本發(fā)明，在其一些實施例中，涉及一種減少干細胞的方法，所述干細胞包含造血的干細胞以及癌癥干細胞。Wnt途徑在整個進化過程中是高度被保持的，從蠕蟲到人類，在胚胎發(fā)育和疾病中均扮演了關鍵角色。Wnt信號是由一組激酶及磷酸酶進行嚴格調節(jié)，作用于級聯(lián)的不同組件且在一有機體生命期中引領各種細胞的命運。正規(guī)的Wnt途徑的主要目標是細胞質β-連環(huán)蛋白，其作為基因增殖、分化、遷移以及生存的一轉錄共活化劑。所述信號轉導取決于所述Wnt配體的存在或缺乏。在靜息組織中，在Wnt配體的缺乏中，β-連環(huán)蛋白經(jīng)常通過一多蛋白絡合物被磷酸化以及降級，且因此在細胞中被維持在低階。在分裂細胞中，在成人自我更新組織及胚胎各處中，隱藏的Wnt蛋白質結合于卷曲受體家族的成員以及細胞膜上的協(xié)同受體LRP5/6。Wnt鍵結激活了蓬亂蛋白(Dishevelled，Dv1)，導致β-連環(huán)蛋白降解絡合物的分解以及在所述細胞質中的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定。這可使β-連環(huán)蛋白易位進入細胞核，且通過Tcf/Lef依賴的轉錄激活它的目標基因(如c-Myc、cyclinD1)。所述正規(guī)的Wnt信號的失調導致各種癌癥，其中包括大腸癌(CRC)、肝細胞癌(HCC)以及黑色素瘤。在這些癌癥中，一或多個Wnt組成構件時常突變，造成核的β-連環(huán)蛋白的異常積累。此解釋了在細胞中嚴格調節(jié)β-連環(huán)蛋白水平的需求。β-連環(huán)蛋白被磷酸化及降級的機制就在最近已經(jīng)被展示出來，其強調了在所述Wnt信號途徑中明顯的角色扮演者。所述β-連環(huán)蛋白降解絡合物包含腺瘤性結腸息肉病(APC)腫瘤抑制因子、Axin1或Axin2(被認為扮演一支架功能)以及包含兩個絲氨酸/蘇氨酸(Serine/Threonine)激酶：酪蛋白激酶I(CKI)以及糖原合成酶激酶-3(Glycogensynthasekinase-3，GSK3)，其在四個N端的Ser/Thr殘片上將β-連環(huán)蛋白磷酸化。此結果標識了β-連環(huán)蛋白通過SCFβ-TrCPE3泛素連接酶的泛素化，以及隨后的蛋白酶體降解。最近已經(jīng)展示了第一個磷酸化事件是由CKI介導，其磷酸化β-連環(huán)蛋白的Ser45。此創(chuàng)造了一個給GSK3的引發(fā)位址，隨后磷酸化Thr41、Ser37以及Ser33。最后的兩個殘片，當進行磷酸化時，作為給E3連接酶βTrCP的一個?？课恢罚錁俗Rβ-連環(huán)蛋白以進行降解。CKI的參與被證實驅動級聯(lián)造成β-連環(huán)蛋白負調節(jié)所必須且為充足的。此與果蠅Wnt信號組件的同源物的研究一致，且因此指派CKI作為一Wnt信號拮抗劑。換言之，在涉及CKI作為一Wnt信號效應因子的非洲爪蟾和線蟲發(fā)育研究中顯示了，CKI提升了二級體軸和胚胎極性(Wnt效應)。支持它的是觀察CKI磷酸化及激活Dvl，另一個Wnt效應因子，從而增加β-連環(huán)蛋白的水平。美國專利申請案第20050171005號教導調變β-連環(huán)蛋白磷酸化的方法。美國專利申請案第20090005335號教導了通過提供正調節(jié)B-連環(huán)蛋白的組合物治療具有APC基因突變的癌癥細胞。美國專利申請案第20110076683號教導了Wnt抑制劑用于治療白血病。其余先前技術包括美國專利申請案第20080146555號、國際專利申請案WO2014023271以及美國專利申請案第20100179154號。技術實現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種治療有需求的受試者的癌癥的方法，其包含對所述受試者施用一治療有效量的一酪蛋白激酶Iα(CKIα)抑制劑，其中所述癌癥與一腺瘤性結腸息肉病(APC)突變非相關聯(lián)，從而治療所述癌癥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種使用酪蛋白激酶Iα(CKIα)抑制劑以治療癌癥的用途，其中所述癌癥與一腺瘤性結腸息肉病(APC)突變非相關聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種治療有需求的受試者的癌癥的方法，其包含對所述受試者施用一治療有效量的PF670462，其中所述癌癥不是慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，從而治療所述癌癥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種使用PF670462以治療癌癥的用途，其中所述癌癥不是CLL。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種治療有需求的受試者的慢性骨髓性白血病(CML)的方法，其包含對所述受試者施用一治療有效量的一酪蛋白激酶I抑制劑，其中所述CML選自于由伊馬替尼抗性的CML、伊馬替尼相關的TKI抗性的CML、伊馬替尼不耐的CML、增生的CML以及淋巴急變期CML所組成的一族群，從而治療所述CML。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種使用酪蛋白激酶I抑制劑以治療CML的用途，其中所述CML選自于由伊馬替尼抗性的CML、伊馬替尼相關的TKI抗性的CML、伊馬替尼不耐的CML、增生的CML以及淋巴急變期CML所組成的一族群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種將細胞移植至有需求的受試者體內(nèi)的方法，所述方法包含步驟：(a)通過使取自一受試者的一血液或骨髓的多個不成熟血細胞與一數(shù)量的CKI抑制劑接觸，以消耗取自所述受試者的血液或骨髓的所述不成熟血細胞，其中所述CKI抑制劑用以正調節(jié)p35的一數(shù)量及/或活性，且殺死所述血液或骨髓中的所述不成熟血細胞；以及隨后：(b)移植多個細胞至所述受試者體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種消耗取自一受試者的一血液或骨髓的不成熟血細胞的方法，包含：在體外使多個干細胞與一數(shù)量的CKI抑制劑接觸，其中所述CKI抑制劑用以正調節(jié)P35的一數(shù)量及/或活性，且殺死所述血液或骨髓中的所述不成熟血細胞，從而消耗取自所述血液或骨髓的所述不成熟血細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種鑒定及可選擇性制造有利于消耗干細胞的試劑的方法，所述方法包含：(a)決定在一候選試劑存在下的CKI的一活性及/或表達；以及(b)選擇用以負調節(jié)所述CKI的一活性及/或表達以及正調節(jié)p53的一活性及/或表達的所述試劑，從而鑒定有利于消減干細胞的一試劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例的一觀點，其提供一種物質的組合物，所述物質的組合物包含：一小分子，所述小分子對于CKIα的抑制活性大于對于CKIδ(CKIdelta)及/或CKIε(CKIepsilon)的抑制活性至少兩倍。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述方法另包含誘導所述不成熟血細胞從所述骨髓移動到所述血液。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CKIα抑制劑在正調節(jié)p53上至少和CKIδ及CKIε的抑制劑一樣有效。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑鍵結到CKIα或一編碼相同的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑鍵結到CKI或一編碼相同的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑激活一DNA損壞反應(DNAdamageresponse，DDR)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CKI抑制劑包含一CKIα抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CKI抑制劑另包含一CKIδ及/或CKI-ε(CKI-epsilon)抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CKI抑制劑包含一CKIδ及CKI-ε抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑是一小分子抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑是PF670462。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述抑制劑是一RNA靜默劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述靜默劑是靶向至CKIα。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述不成熟血細胞包含多個干細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述不成熟血細胞包含多個癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述接觸是在體內(nèi)實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述接觸是在體外實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述接觸是在分離性輸血期間實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述消耗是在無放射線或化療下實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述消耗是結合放射線及/或化療實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述癌癥是一惡性血液病。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述惡性血液病選自于由慢性骨髓性白血病(CML)、CML增生期或母細胞危象期、多發(fā)性骨髓瘤、增多綜合征(HES)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、急性前髓細胞白血病(APL)、慢性中性粒細胞白血病(CNL)、急性未分化型白血病(AUL)、間變大細胞淋巴瘤(ALCL)、前淋巴細胞白血病(PML)、少年粒單細胞白血病(JMML)、成人T細胞ALL、AML伴隨三系骨髓增生異常(AML/TMDS)、混合系白血病(MLL)、骨髓增殖性紊亂(MPD)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)以及髓細胞肉瘤所組成的一族群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述惡性血液病是慢性骨髓性白血病(CML)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CML是選自于由伊馬替尼抗性的CML、伊馬替尼不耐的CML、伊馬替尼相關的TKI抗性的CML、增生的CML以及髓細胞或淋巴急變期CML所組成的一族群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，對所述受試者施用伊馬替尼。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述受試者不施予一種試劑，其選自于由伊馬替尼、達沙替尼以及尼羅替尼所組成的一族群。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述癌癥是乳癌或黑色素瘤。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述CKIα抑制劑對于CKIα的抑制活性至少兩倍于CKIδ或CKIε。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述干細胞包含造血的干細胞(HSCs)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述干細胞包含癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述方法另包含：測試所述候選試劑作為癌癥的一治療的效果，或者作為細胞移植前的一預治療的效果。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述方法另包含：合成所述候選試劑。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和/或科學術語具有與普通技術人員對本發(fā)明有關的
技術領域：
：中所通常理解的相同含義。雖然類似或等同于本文描述的那些方法與材料可以用在本發(fā)明實施例的實踐或測試中，示例性方法和/或材料仍進行說明如下。在沖突的情況下，專利說明書，包括定義，將控制。此外，材料、方法和舉例僅是說明性的，非意指其必要限制。附圖說明在此描述本發(fā)明的一些實施例，僅通過舉例的方式，參照隨附的圖式以及圖像?，F(xiàn)以具體參照附圖詳細說明，強調所示細節(jié)是通過舉例的方式以及為了發(fā)明實施例的說明性討論的目的。在這點上，結合附圖所做的描述會使得本領域的技術人員明顯可知本發(fā)明的實施例可以如何實施。在附圖中：圖1A至1F說明CKIα消融消耗了小鼠的造血干細胞(HSC)且允許骨髓植入。A)產(chǎn)生一嵌合體小鼠的方案。B)誘導后第7天取自兩個股骨和兩個脛骨的LT-HSC(Lineage-c-kit+Sca1+CD34-FLT3-)、ST-HSC(Lineage-c-kit+Sca1+CD34+FLT3-)、MPP(Lineage-c-kit+Sca1+CD34+FLT3+)的絕對計數(shù)值。C)植入CKIαKO骨髓的致死IR小鼠或控制小鼠的存活曲線。D)CKIα重建實驗的方案。E)CKIαKO誘導小鼠重建或不治療的小鼠的存活曲線。F)取自重建三個月后的WT或CKIαKO誘導小鼠的GFP+外周血白細胞的百分比。圖2是產(chǎn)生老鼠模式的CML母細胞危象期的一方案。圖3A至3D說明CKIα消融如何預防CML發(fā)育。A)實驗方案。B)監(jiān)控白血病起始細胞(LICs)移植后兩個月中的GFP+外周血白細胞的百分比；不帶CKIα缺失的小鼠(PBS-已治療或不帶MXCre的LICs在三周間垂死及犧牲)C)取自白血病小鼠的血涂片的照片，其中CKIα缺失已被誘發(fā)(pIpC-已治療)或未誘發(fā)(PBS已治療)。D)CKIα缺失被以pIpC誘發(fā)或不被誘發(fā)(PBS已治療)的白血病小鼠的存活，或者不具有MXCre于缺失。圖4A至4C說明CKIα消融如何消耗正常與白血病干細胞此兩者，且允許正常骨髓重建。A)實驗方案。B)受白血病折磨的BM移植12天之后CD45.1(捐贈細胞)以及GFP+白血病細胞在外周血白細胞中的百分比，顯示了CKIα缺失之后僅有正常捐贈的BM重建(紅色長條)以及無CKIα缺失的高百分比的白血病GFP-陽性細胞(PBS治療，黑色長條)。C)CKIα缺失之后(pIpC治療)白血病小鼠的全體存活，是因為成功的捐贈者骨髓重建。圖5A至5D說明所述CKI抑制劑PF670462優(yōu)選靶向所述體外白血病細胞。A)實驗方案。B)RT-PCR結果說明抑制劑治療中，劑量依賴性的增加于p53以及Wnt目標的表達。C)PF670462治療之后，白血病細胞數(shù)量選擇性地減少–劑量反應曲線具有LD50<2μM。D)PF670462治療之后，白血病細胞中的凋亡基因表達增加。圖6A至6F說明PF670462激活了BM中的Wnt以及p53，消除移植的白血病起始細胞，并預防體內(nèi)CML發(fā)育。A)實驗治療方案。B)Western印跡分析(Westernblotanalysis)說明基于PF670462治療，β-連環(huán)蛋白和p53穩(wěn)定化，以及c-Myc(一Wnt目標基因的一個例子)的提高。C)PF670462治療后GFP+外周血白細胞的百分比顯示賦形劑處理的(vehicle-treated)小鼠在外周血中的GFP+白血病細胞的迅速擴散，以及抑制劑處理的小鼠的無擴散。D)骨髓脊椎動物部份的H&E染色顯示賦形劑處理的小鼠的胚細胞侵襲以及脊椎動物的完全毀滅，以及抑制劑處理的小鼠顯示一正常的脊椎動物。垂死的賦形劑處理的小鼠均在白血病移植12天后犧牲。健康的抑制劑處理的小鼠在三周后犧牲且他們的骨髓被移植到放射小鼠以監(jiān)控正常的長期造血和無白血病復發(fā)。E)殞滅兩天前于賦形劑處理的小鼠中的不成熟髓細胞和胚細胞，以及同時間于抑制劑處理的小鼠中的正常外周血象。F)PF670462治療后白血病小鼠存活。圖7A至7B是說明一黑色素瘤老鼠模式中CKIα缺失的影響的照片。圖7A是描繪他莫昔芬(tamoxifen)施用于局部耳朵之前及給藥56天之后，一BrafV600E；Pten雙重基因敲除的floxed老鼠臉部的耳朵及組織的照片。圖7B是描繪他莫昔芬(tamoxifen)誘導局部耳朵之前(左側)及給藥56天之后(右側)，一BrafV600E；Pten；CKIα三重基因敲除的floxed老鼠臉部的耳朵及組織的照片。他莫昔芬誘導之后無腫瘤可見于B，僅有耳朵色素沉著，證明了CKIα缺失的一個強烈的腫瘤抑制效果，而沒有腫瘤突變逃逸具體實施方式本發(fā)明，在其一些實施例中，關于消減干細胞的方法，所述干細胞包括造血的干細胞及癌癥干細胞。根據(jù)本發(fā)明的消減干細胞的方法的原理及操作可以參照附圖及說明更好地被了解。詳細解釋本發(fā)明至少一實施例之前，必須了解到在此申請中的發(fā)明不必須受限制于下面的詳細說明或例示。本發(fā)明可以用于其它實施例或可以不同方式實施或執(zhí)行。所述β-連環(huán)蛋白降解絡合物由腺瘤性結腸息肉病(APC)腫瘤抑制因子；Axin1或Axin2(被認為扮演一支架功能)；以及由兩個絲氨酸/蘇氨酸(Serine/Threonine)激酶：酪蛋白激酶I(CKI)以及糖原合成酶激酶-3(Glycogensynthasekinase-3，GSK3)所組成，其在四個N端的Ser/Thr殘片上將β-連環(huán)蛋白磷酸化。CKIα和APC均被注意到于Wnt信號傳導及有絲分裂紡錘體的調控中扮演了重要角色。為了分析骨髓干細胞，如造血干細胞(HSCs)，CKI所扮演的角色，發(fā)明人制得有條件的骨髓CKIα敲出突變小鼠。如圖1A至1F所示，骨髓CKIα消融消耗小鼠的造血干細胞(HSC)且允許骨髓植入(圖1A至1F)不使用其它共同使用于移植的預處理(如放射線或化療)。利用CML母細胞危象期的老鼠模式，發(fā)明人繼續(xù)展示CKIα消融預防慢性骨髓性白血病(CML)的發(fā)育(圖3A至3D)。由于CML一般而言，加上特別是母細胞危象階段，已知與癌癥干細胞有關聯(lián)，發(fā)明人推測CKIα抑制劑可不僅是被用于消耗造血干細胞(HSC)，也會消耗其它干細胞如癌癥干細胞。為評估CKIα缺失是否可取代化療或放射線誘導的髓細胞消融以及白血病細胞凈空，白血病細胞被注入CKIα基因敲除的floxedMx-Cre小鼠。當敲除不被誘導，一個非常高百分比的白血病細胞會出現(xiàn)，而在CKIαKO，則檢測不到所述白血病細胞(圖4B)，反映如存活率數(shù)據(jù)所示(圖4C)。發(fā)明人尋求使用抑制CKI的一小分子試劑以確認他們的結果。由于CKIα的負調節(jié)已知是增加p53的表達，本發(fā)明人尋找CKI抑制劑，其對于p53具有相似效果。在圖5B和6B中可見，所述CKI抑制劑PF670462大幅增加了p53的表達且它的目標于骨髓細胞中。在一體外研究中，本發(fā)明人展示了PF670462優(yōu)先耗盡白血病細胞。此抑制劑的深遠影響反映于一體內(nèi)研究中。這樣，顯示了PF670462消減移植的白血病起始細胞，且預防體內(nèi)的CML發(fā)育(圖6C至6F)。于抑制劑處理的小鼠的所述骨髓移植到致死放射處理的小鼠(移植一個月后)明顯無白血病細胞，表明了所述抑制劑處理根除了所述白血病干細胞，但保留了正常的造血干細胞。同時進一步減少了本發(fā)明實施，本發(fā)明人分析CKIα消耗于其他癌癥的影響，且發(fā)現(xiàn)了CKIα敲出在黑色素瘤的老鼠模式中具有一治療效果。由于黑色素瘤是從神經(jīng)外胚層胚層細胞衍生，以及白血病細胞是從中胚層胚層細胞衍生，本發(fā)明人推斷CKI的負調節(jié)對于無數(shù)的癌癥可以是有效的，不分衍生腫瘤細胞的胚層。再者，由于CKI抑制已經(jīng)顯示選擇性地靶向癌癥干細胞，本發(fā)明人作出可抑制CKI的試劑一般而言應該會對癌癥干細胞有效的結論，不分包含癌癥干細胞的特殊癌癥。如此，根據(jù)本發(fā)明的一第一觀點是提供一種治療有需求的受試者的癌癥的方法，包含對一受試者施用一治療有效量的一酪蛋白激酶Iα(CKIα)抑制劑，其中所述癌癥與一腺瘤性結腸息肉病(APC)突變非相關聯(lián)，從而治療所述癌癥。此處使用的術語“癌癥”參照到增生疾病，包括但不限于是癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤以及白血病。所述癌癥可例如是一實體腫瘤良性腦膜瘤(solidtumorsBenignMeningioma)、唾液腺混合瘤(Mixedtumorsofsalivarygland)、結腸腺瘤(Colonicadenomas)；腺癌(Adenocarcinomas)，如小細胞肺癌、腎、子宮、前列腺、膀胱、卵巢、結腸、肉瘤、脂肪肉瘤、粘液樣、關節(jié)滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤(肺泡)、骨骼外粘液樣軟骨肉瘤、尤文瘤(Ewing'stumor)；其它包括睪丸及卵巢無性細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、腎母細胞瘤(Wilms'tumor)、神經(jīng)母細胞瘤、惡性黑色素瘤、間皮瘤、乳腺、皮膚、前列腺及卵巢。根據(jù)一特別的實施例，所述癌癥是一黑色素瘤、一乳癌或一惡性血液病。此處的術語“惡性血液病”包括一淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或一惡性淋巴瘤，以及一脾臟及淋巴結的癌癥。適合以本發(fā)明所揭露的抗CXCR4抗體治療而作為范例的淋巴瘤包括B細胞淋巴瘤及T細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)以及大多數(shù)非霍奇金淋巴瘤。B細胞淋巴瘤的非限制性的例子包括彌漫型大B細胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(follicularlymphoma，F(xiàn)L)、粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)、小細胞淋巴細胞淋巴瘤(與慢性淋巴細胞性白血病重疊)、外套膜細胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、縱隔大B細胞淋巴瘤、華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrommacroglobulinemia)、結邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤(NMZL)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤(SMZL)、血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤、原發(fā)滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫。T細胞淋巴瘤的非限制性的例子包括結外T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、間變大細胞淋巴瘤以及血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤。惡性血液病也包括白血病，例如但不限于是，二級白血病、急性骨髓性白血病(AML；也稱為急性淋巴白血病))、慢性骨髓性白血病(CML)、B細胞前淋巴細胞白血病(B-PLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)以及骨髓增生異常(MDS)。惡性血液病另包含骨髓瘤，例如但不限于是，多發(fā)性骨髓瘤(MM)、郁積多發(fā)性骨髓瘤(SMM)以及B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。根據(jù)一特殊實施例，所述惡性血液病是慢性骨髓性白血病(CML)術語CML包括伊馬替尼抗性的CML、第二/第三代Bcr-AblTKI(例如達沙替尼(dasatinib)和尼羅替尼(nilotinib))可耐的CML、伊馬替尼不耐的CML、增生的CML以及淋巴急變期CML。其它血液學及/或B細胞或T細胞關聯(lián)的癌癥以術語惡性血液病來涵蓋。例如，惡性血液病也包括其他造血細胞的癌癥，包含樹突狀細胞、血小板、紅血球、自然殺手細胞以及多形核白細胞，如嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞以及單核細胞。本領域的技術人員應該清楚這些前期惡性腫瘤以及惡性腫瘤經(jīng)常由于分類系統(tǒng)的變化而具有不同的名稱，而且具有被分類在不同名稱的淋巴瘤的病患也可以從本發(fā)明的治療方案獲益。如上所述，對于本發(fā)明的此觀點來說，所述癌癥不包括與一腺瘤性結腸息肉病(APC)突變關聯(lián)的癌癥。APC突變的例子可例如是造成所述APC產(chǎn)物截斷的那些。典型突變發(fā)生于編碼序列的上半部，以及在結直腸腫瘤的體細胞突變是進一步集群于一特殊區(qū)域，稱為MCR(mutationclusterregion)。參與人類疾病的APC突變的一份清單提供于OMIM，worldwidewebdotncbidotnlmdotnihdotgov/omim。與APC突變關聯(lián)的癌癥的例子包括結直腸癌癥、神經(jīng)管細胞瘤以及肝細胞癌。根據(jù)本發(fā)明的另一觀點提供一種治療有需求的受試者的CML的方法，包含對所述受試者施用一治療有效量的酪蛋白激酶I抑制劑，其中所述CML選自于由伊馬替尼抗性的CML、伊馬替尼(或伊馬替尼相關的TKI)不耐的CML、增生的CML以及淋巴急變期CML所組成的一族群。根據(jù)本發(fā)明的再另一觀點提供一種治療有需求的受試者的癌癥的方法，包含對所述受試者施用一治療有效量的PF670462，其中所述癌癥不是CLL。所有癌癥都在本發(fā)明的此觀點中被考量(CLL除外)。根據(jù)本發(fā)明此觀點的一實施例，所述癌癥也包括那些與APC突變關聯(lián)的癌癥。根據(jù)另一實施例，所述癌癥不包括與APC突變關聯(lián)的癌癥。本發(fā)明的所述治療的方法通過接觸/施予可抑制CKI的一試劑來實現(xiàn)。CKI是在每個受測有機體中發(fā)現(xiàn)的Ser/Thr激酶的一高度保持的家族，從酵母到人類。在哺乳動物中CKI家族由七個基因(α,β,γ1,γ2,γ3,δ,ε)編碼11個選擇性剪接異構體所組成。Membersofthe所述CKI家族的成員共享一保存催化區(qū)域以及ATP結合位點，其僅僅從其他激酶家族被區(qū)分出來。CKI是在所有細胞中可發(fā)現(xiàn)的一種普及的酵素，占據(jù)不同的亞細胞的本地化且除了Wnt信號傳遞之外，涉及各種細胞進程。優(yōu)選的，所述CKI抑制劑增加p53的表達及/或活性(至少2倍)及/或激活一DNA損壞反應(DDR)。本發(fā)明的CKI抑制劑，相比于其它激酶如周期蛋白依賴性激酶(CDK)用于調節(jié)細胞周期，(例如Cdk2、Cdk4、Cdk6)，優(yōu)選具有至少兩倍、至少5倍、至少10倍對CKI的抑制活性。此外，相比于蛋白激酶C(PKC)、PKA、her2、raf1、MEK1、MAP激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF受體、PI3激酶、wee1激酶、Src及/或Abl，CKI抑制劑具有至少兩倍、至少5倍、至少10倍對CKI的抑制活性。在一些實施例中，所述試劑為CKI-α抑制劑，即它們是選擇性的對于CKI-α(CSNK1A；在基因組，mRNA或蛋白質水平，GenBank登記號NP_001020276、NM_001025105及NM_001020276)。因此，舉例來說，此CKI抑制劑相比于CKI-δ(CKI-delta)及CKI-ε具有至少兩倍、至少5倍、至少10倍對于CKI-α的抑制活性。優(yōu)選地，對CKI-α有選擇性的所述試劑在正調節(jié)p53上至少和CKIδ及CKIε的抑制劑一樣有效(如PF670462)。優(yōu)選地，對CKI-α有選擇性的所述試劑在正調節(jié)p53上至少兩倍有效于CKIδ及CKIε的抑制劑(如PF670462)。在一些實施例中，所述試劑抑制CKI-δ(CSNK1A；在基因組，mRNA或蛋白質水平，GenBank登記號NP_001884.2、NP_620693.1、NM_001893.3及NM_139062.1)以及CKI-ε(CSNK1E；NP_001885.1、NP_689407.1、NM_001894.4及NM_152221.2)。在本發(fā)明觀點的一些實施例中，所述試劑較大程度的抑制CKI-δ以及CKI-ε相較于抑制CKI-α(例如與CKI-α比較，對CKI-δ及CKI-ε的抑制活性至少兩倍、至少5倍、至少10倍)。在本發(fā)明觀點的一些實施例中，所述CKI抑制劑較大程度的抑制CKIα、δ以及ε異構體相較于抑制CKI-β、γ1、γ2或γ3(例如，與CKI-β、γ1、γ2或γ3中的任一個比較，對CKI-δ及CKI-ε的抑制活性至少兩倍、至少5倍、至少10倍)。根據(jù)一實施例，本發(fā)明所述CKI抑制劑直接結合于所述CKI(例如CKI-α、CKI-δ及/或CKI-ε)或一編碼相同的基因。CKI-α、CKI-δ及/或CKI-ε的負調節(jié)可于所述基因組及/或所述轉錄水平上使用干擾轉錄及/或轉譯的各種分子(例如，反義、siRNA、核酶、微小RNA或脫氧核酶(DNAzyme))而被實現(xiàn)，或于蛋白質水平上使用如拮抗劑、切割多肽的酶等類似物。本發(fā)明的一實施例中，可以負調節(jié)所述CKI的一種試劑是一抗體或可特定鍵結所述特定CKI的抗體片段。優(yōu)選地，所述抗體特定鍵結CKI-α、CKI-δ或CKI-ε的至少一表位(epitope)。此處所使用的術語“表位”參照至一抗原上的任何抗原定子其鍵結至一抗體的互補位。表位定子通常由分子的化學活性表面基團所組成，如氨基酸或碳水化合物側鏈，且通常具有特定三維結構特性，以及特定電荷特性。人源化非人類抗體的方法是本領域公知的技術。一般而言，一人源化的抗體具有自一非人類來源導入的一或多個氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基經(jīng)常被認為是輸入殘基，其通常取自一輸入可變結構域。人源化可以Winter等人的方法實質上被執(zhí)行(見Jones等人(1986)；Riechmann等人(1988)；以及Verhoeyen,M.等人(1988)，Reshapinghumanantibodies:graftinganantilysozymeactivity.Science239,1534-1536)，通過以嚙齒動物CDRs或CDR取代一人類抗體的對應序列。據(jù)此，此人源化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中基本上小于一完整人類可變結構域已經(jīng)被一取自非人類物種的對應序列所取代。實際上，人源化抗體是一般人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基由取自嚙齒動物抗體中的類比位點的殘基所取代。人類抗體也可以使用本
技術領域：
：已知的多種技術制得，包括噬菌體展示文庫(phagedisplaylibraries)中(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.(1991).By-passingimmunization.HumanantibodiesfromsyntheticrepertoiresofgermlineVHgenesegmentsrearrangedinvitro.JMolBiol227,381-388)。Cole等人及Boerner等人的技術也可使用于人類單克隆抗體的制備(Coleetal.(1985),MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96；andBoerner,P.etal.(1991).Productionofantigen-specifichumanmonoclonalantibodiesfrominvitro-primedhumansplenocytes.JImmunol147,86-95)。相似的，人類抗體可通過引導人類免疫球蛋白基因位點進入轉基因動物，如小鼠，制得，其中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)部份或完全被去活化。在此挑戰(zhàn)中，人類抗體的制造被觀察到是相當類似于在人類在各方面中所見的，包括基因重排、組裝以及抗體譜。此途徑被描述于，例如，美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號以及第5,661,016號；以及在下列科學公開刊物：Marks,J.D.etal.(1992).By-passingimmunization:buildinghighaffinityhumanantibodiesbychainshuffling.Biotechnology(N.Y.)10(7),779-783；Lonbergetal.,1994.Nature368:856-859；Morrison,S.L.(1994).NewsandView:SuccessinSpecification.Nature368,812-813；Fishwild,D.M.etal.(1996).High-avidityhumanIgGkappamonoclonalantibodiesfromanovelstrainofminilocustransgenicmice.NatBiotechnol14,845-851；Neuberger,M.(1996).Generatinghigh-avidityhumanMabsinmice.NatBiotechnol14,826；以及Lonberg,N.與Huszar,D.(1995).Humanantibodiesfromtransgenicmice.IntRevImmunol13,65-93。本發(fā)明可負調節(jié)所述CKI類的一試劑的另一例子是一RNA靜默劑。此處所使用的術語“RNA靜默”參照調節(jié)機制的一族群(例如RNA干擾(RNAi)、轉錄基因靜默(TGS)、轉錄后基因靜默(PTHS)、平息、共抑制以及轉譯阻抑)由RNA分子介導而導致一對應蛋白質編碼基因的表達的抑制或“靜默”。RNA靜默已在許多類型的生物體中被被觀察到，包括植物、動物以及菌類。此處所使用的術語“RNA靜默劑”參照到可抑制或使一標的基因表達靜默的一RNA。在某些實施例中，所述RNA靜默劑可以預防一mRNA分子的完全處理(例如完全轉譯及/或表達)通過一轉錄后靜默機制。RNA靜默劑包括非編碼的RNA分子，例如RNA雙鏈包含成對股，以及可產(chǎn)生此一小的非編碼的RNA的前驅RNA。RNA靜默劑的例子包括dsRNAs如siRNAs、miRNAs及shRNAs。在一實施例中，所述RNA靜默劑可導入RNA干擾。在另一實施例中，所述RNA靜默劑可介導轉譯的阻抑。RNA干擾參照由短干擾RNA(siRNA)介導的動物的序列特定轉錄后基因靜默的進程。植物的相應進程共同參照為轉錄后基因靜默或RNA靜默，且亦參照為菌類的平息。轉錄后基因靜默的進程被認為是一進化保守的細胞防御機制，其用于預防外來基因的表達，且被多樣的植物群和動物門所共同分享。此保護外來基因表達可能已經(jīng)進化以響應雙股RNA(dsRNAs)的制造，所述雙股RNA衍生自病毒感染，或衍生自轉座子元件通過一細胞響應隨機整合到一主基因組，所述細胞響應特定摧毀同源單股RNA或病毒基因組RNA。長dsRNA在細胞中的存在刺激了被稱為切丁酶(dicer)的一核糖核酸酶III酵素(ribonucleaseIIIenzyme)的活性。切片酶涉及所述dsRNA加工成已知為短干擾RNA(siRNAs)的短片。衍生自切片酶活性的短干擾RNA一般約21至23個核苷酸長度，且包含約19個堿基配對雙鏈。所述RNAi響應也顯示一核酸內(nèi)切酶絡合物，常被稱為一RNA-誘導靜默絡合物(RISC)，其介導單股RNA切割，所述單股RNA具有具有序列互補于所述siRNA鏈的反義股。所述標的RNA的切割發(fā)生在與siRNA鏈的反義股互補的區(qū)域中間。據(jù)此，本發(fā)明考慮以dsRNA負調節(jié)來自mRNA的蛋白質表達的用途。根據(jù)一實施例，所述dsRNA大于30堿基對(bp)。長dsRNAs的用途(即dsRNA大于30bp)已經(jīng)非常有限，由于雙股RNA的這些較長區(qū)段被認為將導致干擾素及PKR反應的誘導。然而，長dsRNAs的使用可提供眾多優(yōu)點，其中細胞可選擇最佳靜默序列以緩和測試大量siRNAs的需要；長dsRNAs將允許靜默資料庫(silencinglibraries)具有較少復雜性，相較于siRNA所必需的復雜性；也許最重要的是，當作為療法使用時，長雙鏈RNA可以避免病毒逃逸突變(viralescapemutations)。各種研究表明，使用長dsRNA可以靜默基因表達而不誘導壓力反應或不引起顯著的非目標效應(off-targeteffects)，見如[Stratetal.,NucleicAcidsResearch,2006,Vol.34,No.133803–3810；BhargavaAetal.BrainRes.Protoc.2004；13:115–125；DialloM.,etal.,Oligonucleotides.2003；13:381–392；PaddisonP.J.,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA.2002；99:1443–1448；TranN.,etal.,FEBSLett.2004；573:127–134]。具體而言，本發(fā)明也設想將長dsRNA(超過30個堿基的轉錄片段(transcripts))引入于細胞中以用于使基因靜默，所述細胞中干擾素途徑未被激活(例如在胚胎細胞和卵母細胞)，例如參見Billy等人所公開的美國國家科學院院刊(PNAS98：14428-14433(2001))；和Diallo等人所公開的寡核苷酸(Oligonucleotides13：381-392(2003).doi:10.1089/154545703322617069)。本發(fā)明亦設想引入長dsRNA，其設計為不會誘導干擾素和PKR路徑，以負調控基因表達。例如，Shinagwa及Ishii(Genes&Dev.17(11):1340-1345,2003)已經(jīng)開發(fā)出一種載體(vector)，命名為pDECAP，以RNA聚合酶II(RNApolymeraseII，PolII)啟動子表達長的雙股RNA。因為源自于pDECAP的轉錄片段(transcripts)缺少5’-帽(5’-cap)結構及3’-聚(A)尾部(3’-poly(A)tail)，以便dsRNA輸出到細胞質中，而源自于pDECAP的長雙鏈RNA并會不誘導干擾素反應。在哺乳動物系統(tǒng)中回避干擾素和PKR通路的另一種方法是通過引入小抑制RNA(smallinhibitoryRNAs，siRNA)或者通過轉染(transfection)或內(nèi)源表達(endogenousexpression)。術語“siRNA”是指小抑制性RNA雙鏈體(smallinhibitoryRNAduplexes，通常為18-30個堿基對)，誘導RNA干擾(RNAi)途徑。通常情況下，siRNA是化學合成為21聚體(21mers)以及中央19堿基對的雙鏈區(qū)域和在末端(termini)對稱的2堿基的3’突出端(overhang)，然而最近已描述25-30堿基長度的化學合成RNA雙鏈體可具有高達增加100倍的效力，當與21單位(21mers)在相同位置相比。使用更長的RNA觸發(fā)RNAi，以獲得觀察到的增加效力，理論上是因為提供切丁酶(dicer)基質(substrate)(27聚體)而非產(chǎn)物(21聚體)，這樣提高siRNA雙鏈進入RISC的速度或效率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3’突出端(overhang)的位置影響siRNA的效力，幷且具有3’突出端(overhang)于反義股的不對稱的雙鏈通常比突出端(overhang)于有義股的更有效力(Rose等人，2005年)。這可以歸因于裝載到RISC的不對稱股，當以反義轉錄片段(transcript)作為目標時，觀察到相反的效力形式。可以理解的是，siRNA可通過選擇兩者蛋白質所共有的序列被設計成抑制一個以上的CKI(例如可同時抑制CKI-δ和CKI-ε)。一個例示性的可負調節(jié)CKI-α的siRNA如SEQIDNO:1及2。一個例示性的可負調節(jié)CKI-δ的siRNA如SEQIDNO:6(5’-GAAACAUGGUGUCCGGUUUTT-3)。一個例示性的可負調節(jié)CKI-ε的siRNA如SEQIDNO:5。一個例示性的可同時負調節(jié)CKI-δ和CKI-ε的siRNA如SEQIDNO:3和4。用于本發(fā)明所述CKI的RNA靜默劑也可由商業(yè)上取得，例如從AppliedBiosystems公司。雙股干擾RNA(例如，siRNA)的雙股可以被連接以形成發(fā)夾(hairpin)或莖環(huán)結構(stem-loepstructure，例如shRNA)。因此，如上所述，本發(fā)明的所述RNA靜默劑也可以是一短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA，shRNA)。此處所使用的術語“shRNA的”，是指具有莖-環(huán)結構(stem-loopstructure)的一RNA，包括互補序列的第一和第二區(qū)域，這些區(qū)域的互補性(complementarity)和取向(orientation)的程度的足以使得在發(fā)生區(qū)域之間產(chǎn)生堿基配對，第一和第二區(qū)域通過環(huán)狀區(qū)域連接，所述環(huán)體(loop)是由于所述環(huán)狀區(qū)域中核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對所導致。在環(huán)體的核苷酸數(shù)目是包括3到23，或5至15或7至13，或4至9，或9至11之間的一數(shù)字。在環(huán)體中一些核苷酸可與環(huán)體中的其他核苷酸的堿基對相互作用有關。可用于形成環(huán)體的寡核苷酸序列的實例包括5’-UUCAAGAGA-3’[Brummelkamp,T.R.etal.(2002)Science296:550]和5’-UUUGUGUAG-3’[Castanotto,D.etal.(2002)RNA8:1454]。所得到的單鏈寡核苷酸形成莖環(huán)或發(fā)夾結構，其包含能夠與RNAi機制相互作用的雙鏈區(qū)域，這可被本領域中的技術人員識別。根據(jù)另一實施例，所述RNA靜默劑可以是一微小RNA(miRNAs)。miRNAs是小的RNA，其由不同尺寸的基因編碼初級轉錄片段(primarytranscripts)所形成。他們在動物及植物兩者之中已經(jīng)被定義出來。所述初級轉錄片段(稱為"pri-miRNA")是經(jīng)過不同核酸切割步驟處理成一較短的miRNA前驅物或"pre-miRNA"。所述pre-miRNA以一折疊形式存在，因此最終(成熟)miRNA是以雙鏈形式存在，其兩股被稱為所述miRNA(所述股，將最終會與標的物形成堿基對)。所述pre-miRNA是切丁酶形態(tài)的一種底材，其自所述前驅物移除了所述miRNA的雙鏈形式，然后，相似于siRNAs，所述雙鏈可被放進所述RISC絡合物。已經(jīng)證實的是，miRNAs可以被轉基因表達，且通過一前驅物的表達是有效的，而非通過整個初級形式(Parizottoetal.(2004)Genes&Development18:2237-2242andGuoetal.(2005)PlantCell17:1376-1386)。不同的是，siRNAs、miRNAs鍵結到轉錄片段序列僅具有部份互補性(Zengetal.,2002,Molec.Cell9:1327-1333)，且抑制了不影響穩(wěn)態(tài)RNA水平的轉譯(Leeetal.,1993,Cell75:843-854；Wightmanetal.,1993,Cell75:855-862)。miRNAs和siRNAs兩者都由切丁酶處理，且與所述RNA誘導靜默絡合物的組成相關(Hutvagneretal.,2001,Science293:834-838；Grishoketal.,2001,Cell106:23-34；Kettingetal.,2001,GenesDev.15:2654-2659；Williamsetal.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6889-6894；Hammondetal.,2001,Science293:1146-1150；Mourlatosetal.,2002,GenesDev.16:720-728)。一個最近的報導(Hutvagneretal.,2002,Sciencexpress297:2056-2060)推測，經(jīng)所述miRNA途徑與所述siRNA途徑的基因調節(jié)是各自與標的轉錄片段的互補性的程度所決定。猜測siRNAs僅部份標識所述mRNA標的將作用于轉譯表達，類似于一miRNA，而不是觸發(fā)RNA降解。適用于本發(fā)明的RNA靜默劑的合成可如以下實施。首先，在AUG起始密碼子下游掃描CKImRNA序列的AA二核苷酸序列。每個AA的發(fā)生點以及與3’相鄰的19個核苷酸被記錄為潛在的siRNA目標位點。優(yōu)選地，siRNA目標位點選自于開放閱讀框(openreadingframe)，因為非轉譯區(qū)(untranslatedregions，UTRs)具有較豐富的調節(jié)蛋白結合位點(regulatoryproteinbindingsites)。UTR結合蛋白及/或轉譯起始絡合物可能干擾siRNA內(nèi)切酶絡合物(siRNAendonucleasecomplex)的結合[Tuschl所著，ChemBiochem.2：239-245(2001)]。但可以理解的是，引導至非翻譯區(qū)的siRNA也可能是有效的，這已由GAPDH所證明，其中引導至5’端非編碼區(qū)的siRNA調節(jié)降低約90％的細胞GAPDHmRNA，并完全消除蛋白質水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。第二，將有潛力的目標位點與適當?shù)幕蚪M資料庫(例如，人，小鼠，大鼠等)比較，使用任何序列比對軟件，例如可用從NCBI服務器的BLAST軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。過濾掉與其他編碼序列表現(xiàn)出顯著同源性的假定目標位點。合格的目標序列被選擇作為siRNA合成模板。優(yōu)選的是那些包括低G/C含量的序列，因為相對于G/C含量高于55％的序列，這些序列已經(jīng)被證明更有效地調節(jié)基因靜默。優(yōu)選地沿著目標基因的長度選擇幾個目標位點進行評估。為了達到所選擇的siRNA的更佳評估，優(yōu)選地一起使用陰性控制組。陰性控制組siRNA優(yōu)選地包括與所述siRNA相同的核苷酸組成，但在基因組中缺乏顯著同源性。因此，優(yōu)選使用一打散的(scrambled)siRNA核苷酸序列，其對其他任何基因不顯示任何顯著同源性。應該理解的是，本發(fā)明的RNA靜默劑不必限于那些只包含RNA的分子，還包括化學修飾的核苷酸和非核苷酸。在一些實施例中，此處提供的所述RNA靜默劑可以是功能上與細胞穿透肽(cell-penetratingpeptide)相關聯(lián)。此處所使用的“細胞穿透肽”是一種肽，其包括一短(約12-30個殘基(residue))氨基酸序列或功能性基序(functionalmotif)，其賦予與能量無關(即非胞吞(non-endocytotic))的轉運(transloation)特性，此特性與穿過細胞膜和/或核膜的膜可透絡合物(membrane-permeablecomplex)的轉輸(tranport)相關聯(lián)。本發(fā)明使用于所述膜可透絡合物(membrane-permeablecomplex)的所述細胞穿透肽(cell-penetratingpeptide)優(yōu)選地包含至少一非功能性的半胱氨酸殘基(cysteineresidue)，其可以是游離的或衍生化的(derivatized)，與雙股核糖核酸形成雙硫鏈接(disulfidelink)，所述雙股核糖核酸被修飾以用于這種鏈接。賦予這類特性的代表性氨基酸基序都列在美國專利第6,348,185號，其內(nèi)容明確地通過引用并入本文。本發(fā)明的所述細胞穿透肽優(yōu)選包括，但不限于，穿膜蛋白(penetratin)、運輸?shù)鞍?transportan)、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS以及MAP。本發(fā)明可負調節(jié)CKI的另一試劑是一脫氧核酶(DNAzyme)分子，其可以特定切割一mRNA轉錄片段或所述CKI-α、δ或ε的一DNA序列。脫氧核酶是單股多核苷酸(single-strandedpolynucleotides)，其可切割單股及雙股標的序列(Breaker,R.R.andJoyce,G.F.(1995).ADNAenzymewithMg2+-dependentRNAphosphoesteraseactivity.CurrBiol2,655-660；Santoro,S.W.andJoyce,G.F.(1997).AgeneralpurposeRNA-cleavingDNAenzyme.ProcNatlAcadSciUSA94,4262-4266)。所述脫氧核酶的一個普通模型("10-23"模型)已經(jīng)被提出。"10-23＂脫氧核酶具有15個脫氧核糖核苷酸組成的一催化結構域，兩側由兩個基底識別域(ubstrate-recognitiondomains)所取代，每個所述基底識別域各自具有7至9個脫氧核糖核苷酸。此類型的脫氧核酶可于嘌呤：嘧啶接點(purine:pyrimidinejunctions)處有效切割其基底RNA(SantoroandJoyce(1997))；為回顧脫氧核酶，見Khachigian,L.M.(2002)(DNAzymes:cuttingapathtoanewclassoftherapeutics.CurrOpinMolTher4,119-121)。建構與放大合成、制造脫氧核酶識別單股及雙股標的切割位點的例子被公開在Joyce等人的美國專利第6,326,174號。針對人類尿激酶受體(Urokinasereceptor)相似設計的脫氧核酶近來已經(jīng)被觀察到可抑制尿激酶受體的表達，且成功抑制結腸癌癥細胞在體內(nèi)的癌轉移(metastasis)(Itoh,T.etal.,Abstract409,AmericanSocietyofGeneTherapy5thAnnualMeeting(www.asgt.org),June5-9,2002,Boston,Mass.USA.)。在另一應用中，與bcr-ab1致癌基因(oncogene)互補的脫氧核酶在抑制白血病細胞中所述致癌基因的表達是成功的，且在自體骨髓移植中成功降低慢性骨髓性白血病(CML)及急性淋巴母細胞白血病(ALL)的復發(fā)率。本發(fā)明CKI的負調節(jié)也可以通過使用特定與一mRNA轉錄片段雜交的一反義多核苷酸被實現(xiàn)，所述mRNA轉錄片段編碼所述CKI。設計反義分子，其可用以有效率地負調節(jié)CKI，必須被實現(xiàn)，同時考慮對反義進程重要的兩方面。第一方面是，運送寡核苷酸到適當細胞的細胞質里面，同時第二方面是，設計一寡核苷酸，其以抑制轉譯的方式在細胞中特定鍵結指定的所述mRNA。先前技術教導了多種運輸策略，可被用于有效率地運輸寡核苷酸進入廣泛且多樣的細胞類型(見，例如：Luft,F.C.(1998).Makingsenseoutofantisenseoligodeoxynucleotidedelivery:gettingthereishalfthefun.JMolMed76(2),75-76(1998)；Kronenwettetal.(1998).Oligodeoxyribonucleotideuptakeinprimaryhumanhematopoieticcellsisenhancedbycationiclipidsanddependsonthehematopoieticcellsubset.Blood91,852-862；Rajur,S.B.etal.(1997).Covalentprotein-oligonucleotideconjugatesforefficientdeliveryofantisensemolecules.BioconjugChem8,935-940；Lavigneetal.BiochemBiophysResCommun237:566-71(1997)；andAoki,M.etal.(1997).InvivotransferefficiencyofantisenseoligonucleotidesintothemyocardiumusingHVJ-liposomemethod.BiochemBiophysResCommun231,540-545)。此外，也可以使用的是基于熱力循環(huán)來辨識那些對它們的目標mRNA具有最高預測鍵結親和力的序列的算法，所述熱力學循環(huán)與所述標的mRNA及所述寡核苷酸的結構改變的能量學有關(見如，Walton,S.P.etal.(1999).PredictionofantisenseoligonucleotidebindingaffinitytoastructuredRNAtarget.BiotechnolBioeng65,1-9)。此算法已經(jīng)成功用于細胞中實施一反義途徑。例如，由Walton等人發(fā)展的所述算法使科學家可以成功設計兔β球蛋白(rabbitbeta-globin，RBG)的反義寡核苷酸，以及老鼠腫瘤壞死因子α(mousetumornecrosisfactor-α，TNF-α)轉錄片段。相同的研究團隊在更近期報導了合理選擇的寡核苷酸的所述反義活性對抗三個模型的標的mRNA(人類乳酸脫氫酶A及B，以及大鼠gp130)在細胞群中通過一動力PCR技術(kineticPCRtechnique)評估來證明在幾乎所有案例中都是有效的，包括使用磷酸二酯(phosphodiester)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)寡核苷酸化學對三個不同目標物在兩個細胞類型中的測試。此外，使用一體外系統(tǒng)來設計及預測特定寡核苷酸的效率的多個方法也已經(jīng)被公開(Matveeva,O.etal.(1998).Predictionofantisenseoligonucleotideefficacybyinvitromethods.NatureBiotechnology16,1374-1375)。多個臨床試驗已經(jīng)證明反義寡核苷酸的安全、可行性以及活性。例如，適合于癌癥的治療的反義寡核苷酸已經(jīng)成功被利用(Holmund,B.P.etal.(1999).Towardantisenseoligonucleotidetherapyforcancer:ISIScompoundsinclinicaldevelopment.CurrOpinMolTher1,372-385),whiletreatmentofhematologicalmalignanciesviaantisenseoligonucleotidestargetingc-mybgene,p53,andBcl-2enteredclinicaltrialsandwasshowntobetoleratedbypatients(Gewirtz,A.M.(1999).Oligonucleotidetherapeutics:clothingtheemperor.CurrOpinMolTher1,297-306)。更近期的，人類肝素酶基因的表達的反義介導的抑制已經(jīng)被報導在一小鼠模型中抑制人類癌癥細胞的胸膜傳播(pleuraldissemination)(Uno,F.etal.(2001).Antisense-mediatedsuppressionofhumanheparanasegeneexpressioninhibitspleuraldisseminationofhuman癌癥cells.癌癥Res61,7855-7860)。因此，目前的共識是，最近在反義
技術領域：
：的發(fā)展，如上所述，已經(jīng)引領高精確的反義設計算法的產(chǎn)生，以及一廣泛多樣的寡核苷酸運輸系統(tǒng)，使得本領域的技術人員可以設計及實施反義方法，適合于負調節(jié)已知序列的表達，而不必訴諸過度的嘗試及錯誤實驗?？梢载撜{節(jié)一CKI的另一試劑是一核酶(ribozyme)分子，其可以特定切割所述特定CKI編碼的一mRNA轉錄片段。核酶日益增加的被使用于基因表達的序列特定性抑制上，通過切割有興趣的mRNA編碼蛋白質(Welch,P.J.etal.(1998).ExpressionofribozymesingenetransfersystemstomodulatetargetRNAlevels.CurrOpinBiotechnol9,486-496)。設計核酶來切割任何特定目標RNA的可能性已經(jīng)使他們同時在基礎研究與療法應用方面成為有價值的工具。在療法領域中，核酶已經(jīng)被用于靶向在感染性疾病中的病毒RNA，在癌癥中的優(yōu)勢致癌基因，以及遺傳性疾病中的特定體細胞突變(Welch,P.J.etal.(1998).RibozymegenetherapyforhepatitisCvirusinfection.ClinDiagnVirol10,163-171)。最顯著的是。HIV患者的多個核酶基因治療方案已經(jīng)在第一階段試驗中。最近，核酶已經(jīng)被使用于轉基因動物研究、基因目標驗證，以及途徑分析。多個核酶還在不同臨床測試的階段。ANGIOZYMETM是第一個化學合成的核酶，在人類臨床試驗中被研究。ANGIOZYME特定抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(VascularEndothelialGrowthFactorreceptor，VEGFR)的形成，它是血管生成途徑的一個關鍵組份。核酶制藥公司(RibozymePharmaceuticals,Inc.)，及其他公司，已經(jīng)在動物模型中證明了抗血管生成治療劑的重要性。HEPTAZYMETM，設計用來選擇性破壞丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)RNA的一個核酶，被發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)試驗中降低HCVRNA是有效的(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colorado,USA(www.rpi.com))。調節(jié)細胞中CKI基因的一個額外方法是通過三股形成能力的寡核苷酸鏈(triplex-formingoligonucleotides，TFOs)。最近研究顯示，TFOs可被設計成辨識且一序列特定方法鍵結到雙股螺旋的DNA中聚嘌呤或多聚嘧啶區(qū)間以一序列特定方法。這些辨識規(guī)則概述于：MaherIII,L.J.等人(1989).InhibitionofDNAbindingproteinsbyoligonucleotide-directedtriplehelixformation.Science245,725-730；Moser,H.E.等人(1987).Sequence-specificcleavageofdoublehelicalDNAbytriplehelixformation.Science238,645-650；Beal,P.A.與Dervan,P.B.(1991).SecondstructuralmotifforrecognitionofDNAbyoligonucleotide-directedtriple-helixformation.Science251,1360-1363；Cooney,M.等人(1988).Science241,456-459；以及Hogan,M.E.等人的歐洲公開號EP375408。寡核苷酸的修飾，如嵌入劑以及骨干取代的導入，以及鍵結條件的優(yōu)化(例如，pH及陽離子濃度)已經(jīng)幫助克服TFO活性所固有的障礙，例如電荷排斥作用以及不穩(wěn)定度，且近來顯示，合成的寡核苷酸可被靶向特定序列(一最近的回顧，見Seidman,M.M.andGlazer,P.M.(2003).ThepotentialforgenerepairviatriplehelixformationJClinInvest112,487-494)。一般來說，所述三股形成能力的寡核苷酸鏈具有序列對應：寡3'--AGGT雙股5'--AGCT雙股3'--TCGA然而，其已經(jīng)顯示的是，所述A-AT和G-GC三聯(lián)體具有最大的三螺旋穩(wěn)定性(Reither,S.andJeltsch,A.(2002).SpecificityofDNAtriplehelixformationanalyzedbyaFRETassay.BMCBiochem3(1),27,Epub)。相同的作者已經(jīng)證明了，根據(jù)A-AT和G-GC規(guī)則所設計的TFOs并不形成非特定性的三聯(lián)體，代表了三聯(lián)體形態(tài)確實是序列特定性的。因此，一三股形成能力的序列可以依據(jù)任何在所述CKI調節(jié)區(qū)間中所給定的序列而被設計出來。三股形成能力的寡核苷酸鏈優(yōu)選是至少15個，更優(yōu)選為25個，仍然更優(yōu)選為30個，或更多的核苷酸長度，至多50或100堿基對(bp)。以TFOs(例如陽離子脂質體)的細胞轉染以及與目標DNA的三螺旋結構的形誘導立體與功能電荷、阻斷轉錄起始及生長，允許內(nèi)源性DNA中所欲序列改變的導入，以及造成基因表達的特定負調節(jié)。以TFOs處理的細胞基因表達的抑制實例包括：在哺乳動物細胞中敲出游離supFG1(episomalsupFG1)及內(nèi)源性HPRT基因(Vasquez,K.M.etal.(1999).Chromosomalmutationsinducedbytriplex-formingoligonucleotidesinmammaliancells.NuclAcidsRes27,1176-1181；以及Puri,N.etal.(2001).TargetedGeneKnockoutby2'-O-AminoethylModifiedTriplexFormingOligonucleotides.JBiolChem276,28991-28998)；所述序列及目標特定的負調節(jié)Ets2轉錄因子的表達，在前列腺癌發(fā)病原因中是重要的(Carbone,G.M.etal.,SelectiveinhibitionoftranscriptionoftheEts2geneinprostatecancercellsbyatriplex-formingoligonucleotide.NuclAcidsRes31,833-843)；以及調節(jié)促炎(pro-inflammatory)ICAM-1基因(Besch,R.etal.(2003).SpecificinhibitionofICAM-1expressionmediatedbygenetargetingwithTriplex-formingoligonucleotides.JBiolChem277,32473-32479)。此外，Vuyisich和Beal最近已經(jīng)展示序列特定的TFOs可鍵結到dsRNA，抑制dsRNA-依賴的酶活性，如RNA-依賴的激酶(Vuyisich,M.andBeal,P.A.(2000).RegulationoftheRNA-dependentproteinkinasebytriplehelixformation.NuclAcidsRes28,2369-2374)。此外，根據(jù)上述原理設計的TFOs可誘導影響DNA修復的定向誘變(directedmutagenesis)，因此提供同時負調節(jié)與正調節(jié)內(nèi)源性基因的表達(SeidmanandGlazer(2003))。有效TFOs的設計、合成及施用的詳細描述可見于Froehler等人的美國專利申請?zhí)柕?3/017068及03/0096980號，以及Emanuele等人的美國專利申請?zhí)柕?2/0128218和02/0123476號，以及Lawn的美國專利第5,721,138號。微小RNAs(MicroRNAs)利用本領域的方針可被設計出來。這些分子的設計的算法也是有用的。見如www.wmddotweigelworlddotorg/cgi-bin/mirnatoolsdotpl網(wǎng)頁所示，此處一并列入?yún)⒖?。本發(fā)明可負調節(jié)所述CKI的另一試劑是鍵結及/或切割所述CKI的任何分子。這些分子可以例如是CKI拮抗劑或一CKI抑制肽?？衫斫獾氖?，CKI的至少一個催化或連接部位的一個非功能性的類似物也可以作為負調節(jié)CKI的一個試劑。小的化學CKI抑制劑也被本發(fā)明所考慮。這些化學試劑對于一特別CKI可具有選擇性的抑制活性，或可包含對于二或多個CKI的抑制活性。與對于CKI-α的抑制活性相比，此抑制劑對于CKI-δ及ε可具有大于至少2倍、至少5倍或甚至10倍的抑制活性。例如，IC261(可自SantaCruztechnology公司取得)是所述CKI-δ及CKI-ε的一特定抑制劑。根據(jù)一特殊實施例，所述小的化學CKI抑制劑對CKI-δ有選擇性。與對于CKI-α及/或CKI-ε的抑制活性相比，此抑制劑對CKI-δ可具有大于至少2倍、至少5倍或甚至10倍的抑制活性。根據(jù)另一實施例，所述小的化學CKI抑制劑對CKI-ε有選擇性。與對于CKI-α及/或CKI-δ的抑制活性相比，此抑制劑對CKI-ε可具有大于至少2倍、至少5倍或甚至10倍的抑制活性。根據(jù)另一實施例，與對于CKI-δ及/或CKI-ε的抑制活性相比，所述小分子化學試劑(即，不是一多核苷酸試劑)對CKI-α可具有大于至少2倍、至少5倍或甚至10倍的抑制活性。根據(jù)一實施例，所述小分子試劑在正調節(jié)p53上至少和CKIδ及CKIε的抑制劑一樣有效。優(yōu)選地，所述小分子試劑在正調節(jié)p53上的有效性至少兩倍于CKIδ及CKIε的抑制劑。根據(jù)一特殊實施例，所述試劑不是CKI7、D4476或IC261，由于這些試劑沒有一個能穩(wěn)定β連環(huán)蛋白及p53，也不會誘導一DNA損壞反應。設想的小分子試劑包括PF670462(CAS編號：950912-80-8)或PF4800567(CAS編號：1188296-52-7)。根據(jù)本發(fā)明可使用以負調節(jié)CKI的另一試劑是預防CKI激活或基材鍵結的分子。其他可被使用以調節(jié)CKI-α、δ或ε的試劑可使用本領域已知的篩選方法被發(fā)現(xiàn)或精制(以改善選擇性、特定性)。這些試驗的例子包括生化試驗(例如，體外激酶活性)、細胞生物學分析(例如蛋白質定位)以及分子檢測(例如，Northern、Western及Southern印跡)。下面是不同檢測的描述，可被使用于篩選小分子化學試劑，具有負調節(jié)本發(fā)明CKI的其中之一的能力。酶抑制測定：1.以一小分子抑制劑(SMI)培養(yǎng)重組的CKIε酶10分鐘；加入一基材，人類Per2，并通過SDS-PAGE上的蛋白質上移(proteinupshift)觀察Ser662的磷酸化(Tohetal,Science291:1040,2001)。2.以一小分子抑制劑(SMI)培養(yǎng)重組的CKIδ酶10分鐘；加入一基材，小鼠p53，并通過Western印跡，利用諾瓦斯兔抗P53(NovusRabbitAnti-p53)，磷酸(Thr18)多克隆抗體(NB100-92607)，觀察Thr182的磷酸化。3.以一SMI培養(yǎng)人類腫瘤細胞1-24小時；獲取細胞并分析他們的β-連環(huán)蛋白在Ser45上的磷酸化，使用英杰公司兔抗β連環(huán)蛋白(InvitrogenRabbitAnti-β-Catenin)，磷酸(Ser45)多克隆抗體(44-208G)(CKIα的一獨特屬性)。生物學分析：1.以一SMI培養(yǎng)人類腫瘤細胞1-24小時；獲取細胞并分析他們的DDR及p53激活，利用抗體對γH2A.X及p53，通過免疫組織化學法或Western印跡。2.以一SMI培養(yǎng)人類原發(fā)腫瘤細胞和與腫瘤相關的成纖維細胞(tumor-associatedfibroblasts)24小時；移去所述SMI并更換培養(yǎng)基；分析細胞的細胞老化現(xiàn)象，通過衰老相關β半乳糖苷酶測定法(Senescence-Associatedβ-galactosidaseassay，SA-β-Gal)。候選試劑可包含，小分子化學抑制劑、抗體或多種多核苷酸試劑，如在本文上面所描述的那些。接著使用上列篩選方法識別，所述試劑可作為癌癥細胞的一候選抗癌試劑被測試，或作為一消耗造血干細胞的候選。確認試劑活性可在合成并制備大量試劑于一藥物組合物之后，所述藥物組合物包含包含本文下面詳述相同的試劑。如所述，本發(fā)明的所述抑制劑也可以作為血液消融試劑(hemato-ablationagent)用于消耗骨髓細胞于一細胞移植步驟之前。所述血液消融可以和化療及/或輻照共同實施，或不使用化療及/或輻照單獨實施。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一觀點，提供一種將細胞移植至有需求的受試者體內(nèi)的方法，包含：(a)通過使取自一受試者的一血液或骨髓的多個不成熟血細胞與一數(shù)量的CKI抑制劑接觸，以消耗取自所述受試者的血液或骨髓的所述不成熟血細胞，其中所述CKI抑制劑用以正調節(jié)p35的一數(shù)量及/或活性，且殺死所述血液或骨髓中的所述不成熟血細胞；以及隨后：(b)移植多個細胞至所述受試者體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明一實施例的此觀點，所述受試者患有一疾病，細胞移植對他來說是治療方法。此疾病包括但不限于一血液學疾病、一心臟疾病、糖尿病、神經(jīng)退化性疾病、一惡性疾病、一免疫疾病以及一自體免疫疾病。所述疾病可為先天或后天。根據(jù)本發(fā)明一實施例的此觀點，所述疾病是一惡性疾病。根據(jù)一特定實施例，所述惡性疾病是造血或淋巴組織的一惡性腫瘤。所述受試者可能患有的疾病包括，但不限于，白血病[例如，急性淋巴的、急性淋巴母細胞的、急性淋巴母細胞前B細胞(pre-Bcell)、急性淋巴母細胞T細胞白血病，急性巨核細胞的(megakaryoblastic)、單核細胞的、急性骨髓性、急性髓細胞、具有嗜酸性粒細胞的急性髓細胞、B細胞、嗜堿性粒細胞、慢性髓細胞、慢性B細胞、嗜酸性粒細胞、伴細胞(Friend)、粒細胞(granuclocytic)或髓細胞性(myelocytic)、毛發(fā)細胞、淋巴細胞、巨核細胞、單核細胞、單核巨噬細胞、粒細胞、髓細胞、粒單核、血漿細胞、前B細胞、前髓細胞、亞急性T細胞、淋巴腫瘤、傾向髓細胞的惡性腫瘤、急性非淋巴細胞白血病，T細胞急性淋巴細胞性白血病(T-ALL)，以及B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)]；淋巴瘤[例如，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，B細胞、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，B細胞慢性淋巴細胞性白血病/淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，T細胞、皮膚T細胞、前驅T細胞白血病/淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，外套膜細胞淋巴瘤，MALT淋巴瘤，組織細胞性(histiocytic)、淋巴母細胞、胸腺(thymic)及蕈樣肉芽腫(Mycosisfungoides)]，與一接枝的移植關聯(lián)的病癥(例如移植排斥反應，慢性移植排斥反應，亞急性移植排斥反應，超急性移植排斥反應，急性移植排斥反應，以及移植物抗宿主癥(graftversushostdisease))；自體免疫疾病如1型糖尿病(Type1diabetes)；重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征(severecombinedimmunodeficiencysyndromes，SCID)，包括腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase，ADA)、骨硬化病(osteopetrosis)、再生障礙性貧血(aplasticanemia)、戈謝氏病(Gaucher'sdisease)、地中海貧血(thalassemia)以及其他先天性或遺傳決定的造血異常。被消耗的所述不成熟血細胞，根據(jù)本發(fā)明的此觀點，包括造血干細胞(HSCs)、造血祖細胞(progenitorcell)以及癌癥干細胞。所述不成熟血細胞可以存在于骨髓及/或循環(huán)系統(tǒng)血中。術語“造血干細胞”指多能干細胞，引起一生物體的全部血細胞類型，包括髓細胞(例如單核細胞及巨噬細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅血球、巨核細胞/血小板、樹突狀細胞)，以及淋巴世系(例如，T細胞、B細胞、NK細胞)。當被移植到致死劑量輻照的動物或人體，造血干細胞可以重新填入紅細胞、中性粒細胞-巨噬細胞、巨核細胞及淋巴造血細胞池中。此處所使用的術語“造血干及祖細胞”或“HSPC”是指一細胞由抗原標記物CD34的出現(xiàn)，及缺乏譜系(lin)標記物來識別。HSPCs因此特征如CD34+/Lin(-)細胞，及這些細胞群。已認識到，所述細胞群包括CD34+及Lin(-)細胞也包括造血祖細胞，因此對于此應用的目的來說，術語“HSPC”包括造血祖細胞。此處所使用的術語“消耗”指消減至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的骨髓干細胞。因此，所述CKI抑制劑可以一清髓性(myeloablative)或一降髓性(myeloreductive)劑量被提供。此處所使用的“清髓性”是指一治療中，如若不給予造血干細胞移植，將發(fā)生一顯著數(shù)量的接受者由于骨髓衰竭而死亡。此處所使用的“非清髓性”是指一治療，其殺害骨髓細胞，但將不會使一顯著數(shù)量的接受者因骨髓衰竭而導致死亡。此處所使用的“降髓性”是指一治療造成血細胞減少或貧血。可以理解的是，當所述CKI抑制劑以一降髓性劑量提供，其他試劑可用以帶來一個完整的骨髓消融。此試劑包括例如腫瘤細胞減滅劑，其選自于一或多個的：烷化劑，例如氮芥類(nitrogenmustards)[如mechloretamine]、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)以及苯丁酸氮芥(chlorambucil)；烷基磺酸鹽，例如白消安(busulphan)；亞硝基脲類(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)以及鏈脲霉素(streptozocine)；三嗪類(triazenes)，例如達卡巴嗪(dacarbazine)；抗代謝藥物，例如葉酸類似物如氨甲喋呤(methotrexate)；嘧啶類似物，例如氟尿嘧啶(fluorouracil)以及阿糖胞苷(cytarabine)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、伊達比星(idarubicin)、阿拉伯糖胞苷(cytosinearabinoside)、巰基嘌呤(mercaptopurine)以及硫鳥嘌呤(thioguanine)；長春花生物堿類(vincaalkaloids)，例如長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)以及范地辛(vendesine)；表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博萊霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)以及絲裂霉素(mitomycin)；二溴甘露醇(dibromomannitol)；脫氧精胍菌素(deoxyspergualine)；二甲基馬利蘭(dimethylmyleran)以及噻替哌(thiotepa)。其他降髓性非清髓性試劑為烷化劑，例如環(huán)磷酰胺，或氟達拉濱或相似物質，然而，造血空間創(chuàng)造抗體或藥物，例如細胞增殖抑制劑，例如DSG，或一抗代謝產(chǎn)物，例如布喹那(brequinar)，或一抗T細胞抗體，例如一抗CD4或抗CD8抗體中的一或二者可被使用作為一降髓性非清髓性試劑。X輻射，以及X輻射和藥物施用的結合也是被考慮的。在一些實施例中，骨髓消融是通過已知是殺害轉移性骨細胞的放射性同位素的給予而制造，例如，放射性元素鍶、釤135(135Samarium)或鈥166(166Holmium)(Applebaumetal.,1992,Blood80:1608-1613)。所述CKI抑制劑一般以可增加p53的數(shù)量及/或活性的一數(shù)量來提供。所述CKI抑制劑與所述骨髓細胞的接觸是在體內(nèi)或體外實現(xiàn)，例如分離性輸血期間。如此，根據(jù)本發(fā)明的另一觀點，提供一種消耗取自一受試者的一血液或骨髓的不成熟血細胞的方法，其包含：在體外使多個干細胞與一數(shù)量的CKI抑制劑接觸，其中所述CKI抑制劑用以正調節(jié)P35的一數(shù)量及/或活性，且殺死所述血液或骨髓中的所述不成熟血細胞，從而消耗取自所述血液或骨髓的所述不成熟血細胞。根據(jù)本發(fā)明的這些觀點可被使用的CKI抑制劑描述于本文上面。被移植的所述細胞可以是被分離的細胞(也參照為一細胞植入物(cellgraft))或可以被包含在一組織內(nèi)(也參照為一組織植入物(tissuegraft))。此處所使用的字串“細胞或組織植入物”是指一身體細胞(例如一單一細胞或一群細胞)或組織(例如固態(tài)組織或軟組織，可被完整或部份移植)。根據(jù)本發(fā)明教導可被移植的組織，包含但不限于，例如淋巴/造血組織(例如淋巴結、淋巴集結胸腺(Peyer'spatchesthymus)或骨髓)。根據(jù)本發(fā)明教導可被移植的細胞，包含但不限于，例如造血干細胞(例如不成熟造血細胞)。根據(jù)一特定實施例，本發(fā)明的所述造血干細胞是CD34+?？梢岳斫獾氖牵灰浦驳焦撬韪杉毎牡氖茉囌唧w內(nèi)的細胞類型依賴于治療的疾病。因此，舉例來說，當所述受試者有腎臟或心臟衰竭，所述移植細胞可包含腎或心臟細胞。當所述受試者患有肝或肺衰竭或皮膚損害(例如燒傷)，所述植入物可包含肝，肺或皮膚組織。當所述受試者有糖尿病，所述細胞包括β細胞胰腺細胞(pancreaticcells)。當所述受試者有血液疾病，所述細胞可包含不成熟造血細胞。取決于應用，所述方法可以利用一細胞或組織植入物來實施，所述植入物與所述受試者同基因系或不同基因系。此處所使用的術語“同基因系”指一細胞或組織，其衍生自一個體，實質上與所述受試者的基因一致。一般來說，實質上完全自交的哺乳動物、哺乳動物的克隆或同卵雙胞胎哺乳動物都屬于同基因系。同基因系細胞或組織的例子包括，自所述受試者衍生的細胞或組織(本領域也指“自體”)，所述受試者的一克隆，或所述受試者的一同卵雙胞胎。此處所使用的“不同基因系”指自一個體衍生的細胞或組織，所述個體與所述受試者的淋巴細胞同種異體(allogeneic)或異種(xenogeneic)(本領域也指“非自體”)。此處所使用的術語“同種異體”指自一捐贈者衍生的一細胞或組織，所述捐贈者與所述受試者相同物種，但基本上與所述受試者是非克隆(non-clonal)。一般而言，相同物種的遠系雜交，非同卵(non-zygotic)雙胞胎哺乳動物是彼此同種異體的。可以理解的是，一同種異體的捐贈者可以與所述受試者HLA一致或非一致。此處所使用的術語“異種”是指一細胞或組織，基本上表達一不同物種抗原關于所述受試者的一大量比例的淋巴細胞的物種。一般而言，不同物種的遠系雜交的哺乳動物是彼此為異種。本發(fā)明設想，異種細胞或組織是從各種各樣的物種衍生，例如但不限于，牛科動物(例如，牛)、馬科動物(例如，馬)、豬類(例如豬)、羊科(ovids，例如，山羊、綿羊)、貓科動物(例如，家貓)、犬類(例如，家犬)、嚙齒動物(例如，老鼠，大鼠、兔子、豚鼠、沙鼠、倉鼠)或靈長類動物(例如，黑猩猩、恒河猴、獼猴、狨猴)。異種來源的細胞或組織(例如豬源)優(yōu)選取自一來源，已知無人畜共患病，例如豬內(nèi)源性逆轉錄病毒(porcineendogenousretroviruses)。相似地，人類衍生細胞或組織優(yōu)選取自基本上無病原體的來源。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，所述受測者與所述捐贈者都是人類。取決于應用及可用的來源，本發(fā)明的所述細胞或組織植入物可取自一產(chǎn)前生物體、產(chǎn)后生物體、成人或死體捐贈者。再者，取決于所需應用，所述細胞或組織可以是天然或基因修飾的。這些判斷是在本領域的普通技術人員中的一個的能力范圍之內(nèi)。任何本領域已知的方法可被采用，以獲得一細胞或組織(例如，為了移植)。根據(jù)一特別實施例，被移植的所述細胞包含造血細胞，例如不成熟造血細胞(immaturehematopoieticcells)。此處所使用的術語“不成熟造血細胞”指任何類型不完全分化的細胞，其可分化為一或多種的完全分化的造血細胞。不成熟造血細胞包括本
技術領域：
：所指不限類型的細胞，如“祖細胞(progenitorcells)”、“前驅細胞(precursorcells)”、“干細胞”、“多能細胞(pluripotentcells)”、“復能細胞(multipotentcells)”等等。優(yōu)選的所述不成熟造血細胞為造血干細胞。優(yōu)選地，其中所述不成熟造血細胞是從人類衍生，所述不成熟造血細胞為CD34+細胞，如CD34+CD133+細胞。本發(fā)明的植入物類型包含不成熟造血細胞，其包括所有骨髓細胞植入物(耗盡的T細胞或耗盡的非T細胞)、取自骨髓抽取物的不成熟造血細胞植入物、外周血衍生的不成熟造血細胞植入物，以及臍帶衍生的不成熟造血細胞植入物。獲得這些植入物的方法在下面描述。一植入物，包含人類外周血衍生的造血干細胞可以根據(jù)標準方法被取得，如由細胞因子治療的捐贈者移動CD34+細胞至所述外周血，且獲取所述移動的CD34+細胞通過白細胞分離。大量方針在本領域的文獻中被提供用于實施從骨髓或血液分離骨髓衍生的干細胞(參照例如：AraiS,KlingemannHG.,2003.ArchMedRes.34:545-53；以及RepkaT.andWeisdorfD.,1998.CurrOpinOncol.10:112-7；JanssenWE.etal.,1994.CancerControl1:225-230；AtkinsonK.,1999.CurrTopPathol.92:107-36)。人類臍帶血衍生的造血干細胞的一植入物可根據(jù)標準方法取得(參照如：QuillenK,BerkmanEM.,1996.J.Hematother.5:153-5)。本發(fā)明的造血干細胞的一植入物葉可以衍生自肝組織或卵黃囊。造血干細胞的一必要數(shù)量可通過初級造血干細胞的前體(ex-vivo)擴展來提供(回顧Emerson,1996,Blood87:3082，以及更詳細描述于Petzeretal.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.3:1470；Zundstraetal.,1994,BioTechnology12:909；以及國際專利申請案WO9511692)。移植所述細胞或組織植入物到所述受試者體內(nèi)可利用眾多方式實現(xiàn)，取決于多種參數(shù)，如，所述細胞或組織類型；所述接受者的疾病類型、階段或嚴重性(例如器官衰竭)；特定對所述受試者的所述物理或生理參數(shù)；及/或所想要的治療結果。本發(fā)明移植細胞或組織植入物可通過移植細胞或組織植入物到任何一個解剖位置，取決于應用。所述細胞或組織植入物可以被移植到一同倫解剖位置(homotopicanatomicallocation，對于移植正常的解剖位置)，或一異位解剖位置(對于移植不正常的解剖位置)。取決于應用，所述細胞或組織植入物可以是有利植入腎包膜下，或植入腎、睪丸脂肪、皮下組織、網(wǎng)膜、門靜脈、肝、脾臟、骨骼、心臟腔室、心臟、胸腔、肺、皮膚、胰腺及/或在腹腔內(nèi)的空間?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明所述同基因系或不同基因系造血細胞(例如不成熟造血細胞)可被移植到一受體體內(nèi)，使用任何本
技術領域：
：已知的細胞移植方法，例如但不限于，細胞輸注(例如I.V.)或通過一腹膜內(nèi)途徑(intraperitonealroute)?？蛇x擇的，當移植本發(fā)明的一細胞或組織植入物到有缺陷的器官/細胞的一受試者體內(nèi)，首先從所述受試者至少部份移除失效的器官/細胞是有利的，因此使植入物有最佳發(fā)展，且其結構/功能上與受試者的解剖學/生理學整合。在消耗步驟之前，從所述骨髓移出所述不成熟血細胞到所述血液中也在本發(fā)明中被考慮。移動試劑的例子包括影響移動的生長因子或細胞因子，例如細胞集落刺激因子(例如粒細胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，G-CSF)以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagescolonystimulatingfactor，GM-CSF))以及干細胞因子SCF。肽群集試劑也在本發(fā)明中被設想，包括那些公開于美國專利申請案第2004/0209921號、美國專利第6,946,445號、美國專利第6,875,738號、美國專利申請案第2005/0002939號、國際專利申請案WO2002/020561、WO2004/020462以及WO2004/087068、WO00/09152、美國專利申請案第2002/0156034號，以及國際專利申請案WO2004/024178及WO01/85196。接著根據(jù)本發(fā)明，移植所述細胞或組織植入物到所述受試者體內(nèi)，根據(jù)標準醫(yī)療實踐，依照任一種標準技術，監(jiān)測所述器官/細胞的生長功能性及免疫兼容性是適當?shù)摹Ｅe例來說，所述細胞或組織的結構發(fā)展可以使用計算機斷層掃描或超聲影像被監(jiān)控當植入不同基因系細胞或骨髓植入物可例如以嵌合體測試被監(jiān)控[例如基于PCR的步驟，使用短串聯(lián)重復序列(STR)分析]。本文上面所述CKI抑制劑(或表達載體編碼的多核苷酸CKI抑制劑)可被施用于個體本身或作為藥物組合物的一部份，其也包括一生理學上可接受的載體。一藥物組合物的目的是促進活性成分施用到生物體。此處所使用的一"藥物組合物"是指一制劑含有本文所述的一或多個活性成分(例如一CKI-α抑制劑、CKI-δ抑制劑及/或一CKI-ε抑制劑)以及其他化學成分，例如生理上適合的載體和賦形劑(excipient)。此處術語"活性成分"是指負責生物效應的試劑(例如，靜默分子)。在下文中，所述字串"生理學上可接受的載體"以及"藥學可接受的載體"可彼此交換使用參照為一種載體或一種稀釋劑，不會造成一生物體的顯著刺激，且不會廢除所施用的化合物的生物活性及特性。這些字串也涵蓋一助劑(adjuvant)。此處術語"賦形劑(excipient)"是指一種加入藥物組合物的惰性物質，以更促進活性成分的施用。例如，但不限于，賦形劑包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠(gelatin)、植物油和聚乙二醇。制定及給藥技術可見于“Remington’sPharmaceuticalSciences,”(MackPublishingCo.,Easton,PA,latestedition)，一并列入本文參考。適合的給藥途徑，可例如是，包含口腔(oral)、直腸(rectal)、粘膜(transmucosal)，特別是especially鼻(transnasal)、腸(intestinal)或腸外(parenteral)輸送，包括肌肉注射(intramuscular)、皮下注射(subcutaneous)以及髓內(nèi)注射(intramedullaryinjections)以及鞘內(nèi)注射(intrathecal)、直接心室內(nèi)(directintraventricular)、心內(nèi)(intracardiac)，例如到右或左心室、到公共冠狀動脈、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。二者擇一，可以一局部而非系統(tǒng)的方式來施用所述藥物組合物，例如，通過直接注射所述藥物組合物至一病患的一組織區(qū)間。術語“組織”是指一生物體的部份，由具有相似構造及/或共同功能的細胞群集所組成。例子包括，但不限于，腦組織，視網(wǎng)膜，皮膚組織，肝組織，胰腺組織，骨，軟骨，結締組織，血組織，肌肉組織，心臟組織腦組織，血管組織，腎組織，肺組織，性腺組織，造血組織。在一例示的實施例，所述組織是一結腸癌癥組織。本發(fā)明的藥物組合物可利用本
技術領域：
：已知的工序來制造，例如，以常規(guī)混合、溶解、造粒、制錠、研碎、乳化、封裝、包埋或凍干工藝。依照本發(fā)明所使用的藥物組合物因此可以常規(guī)方式使用一或多個生理學可接受的載體來配制，所述生理學可接受的載體包含賦形劑與輔劑，促進所述活性成分加工到制劑中，可在藥學上使用。恰當?shù)呐渲剖腔谒x擇的給藥途徑。用于注射，所述藥物組合物的所述活性成分可被配制為一水溶液，優(yōu)選是在在生理相容的緩沖液中，如漢克溶液(Hank’ssolution)、林格氏液(Ringer’ssolution)，或生理鹽水緩沖液。用于粘膜給藥，適合于被滲透的屏障的滲透劑也使用于所述配方中。這些滲透劑一般是本領域已知的。用于口腔給藥，所述藥物組合物可通過組合所述活性化合物與本領域已知的藥學可接受的載體而被容易地配制。這些載體使所述藥物組合物可以被配制成片劑(tablets)、丸劑(pills)、糖衣丸(dragees)、膠囊(capsules)、液體、凝膠、糖漿、漿料(slurries)、懸浮液及其他類似物，用于患者口服攝取?？谇皇褂玫乃幬镏苿┛梢允褂靡还虘B(tài)賦形劑，任選地研磨所得混合物，且加工顆粒狀的所述混合物，如果需要，加入適合的助劑(auxiliaries)后，可獲得片劑或糖衣丸心。適當?shù)馁x形劑為，特別是，填充劑如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇(mannitol)、山梨糖醇；纖維素制劑如，舉例來說，玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；及/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，崩解劑(disintegratingagents)也可以加入，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂(agar)或海藻酸(alginicacid)，或其鹽類如海藻酸鈉(sodiumalginate)。糖衣丸心(Drageecores)具有合適的涂層。為了此目的，濃縮的糖液可被使用，選擇性地包含阿拉伯樹膠(gumarabic)、滑石(talc)、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠(carbopolgel)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、二氧化鈦、漆溶液(lacquersolutions)和合適的有機溶劑或溶劑混合物。染料和顏料可被加入涂層中，以識別或表示不同組合的活性化合物計量。口部可使用的藥物組合物，包括由明膠(gelatin)與明膠和增塑劑制成的軟、密封的膠囊所組合成的推入配合膠囊(push-fitcapsules)，所述增塑劑如甘油或山梨糖醇(sorbitol)。所述推入配合膠囊可包含所述活性成分，與填料混合，如乳糖，粘著劑(binders)如淀粉，潤滑劑如滑石(talc)或硬脂酸鎂(magnesiumstearate)，以及，可選擇的，穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，所述活性成分可被溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油(fattyoils)，液體石蠟(liquidparaffin)，或液體聚乙二醇(polyethyleneglycols)。此外，穩(wěn)定劑可以被加入。用于口服給藥的所有制劑應該是適合于選擇的給藥途徑的劑量。對于口腔(buccal)給藥，組合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑(lozenges)的形式。用于鼻腔吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明使用的所述活性成分從加壓包裝或噴霧器使用一合適的推進劑以氣溶膠噴霧(aerosolspray)的形式呈現(xiàn)且方便攜帶，所述推進劑例如二氯二氟甲烷(dichlorodifluoromethane)、三氯氟甲烷(trichlorofluoromethane)、二氯四氟乙烷(dichloro-tetrafluoroethane)或二氧化碳。在一加壓氣溶膠的例子中，所述劑量單位可由提供一閥門以遞送一定量來決定。用于一分散劑的，例如明膠(gelatin)，膠囊與匣可被制成容置一粉末，混合有所述化合物及一合適的粉末基底，例如乳糖或淀粉。此處所述藥物組合物可被定制為腸胃外給藥，例如，丸劑推注(bolusinjection)或連續(xù)輸液。注射配方可以單位劑量形式呈現(xiàn)，例如，在安瓿(ampoules)中或在多劑量容器中具有選擇性地，一添加的防腐劑。所述組合物可以是懸浮液、水溶液或乳化液，于油性或水溶液介質中，且可以包含調配劑(formulatoryagent)，如懸浮劑，穩(wěn)定劑及/或分散劑。腸胃外給藥的藥物組合物包括水可溶解型態(tài)的所述活性制劑的水溶液。此外，所述活性成分的懸浮液可以被制備成適當油或水為基礎的注射懸浮液。適合的親脂溶劑或介質包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯，甘油三酯或脂質體。水溶液注射懸浮液可以包含物質，其提高所述懸浮液的粘性，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐?？蛇x擇的，所述懸浮液可包含適合的穩(wěn)定劑或試劑，其提高所述活性成分的穩(wěn)定性，可制備高濃縮水溶液?？蛇x擇的，所述活性成分可以是粉末狀，使用前可與一適當?shù)馁x形劑一起組合，所述賦形劑例如，無菌的、無熱原水溶液。本發(fā)明的所述藥物組合物也可以定制為直腸(rectal)組合物，如栓劑或保留灌腸劑(suppositoriesorretentionenemas)使用例如傳統(tǒng)栓劑基質，如可可脂(cocoabutter)或其它甘油酯。適合用于本發(fā)明上下文的藥物組合物包括組合物，其中所述活性成分以一有效數(shù)量被包含于其中，以達成所想要的目的。更特別的，一治療有效量意指一數(shù)量的活性成分有效于的預防、緩解或改善一紊亂癥狀或延長被處理的所述受試者的存活。治療有效量的確定是內(nèi)本領域技術人員中的能力，特別是根據(jù)本文提供的詳細公開內(nèi)容。使用于本發(fā)明方法的制劑，所述治療有效量或計量可從體外及細胞培養(yǎng)分析被初步估算出來。例如，一劑可以被定制于動物模型(例如此處例示的APC模型)，以達成一所欲濃度或滴定量(titer)。此資訊可被使用在更精確決定可用于人類的劑量。此處所述活性成分的毒性及療效可以通過在細胞群或實驗動物中的體外標準藥學方法來確定。從這些體外及細胞群測試，以及動物研究中所獲得的數(shù)據(jù)，可以被用于制定使用于人類的一劑量范圍。所述劑量取決于采用的劑型以及利用的給藥途徑而有不同。確切的配方、給藥途徑以及數(shù)量可通過個體醫(yī)生鑒于患者的病情而做選擇。(見如，F(xiàn)ingl,etal.,1975,in"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1p.1)。劑量及間隔可以各自調整，以提供活性成分的組織水平是足以誘導或抑制生物學效果(最低有效濃度(minimaleffectiveconcentration)，MEC)。所述MEC將在每一制劑都不同，但可以從體外數(shù)據(jù)估量。達成MEC所必需的劑量取決于個體特性和給藥途徑。檢測方法可用于確定血漿濃度。取決于被處理的狀況的嚴重程度和響應，給藥劑量可以是單一或多個施藥，隨著治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或直到治愈，或疾病狀態(tài)的縮減實現(xiàn)。一組合物的給藥量，當然，將是依賴于被處理的所述受試者、痛苦的嚴重性、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷等。本發(fā)明的組合物可以，如果想要的話，以包裝或分配裝置呈現(xiàn)，例如一FDA批準的套件，其可以容納含有活性成分的一或多單位劑量形式。所述套件可包含所述抑制劑的組合，如一CKI-α抑制劑、CKI-δ抑制劑以及CKI-ε抑制劑。所述包裝可以，例如，包含金屬或塑膠薄片，如一吸塑包裝(blisterpack)。所述包裝或分配裝置可伴隨施用說明書。所述包裝或分配裝置也可以被關聯(lián)所述容器的一通知來提供，所述容器以政府機構規(guī)定的形式調節(jié)制造、使用或販售藥物，所述通知反映所述機構核準的所述組合物或人類或獸醫(yī)給藥的形式。此通知，例如，可以是標示通知，由美國食品和藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)所批準用于處方藥(prescriptiondrugs)或一批準的產(chǎn)品說明書。組合物包含本發(fā)明在相容的藥物載體中所制定的一制劑，也可被制造、放置于一適當容器，且標示用于處理一適應癥，如上面更詳細的說明。術語“處理”指抑制、預防或阻止一病理(疾病、紊亂或條件)的發(fā)展及/或造成一病理的降低、緩解或消退。那些本領域的技術人員將理解，各種方法及測試可被使用，以評估病理發(fā)展，且相同的，各種方法及測試也可被使用來評估病理的降低、緩解或消退。此處所使用的術語“預防”是指保持一疾病、紊亂或條件不會發(fā)生在處于所述疾病的風險的受試者，但未被診斷為患有所述及并。此處所使用的術語“受試者”包括哺乳動物，優(yōu)選任何年齡患病的人類。優(yōu)選地，此術語包含處于發(fā)展患病風險的個體。根據(jù)一特殊實施例，所述受試者不伴隨使用伊馬替尼、達沙替尼或尼羅替尼治療?？梢岳斫獾氖?，發(fā)明的某些特征，為了明確清晰，描述于分開的實施例的上下文中，也可以在一單一實施例中被結合提供。反之，本發(fā)明的各個特征，為了簡短，描述于一單一實施例的上下文中，也可以被分開或以任何適當?shù)淖咏M合，或作為適合用于本發(fā)明的任何其他描述的實施例。各個實施例上下文中所述的某些特征不考慮為那些實施例的必要特征，除非實施例沒有那些元件是無法操作的。如上文劃定的本發(fā)明的各種實施例和各方面，以及如下面權利要求所宣告，可以在以下實施例找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參考以下實施例，其與上面的描述一起示出了一個非限制性的方式來說明本發(fā)明的一些實施例。一般來說，本發(fā)明此處所用的術語和實驗室方法包括分子、生化、微生物以及重組DNA技術。這些技術在文獻中充分說明。請參照，例如："MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrooketal.,(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubeletal.,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watsonetal.,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birrenetal.(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；闡述于美國專利第4,666,828號、第4,683,202號、第4,801,531號、第5,192,659號以及第5,272,057號的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition；"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994)；Stitesetal.(eds),"BasicandClinicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；MishellandShiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可用的免疫檢測方法廣泛描述于專利及科學期刊論文中，請參照例如美國專利第3,791,932號、第3,839,153號、第3,850,752號、第3,850,578號、第3,853,987號、第3,867,517號、第3,879,262號、第3,901,654號、第3,935,074號、第3,984,533號、第3,996,345號、第4,034,074號、第4,098,876號、第4,879,219號、第5,011,771號以及第5,281,521號；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1985)；"轉錄andTranslation"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)以及"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshaketal.,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；它們?nèi)克U述的完整內(nèi)容都并入本文作為參考。其他一般參考文件已在此文件各處提供。其中步驟被認為在本領域中是公知的，且為了讀者的方便性而提供，其所有涵蓋的資訊在此一并列入?yún)⒖?。材料與方法條件的CKIαKO小鼠：C57bl/6小鼠是具有l(wèi)oxP兩側CSNK1A1的小鼠(Elyadaetal.,2011)與mx1-Cre小鼠(Kuhnetal.,1995)進行雜交。七代與C57bl/6小鼠回交以產(chǎn)出一純基因背景。Mx1-Cre誘導以隔日2mg/mL聚肌胞苷酸鈉鹽(Polyinosinic–polycytidylicacidsodiumsalt，pIpC(sigmaP1530))的三個I.P.注射的10uL/g小鼠實施。植入通過I.V.注射新鮮分離的5x106骨髓細胞來實施。BCR-ABL–誘導CML模型：為了產(chǎn)生BCR-ABL–誘導CML模型，從MxCre-Ck1α1fl/fl或MxCre+Ck1α1fl/fl取得的BM細胞為了cKit表達細胞(EasySep#18757)被提取且豐富，且于RPMI補充15％FCSL-谷氨酰胺(L-Glutamine)、Pen/Strep(BeitHaemek公司)、干細胞因子(SCF)、IL-3、IL-6以及TPO(Peprotech公司)中培養(yǎng)整夜。培養(yǎng)基接著以含上清液的p210BCR-ABL-IRES-GFP逆轉錄病毒構建感染4小時及返回培養(yǎng)基再經(jīng)額外24小時。所述培養(yǎng)接著被注入I.V.至亞致死劑量輻照(500rad)小鼠?；谛∈笸庵苎锌蓚蓽y的穩(wěn)定增加GFP表達細胞(通過FACS)以及白細胞與不成熟細胞數(shù)量的上升(通過Wright-Giemsa染色血膜(Wright-Giemsastainedbloodfilms))，所述小鼠被犧牲且他們的骨髓被轉移到亞致死劑量輻照的WT宿主。每一此轉移都稱為疾病世代(diseasegeneration)。通過第四次轉移，宿主不再于及并轉移前被亞致死劑量輻照，且世代之間的時間更短(經(jīng)常是10天)。母細胞危象的發(fā)展是易于檢測的，通過高不正常數(shù)量的胚細胞(在PB中大于30％的WBC)，及轉移之間所縮短的時間。實驗步驟如圖3所示。實驗在最后世代疾病實施，其中胚細胞易于偵測到，宿主必須無輻照，且世代時間是短的(至多14天)。每日監(jiān)測小鼠的惡病質(cachexia)、昏睡(lethargy)及環(huán)狀毛皮(ruffcoats)，麻痹及垂死小鼠被犧牲。為了評估Ck1α1KO在CMP上的效果，pIpC自骨髓移植(BMT)后24小時起通過I.P.(20微克/克小鼠)隔日施用。當MxCre+Ck1α1fl/flCD45.2疾病宿主被使用時，實施相同的步驟，在第一pIpC施用的第7天自一WT同類CD45.1捐贈者添加I.V.5x106的BM細胞。嵌合體通過分析小鼠PB中植入后一個月的CD45.1表達的白細胞而被評估。LT-HSC植入通過PC中髓細胞與淋巴成熟CD45.1表達白細胞兩者的出現(xiàn)來評價。所述PF670462溶解于20％的2-羥丙基β-環(huán)糊精(2-hydroxypropylβ-cyclodextrin)(賦形劑)，且在疾病轉移之后每日I.P.給藥劑量60mg/Kg開始7小時。所述控制組小鼠僅以所述賦形劑處理。體外抑制劑測試：從帶有CML的小鼠中分離的新鮮骨髓與正常小鼠骨髓以1：1的比例混合，且在RPMI補充15％的FCSL-谷氨酰胺(L-Glutamine)、Pen/Strep、Hepes、丙酮酸鈉(SodiumPyruvate)、非必要的氨基酸(BeitHaemek公司)中生長。PF670462抑制劑溶解于DMSO并加入所示濃度的組織培養(yǎng)基以及0.1％的DMSO。為了控制對照，所述細胞僅以賦形劑處理。36至48小時之后，收獲細胞并使用相機及標準倒置光顯微鏡進行手動計數(shù)。死去的細胞使用TrypanBlue(sigma公司)被剔除。正常及BCR-ABL表達細胞的數(shù)量根據(jù)FACS分析的％GFP+/7AAD-表達細胞在之后推算。膜聯(lián)蛋白V-PE(AnnexinV-PE，MBL)、7AAD(Tonbo公司)染色由FACS根據(jù)制造者的建議來評估。定量RT-PCR：細胞中全部RNA使用DirectZolRNAminiprep(Zymed公司)提取。使用一聚(dT)寡核苷酸(IDT)及MMLV-逆轉錄酶(Invitrogen公司)生成cDNA，且在7900HT實時PCR系統(tǒng)(7900HTRealTimePCRSystem，AppliedBiosystems公司)中放大，根據(jù)制造者的說明使用Green(Invitrogen公司)。每個基因實施至少相同的三次反應。熔解曲線分析在每次反應之后實施，以控制非特定PCR產(chǎn)物及引物二聚體(primerdimers)。正常化使用PP1A，UBC和HPRT作為一內(nèi)部控制來實施。Western印跡分析：所有細胞裂解物從帶有CML，且以賦形劑或PF670462處理后的小鼠的骨髓萃取到蛋白酶及磷酸酶抑制劑中。蛋白質以SDS-PAGE提取、分離且轉移到硝化纖維素薄膜(nitrocellulosemembranes)上，以β-連環(huán)蛋白、c-Myc、p53及HSP90的抗體探測。感興趣的蛋白質以HRP-復合驢/兔抗小鼠IgG抗體(Donkey/Rabbitanti-mouseIgGantibody)偵測(1:5000,GEHealthcare,Uppsala,Sweden)，且根據(jù)所提供的規(guī)則，以PierceECLWestern印跡基材進行可視化(ThermoScientific,Rockford,IL)。FACS分析：所有試驗都在BD's:FACS口徑，F(xiàn)ACSARIA分類器或LSRII機器實施。染色細胞以5uM的EDTA懸浮于1％的BSA/PBS緩沖液中。細胞接著與適當抗體冰上培養(yǎng)30分鐘，清洗并與制造商的建議適合的二級抗體一起培養(yǎng)。特定對CD16及CD32的單克隆抗體(MiltenyiBiotec公司)被用于染色前封鎖Fc受體。用于細胞表面標識的所述抗體列在下面表1。表1實施例1CKIα缺失引導正常HSC消耗而令骨髓重建生產(chǎn)Ck1α1fl/flMx-Cre轉基因小鼠以分析骨髓中CKIα缺失的效果。Mx-Cre不僅被引入BM也引入肝臟及脾臟。為了確保觀察到的表現(xiàn)型是特定對在BM中的CKIα缺失而不是在其他組織，GFP老鼠Ck1α1fl/flMx-Cre轉基因的所述骨髓被注入一致死IRWT老鼠內(nèi)。藉著這樣做，可確保在pIpC注射到受體小鼠，CKIα缺失僅作用在BM而不是在其他組織。長期(LT)植入由移植后2個月決定穩(wěn)定捐贈GFP陽性細胞于外周血被驗證。僅在確認成功植入后注射pIpC。CKIαKO誘發(fā)(以pIpC)情況中，所述小鼠發(fā)展一致死的全血細胞減少，由于HSC數(shù)量的降低，造成20天的平均存活(圖1C)。然而，如果pIpC處理，BMCKIα刪除的小鼠在pIpC治療后第7天以WT骨髓移植，牠們被救回且顯出高水平的嵌合現(xiàn)象(chimerism)(圖1D至1F)。此維持超過3個月且包括髓細胞及淋巴世系(未顯示)，代表一長期骨髓重建。所述控制組小鼠不受pIpC誘導注射的影響，且對植入不顯出超過1％的嵌合現(xiàn)象(未示數(shù)據(jù))。實施例2刪除CKIα的骨髓預防Bcr-Abl驅使白血病發(fā)生取自帶有Mx-Cre或不帶Mx-Cre的CKIα的floxed等位基因(floxedalleles)的小鼠的骨髓被帶有逆轉錄病毒的Bcr-Abl感染，并注入到亞致死量輻射WT受體小鼠(圖2)。接著，從生病的小鼠取出BM，并接枝到一WT小鼠。此一流程重復數(shù)次直到慢性白血病轉為一激進的急性母細胞危象疾病，具有多重胚細胞(blastcell)在BM及外周血中，且在2-3周間死亡。當在第一代中，所述小鼠約5周后死亡，在下一代中，所述小鼠移植后僅存活2周，因為他們患了更加激進的疾病。再者，幾次重復移植之后，不再需要輻照所述白血病受體小鼠，證明了所述白血病的激進本質。為了測試CKIα消融于CML發(fā)展中的的效果，白血病BM植入受體小鼠之后24小時，pIpC被注入。在此實驗中，使用兩個不同的控制組：在第一控制組，所述小鼠以帶有Mx-Cre的白血病細胞注入，且所述小鼠以PBS注射；以及在第二控制組中，所述小鼠以缺少所述Mx-Cre的白血病細胞注射，但接受pIpC注射(圖3A至3D)。疾病進展在計數(shù)所述受體小鼠的外周血中的GFP+之后(圖3B)。在所述控制小鼠中，代表一激進疾病的所述GFP+細胞呈指數(shù)增加，而在CKIαKO組，所述白血病細胞幾乎檢測不到(圖3B)。控制與CKIα刪除的組別之間的差異在血涂片中也是明顯的。在所述控制組，多重胚細胞是明顯的，就如在CML母細胞危象期中，而在CKIαKO組，所述外周血the外周血涂片看起來正常無胚細胞存在(圖3C)。所述小鼠也接著存活。兩組控制組小鼠在骨髓移植后約3周死亡，而CKIαKO組的絕大多數(shù)的小鼠都存活(圖3D)。BMT候選的CML病患以高劑量的化療或IR治療，為了優(yōu)先在BMT之前消減白血病干細胞(LSC)。在這些方法中，正常造血干細胞(HSCs)也會被消減。為了評估CKI缺失能否取代化療或輻照誘導髓細胞消融以及白血病細胞清除，白血病細胞被注入以Mx-Cre基因敲除的CKIαfloxed小鼠。在此模型中，pIpC注射在白血病及正常HSCs的受體小鼠兩者都誘發(fā)CKIαKO。KO誘發(fā)后七天，WT小鼠的BM被植入所述白血病小鼠無輻照(圖4A)。為了區(qū)別捐贈及受體小鼠，使用具有兩個不同亞型的CD45的小鼠。如圖4B所是，在控制組的CKIαKO并沒有被誘發(fā)，沒有捐贈者衍生細胞在外周血(PB)的證據(jù)，而在KO組則有大于25％的細胞為12天后捐贈者衍生。疾病進展的分析顯示，有非常高百分比的白血病細胞存在控制組小鼠中，而在CKIαKO組，偵測不到所述白血病細胞(圖4B)，正如存活率數(shù)據(jù)所反映出來的(圖4C)。實施例3CKI抑制劑PF670462在白血病細胞的效果接著，發(fā)明人評估PF670462、CKI抑制劑在體外正常BM及白血病細胞的效果。PF670462被考慮為CKI-δ/ε特定的抑制劑(LongA,ZhaoH,HuangX.JMedChem.2012Jan26；55(2):956-60.doi:10.1021/jm201387s)，且因此不被認為可激活Wnt或p53途徑(PriceMA,GenesDev.Feb15；20(4):399-410)。當所述細胞在體外以所述抑制劑處理，一Wnt及p53的正調節(jié)以劑量依賴性的方式在骨髓細胞分析中被觀察到(圖5B)，其指出了CKIα抑制活性(Elyadaetal,Nature.2011Feb17；470(7334):409-13.doi:10.1038/nature09673)。特別注意的是，一個顯著的差異存在以所述抑制劑處理之后的細胞類型已被觀察到，而以濃度增加的抑制劑處理后，所述正常BM細胞數(shù)量僅略微降低，白血病細胞數(shù)量的下降是更為突出的(圖5C)?？赡芸梢酝茰y的是，所述抑制劑誘導所述白血病細胞中的細胞凋亡(apoptosis)。這通過7AAD-/Annexin+測試被確認，其驗證了在所述抑制劑處理下以一劑量依賴的方式凋亡細胞率的增加，同時所述WTBM細胞不顯著地被影響(圖5D)。如圖6A的方案所述的一體內(nèi)研究被實施。疾病轉移七個小時后，每日以PF670462(i.p.)處理小鼠。取自抑制劑處理的小鼠的骨髓細胞的Western印跡分析顯示β-連環(huán)蛋白和p53的穩(wěn)定性，以及Wnt目標基因c-Myc的誘導，再次證明PF670462對CKIα的抑制活性(圖6B)。抑制劑處理的小鼠的疾病進展在計數(shù)在所述白血病起始細胞(LIC)(即癌癥干細胞)受體小鼠的外周血中的GFP+之后。在以賦形劑處理的小鼠組別中，所述GFP+細胞呈指數(shù)上漲，代表一惡化的疾病，而在以CKI抑制劑處理的小鼠組別中，所述白血病細胞幾乎檢測不到(圖6C)。在賦形劑處理的小鼠中，所述骨髓被摧毀脊椎動物的白血病細胞入侵，抑制劑處理的小鼠則具有脊椎動物外觀完好的正常骨髓(圖6D)。不像賦形劑處理的小鼠，抑制劑處理的小鼠在外周血沒有胚細胞被偵測到(圖6E)。當隨后小鼠存活，可見到當賦形劑處理的組別在12天內(nèi)死亡，所述CKI抑制劑處理的組別仍然存活(圖6F)。健康顯現(xiàn)的抑制劑處理小鼠在20天后被犧牲，他們的組織被檢驗是否有任何白血病跡象(例如，圖6D)，且他們的骨髓被移植到致死輻射劑量的小鼠以確定任何殘留的LICs是否在輻射宿主中存活與擴張，以及正常、長期再植入的造血干細胞(LT0HSCs)是否會被所述抑制劑影響。到目前為止，移植后一個月，所述受體小鼠的骨髓完整重建而沒有白血病GFP+細胞在外周血中的證據(jù)，代表完整的LT-HSCs具有LICs的完全消減。實施例4黑色素瘤小鼠中CKIα缺失的效果BRAF的突變激活是人類黑色素瘤中最早且最普遍的基因改變。BRAfv600E結合Pten腫瘤抑制基因靜默的表達誘發(fā)100％外顯率的黑色素瘤的發(fā)育，短潛伏期且在淋巴結、腹腔和肺中觀察到轉移。這些小鼠提供一個系統(tǒng)，用來研究具有長生命期的黑色素瘤起始細胞(MIC)存在，轉移的黑色素瘤的根本特點。所述小鼠黑色素瘤模型基于致癌基因BRAF及PTEN缺失(B6.Cg-Braftm1MmcmPtentm1HwuTg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ)，基于他莫昔芬-誘導激活的酪氨酸酶-Cre(Tyrosinase-Cre)(對黑色素細胞具有特定性)，此處所指，所述BRAF模型培育出CKIα-floxed小鼠，稱為BRAF-CKIKO小鼠模型。所述BRAF和所述BRAF-CKIKO模型兩者都以他莫昔芬的局部耳部應用來處理。他莫昔芬處理后56天，所述BRAF模型的小鼠發(fā)展轉移的黑色素瘤(圖7A)，局部及系統(tǒng)傳播，但所述BRAF-CKIKO模型顯示沒有黑色素瘤的跡象，僅有色素斑在耳朵上(圖7B)。在此實驗系統(tǒng)中，CKIα消融因此消減了MIC。BRAF黑色素瘤小鼠每日以60mg/Kg的PF-670462皮下注射處理，或以賦形劑(20％的2-羥丙基β-環(huán)糊精；Sigma公司)處理，黑色素瘤的他莫昔芬誘導后開始24小時或3周。小鼠于他莫昔芬誘導之后56天被犧牲以觀察所述抑制劑的效果。盡管本發(fā)明已經(jīng)結合具體實施方案進行了描述，但顯然的，許多替換、修改和變化對于本領域的技術人員將是清楚明白的。因此，本發(fā)明意在涵蓋落入所附權利要求的精神和范圍內(nèi)的所有替換、修改和變化。所有在此說明書中所述的公開刊物、專利以及專利申請案在此并入它們的全文于本說明書中，以供參照至每一個單一公開文件、專利或專利申請案所特定且單一指示于此并入?yún)⒄盏南嗤秶?。此外，任何參照資料的援引文獻或定義在此申請中不應被解釋為承認這個參照資料可作為本發(fā)明的已知技術。關于其章節(jié)標題被使用的情況下，不應被解釋為必要的限制。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3