5)具有5，gcggcgtgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(6)具有5，gcgggatgccttacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(7)具有5，gcggcatgcctUcacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；W具有5，gcggcatgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(9)具有5，gcggcgtgctUatacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(10)具有5，gcggcaggcctaatacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(11)具有5，gcgggatgctttacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(12)具有5，gcggcgtgccUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(13)具有5，gcggcgtgcaUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(14)具有5，gcggcatgccUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(15)具有5，gcggcgcgcctaacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(16)具有5，gcggcgcgcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:2)的(SEQIDNO:3)的(SEQIDNO:4)的卿IDNO:5)的(SEQIDNO:6)的卿IDNO:7)的(SEQIDNO:8)的(SEQIDNO:9)的(SEQIDNO:10)(SEQ(SEQ(SEQ(SEQ(SEQ(SEQIDIDIDIDIDNO:11)NO:12)NO:13)NO:14)NO:15)IDNO:16)的堿基序列的寡核苷酸；(17)具有5，gcgtcatgcctaacacatgcaag3，(SEQIDNO:17)的堿基序列的寡核苷酸；(18)具有5，gcgataggcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:18)的堿基序列的寡核苷酸；(19)具有5，gcgacaggcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:19)的堿基序列的寡核苷酸；(20)具有5，gctacaggcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:20)的堿基序列的寡核苷酸；(21)具有5，acagaatgcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:21)的堿基序列的寡核苷酸；(22)具有5,atccagccgcaccttccgatac3，(SEQIDNO:22)的堿基序列的寡核苷酸；(23)具有5，atccaaccgcaggttcccctac3，(SEQIDNO:23)的堿基序列的寡核苷酸；(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，(SEQIDNO:24)的堿基序列的寡核苷酸；(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，(SEQIDNO:25)的堿基序列的寡核苷酸；(26)具有5，atccagcgccaggttcccctag3，(SEQIDNO:26)的堿基序列的寡核苦酸；(27)具有5，atccagccgcaggttctcctac3，(SEQIDNO:27)的堿基序列的寡核苷酸；和(28)具有5，atccagccgcacgttcccgtac3，(SEQIDNO:28)的堿基序列的寡核苷酸。在它們中，設(shè)計(jì)用于使不動(dòng)桿菌(屬)擴(kuò)增的引物是下述引物組(3)具有5，gcggcaggcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:3)的堿基序列的寡核普酸；和(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3,(SEQIDNO:24)的堿基序列的寡核苷酸。為了檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)，至少可以包括這樣的引物。通過(guò)對(duì)SEQIDNO.1到28的每個(gè)序列與包括乙酸釣不動(dòng)桿菌(ATCC23055，SEQIDNO.95)的16SrRNA編碼區(qū)的DM序列進(jìn)行比較，能評(píng)價(jià)和驗(yàn)證各個(gè)引物(1)到(28)對(duì)于不動(dòng)桿菌(屬)的擴(kuò)增的效用。使用至少一種如上所述的探針和用于檢測(cè)該探針和分析物中的核酸的反應(yīng)的試劑，可以構(gòu)建用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的試劑盒。試劑盒中的探針可以優(yōu)選地被提供為如上所述的固定有有探針的載體。進(jìn)一步地，檢測(cè)試劑可以含有標(biāo)記物以檢測(cè)反應(yīng)或含有用于進(jìn)行作為預(yù)處理的擴(kuò)增的引物。實(shí)施例在下文中，通過(guò)使用用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針以檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。(實(shí)施例1)在這個(gè)實(shí)施例中，將描述使用兩步PCR的微生物檢測(cè)。l.探針DM的制備示于表1的核酸序列被設(shè)計(jì)作為用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的探針。具體而言，下面的探針堿基序列選自于編碼不動(dòng)桿菌(屬)16srRNA基因的基因組部分。這些探針堿基序列被設(shè)計(jì)為它們能具有對(duì)所述細(xì)菌的非常高的特異性，并且可以期望在探針堿基序列沒(méi)有變化的情況下具有足夠的雜交靈敏度。探針堿基序列不必總是與表1所示的那些完全匹配。除了具有表1所示堿基序列的探針以外，還可以使用包括表1所示堿基序列的具有20到30個(gè)堿基長(zhǎng)度的探針。不過(guò)，應(yīng)該確保在這樣的探針中的除表1所示部分以外的其它堿基序列部分對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性沒(méi)有影響。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>對(duì)于具有表1所示堿基序列的每種探針，在依照常規(guī)方法進(jìn)行合成后在核酸的5'末端引入作為用于將探針固定在DNA芯片上的官能團(tuán)的巰基。在引入官能團(tuán)后，進(jìn)行純化和凍干。用作內(nèi)標(biāo)物的凍干的探針儲(chǔ)存于-30'C冰箱。PCR引物的制備制備用于分析物擴(kuò)增的PCR引物作為用于病原性細(xì)菌檢測(cè)的16SrRM基因(目標(biāo)基因)擴(kuò)增PCR引物，設(shè)計(jì)了如下面的表2所示的核酸序列。具體地，設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增編碼16SrRM的基因組部分的引物組，即，位于堿基長(zhǎng)度為1400到1700的16SrRNA編碼區(qū)的兩個(gè)末端部分的、特定解鏈溫度盡可能相等的引物。為了同時(shí)擴(kuò)增列于下述(l)到(80)的多個(gè)不同細(xì)菌菌種、突變體或基因組中的多個(gè)16SrRNA基因，設(shè)計(jì)了多種類型的引物。注意，引物組不局限于表2所示的引物組，只要該引物組能共同地?cái)U(kuò)增幾乎全長(zhǎng)的所述病原性細(xì)菌16SrRNA基因即可。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(3)大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)(4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)(5)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)(7)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)(8)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(9)陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)(10)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)(12)人葡萄球菌(Staphylococcushominis)(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)(14)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(15)變異鏈球菌(Streptococcusmutans)(16)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(17)血鏈球菌(Streptococcussanguis)(18)鳥腸球菌(Enterococcusavium)(19)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)(20)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(21)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)(23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(24)鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbauraannii)(25)乙酸鉤不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacterxylosoxidans)(27)創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)(28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonellacholeraesuis)(29)弗勞地氏檸檬桿菌(Citrobacterfreundii)(30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)(32)蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)(33)液化沙雷氏菌(Serratia1iquefaciens)(34)奇異變形菌(Proteusmirabilis)(35)普通變形菌(Proteusvulgaris)(36)摩氏摩根(氏)菌(Morganellamorganii)(37)雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)(38)嗜7jc氣單胞菌(Aeromonashydrophila)(39)溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(40)P月道力口德納氏菌(Gardnerellavaginalis)(41)白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)(43)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)(44)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(45)堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)(46)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)(47)龜分支桿菌(Mycobacteriumchelonae)(48)星狀諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)(49)脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)(50)多形類桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)(51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)(52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)(53)遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)(54)壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)(55)核粒梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)(56)嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)(57)普氏厭氧球菌(Anaerococcusprevotii)(58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)(59)不解糖外淋單胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)(60)牙齦吟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)(61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotelladenticola)(62)痤齊丙酸桿菌(Propionibacteri認(rèn)acnes)(63)約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)(64)瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)(65)舒氏氣單胞菌(Aeromonasschubertii)(66)維羅納氣單胞菌(Aeromonasveronii)(67)吉氏類桿菌(Bacteroidesdistasonis)(68)普通類桿菌(Bacteroidesvulgatus)(69)大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)(70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestina1is)(71)空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)(72)水生黃桿菌(Flavobacteriumaquatile)(73)水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)(74)黑色消化球菌(Peptococcusniger)(75)親合丙酸桿菌(Propionibacteriumavidum)(76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)(77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacteriumgranulosura)(78)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricura)(79)Flavobacteriurahydatis(80)約氏黃桿菌(FlavobacteriumjohnsoiUae)在合成后通過(guò)高效液相色鐠(HPLC)純化表2所示引物。將21個(gè)正向引物和7個(gè)反向引物混合并溶于TE緩沖液，每個(gè)引物的終濃度為10pmol/ji1。標(biāo)記式PCR引物的制備采用和上述分析物擴(kuò)增引物相似的方式，具有如下面表3所示的序列的寡核苷酸用作用于進(jìn)行標(biāo)記的引物。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>用熒光染料Cy3標(biāo)記表3所示引物。合成后通過(guò)高效液相色譜(HPLC)純化引物。將所述6個(gè)標(biāo)記的引物混合并溶于TE緩沖液中，使每個(gè)引物的終濃度為10pmol/u1。不動(dòng)桿菌(屬)基因組DM(模型分析物)的提取微生物培養(yǎng)和基因組DNA提取首先，按照常規(guī)方法培養(yǎng)不動(dòng)桿菌(屬)的3種菌種鮑氏不動(dòng)桿菌(ATCC19606)、乙酸釣不動(dòng)桿菌(ATCC23055)和約氏不動(dòng)桿菌(ATCC17909)。使用核酸純化試劑盒(FastPrepFP100AFastDNAKit，F(xiàn)unakoshi公司制造)對(duì)這種微生物培養(yǎng)基施行基因組DM的提取和純化。收集的基因組DNA的檢測(cè)按照常規(guī)方法對(duì)收集的微生物不動(dòng)桿菌(屬)的基因組DM進(jìn)行瓊脂糖電泳和260/280nm吸收測(cè)定。因此，檢測(cè)了質(zhì)量(低分子核酸的混入量和分解程度)和收集量。在這個(gè)實(shí)施例中，大約收集了10yg的基因組DNA。沒(méi)有觀察到基因組DNA的降解或rRNA污染。收集的基因組DM以50ng/jliI的終濃度溶于TE緩沖液中，并用于下面的實(shí)驗(yàn)。DNA芯片的制備清潔玻璃基板將合成石英制備的玻璃基板(尺寸25mmx75mmxlmm，購(gòu)自IiyamaPrecisionGlass公司)放在耐熱和堿的架子中并浸泡在已經(jīng)調(diào)節(jié)到具有預(yù)定濃度的清潔溶液中進(jìn)行超聲波清洗。玻璃基板在清潔溶液中持續(xù)浸泡一夜并用超聲波清洗20分鐘。取出基板，用純水輕輕沖洗，并在高純水中用超聲波清洗20分鐘。將該基板在加熱到80'C的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡IO分鐘。再次用純水清洗和用高純水清洗。如此制備了DM芯片的石英玻璃基板。表面處理硅烷偶聯(lián)試劑KBM-603(購(gòu)自Shin-EtsuSilicone公司)以1重量。/。(wt。/。)的濃度溶于純水，并在室溫下攪拌2小時(shí)。清潔的玻璃基板浸泡到硅烷偶聯(lián)試劑水溶液中并在室溫下持續(xù)放置20分鐘。取出玻璃基板。用純水輕輕沖洗其表面，并通過(guò)噴射氮?dú)庵粱宓膬蓚€(gè)表面上來(lái)進(jìn)行干燥。干燥的基板在烘箱中以120。C烘烤1小時(shí)來(lái)完成偶聯(lián)試劑處理，由此氳基基團(tuán)被引入到基板表面上。下一步，N-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基琥珀酰亞胺(下文簡(jiǎn)寫為EMCS)溶于二曱亞砜和乙醇的1:1(體積比)溶劑混合物中，以獲得0.3mg/ml的終濃度。結(jié)果，制備了EMCS溶液。此處，EMCS是N-(6-馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購(gòu)自Dojindo。烘烤的玻璃基板保持靜置并冷卻，并在室溫下浸泡到制備好的EMCS溶液中2小時(shí)。通過(guò)這個(gè)處理，通過(guò)硅烷偶聯(lián)試劑引入到基板表面上的氨基基團(tuán)和EMCS中的琥珀酰亞胺基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，將馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板表面上。使用上述溶有EMCS的溶劑混合物清洗從EMCS溶液中取出的玻璃基板。用乙醇進(jìn)一步清洗玻璃基板并在氮?dú)夥諊懈稍铩Ｌ结樛葘⒃趯?shí)施例1的階段1(探針DNA的制備)中制備的微生物檢測(cè)探針溶于純水。溶液配制為終濃度(溶解在墨水中時(shí))為10jjM。隨后，溶液被凍干以去除水。用BJ打印機(jī)吐出DNA并結(jié)合到基板上制備含有7.5-wt。/。丙三醇、7.5-wt。/U克二甘醇、7.5-wt。/。尿素和1.0-wt%AcetylenolEH(購(gòu)自KawakenFineChemicals公司)的7k溶液。事先制備的兩個(gè)探針(表1)中的每個(gè)探針按特定濃度溶于該溶劑混合物中。用所得到的DNA溶液充滿噴墨打印機(jī)(商品名BJF-850，購(gòu)自Canon公司)的墨盒，并安裝到打印頭上。此處所用的噴墨打印機(jī)事先已經(jīng)被改良，能在平板上打印。當(dāng)根據(jù)預(yù)定的文件創(chuàng)建方法輸入打印模式時(shí)，可將大約5皮升DM溶液以大約120iam的間距點(diǎn)樣。通過(guò)使用改良的噴墨打印機(jī)來(lái)對(duì)一片玻璃基板進(jìn)行打印操作以制備陣列。在確證打印已經(jīng)確實(shí)完成后，玻璃基板在潮濕的倉(cāng)室中靜置30分鐘，讓玻璃基板表面上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和核酸探針末端的巰基基團(tuán)反應(yīng)。清洗反應(yīng)30分鐘后，使用含有100mMNaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.O)清洗表面殘留的DNA溶液，由此獲得DM芯片，在該芯片中單鏈DNA被固定在玻璃基板的表面上。分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記分析物的擴(kuò)增第一PCR提供作為分析物的微生物基因的擴(kuò)增反應(yīng)(第一PCR)和標(biāo)記反應(yīng)(第二PCR)如下面表4所示。表4AmpliTaqGoldLD(5.0U/mL)引物混合物<FR21x7>正向引物(x21[每種0.625pM])反向引物(x07[每種1.875pM])10xPCR緩沖液MgCl2(25mM)dNTP混合物(每種2.5mM)模板H20__0.5pL(2.5單位/管)2.0pL(最終每種1.25pmol/管)(最終每種3.75pmol/管)5.0pL(最終1倍濃度)8.0mL(最終4.0raM)4.0mL(最終每種200jaM)可變直到50pL_50使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖1所示的操作流程進(jìn)行具有上述的組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用純化柱(QIAquickPCRPurificationKit,購(gòu)自QIAGEN公司)純化引物。隨后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的定量測(cè)定。標(biāo)記反應(yīng)第二PCR使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖2所示操作流程進(jìn)行具有表5所示組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。表5PremixTaq(ExTaqVersion)25jaLCy3-標(biāo)記的反向引物混合物0.83iaLCy3R9混合物(x06[每種10mM])(最終每種8.3pmol/管)模板可變(最終30ng/管)H20___直到50iaL_總計(jì)50jaL反應(yīng)結(jié)束后，寸吏用純4匕柱(QIAquickPCRPurificationKit，購(gòu)自QIAGEN)純化引物來(lái)獲得標(biāo)記的分析物。雜交使用在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片和在階段5(分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記)制備的標(biāo)記的分析物進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。DNA芯片的封閉牛血清白蛋白(BSA，F(xiàn)ractionV:購(gòu)自Sigma公司)溶于lOOmMNaCl/10mM磷酸鹽緩沖液中，獲得1wt%的溶液。隨后，在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片在室溫下在所述溶液中浸泡2小時(shí)以進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，使用如下所述的清洗溶液清洗芯片，用純水沖洗，并用旋轉(zhuǎn)式干燥機(jī)脫水。清洗溶液含有0.1wt。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)的2xSSC溶液(NaC1300mM，檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉二水合物，C6H5Na3'2H20)30mM，pH7.0)。雜交脫水的DNA芯片置于雜交儀(HybridizationStation,購(gòu)自GenomicSolutions公司)。在雜交溶液中在下述條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交溶液6xSSPE/10。/。曱酰胺/目標(biāo)(所有第二PCR產(chǎn)物)/0.05wt°/。(6xSSPE:NaCl900mM，NaH2P04H2050mM，EDTA6mM，pH，7.4)雜交條件65。C3分鐘，55。C4小時(shí)，用2xSSC/0.1%SDS在50"下清洗，用2xSSC/0.1%SDS在20。C下清洗(用H20沖洗手工)，并旋轉(zhuǎn)甩千。微生物基因組檢測(cè)(熒光測(cè)定法)雜交反應(yīng)結(jié)束后用DNA芯片熒光檢測(cè)器(GenePix4000B，購(gòu)自Axon公司)對(duì)DNA芯片進(jìn)行熒光測(cè)定。結(jié)果，能夠具有足夠信號(hào)地、可高重復(fù)性地檢測(cè)出不動(dòng)桿菌(屬)。熒光測(cè)定結(jié)果顯示于下面的表6。表6探針號(hào)熒光強(qiáng)度鮑氏不動(dòng)桿菌ATCC19606乙酸鈣不動(dòng)桿菌ATCC23055約氏不動(dòng)桿菌ATCC17909102-G-ACI-014444.95597.93313.7102—G_ACI_025803.09381.26109.9和其它細(xì)菌菌種的雜交為了證實(shí)表1所示探針組能特異性地只和不動(dòng)桿菌(屬)雜交這一事實(shí)，和大腸埃希氏桿菌(JCM1649)的雜交反應(yīng)的結(jié)果顯示于下面的表7。表7探針號(hào)焚光強(qiáng)度大腸埃希氏桿菌(JCM1649)102-G-ACI—0150.0102-G—ACI-0264.59.結(jié)果如從上面的描述可以看出的，制備了固定有能以特異性的方式只檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的探針組的DNA芯片。進(jìn)一步地，使用這種DNA芯片能鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌，因此來(lái)自于微生物的DNA探針的問(wèn)題能被解決。換句話說(shuō)，所述寡核苷酸探針能被大量地化學(xué)制備，同時(shí)它的純化或濃縮能被控制。此外，對(duì)于微生物菌種的分類，能夠提供探針組，所述探針組能匯總性地檢測(cè)相同屬的菌林，并能將它們從其它屬細(xì)菌中區(qū)別性地檢測(cè)出來(lái)。進(jìn)一步地，除了如上述的大腸埃希氏桿菌以外，對(duì)提取自上述(l)到(80)所示的細(xì)菌的每種核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)。其結(jié)果證實(shí)，除了不動(dòng)桿菌(屬)以外，對(duì)于那些細(xì)菌中的每種細(xì)菌，和大腸桿菌相似，沒(méi)有觀察到實(shí)質(zhì)上的反應(yīng)。列于上述(l)到(80)的細(xì)菌是敗血病病原性細(xì)菌，并且它們幾乎覆蓋了過(guò)去在人血液中檢測(cè)到的所有的病原性細(xì)菌。因此，通過(guò)使用本實(shí)施方案的引物，血液中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的核酸能被提取出來(lái)并隨后和本發(fā)明的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此能夠以高準(zhǔn)確性進(jìn)行不動(dòng)桿菌(屬)的鑒定。進(jìn)一步地，根據(jù)上述的實(shí)施例，通過(guò)完全地檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的16SrRNA基因，能夠以高準(zhǔn)確性且有效地確定傳染性疾病病原性細(xì)菌的存在。(實(shí)施例2)能同時(shí)確定多種細(xì)菌菌種的DNA芯片的制備按照和實(shí)施例1的階段l(探針DNA的制備)相似的方式，制備具有顯示于下面表8的堿基序列的探針。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>這些探針能特異性地檢測(cè)列于表中左欄的特定細(xì)菌菌種(或?qū)?，正如實(shí)施例1中的能特異性地針對(duì)不動(dòng)桿菌(屬)的探針一樣。進(jìn)一步地，這些探針被設(shè)計(jì)為它們具有和目標(biāo)相同的Tm值、和非目標(biāo)序列相同的反應(yīng)性等，因此在相同的反應(yīng)條件下，感興趣的細(xì)菌菌種的核酸能被特異性地檢測(cè)。對(duì)于各個(gè)探針，按照和實(shí)施例1的階段4-3相似的方式制備探針溶液。隨后，使用在實(shí)施例1的階段4-4中使用的噴墨打印機(jī)將每個(gè)探針溶液吐出到相同的基板上，形成具有以大約120nra的間隔排列的各個(gè)探針的點(diǎn)的多個(gè)DNA芯片。按照和實(shí)施例1的階段6相似的方式將所述DNA芯片之一用于和提取自不動(dòng)桿菌(屬)的核酸雜交。結(jié)果，特異性檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的探針點(diǎn)顯示出和實(shí)施例1幾乎相等的熒光強(qiáng)度。相反，其它探針的點(diǎn)顯示非常低的熒光強(qiáng)度。進(jìn)一步，使用其它制備的DM芯片和表8所列的除不動(dòng)桿菌(屬)以外的細(xì)菌雜交。結(jié)果，不動(dòng)桿菌(屬)的點(diǎn)顯示非常低的熒光強(qiáng)度，同時(shí)針對(duì)感興趣的細(xì)菌菌種的探針的點(diǎn)顯示非常高的熒光強(qiáng)度。因此，證實(shí)了本實(shí)施例制備的DNA芯片還能同時(shí)測(cè)定列于表8的除不動(dòng)桿菌(屬)以外的16個(gè)細(xì)菌菌種和6個(gè)屬。通過(guò)同時(shí)使用針對(duì)目標(biāo)種和相應(yīng)屬(例如丙酸桿菌屬和痤瘡丙酸桿菌)的探針，能夠高度準(zhǔn)確地鑒定目標(biāo)種或同時(shí)鑒定相同屬的多個(gè)目標(biāo)種。(實(shí)施例3)當(dāng)分析物中存在多種細(xì)菌菌種時(shí)，嘗試了使用實(shí)施例2所制備的DNA芯片進(jìn)行檢測(cè)。制備其中培養(yǎng)有不動(dòng)桿菌(屬)和艱難梭狀芽胞桿菌的培養(yǎng)基，并進(jìn)行和實(shí)施例1相同的處理來(lái)和DNA芯片反應(yīng)。結(jié)果，只有具有SEQIDNO.43、44、45、68和69的探針點(diǎn)顯示高熒光強(qiáng)度，因此能同時(shí)證實(shí)這些細(xì)菌的共同存在。本發(fā)明不局限于上述實(shí)施例，并且在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以進(jìn)行多種改變和修飾。因此為了向公眾通告本發(fā)明的范圍，指定了下面的權(quán)利要求。<110>佳能株式會(huì)社<120〉探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測(cè)方法<130>10048378CN01<150>JP2006-306010<151〉2006-11-10<160〉95<170〉Patentinversion3.1<210〉1<211〉23〈212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物〈400〉1gcggcgtgcct肪tacatgcaag23<210〉2<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>2gcggcaggcctaacacertgcaag23<210〉3<211>23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400〉3gCggC3ggCtt33C3C3tgCS3g<210>4<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉引物<400>4gcggtaggcctascac3tgc3￡ig〈210〉5〈211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉5gcggcgtgcttaacacatgcaag<210〉6〈211>23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉6gcgggatgccttacacatgcaag<210〉7說(shuō)明書第30/56頁(yè)232323<211〉23<212>腿<213〉人工序列〈220〉<223>引物<400〉7gcggcatgccttacacatgcaag<210>8<211〉23<212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉引物〈400〉8gcggcatgcttaacacatgcaag<210〉9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>9gcggcgtgctt幼tacatgcaag<210〉10<211〉23〈212〉腿<213>人工序列<220〉<223>引物<400>10gcggcaggcctaatacatgcaag<210>11<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400〉11gcgggatgctttacacatgcaag<210〉12<211>23〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉引物<400〉12gcggcgtgcctaacacatgc肪g<210>13<211〉23<212〉DNA〈213>人工序列<220><223〉引物<400>13gcggcgtgcataacacatgc肪g<210>14<211〉23<212〉廳<213〉人工序列23232323<220><223>引物<400〉14gcggcatgcctaacacatgcaag23<210〉15<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉引物<400>15gcggcgcgcctaacacatgcaag〈210〉16<211〉23<212>腿<213>人工序列<220><223>引物<400>16gcggcgcgcttaacacatgc幼g<210>17<2U>23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物〈400〉17gcgtcatgcctaacacatgcaag<210>18<211>23<212>畫<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉18gcgataggcttaacacatgcaag<210>19<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>19gcgacaggcttaacacatgcaag<210〉20<211〉23〈212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>20gctacaggcttaacacatgcaag<210>21<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉212323233c灘aatgcttaacacatgc紛g23<210>22<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉22atccagccgcacctt.ccgatac22<210>23〈211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉23atccaaccgcaggttcccctac22<210〉24<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物〈400〉24atccagccgcaggttcccctac22<210〉25<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉25atccagccgcaccttccggtac<210〉26<211〉22<212>鵬<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉26atccagcgccaggttcccctag<210〉27<211>22<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉27atccagccgcaggttctcctac<210〉28〈211〉22<212>腿<213〉人工序列<220〉<223>引物<400〉28atccagccgcacgttcccgtac<210>29<211〉23<212>腿<213>人工序列<220〉<223〉引物<400〉29taccttgttacgacttcacccca23<210>30<211〉23<212>腿<213>人工序列<220><223〉引物<400>30taccttgttacgacttcgtccca23〈210>31<211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉引物<400>31taccttgttacgacttagtccca23<210>32<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>32taccttgttacgacttagcccca<210>33<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>33taccttgttacgacttagtccta<210>34<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉34taccttgttacgacttagcccta232323<210>35<211〉28<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉探針<400>35tcatcttgaggtatggaaggga卿tgg28<210〉36<211〉28<212〉腿<213>人工序列<220〉<223〉探針<400>36gtgttaggtgtctgg組aatctgggtg28〈210〉37<211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉探針<400>37accaagtcttgacatattacggcgg25<210>38<211>26<212>腿<2丄3>人工序列<220〉<223>探針<400>38aaggattccggtaaaggatggggatg26<210>39<211〉26<212>DNA〈213〉人工序列<220><223〉探針<400〉39tggaaacatgtcagtgagcaatcacc26<210〉40<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>3atatC333ggtgagCC3gt3C3gg3tgg330<210>44<211>28<212>DNA<213〉人:」:序列<220〉<223〉探針<400〉44ccgtagtaagctcttgaaactgggagac28<210〉45<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>探針<400>45tcccaatgacatctccttaatcggagag28<210>46〈211>27<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉探針<400>46aaccaaaggagcaatccgctatgagat27<210〉47<211〉25〈212〉DNA<213>人工序列<220><223〉探針<400>47gagcgtaggcggatgattaagtggg25<210〉48<211>29<212>DNA<213〉人工序列〈220>〈223>探針<400〉48cccttgcattactcttaatcgaggaaatc29〈210〉49<211>22<212〉DNA<213>人工序列<220><223>探針<400〉49ggaaagcccagacggcaaggga22<210>50<211>26<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉探針<400>50cctctcaagcgggatctctaatccga26<210〉51<211>23<212〉鵬〈213〉人工序列<220><223〉探針<400>51tgccccatgttgccagc.attagg<210>52<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉探針<400>52ttttcgcatggagg犯tcatgaaagcta<210>53<211〉21<212>醒<213>人工序列〈220〉<223>探針<'■〉53agatgcgccggtgccctttcg<210〉54<211>26<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>探針<400〉54agtcgggaagaagtcagtgacggtac<210〉55<211〉24<212〉DNA〈213>人l:序列<220〉<223>探針<400〉55gagtacgtgcgcaagcatga犯ct<210>56<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>探針〈400〉56gaagactgcccgcaagggttgtaa<210〉57<211>25<212〉DNA<213>人丄序列<220><223〉探針<400〉57gtgtactggaggtacgtggaetcgtg〈210>58<211>24<212>DNA<213〉人工序列26242425<220><223〉探針<400>58gcatgaggctgagaggtctcttcc24<210>59<211>28<212〉DNA<213>人[序列〈220>〈223〉探針<400〉59ttatagctgtaagataggcatgcgtccc28<210〉60<211>26<212>醒<213〉人」—:序列<220〉<223>探針<400〉60aacgggcgatacgagtattgcattga26<210〉61<211>25<212>DNA<213〉人工序列<220><223>探針<400〉61atataccgtcaagcttccacagcga25<210〉62<211〉25<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223>探針<400〉62tttgaaaggcgcttttgcgtcactg<210〉63<211〉30<212〉DNA<213〉人丄序列<220><223〉探針<400>63caaggatgagagtagaacgttcatcccttg〈210〉64<211〉30<212〉DNA<2i3〉人r.序列<220〉<223>探針<400>64cagigg3tgag3gtagaa/tgttcatcccttg<210>65<211>27<212〉讓<213〉人工序列<220><223>探針<400>65cctgggaatggcatctaagactggtca27<210>66<211>28<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉探針<400〉66g3ggaaggcgttg3tgcta3tstcstcs28<210〉67〈211〉24<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉探針〈400>67gagca幼gcaggggaacttcggtc<210〉68<211〉24<212>腿<213>人工序列<220><223〉探針<400〉68gttggggcctttgaggctttagtg〈210〉69<211>26<212>陽(yáng)<213〉人工序列<220〉<223〉探針<400〉69tgggagaggatggtagaattccaggt<210>70<211>26<212>腿<213>人工序列<220〉〈223〉探針<400〉70tcg3tgacggcatcagattcgaagca<210>71<211>24<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉探針<400〉71aatgtaggcgcccaacgtctgact<210><211><212〉<213>7224腿人工序列<220〉<223>探針<400〉72atgttgaggtccttcgggactcct<210>7326262424<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223〉探針<400〉73ggaagtaactagaatatgtagtgtagcggtg<210>74<211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉探針<400>74gccagtgc肌actgtgaggaaggt〈210〉75<211>25〈212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>探針<400>75gggt3ggggtcctg卿ggg卿tc<210〉76<211>24<212>■<213>人工序列<220><223〉探針<400〉76g戰(zhàn)tgCCttCggg朋tC3g33C3C<210〉77<211>24<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉探針<400>77ctgcaagctagcgatagtgagcga<210>78<211>25〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>探針<400〉78cgatggataggggttctgagaggaa24<210><211><212><213〉7925DNA人工序列<220><223>探針<400>79tgcggctc肌ccgt朋aattgcagt〈210>80<211〉25〈212〉廳<213>人工序列<220><223>探針<400>80tgtggctcaaccatagaattgccgt25〈210〉81<211>26<212〉DNA〈213>人工序列<220>〈223〉探針<400〉81gtacctgtaagaaagacggccttcgt26<210〉82<211〉27<212〉DNA<213>人丄序列<220><223>探針〈400>82ctgccgagtgatgtaatgtcacttttc27<210>83<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉探針<400〉83tcggaggtttc卿accgtcgg22<210>84DNA<213〉人工序列<220>〈223〉探針〈400〉84accsi肌gg3gc肌tccgct3tgagatg27<210〉85<211>26<212〉DNA<213>人」:序列<220><223〉探針〈400〉85atcaaaggtgagccagtacaggatgg<210〉86<211〉31<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉探針〈400〉86attaa8gg兆taatccgctatgagatggacc31<210>87<211>26<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>探針<400〉87<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula><220><223>探針<400>91acagtggaatcagcgactgggg22<210>92<211>28<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉探針<400〉92gcctaatacgtatcaactgtgacgttac28<210>93<211〉28<212>DNA〈213〉人「.序列<220〉<223>探針<400〉93gcctaatacgtgtcaactgtgacgttac28<210>94<211>27<212>DNA〈213〉人工序列<220><223>探針<400〉94gctttcgatacgggttgacttgaggaa27<210>95<211〉1499<212>腿<213〉乙酸韋丐不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)<400〉95ctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgggggaaggtagctt60gctaccggacctagcggcggacgggtgagtaatgctt鄉(xiāng)aatctgcctattagtggggg120acaacatctcgaaagggatgctaataccgcatacgtcctacgggag幼agcaggggatct180tcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcc240taccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccscactgggactgagac300acggcccagactcctacggg3ggcagcagtggggaatattggac朋tggggggaaccctg360atccagccatgccgcgtgtgtg肌gaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgagga420ggaggctactttagttaatacctagagatagtggacgttactcgcag肌taagcaccggc480t犯ctctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgg540gcgta朋gcgtgcgt3ggcggct城t肌gtcggatgtgaaatccccgagctt犯cttgg600gaattgcattcgatactggtgagctagagtatggg兆aggatggtag犯ttccaggtgta660gcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaa720tactgacgctgaggtacg犯3gcatggggagc犯acaggattagataccctggtagtcca780tgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacg840cgataagtagaccgcctggggagtacggtcgc犯gact犯朋ctcaaatgaattgacggg900ggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgc犯cgcgaagaaccttacctg960gccttgacatactagaaactttccagagatggattggtgccttcgggaatctagatacag1020gtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtt犯gtcccgc犯cgagc1080gcaacccttttccttacttgccagcatttcggatgggaactttaaggatactgccagtga1140caaactg眺gaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctaca1200cacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacacagcgatgtgatgctaatctcaaa1260aagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctag1320taatcgcggatcagaatgccgcggtg犯tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc1380acaccatgggagtttgttgcaccagaagtagctagcct肌ctgca犯gagggcggttacc1440scggtgtggccgatgactggggtg犯gtcgt犯c犯ggtagccgt鄉(xiāng)gg犯cctgcggl柳權(quán)利要求1.用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌不動(dòng)桿菌(屬)(Acinetobacter)的基因的探針，所述探針具有下述(1)到(3)中的任一個(gè)堿基序列(1)GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG(SEQIDNO.68)或它的互補(bǔ)序列；(2)TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT(SEQIDNO.69)或它的互補(bǔ)序列；和(3)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68到69的序列和它們的互補(bǔ)序列中的任一個(gè)上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。2.固定有探針的載體，其中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的第一探針被排列在固相載體上。3.根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體，其中固定有探針的載體包含至少一個(gè)具有在說(shuō)明書中提到的SEQIDNO.35到94中任一個(gè)的堿基序列的、固定在與第一探針相分開的位置上的第二探針。4.用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求l的探針；和用于檢測(cè)探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述試劑含有用于擴(kuò)增不動(dòng)桿菌(屬)的基因的引物，并且該引物包括(3)具有5，gcggcaggcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:3)的堿基序列的寡核苷酸；和(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，(SEQIDNO:24)的堿基序列的寡核苷酸。6.基因檢測(cè)試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求3的固定有探針的載體；和用于檢測(cè)探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑，其中該試劑含有引物，所述引物包括選自下述(1)到(21)中的至少一個(gè)寡核苷酸和選自下述(22)到(28)中的至少一個(gè)寡核苷酸(1)具有5，gcggcgtgcctaatacatgcaag3，(SEQIDNO:堿基序列的寡核苷酸；(2)具有5，gcggcaggcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(3)具有5，gcggcaggctUacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(4)具有5，gcggtaggcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(5)具有5,gcggcgtgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(6)具有5，gcgggatgccttacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(7)具有5，gcggcatgccUacacatgcaL8Lg3，堿基序列的寡核苷酸；(8)具有5，gcggcatgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(9)具有5，gcggcgtgcttaatacatgcaag3，堿基序列的寡核普酸；(10)具有5，gcggcaggcctaatacatgcaag3，堿基序列的寡核普酸；(11)具有5，gcgggatgctttacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(12)具有5，gcggcgtgcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(13)具有5，gcggcgtgcaUacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；U4)具有5，gcggcatgcctaacacatgcaag3，(SEQIDNO:(SEQIDNO:卿IDNO:卿IDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:10)的(SEQIDNO:11)的(SEQIDNO:12)的卿IDNO:13)的(SEQIDNO:14)的1)的2)的3)的4)的5)的6)的7)的8)的9)的堿基序列的寡核苷酸；Q5)具有5，gcggcgcgcctaacacatgcaag3'堿基序列的寡核苷酸；(16)具有5，gcggcgcgcttaacacatgcaag3'堿基序列的寡核苷酸；(17)具有5，gcgtcatgcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(18)具有5，gcgataggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(19)具有5，gcgacaggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(20)具有5，gctacaggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(21)具有5，ac￡igaatgctta￡ic￡ic"gc￡iag3，堿基序列的寡核苷酸；(22)具有5，atccagccgcaccttccgatac3，堿基序列的寡核苷酸；(23)具有5，atccaaccgcaggttcccctac3，堿基序列的寡核苷酸；(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，堿基序列的寡核苷酸；(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，堿基序列的寡核苷酸；(26)具有5，"ccagcgccaggttcccctag3，堿基序列的寡核苷酸；U7)具有5，atccagccgcaggttctcctac3，堿基序列的寡核苷酸；和(28)具有5，atccagccgcacgttcccgtac3，堿基序列的寡核苷酸。(SEQIDN0:15)的(SEQIDNO:16)的(SEQIDNO:17)的(SEQIDNO:18)的(SEQIDNO:19)的(SEQIDNO:20)的(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:21)的22)的23)的24)的(SEQIDNO:25)的(SEQIDNO:26)的(SEQIDNO:27)的(SEQIDNO:28)的7.用于檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針組包括選自下述(A)到(H)的至少兩種探針(A)具有GTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG(SEQIDNO.68)所示的堿基序列的探針；(B)具有TGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT(SEQIDNO.69)所示的堿基序列的探針；(C)具有SEQIDNO.68所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(D)具有SEQIDNO.69所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(E)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(F)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.69所示的堿基序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(G)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.68所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和(H)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.69所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測(cè)不動(dòng)桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。8.固定有探針的載體，包含組成根據(jù)權(quán)利要求7的探針組的多個(gè)第一探針，其中所述多個(gè)第一探針互相間隔地排列在固相載體上。9.根據(jù)權(quán)利要求8的固定有探針的載體，其中該固定有探針的載體包含至少一個(gè)具有在說(shuō)明書中提到的SEQIDNO.35到94中任一個(gè)的堿基序列的、固定在與所述多個(gè)第一探針相分開的位置上的第二探針。10.使用固定有探針的載體檢測(cè)分析物中的不動(dòng)桿菌(屬)的基因的方法，包括步驟(i)使分析物和根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體反應(yīng)；和(ii)檢測(cè)固定有探針的栽體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測(cè)固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。ll.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)使用包括下述寡核苷酸的引物進(jìn)行分析物中的目標(biāo)核酸的PCR擴(kuò)增的步驟(3)具有5，gcggcaggcttaacacatgcaag3，(SEQIDN0:3)的堿基序列的寡核苷酸；和(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，(SEQIDNO:24)的堿基序列的寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供用于病原性細(xì)菌菌種分類的、能匯總性地檢測(cè)相同菌種的菌株和將它們從其它細(xì)菌菌種中區(qū)別性地檢測(cè)出來(lái)的核酸探針。使用SEQIDNO.68到69所示的堿基序列、和其互補(bǔ)序列或其修飾的序列中的任意一個(gè)，或它們中的至少兩個(gè)的組合來(lái)檢測(cè)傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101177708SQ20071017004公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者吉井裕人,栗林英人,福井壽文申請(qǐng)人:佳能株式會(huì)社