患有癌癥的患者典型地表現(xiàn)出針對(duì)不同腫瘤抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。盡管存在這種針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，但是在許多情況下，患者的免疫應(yīng)答不足以阻斷腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)存活期。最初設(shè)計(jì)癌癥疫苗來(lái)增強(qiáng)患者的自身免疫應(yīng)答。迄今為止，此類癌癥疫苗的治療潛力尚未實(shí)現(xiàn)。因此，迫切需要用于增強(qiáng)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的效力的方法。

發(fā)明概述

如下文所述，本發(fā)明的特征在于用于通過(guò)給予OX40激動(dòng)劑和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑連同腫瘤抗原來(lái)增強(qiáng)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的效力的方法。腫瘤抗原可以存在于癌癥疫苗中或者可以例如通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而自受試者中存在的腫瘤釋放。腫瘤細(xì)胞的凋亡可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如放射療法、化學(xué)療法)來(lái)誘導(dǎo)。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于增強(qiáng)針對(duì)受試者中的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法涉及向該受試者給予OX40激動(dòng)劑(例如OX40抗體激動(dòng)劑)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑(例如1MT)、以及含有腫瘤抗原的免疫原性組合物(例如癌癥疫苗)，從而相對(duì)于單獨(dú)給予該免疫原性組合物增強(qiáng)該受試者的針對(duì)該腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于使受試者中的腫瘤生長(zhǎng)延遲或減少(例如至少約10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％或100％)的方法，該方法涉及向該受試者給予OX40激動(dòng)劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、以及含有腫瘤抗原的免疫原性組合物，從而相對(duì)于未治療的對(duì)照受試者延遲或減少該受試者中的腫瘤生長(zhǎng)。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于增強(qiáng)針對(duì)受試者中的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法涉及向該受試者給予足以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的放射療法或化學(xué)治療劑(例如蒽環(huán)類藥物(例如柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和戊柔比星)或奧沙利鉑)、OX40激動(dòng)劑、以及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，從而相對(duì)于單獨(dú)給予放射療法或蒽環(huán)類藥物增強(qiáng)該受試者的針對(duì)該腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于延遲或減少受試者中的腫瘤生長(zhǎng)的方法，該方法涉及向該受試者給予足以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的放射療法或化學(xué)治療劑(例如蒽環(huán)類藥物(例如柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和戊柔比星)或奧沙利鉑)、OX40激動(dòng)劑、以及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，從而相對(duì)于未治療的對(duì)照受試者延遲或減少該受試者中的腫瘤生長(zhǎng)。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于增加受試者中腫瘤內(nèi)的CD8⁺T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率的方法，該方法涉及向該受試者給予有效量的OX40激動(dòng)劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、以及含有腫瘤抗原的免疫原性組合物，從而增加腫瘤的CD8/Treg比率。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于增加受試者中腫瘤內(nèi)的CD8⁺T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率的方法，該方法涉及向該受試者給予足以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的放射療法或化學(xué)治療劑(例如蒽環(huán)類藥物(例如柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和戊柔比星)或奧沙利鉑)、有效量的OX40激動(dòng)劑、以及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，從而增加腫瘤的CD8/Treg比率。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于增強(qiáng)針對(duì)受試者中的HPV腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法涉及向該受試者給予與mAb 9B12結(jié)合相同OX40表位的激動(dòng)劑OX40抗體、1-MT、以及含有HPV16抗原和佐劑的免疫原性組合物，從而相對(duì)于單獨(dú)給予該免疫原性組合物增強(qiáng)該受試者的針對(duì)該腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于治療受試者中的HPV相關(guān)癌癥的方法，該方法涉及向該受試者給予與mAb 9B12結(jié)合相同OX40表位的激動(dòng)劑OX40抗體、1-MT、以及含有HPV16抗原和佐劑的免疫原性組合物，從而治療該受試者中的HPV相關(guān)癌癥。

在以上方面或在此描繪的本發(fā)明的任何其他方面的不同實(shí)施例中，該方法使受試者腫瘤內(nèi)的CD8⁺T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比率增加(例如至少約5％、10％、20％、30％或更多)。在以上方面的其他實(shí)施例中，所給予的OX40激動(dòng)劑的量足以增加受試者腫瘤內(nèi)的CD8⁺T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率。在以上方面的仍然其他實(shí)施例中，所給予的OX40激動(dòng)劑的量是足夠低的，以便不會(huì)增加受試者中的腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞。在以上方面的仍然其他實(shí)施例中，相對(duì)于單獨(dú)給予免疫原性組合物，該給予使受試者的抗腫瘤免疫應(yīng)答增加(例如至少約10％、25％、50％、75％或100％)。在以上方面的其他實(shí)施例中，吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑是1-甲基色氨酸(1-MT)、1-甲基-色氨酸的D異構(gòu)體、或NLG919。在以上方面的其他實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑特異性地結(jié)合OX40。在以上方面的其他實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑是特異性地結(jié)合OX40的抗體或其抗原結(jié)合片段。在以上方面的其他實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段是單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在以上方面的其他實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段與mAb 9B12結(jié)合相同OX40表位。在以上方面的其他實(shí)施例中，腫瘤抗原是以下各項(xiàng)中的任何一種或多種：甲胎蛋白、癌胚抗原、cdk4、β-連環(huán)蛋白、CA125、半胱天冬酶-8、上皮腫瘤抗原、HPV抗原、HPV16抗原、來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-1、MAGE-3、酪氨酸酶、表面Ig個(gè)體基因型、Her-2/neu、MUC-1、前列腺特異性抗原(PSA)、唾液酸Tn(STn)、熱休克蛋白、gp96、神經(jīng)節(jié)苷脂分子GM2、GD2、GD3、癌胚抗原(CEA)、以及MART-1。在以上方面的其他實(shí)施例中，免疫原性組合物中存在的腫瘤抗原的量足以誘導(dǎo)受試者中的抗癌癥免疫應(yīng)答。在以上方面的其他實(shí)施例中，給予免疫原性組合物刺激受試者中的T淋巴細(xì)胞活性。在以上方面的其他實(shí)施例中，免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。在以上方面的其他實(shí)施例中，受試者患有選自下組的癌癥，該組由以下各項(xiàng)組成：HPV相關(guān)癌癥、宮頸癌、陰莖癌、肛門(mén)癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、以及外陰癌。在以上方面的其他實(shí)施例中，該方法使受試者存活期相對(duì)于僅接受免疫原性組合物給予的受試者增加至少10％、20％或30％或更多。在以上方面的其他實(shí)施例中，該方法使腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)于未治療的對(duì)照受試者中的腫瘤生長(zhǎng)減少至少約20％或者誘導(dǎo)腫瘤消退。在以上方面的其他實(shí)施例中，受試者是人患者。在以上方面的其他實(shí)施例中，免疫原性組合物是癌癥疫苗。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在詳細(xì)說(shuō)明以及在權(quán)利要求書(shū)中呈現(xiàn)。

定義

除非另有定義，在此所使用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義：辛格爾頓(Singleton)等人，微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；劍橋科技詞典(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)(沃克(Walker)編著，1988)；遺傳學(xué)詞匯(The Glossary of Genetics)，第5版，R.雷格(R.Rieger)等人(編著)，施普林格維拉格(Springer Verlag)(1991)；以及黑爾和馬漢姆(Hale&Marham)，哈拍科林斯生物學(xué)詞典(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。除非另外指明，否則如在此所使用的以下術(shù)語(yǔ)具有以下賦予它們的含意。

“OX40”意指受體TNFR超家族中的表達(dá)于抗原激活的哺乳動(dòng)物CD4⁺和CD8⁺T淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的表面上的成員。參見(jiàn)，例如，帕特森，D.J.(Paterson D.J.)等人，分子免疫學(xué)(Mol Immunol)24，1281-1290(1987)；馬利特，S.(Mallett,S.)等人，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(EMBO J.)9，1063-1068(1990)；以及考爾德黑德，D.M.(Calderhead,D.M.)等人，免疫學(xué)雜志(J Immunol)151，5261-5271(1993)。術(shù)語(yǔ)“OX40”和“OX40受體”在此可互換使用。OX40也被稱為CD134、TNFRSF4、ACT-4和ACT35。OX40受體序列是本領(lǐng)域中已知的并且例如以Genbank登錄號(hào)：AAB33944或CAE11757提供。

以下提供示例性人OX40序列：

“OX40配體”意指與OX40受體特異性地相互作用的蛋白質(zhì)。參見(jiàn)，例如，鮑姆P.R.(Baum P.R.)等人歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志13:3992-4001(1994)。OX40配體還被稱為CD252、CD143L、gp34和TNFSF4。術(shù)語(yǔ)OX40L包括整個(gè)OX40配體、可溶性O(shè)X40配體、以及包含OX40配體的共價(jià)連接至第二部分例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能活性部分的融合蛋白。還包括在OX40L的定義之內(nèi)的是與天然存在的OX40L在氨基酸序列上不同但保留特異性地結(jié)合OX40受體的能力的變體。還包括在OX40L的定義之內(nèi)的是增強(qiáng)OX40的生物活性的變體。

“Ox40激動(dòng)劑”意指與OX40受體特異性地相互作用并且增加或增強(qiáng)OX40受體的生物活性的分子。令人希望的是，生物活性增加至少約10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在某些方面中，如在此披露的OX40激動(dòng)劑包括OX40結(jié)合多肽，諸如抗OX40抗體(例如OX40激動(dòng)劑抗體)、OX40配體、或這些分子的片段或衍生物。

“OX40抗體”意指特異性地結(jié)合OX40的抗體。OX40抗體包括對(duì)OX40具有特異性的單克隆抗體和多克隆抗體以及其抗原結(jié)合片段。在某些方面中，如在此所述的抗OX40抗體是單克隆抗體(或其抗原結(jié)合片段)，例如鼠類、人源化或全人單克隆抗體。在一個(gè)具體實(shí)施例中，OX40抗體是OX40受體激動(dòng)劑，諸如由溫伯格，A.D.(Weinberg,A.D.)等人，免疫學(xué)治療雜志(J Immunother)29，575-585(2006)所述的小鼠抗人OX40單克隆抗體(9B12)。在其他實(shí)施例中，特異性地結(jié)合OX40的抗體或其抗原結(jié)合片段與mAb 9B12結(jié)合相同OX40表位。

術(shù)語(yǔ)“抗體”意指識(shí)別且特異性地結(jié)合靶標(biāo)的免疫球蛋白分子。如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段)、單鏈Fv(sc Fv)突變體，從至少兩個(gè)完整抗體產(chǎn)生的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白、以及包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他修飾的免疫球蛋白分子的，只要這些抗體展現(xiàn)所希望的生物活性。抗體可以是以下五種主要類別的免疫球蛋白中的任一種：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM、或其亞類(同種型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)，基于它們的重鏈恒定區(qū)的特性分別被稱為α、δ、ε、γ、以及μ。不同類別的免疫球蛋白具有不同的且眾所周知的亞基結(jié)構(gòu)以及三維構(gòu)型。

“改善”意指減少、阻遏、減弱、減輕、阻止或穩(wěn)定疾病的發(fā)展或進(jìn)展。

“抗原結(jié)合片段”意指完整抗體的結(jié)合抗原的部分。具體地，術(shù)語(yǔ)抗原結(jié)合片段是指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)執(zhí)行?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體、以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

“癌癥”意指特征在于過(guò)度增殖或細(xì)胞凋亡減少的疾病或病癥。本發(fā)明可以用于的示例性癌癥包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性粒單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、沃爾丹斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病、和實(shí)體瘤諸如肉瘤和癌(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms’tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、以及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)。

“嵌合抗體”意指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)物種的抗體。典型地，輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于來(lái)源于一個(gè)哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠、大鼠、兔子等)的具有所希望特異性、親和性和功能性能力的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與來(lái)源于另一個(gè)哺乳類物種(通常為人)的抗體中的序列同源以便避免在那些物種中引起免疫應(yīng)答。

在本披露中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”和“具有(having)”等可以具有美國(guó)專利法賦予它們的意義并且可以意味著“包括(includes、including)”等；“基本上由…組成(consisting essentially of或consists essentially)”同樣具有美國(guó)專利法賦予的意義并且該術(shù)語(yǔ)是開(kāi)放性的，允許超出所敘述的存在，只要所敘述的基本或新特征不被超過(guò)敘述的存在改變，但是排除現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施例。

“檢測(cè)”是指鑒定待檢測(cè)的分析物的存在、不存在或數(shù)量。

“有效量”意指相對(duì)于未治療的患者，改善疾病的癥狀所需的在此所述的藥劑(例如OX40激動(dòng)劑)的量。這種藥劑的用于針對(duì)治療性治療疾病而實(shí)施本發(fā)明的有效量根據(jù)給藥方式、受試者的年齡、體重和一般健康狀況而變化。最終，主治醫(yī)生或獸醫(yī)將決定適當(dāng)?shù)牧亢徒o藥方案。這種量被稱為“有效”量。

“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。此部分優(yōu)選含有參考核酸分子或多肽的全長(zhǎng)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)核苷酸或氨基酸。

“人源化抗體”意指來(lái)源于非人免疫球蛋白的已被工程化為含有人序列的抗體。典型地，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中來(lái)自互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)自非人物種(例如，小鼠、大鼠、兔子或倉(cāng)鼠)的CDR的具有所希望特異性、親和性和能力的殘基替代(瓊斯(Jone)等人，1986，自然(Nature)，321:522-525；里希曼(Riechmann)等人，1988，自然，332:323-327；費(fèi)爾海恩(Verhoeyen)等人，1988，科學(xué)(Science)，239:1534-1536)。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FW)殘基被來(lái)自非人物種的具有所希望特異性、親和性和能力的抗體中的相應(yīng)殘基替代。

人源化抗體可以通過(guò)取代Fv構(gòu)架區(qū)中和/或替代的非人殘基內(nèi)的額外殘基來(lái)進(jìn)一步修飾以便改善并優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。通常，人源化抗體將基本上都包括至少一個(gè)、并且典型地兩個(gè)或三個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，這些可變結(jié)構(gòu)域含有的所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白，而所有或基本上所有的FW區(qū)是具有人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分，典型地是一種人免疫球蛋白的至少一部分。在美國(guó)專利號(hào)5,225,539或5,639,641中描述用于產(chǎn)生人源化抗體的方法的實(shí)例。

如在此所使用的“人”或“完全人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并且包括從人免疫球蛋白文庫(kù)分離的抗體或來(lái)自針對(duì)一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因并且不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的動(dòng)物的抗體，如下文和例如庫(kù)徹拉帕提(Kucherlapati)等人的美國(guó)專利號(hào)5,939,598中所描述?！叭恕被颉巴耆恕笨贵w還包括包含至少重鏈的可變結(jié)果域和至少重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

“人”或“完全人”抗體還包括包含變體(包括衍生物)的抗體、基本上由或由這些變體組成的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)將突變引入編碼人抗體的核苷酸序列中，這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于導(dǎo)致氨基酸取代的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，相對(duì)于參考VH區(qū)、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL區(qū)、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，這些變體(包括衍生物)編碼少于50個(gè)氨基酸取代、少于40個(gè)氨基酸取代、少于30個(gè)氨基酸取代、少于25個(gè)氨基酸取代、少于20個(gè)氨基酸取代、少于15個(gè)氨基酸取代、少于10個(gè)氨基酸取代、少于5個(gè)氨基酸取代、少于4個(gè)氨基酸取代、少于3個(gè)氨基酸取代、或少于2個(gè)氨基酸取代。

“免疫原性組合物”意指包含當(dāng)給予至受試者時(shí)能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原的組合物?？乖?包括腫瘤抗原)典型地提供于藥學(xué)上可接受的賦形劑中。如果需要，免疫原性組合物包含佐劑。在具體的實(shí)施例中，通過(guò)以下方式來(lái)提供腫瘤抗原：原位誘導(dǎo)腫瘤的細(xì)胞凋亡，從而釋放能夠誘導(dǎo)針對(duì)該腫瘤的免疫應(yīng)答的腫瘤抗原。

“單克隆抗體”意指參與高度特異性識(shí)別并且結(jié)合單個(gè)抗原決定簇或表位的均質(zhì)性抗體。這與典型地包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的多克隆抗體相反。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”包括完整和全長(zhǎng)單克隆抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白，以及包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他修飾的免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指以任何數(shù)量的方式制成的此類抗體，這些方式包括但不限于，通過(guò)雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

“增強(qiáng)”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的積極改變。

“參考(reference)”意指標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ諣顩r。

“特異地結(jié)合”意指化合物或抗體，其識(shí)別并且結(jié)合本發(fā)明的多肽，但是基本上不識(shí)別和結(jié)合在樣品(例如，生物樣品，其天然地包括本發(fā)明的多肽)中的其他分子。

“受試者”意指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人或非人哺乳動(dòng)物，諸如牛、馬、犬、羊或貓。

抗體的“可變區(qū)”是指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，單獨(dú)地抑或進(jìn)行組合。重鏈和輕鏈的這些可變區(qū)各自由通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(又稱為超變區(qū))連接的四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FW)組成。每個(gè)鏈中的CDR由FW區(qū)緊密靠近地保持在一起，與來(lái)自另一個(gè)鏈的CDR促成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。有至少兩種技術(shù)用于確定CDR：(1)一種基于跨物種序列變異性的方法(即，卡巴特(Kabat)等人，具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，(第5版，1991，馬里蘭州貝塞斯達(dá)的美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes ofHealth,Bethesda Md.)))；和(2)一種基于抗原抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(an approach based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes)(Al-拉茲卡尼(Al-lazikani)等人(1997)分子生物學(xué)雜志(J.Molec.Biol.)273:927-948))。此外，這兩種方法的組合有時(shí)在本領(lǐng)域中用于確定CDR。

在此提供的范圍被理解成對(duì)范圍內(nèi)的所有值的簡(jiǎn)寫(xiě)。例如，一個(gè)1到50的范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括來(lái)自下組的任何數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍，該組由以下各項(xiàng)組成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat、treating、treatment等)”是指減少或改善病癥和/或與其相關(guān)的癥狀。將被理解的是，盡管不能排除，但是治療病癥或病狀并不要求完全地消除該病癥、病狀或與其相關(guān)的癥狀。

如果受試者顯示出以下各項(xiàng)中的一種或多種，則受試者被成功地“治療”：癌細(xì)胞的數(shù)目減少或完全不存在；腫瘤尺寸的減小；腫瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)定化、阻滯或逆轉(zhuǎn)，腫瘤生長(zhǎng)的抑制包括例如轉(zhuǎn)移(例如癌細(xì)胞浸潤(rùn)到外周器官中，包括例如癌癥向軟組織和骨中的擴(kuò)散；抑制)的阻遏、阻止、阻滯、收縮或逆轉(zhuǎn)；與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的減輕；降低的發(fā)病率和死亡率；生命質(zhì)量的改善；或這些作用的一些組合。

有益或所希望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀緩解、疾病程度減輕、疾病狀態(tài)穩(wěn)定化(即未惡化)、疾病進(jìn)展延遲或減緩、疾病狀態(tài)改善或緩和、以及減輕(無(wú)論是部分減輕還是全部減輕)，無(wú)論是可檢測(cè)的還是不可檢測(cè)的?！爸委煛边€可以意指與不存在治療情況下的預(yù)期存活期相比，或與接受標(biāo)準(zhǔn)治療的受試者相比，延長(zhǎng)存活期。需要治療的那些包括已患有病狀或病癥的那些以及易于患上病狀或病癥的那些或打算預(yù)防病狀或病癥的那些。

術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞”和“T淋巴細(xì)胞”可以互換使用來(lái)指在細(xì)胞表面上攜帶T細(xì)胞受體復(fù)合物的淋巴細(xì)胞群體。雖然T淋巴細(xì)胞典型地在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起作用，但是它們可以分為多種亞群，該分類不僅基于其具體功能，而且還基于可以充當(dāng)特定T淋巴細(xì)胞亞群的“標(biāo)記物”的某些表面抗原和細(xì)胞內(nèi)抗原的差異表達(dá)。一般來(lái)說(shuō)，輔助T細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD4并且細(xì)胞毒性T細(xì)胞表達(dá)CD8。這些群組內(nèi)的亞群以及這些群組之間的重疊可以通過(guò)其他細(xì)胞表面標(biāo)記物來(lái)鑒定，這些其他細(xì)胞表面標(biāo)記物包括但不限于CD95、CD25、FoxP3、CD28、CCR7、CD127、CD38、HLA-DR、以及Ki-67。T淋巴細(xì)胞的亞群可以通過(guò)使用標(biāo)記的抗體，例如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)來(lái)鑒定和/或從血細(xì)胞的混合群體中分離出，在下文的實(shí)例中更詳細(xì)描述。例如，輔助T細(xì)胞可以被鑒定為表達(dá)CD3和CD4，而不是FoxP3。T淋巴細(xì)胞的其他重疊和非重疊亞群包括記憶T細(xì)胞、未成熟T細(xì)胞、成熟T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、激活的T細(xì)胞、以及自然殺傷(NKT)細(xì)胞。

除非明確聲明或從上下文顯而易見(jiàn)，如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“或”被理解為包括在內(nèi)。除非明確聲明或從上下文顯而易見(jiàn)，如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“一種”、“一個(gè)”和“該(the)”被理解為單數(shù)的或復(fù)數(shù)的。

除非確切規(guī)定或從上下文顯而易見(jiàn)，否則如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“約(about)”被理解為在本領(lǐng)域的正常公差范圍內(nèi)，例如，在平均數(shù)的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。約可以被理解為在聲明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之內(nèi)。除非從上下文顯而易見(jiàn)，在此提供的所有數(shù)值被該術(shù)語(yǔ)約修飾。

在在此的變量的任何定義中對(duì)化學(xué)基團(tuán)清單的敘述包括將該變量定義為任何單個(gè)基團(tuán)或所列基團(tuán)的組合。在此的變量或方面的實(shí)施例的敘述包括作為任何單個(gè)實(shí)施例或與任何其他實(shí)施例或其部分結(jié)合的實(shí)施例。

在此提供的任何組合物或方法可以與在此提供的一種或多種任何其他組合物和方法進(jìn)行組合。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A和1B示出給予癌癥疫苗與抗OX40激動(dòng)劑抗體的組合增加了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的存活期。圖1A描繪通過(guò)測(cè)量腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的存活期來(lái)研究癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和抗OX40的作用的設(shè)計(jì)。圖1B是示出下述的圖：與給予單獨(dú)癌癥疫苗或單獨(dú)抗OX40，或給予癌癥疫苗和較低(0.5mg/kg，左上圖)或較高(2.5mg/kg，下圖)劑量的抗OX40相比，給予癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體提高了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的存活期(右上圖)。在接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠中，在注射TC-1細(xì)胞之后達(dá)約62天時(shí)，約20％的小鼠是存活的。

圖2A和2B示出給予癌癥疫苗與抗OX40激動(dòng)劑抗體的組合抑制了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。圖2A描繪通過(guò)測(cè)量腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)來(lái)研究癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和抗OX40的作用的設(shè)計(jì)。圖2B是示出下述的圖：與給予單獨(dú)癌癥疫苗(下方，左圖)或單獨(dú)抗OX40(1mg/kg，中上圖；2.5mg/kg，右上圖)，或給予癌癥疫苗和較高(2.5mg/kg；右下圖)劑量的抗OX40相比，給予癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體抑制了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)(下方，中圖)。與其他研究組相比，在接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠中，小鼠顯示出腫瘤體積的減小和/或腫瘤生長(zhǎng)的延遲。

圖3A-圖3C示出給予癌癥疫苗與抗OX40激動(dòng)劑抗體的組合刺激了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的抗原特異性免疫應(yīng)答。圖3A描繪通過(guò)評(píng)價(jià)腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的抗原特異性免疫應(yīng)答和腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞分布來(lái)研究癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和抗OX40的作用的設(shè)計(jì)。圖3B是示出下述的圖：與接受單獨(dú)癌癥疫苗或單獨(dú)抗OX40的小鼠相比，接受癌癥疫苗和抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出腫瘤發(fā)生小鼠模型中的抗原(E7)特異性CD8T細(xì)胞的增加。與接受癌癥疫苗和抗OX40的其他組相比，接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出最高的E7-特異性CD8T細(xì)胞:總CD8T細(xì)胞比率。圖3C是示出下述的圖：與接受單獨(dú)癌癥疫苗或單獨(dú)抗OX40的小鼠相比，接受癌癥疫苗和抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出腫瘤發(fā)生小鼠模型中的抗原(E7)特異性CD8T細(xì)胞的增加。與接受癌癥疫苗和較低(0.5mg/kg)或較高(2.5mg/kg)劑量的抗OX40的其他組相比，接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出最高的E7-特異性CD8T細(xì)胞:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比率。

圖4A-圖4C示出給予癌癥疫苗與抗OX40激動(dòng)劑抗體的組合增加了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的腫瘤浸潤(rùn)。圖4A描繪通過(guò)評(píng)價(jià)腫瘤發(fā)生小鼠模型中的脾和腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞分布來(lái)研究基于抗OX40抗體的治療的作用的設(shè)計(jì)。圖4B是示出下述的圖：與未接受治療的小鼠相比，接受抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg；1.75mg/kg；2.5mg/kg)的小鼠在脾中顯示出非Treg CD4T細(xì)胞(CD4⁺FoxP3^-)的顯著增加。與未接受治療的小鼠相比，接受抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg；1.75mg/kg；2.5mg/kg)的小鼠在脾中具有類似水平的CD8⁺細(xì)胞(左上圖)和Treg細(xì)胞(CD4⁺Foxp3⁺；下圖)。圖4C是示出下述的圖：接受抗OX40的小鼠隨著抗OX40劑量的增加顯示出增加的腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞水平(下圖)。

圖5A-圖5D示出給予癌癥疫苗與抗OX40激動(dòng)劑抗體和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑的組合抑制了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)并且增加了存活期。圖5A描繪通過(guò)測(cè)量腫瘤發(fā)生小鼠模型中的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和存活期來(lái)研究癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)、抗OX40和1-甲基色氨酸(1-MT)的作用的設(shè)計(jì)。圖5B是示出下述的圖：與其他組小鼠，包括接受癌癥疫苗和抗OX40(f圖)或癌癥疫苗和1-MT(g圖)的小鼠相比，接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg)和1-MT的小鼠顯著抑制和/或延遲了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)(h圖)。在接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體和1-MT的小鼠中，在注射TC-1腫瘤細(xì)胞后約35天時(shí)，兩只小鼠顯示出腫瘤體積的完全減小。圖5C是示出下述的圖：與其他組小鼠，包括接受癌癥疫苗和抗OX40(藍(lán)色)或癌癥疫苗和1-MT(綠色)的小鼠相比，接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg)和1-MT的小鼠的存活期增加。與其他研究組相比，接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體和1-MT的小鼠顯示出腫瘤體積的減小和/或腫瘤生長(zhǎng)的延遲。在注射TC-1腫瘤細(xì)胞后達(dá)約55天時(shí)，在這些小鼠中觀察到達(dá)約80％的存活率。圖5D是示出腫瘤生長(zhǎng)的抑制與小鼠的存活期相關(guān)的圖。對(duì)研究中的個(gè)別小鼠的腫瘤體積和存活天數(shù)進(jìn)行繪圖。

發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明的特征在于適用于增強(qiáng)癌癥疫苗的效力的方法。

本發(fā)明是至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：使用激動(dòng)劑抗OX40抗體靶向免疫系統(tǒng)的效應(yīng)臂和使用IDO抑制劑靶向免疫系統(tǒng)的阻遏臂增強(qiáng)了癌癥疫苗的效力。OX40分子是在T細(xì)胞上表達(dá)的共刺激受體，當(dāng)用激動(dòng)劑抗體靶向時(shí)，該共刺激受體可以產(chǎn)生T細(xì)胞的增殖和T細(xì)胞效應(yīng)功能的增強(qiáng)。然而，效應(yīng)T細(xì)胞受吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑阻遏，該抑制劑由腫瘤分泌作為針對(duì)腫瘤破壞的保護(hù)性機(jī)制。如下文詳細(xì)報(bào)道的，使用抗OX40激動(dòng)劑抗體與癌癥疫苗的組合治療使得抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。1mg/kg抗OX40抗體的劑量刺激T細(xì)胞的效應(yīng)臂，最終使得腫瘤內(nèi)的CD8⁺/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比率顯著增加。此外，與未治療的具有腫瘤(TC-1)的小鼠相比，疫苗與抗OX40抗體治療的這種組合產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制和延長(zhǎng)的小鼠存活期。在20％的治療小鼠中觀察到完全的腫瘤消退。當(dāng)將疫苗和抗OX40抗體治療與1-MT、吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶(IDO)活性抑制劑相結(jié)合時(shí)，這種作用被顯著增強(qiáng)。已證明IDO由腫瘤環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、抑制性樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，并且已知IDO是負(fù)責(zé)阻遏效應(yīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的。這些數(shù)據(jù)證明疫苗和抗OX40抗體與1-甲基色氨酸(1-MT，IDO抑制劑)的組合產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)的更顯著抑制和60％小鼠中形成的腫瘤完全消退?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明使用抗OX40抗體對(duì)免疫效應(yīng)臂和使用1-MT對(duì)免疫阻遏臂的同時(shí)靶向具有使得腫瘤根除的協(xié)同效應(yīng)，并且是可以增強(qiáng)患者的癌癥治療的總體效力的有前景的策略。

OX40

OX40是TNF受體家族成員，其主要表達(dá)于激活的CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上。OX40激動(dòng)劑具有針對(duì)多種腫瘤類型的有效抗腫瘤活性，這取決于CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞(卡吉爾加德，J.(Kjaergaard,J.)等人，癌癥研究(Cancer Res)60，5514-5521(2000)；溫伯格，A.D.等人，免疫學(xué)雜志164，2160-2169(2000)；高夫，M.J.(Gough,M.J.)等人，癌癥研究68，5206-5215(2008)；皮肯尼斯，S.(Piconese,S.)、瓦爾西娜，B.(Valzasina,B.)和科倫坡，M.P.(Colombo,M.P.)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med)205，825-839(2008))。在非人模型系統(tǒng)中，OX40激動(dòng)劑增強(qiáng)T細(xì)胞增殖、效應(yīng)子細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞毒性，并且減少激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡且增加記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生(格馬利亞，I.(Gramaglia,I.)等人，免疫學(xué)雜志165，3043-3050.(2000)；麥克斯韋，J.R.(Maxwell,J.R.)等人，免疫學(xué)雜志164，107-112(2000)；李，S.W.(Lee,S.W.)等人，免疫學(xué)雜志177，4464-4472(2006)；魯比，C.E.(Ruby,C.E.)和溫伯格，A.D.癌癥免疫學(xué)免疫治療(Cancer Immunol Immunother)58，1941-1947(2009))。

OX40激動(dòng)劑

在通過(guò)抗原引發(fā)過(guò)程中或在該引發(fā)后不久，OX40激動(dòng)劑與CD4⁺T細(xì)胞上的OX40受體相互作用，從而產(chǎn)生CD4⁺T細(xì)胞對(duì)該抗原的應(yīng)答增加。與對(duì)單獨(dú)抗原的應(yīng)答相比，OX40激動(dòng)劑與抗原特異性CD4⁺T細(xì)胞上的OX40受體相互作用可以增加T細(xì)胞增殖。與不存在OX40激動(dòng)劑的情況相比，對(duì)抗原的升高的應(yīng)答可以維持實(shí)質(zhì)上更長(zhǎng)的時(shí)間段。因此，經(jīng)由OX40激動(dòng)劑刺激通過(guò)加強(qiáng)抗原例如腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞識(shí)別來(lái)增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。OX40激動(dòng)劑例如在美國(guó)專利號(hào)6,312,700、7.504,101、7,622,444和7,959,925中有所描述，這些專利通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。在癌癥治療中使用此類激動(dòng)劑的方法例如在WO/2013/119202中和WO/2013/130102中有所描述，這些專利各自通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。

OX40激動(dòng)劑包括但不限于OX40結(jié)合分子，例如結(jié)合多肽，例如OX40配體(“OX40L”)或OX40結(jié)合片段、變體或其衍生物(諸如可溶性細(xì)胞外配體結(jié)構(gòu)域和OX40L融合蛋白)，以及抗OX40抗體(例如，單克隆抗體諸如人源化單克隆抗體)或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物?？筄X40單克隆抗體的實(shí)例例如在WO 95/12673和WO/95/21915中有所描述，這些專利的披露內(nèi)容通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。在某些實(shí)施例中，抗OX40單克隆抗體是9B12或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，如溫伯格，A.D.等人，免疫學(xué)治療雜志29，575-585(2006)中所描述，該文獻(xiàn)通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容體結(jié)合在此。

9B12是鼠類IgG1，針對(duì)人OX40(CD134)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗OX40mAb(溫伯格，A.D.等人，免疫學(xué)治療雜志29，575-585(2006))。由于9B12引發(fā)針對(duì)OX40信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑應(yīng)答的能力、穩(wěn)定性以及其通過(guò)雜交瘤的高水平產(chǎn)生，所以從一系列抗OX40單克隆抗體中選擇9B12。對(duì)于在臨床應(yīng)用中使用，將9B12mAb用磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.0)平衡，并且通過(guò)滲濾將其濃度調(diào)節(jié)至5.0mg/ml。

OX40激動(dòng)劑包括融合蛋白，在該融合蛋白中，OX40L的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域被共價(jià)地連接至一個(gè)或多個(gè)另外的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?？捎米鱋X40激動(dòng)劑的示例性O(shè)X40L融合蛋白在美國(guó)專利號(hào)6,312,700中有所描述，該專利的披露內(nèi)容通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。在一個(gè)實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑包括自組裝成多聚體(例如，三聚體或六聚體)OX40L融合蛋白的OX40L融合多肽。此類融合蛋白例如在美國(guó)專利號(hào)7,959,925中有所描述，該專利通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。多聚體OX40L融合蛋白在增強(qiáng)受試者(尤其是人受試者)中的抗原特異性免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)出增加的效力，這歸因于其自發(fā)地組裝成高度穩(wěn)定的三聚體和六聚體的能力。

在另一個(gè)實(shí)施例中，能夠組裝成多聚體形式的OX40激動(dòng)劑包括在N末端至C末端方向上包含以下各項(xiàng)的融合多肽：免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其中該免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括Fc結(jié)構(gòu)域、三聚結(jié)構(gòu)域，其中該三聚結(jié)構(gòu)域包括卷曲螺旋三聚結(jié)構(gòu)域；以及受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中該受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是OX40受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如OX40L或其OX40結(jié)合片段、變體或衍生物，其中該融合多肽可以自組裝成三聚體融合蛋白。在一個(gè)方面中，能夠組裝成多聚體形式的OX40激動(dòng)劑能夠結(jié)合OX40受體并且刺激至少一種OX40介導(dǎo)的活性。在某些方面中，OX40激動(dòng)劑包含OX40配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。

能夠組裝成多聚體形式的OX40激動(dòng)劑的三聚結(jié)構(gòu)域用于促進(jìn)單個(gè)OX40L融合多肽分子自組裝成三聚體蛋白質(zhì)。因此，具有三聚結(jié)構(gòu)域的OX40L融合多肽自組裝成三聚體OX40L融合蛋白。在一個(gè)方面中，三聚結(jié)構(gòu)域是異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(zipper domain)或其他卷曲螺旋多肽結(jié)構(gòu)。示例性卷曲螺旋三聚結(jié)構(gòu)域包括：TRAF2(登錄號(hào)Q12933，氨基酸299-348)；血小板反應(yīng)蛋白1(登錄號(hào)PO7996，氨基酸291-314)；母系蛋白-4(登錄號(hào)O95460，氨基酸594-618)；CMP(母系蛋白-1)(登錄號(hào)NP—002370，氨基酸463-496)；HSF1(登錄號(hào)AAX42211，氨基酸165-191)；以及Cubilin(登錄號(hào)NP—001072，氨基酸104-138)。在某些特異性方面中，三聚結(jié)構(gòu)域包括TRAF2三聚結(jié)構(gòu)域、母系蛋白-4三聚結(jié)構(gòu)域或其組合。

在具體的實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑被修飾以增加其血清半衰期。例如，OX40激動(dòng)劑的血清半衰期可以通過(guò)與異源分子諸如血清白蛋白、抗體Fc區(qū)或PEG軛合而增加。此外，在某些實(shí)施例中，可以對(duì)抗體或功能部分進(jìn)行突變(諸如缺失、添加或取代突變)以改進(jìn)其半衰期。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將Fc區(qū)域突變?yōu)榘ㄒ韵氯〈鶰252Y、S254T以及T256E中的一種、兩種或所有三種，其中編號(hào)對(duì)應(yīng)于卡巴特的EU索引。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將Fc區(qū)域突變?yōu)榘ㄋ幸韵氯〈鶰252Y、S254T以及T256E，其中編號(hào)對(duì)應(yīng)于卡巴特的EU索引。戴爾’阿夸(Dall’Acqua)等人，針對(duì)提高的對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合工程化的人IgG1的特性(Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor(FcRn))，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)281(33):23514-23524(2006)。具有所有三種取代的實(shí)施例被表示為YTE變體。換言之，在一個(gè)實(shí)施例中，該抗體或功能部分具有在位置252Y具有Y、在位置254T具有T并且在位置256具有E的Fc區(qū)域，其中編號(hào)對(duì)應(yīng)于卡巴特的EU索引。

在某些實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑可以與其他治療劑或毒素軛合以形成免疫軛合物和/或融合蛋白。

在某些方面中，OX40激動(dòng)劑可以進(jìn)行配制以便有助于給予且促進(jìn)活性劑的穩(wěn)定性。在某些方面中，根據(jù)本披露的藥用組合物包含藥學(xué)上可接受的、無(wú)毒性的、無(wú)菌的載體，諸如生理鹽水、無(wú)毒性的緩沖劑、防腐劑等。用于在此披露的治療方法中使用的合適配制品在例如雷明登氏藥學(xué)全書(shū)(Remington's Pharmaceutical Sciences)(Mack出版公司(Mack Publishing Co.))，第16版(1980)中有所描述。

令人希望的是，給予OX40激動(dòng)劑使得對(duì)多種癌細(xì)胞上的抗原的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)，因?yàn)楫?dāng)與T淋巴細(xì)胞的抗原刺激一致地作用時(shí)，OX40的激活本身不是抗原特異性或細(xì)胞特異性的。因此，給予OX40激動(dòng)劑可以用于增強(qiáng)針對(duì)幾乎任何腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。

有待給予的OX40激動(dòng)劑的有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)熟知的方法來(lái)確定。

對(duì)給予OX40激動(dòng)劑的臨床應(yīng)答可以使用臨床醫(yī)生已知的診斷技術(shù)來(lái)評(píng)估，這些診斷技術(shù)包括但不限于磁共振成像(MRI)掃描、x-射線照相成像、計(jì)算機(jī)斷層照相(CT)掃描、流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活的細(xì)胞分選器(FACS)分析、組織學(xué)、宏觀病理學(xué)、以及血液化學(xué)，包括但不限于可通過(guò)ELISA、RIA和色譜法檢測(cè)到的變化。此外，正經(jīng)受使用OX40激動(dòng)劑的治療的受試者可以經(jīng)歷與疾病相關(guān)的癥狀的改善的有益作用。

給予OX40激動(dòng)劑可以經(jīng)由任何可用的途徑，如由配制品的性質(zhì)和患者的需要所決定。在某些實(shí)施例中，OX40激動(dòng)劑是通過(guò)靜脈內(nèi)輸注給予的。

考慮到使用OX40激動(dòng)劑的免疫刺激不是抗原特異性的，可以通過(guò)在此提供的方法治療多種癌癥，例如在某些方面中，癌癥是實(shí)體瘤或其轉(zhuǎn)移。癌癥的類型包括但不限于黑色素瘤、胃腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、肺癌或其任何組合。轉(zhuǎn)移部位是非限制性的并且可以包括例如淋巴結(jié)、肺、肝、骨中的轉(zhuǎn)移，或其任何組合。

除癌癥疫苗、OX40激動(dòng)劑和IDO抑制劑的給予之外，在此提供的癌癥治療方法還包括常規(guī)的或非常規(guī)的癌癥治療。作為非限制性實(shí)例，癌癥疫苗、OX40激動(dòng)劑和IDO抑制劑的給予可以與外科手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、免疫療法、靶向抗癌療法、激素療法或其任何組合相結(jié)合。

使用OX40激動(dòng)劑的有效治療包括例如降低癌癥的進(jìn)展速率，阻滯或穩(wěn)定化原發(fā)性腫瘤部位處或一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移中的腫瘤或轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)、腫瘤收縮、和/或腫瘤消退。

如在此下文所報(bào)道的，給予OX40激動(dòng)劑和IDO抑制劑出人意料地增強(qiáng)了包含腫瘤抗原的免疫原性組合物的效力。

吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制劑

色氨酸(Trp)是蛋白質(zhì)、煙酸和神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(血清素)的生物合成所需的必需氨基酸。酶吲哚胺2,3-雙加氧酶(也稱為INDO或IDO)在L-色氨酸降解為N-甲酰基-犬尿氨酸中催化第一和限速步驟。在人細(xì)胞中，IFN-y刺激誘導(dǎo)IDO的激活，這導(dǎo)致Trp的消耗，從而遏制Trp依賴性的細(xì)胞內(nèi)病原體諸如鼠弓形體和沙眼衣原體的生長(zhǎng)。IDO活性還對(duì)許多腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用，并且已在同種異體腫瘤的排斥過(guò)程中體內(nèi)觀察到IDO誘導(dǎo)，從而表明這種酶在腫瘤排斥過(guò)程中的可能作用。

已觀察到與外周血淋巴細(xì)胞(PBL)共同培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞通過(guò)上調(diào)IDO活性獲得免疫抑制性表型。據(jù)信在用白介素-2(IL-2)治療后PBL增殖的減少是由腫瘤細(xì)胞響應(yīng)于PBL的IFN-y分泌而釋放的IDO引起的。這種作用通過(guò)用特異性IDO抑制劑1-甲基-色氨酸(1-MT)治療逆轉(zhuǎn)。提出腫瘤細(xì)胞中的IDO活性可以用于損害抗腫瘤應(yīng)答(洛根(Logan)等人，2002，免疫學(xué)(Immunology)，105:478-87)。

適用于本發(fā)明的方法中的IDO的小分子抑制劑例如在PCT公開(kāi)WO99/29310中有所描述，該專利報(bào)道了用于使用IDO的抑制劑諸如1-甲基-DL-色氨酸、p-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-[3-苯并(b)噻吩基]-DL-丙氨酸以及6-硝基-L-色氨酸)改變T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的方法，包括改變色氨酸和色氨酸代謝物的局部細(xì)胞外濃度(芒恩(Munn)，1999)。具有吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制性活性的化合物進(jìn)一步在WO 2004/094409中報(bào)道；并且美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0234623涉及通過(guò)給予吲哚胺-2,3-雙加氧酶與其他治療形式的組合來(lái)治療患有癌癥或感染的受試者的方法。IDO抑制劑(包括Indoximod，1-甲基-色氨酸的D異構(gòu)體；和NLG919)是本領(lǐng)域已知的并且可例如從紐琳基因公司(NewLink Genetics)(愛(ài)荷華州艾姆斯(Ames,IA))商購(gòu)。其他IDO抑制劑例如在美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)20130289083中有所描述，該專利通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。

產(chǎn)生抗癌癥免疫應(yīng)答

癌癥疫苗可潛在地用作用于治療特定類型的癌癥的治療劑。有利地，通過(guò)產(chǎn)生靶向表達(dá)于受試者中的腫瘤上的特異性腫瘤抗原的免疫原性組合物，這些疫苗可以被定制成用于治療特定個(gè)體的癌癥。癌癥疫苗典型地含有刺激患者的免疫系統(tǒng)的滅活的腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原。免疫系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生靶向癌癥的免疫應(yīng)答細(xì)胞來(lái)對(duì)這種刺激作出應(yīng)答。與用于預(yù)防疾病發(fā)生的其他疾病的疫苗不同，癌癥疫苗典型地在受試者已被鑒定為患有瘤形成之后給予。

抗原疫苗使用腫瘤特異性抗原--展示在腫瘤細(xì)胞上的蛋白質(zhì)--來(lái)刺激免疫系統(tǒng)。通過(guò)將這些抗原注射到患者的癌性區(qū)域中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞來(lái)攻擊攜帶特異性抗原的癌細(xì)胞?？梢栽谶@種類型的疫苗中使用多種抗原以改變免疫系統(tǒng)應(yīng)答。

適合地，腫瘤抗原是腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。若干種腫瘤抗原及其表達(dá)模式是本領(lǐng)域已知的，并且可以基于有待治療的腫瘤類型來(lái)選擇。腫瘤抗原的非限制性實(shí)例包括甲胎蛋白(肝細(xì)胞癌)、癌胚抗原(腸癌)、cdk4(黑色素瘤)、β-連環(huán)蛋白(黑色素瘤)、BING-4、CA125(卵巢癌)、鈣激活的氯離子通道2、癌胚抗原、半胱天冬酶-8(鱗狀細(xì)胞癌)、CDK4、CML66、細(xì)胞周期蛋白-B1、Ep-Cam、上皮腫瘤抗原(乳腺癌)、EphA3、纖連蛋白、HPV抗原、HPV16抗原、HPV 36，37、來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、ART-2、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-1和MAGE-3(黑色素瘤、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、間皮素、SAP-1、存活蛋白、端粒酶、酪氨酸酶(黑色素瘤)、表面Ig個(gè)體基因型(例如BCR)(淋巴瘤)、Her-2/neu(乳腺癌、卵巢癌)、MUC-1(乳腺癌、胰腺癌)、TAG-72、酪氨酸酶(黑色素瘤)、以及HPV E6和E7(宮頸癌)。另外適合的腫瘤抗原包括前列腺特異性抗原(PSA)、RAS、唾液酸Tn(STn)、熱休克蛋白和相關(guān)腫瘤肽(例如gp96)、神經(jīng)節(jié)苷脂分子(例如GM2、GD2和GD3)、癌胚抗原(CEA)和MART-1。

典型地，包含腫瘤抗原的免疫原性組合物被制備成處于可注射形式，作為液體溶液抑或作為懸浮液。適合用于注射的固體形式也可以制備為乳液，或與多肽一起包封在脂質(zhì)體中。以本領(lǐng)域已知的任何合適載體來(lái)注射一種或多種腫瘤抗原。適合的載體典型地包括緩慢代謝的大分子，諸如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集體、以及無(wú)活性病毒顆粒。此類載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。這些載體也可以用作佐劑。

佐劑是增強(qiáng)疫苗有效性的免疫刺激劑。有效的佐劑包括但不限于鋁鹽諸如氫氧化鋁和磷酸鋁、胞壁肽、細(xì)菌細(xì)胞壁組分、皂苷佐劑、以及充當(dāng)用于增強(qiáng)組合物的有效性的免疫刺激劑的其他物質(zhì)。

免疫原性組合物(例如癌癥疫苗)以與劑量配制品相容的方式來(lái)給予。有效劑量意指有效治療或預(yù)防疾病或病癥的單劑量或以多劑量方案給予的疫苗。優(yōu)選地，該劑量有效抑制贅生物的生長(zhǎng)。所給予的劑量將取決于有待治療的受試者、受試者的健康和身體狀況、受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力、所希望的保護(hù)程度、以及其他相關(guān)的因素而變化。所需的活性成分的精確量將取決于從業(yè)者的判斷。

如在此下文所報(bào)道的，IDO抑制劑(例如1-MT)和OX40激動(dòng)劑(例如OX40抗體激動(dòng)劑)的給予協(xié)同地增強(qiáng)癌癥疫苗的效力。優(yōu)選地，相對(duì)于單獨(dú)給予此類藥劑，給予包含腫瘤抗原、OX40抗體激動(dòng)劑和IDO抑制劑的免疫原性組合物減少或延遲腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤消退、或增加患者存活期。

除使用癌癥疫苗之外，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的療法使腫瘤抗原釋放到體內(nèi)，這些腫瘤抗原能夠誘導(dǎo)抗癌癥免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施例中，可以使用放射療法來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明提供了用于通過(guò)給予OX40激動(dòng)劑和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑與放射療法的組合來(lái)增強(qiáng)腫瘤抗原在誘導(dǎo)抗癌癥免疫應(yīng)答中的效力的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的化學(xué)療法(例如蒽環(huán)類藥物、奧沙利鉑)可以與OX40激動(dòng)劑和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑組合給予。示例性蒽環(huán)類藥物包括，但不限于柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、以及戊柔比星。

除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施采用很好地處在熟練業(yè)內(nèi)人士的見(jiàn)識(shí)范圍之內(nèi)的分子生物學(xué)(包含重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分闡明，諸如，“分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”，第二版(Sambrook,1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(Gait,1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)”(Freshney,1987)；“酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)”“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)”(Weir,1996)；“用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)”(Miller and Calos,1987)；“當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology)”(Ausubel,1987)；“PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(The Polymerase Chain Reaction)”(Mullis,1994)；“當(dāng)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Immunology)”(Coligan,1991)。這些技術(shù)適用于本發(fā)明的多核苷酸和多肽的生產(chǎn)，并且按照這樣，可以被考慮用于制備和實(shí)施本發(fā)明。對(duì)具體實(shí)施例特別有用的技術(shù)將在下面的部分進(jìn)行討論。

給出以下的實(shí)例是為了給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何準(zhǔn)備和使用測(cè)定、篩選和本發(fā)明的治療方法的一個(gè)完整的公開(kāi)和說(shuō)明，而不是旨在限定諸位發(fā)明人認(rèn)為是自己的發(fā)明的范圍。

實(shí)例

實(shí)例1.用癌癥疫苗和抗-OX40激動(dòng)劑抗體治療增加腫瘤發(fā)生小鼠模型中的存活期。

在腫瘤發(fā)生小鼠模型中進(jìn)行研究以確定用癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和OX40激動(dòng)劑治療對(duì)存活期的影響(圖1A)。向小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)注射TC-1腫瘤細(xì)胞(7×10⁴個(gè)，皮下(s.c.))。在注射TC-1細(xì)胞后第4天或第10天時(shí)開(kāi)始給予抗OX40抗體(克隆OX86)。腫瘤出現(xiàn)的第一天是約第10天。以0.5、1.0和2.5mg/kg劑量腹膜內(nèi)(i.p.)給予抗OX40抗體，一周兩次?？偣矊?duì)14組小鼠(n＝5/組)進(jìn)行了研究，包括未接受治療的小鼠、接受單獨(dú)疫苗的小鼠、在第4天接受單獨(dú)抗OX40(0.5、1.0和2.5mg/kg)的小鼠、在第10天接受單獨(dú)抗OX40(0.5、1.0和2.5mg/kg)的小鼠、接受第4天的抗OX40(0.5、1.0和2.5mg/kg)和癌癥疫苗的小鼠、以及接受第10天的抗OX40(0.5、1.0和2.5mg/kg)和癌癥疫苗的小鼠。該研究重復(fù)兩次。

與給予單獨(dú)癌癥疫苗或單獨(dú)抗OX40的小鼠相比，給予癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出提高的存活期(圖1B)。具體地，給予癌癥疫苗和較低(0.5mg/kg，左上圖)或較高(2.5mg/kg，下圖)劑量的抗OX40的小鼠未顯示出提高的存活期。在接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠中，在注射TC-1細(xì)胞之后達(dá)約62天時(shí)，約20％的小鼠是存活的。當(dāng)在腫瘤出現(xiàn)之前(腫瘤植入后第4天)或在腫瘤出現(xiàn)第一天時(shí)(腫瘤植入后第10天)給予抗OX40抗體時(shí)，未提供存活期的顯著差異。

實(shí)例2.用癌癥疫苗和抗-OX40激動(dòng)劑抗體治療減少腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)。

在腫瘤發(fā)生小鼠模型中進(jìn)行研究以確定用癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和OX40激動(dòng)劑治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(圖2A)。向小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)注射TC-1腫瘤細(xì)胞(7×10⁴個(gè)，皮下)。在注射TC-1細(xì)胞后第4天或第10天時(shí)開(kāi)始給予抗OX40抗體(克隆OX86)。以1.0和2.5mg/kg劑量腹膜內(nèi)給予抗OX40抗體，一周兩次。總共對(duì)6組小鼠(n＝5/組)進(jìn)行了研究，包括未接受治療的小鼠、接受單獨(dú)疫苗的小鼠、接受單獨(dú)抗OX40(1.0和2.5mg/kg)的小鼠、以及接受抗OX40(1.0和2.5mg/kg)和癌癥疫苗的小鼠。該研究重復(fù)兩次。

與給予單獨(dú)癌癥疫苗(圖2B：下方，左圖)或單獨(dú)抗OX40(圖2B：中上圖、右上圖)的小鼠相比，給予癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠顯示出腫瘤體積的減小和/或腫瘤生長(zhǎng)的延遲(圖2B，下方，中圖)。與其他結(jié)果(參見(jiàn)例如圖1B)一致，給予癌癥疫苗和較高劑量(2.5mg/kg)的抗OX40的小鼠對(duì)腫瘤生長(zhǎng)未顯示出與接受癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠相同的作用(圖2B：右下圖)。因此，用癌癥疫苗和1mg/kg的抗OX40激動(dòng)劑抗體治療抑制了小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)。

實(shí)例3.用癌癥疫苗和抗-OX40激動(dòng)劑抗體治療增加腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤內(nèi)的CD8/Treg比率。

在腫瘤發(fā)生小鼠模型中進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)用癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和OX40激動(dòng)劑治療對(duì)免疫應(yīng)答的影響(圖3A)。向小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)注射TC-1腫瘤細(xì)胞(7×10⁴個(gè)，皮下)。在注射TC-1細(xì)胞后第10天時(shí)開(kāi)始給予抗OX40抗體(克隆OX86)。以0.5、1.0或2.5mg/kg劑量腹膜內(nèi)給予抗OX40抗體，一周兩次。總共對(duì)8組小鼠(n＝5/組)進(jìn)行了研究，包括未接受治療的小鼠、接受單獨(dú)疫苗的小鼠、接受單獨(dú)抗OX40(0.5和1.0mg/kg)的小鼠、以及接受抗OX40(0.5、1.0和2.5mg/kg)和癌癥疫苗的小鼠。該研究重復(fù)兩次。圖3B和圖3C示出不同劑量的單獨(dú)Ox40、或不同劑量的Ox40與疫苗的組合對(duì)CD8T細(xì)胞、E7特異性CD8T細(xì)胞、T reg細(xì)胞以及CD8/Treg比率的作用。

實(shí)例4.用癌癥疫苗和抗-OX40激動(dòng)劑抗體治療刺激腫瘤發(fā)生小鼠模型中的抗原特異性免疫應(yīng)答。

在腫瘤發(fā)生小鼠模型中進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)用癌癥疫苗(來(lái)自HPV16E7抗原的CTL表位、PADRE T輔助表位和QuilA佐劑)和OX40激動(dòng)劑治療對(duì)免疫應(yīng)答的影響(圖4A)。向小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)注射TC-1腫瘤細(xì)胞(7×10⁴個(gè)，皮下)。在注射TC-1細(xì)胞后第10天時(shí)開(kāi)始給予抗OX40抗體(克隆OX86)。以1.0、1.75或2.5mg/kg劑量腹膜內(nèi)給予抗OX40抗體，一周兩次?？偣矊?duì)4組小鼠(n＝5/組)進(jìn)行了研究，包括未接受治療的小鼠和接受單獨(dú)抗OX40(1.0、1.75和2.5mg/kg)的小鼠。該研究重復(fù)兩次。

在用所有劑量的抗OX40抗體治療之后，未檢測(cè)到對(duì)脾(圖4B：左上圖)或腫瘤(圖4C：右上圖)中的CD8⁺T細(xì)胞的百分比或數(shù)目的影響。所有三種劑量都顯著增加了脾(圖4B，右上圖)中和腫瘤(圖4C，右上圖)內(nèi)的非Treg CD4T細(xì)胞(CD4⁺FoxP3^-)。與未接受治療的小鼠相比，接受抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠具有類似的Treg細(xì)胞(CD4⁺Foxp3⁺；圖4B：下圖)水平。然而，接受抗OX40的小鼠隨著抗OX40劑量的增加顯示出增加的腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞水平(圖4C：下圖)。不受任何具體理論束縛，腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的增加可以解釋當(dāng)2.5mg/kg的抗OX40Ab與癌癥疫苗一起使用時(shí)的治療作用的缺乏。

實(shí)例5.用癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑治療減少腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)并且增加存活期。

表達(dá)來(lái)自HPV-16的E7癌蛋白的小鼠腫瘤TC-1用作感染HPV-16的人腫瘤的替代物。在第0天向小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)注射TC-1腫瘤細(xì)胞(7×104個(gè)，皮下)。在注射TC-1細(xì)胞后第10天時(shí)開(kāi)始給予抗OX40抗體(克隆OX86)。以1.0mg/kg腹膜內(nèi)給予抗OX40抗體，一周兩次。在第10天開(kāi)始，通過(guò)將1-甲基-色氨酸(1-MT)(2mg/mL)添加至小鼠的飲用水來(lái)向小鼠給予1-MT?？偣矊?duì)8組小鼠(n＝5/組)進(jìn)行了研究，包括未接受治療的小鼠、接受單獨(dú)抗OX40(1.0mg/kg)的小鼠、接受單獨(dú)1-MT的小鼠、接受抗OX40和1-MT的小鼠、接受單獨(dú)癌癥疫苗的小鼠、接受癌癥疫苗和抗OX40(1.0mg/kg)的小鼠、接受癌癥疫苗和1-MT的小鼠、以及接受癌癥疫苗、抗OX40和1-MT的小鼠。

與其他組小鼠，包括接受癌癥疫苗和抗OX40(圖5B：f圖)或癌癥疫苗和1-MT(圖5B：g圖)的小鼠相比，接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg)和1-MT的小鼠顯著抑制和/或延遲了腫瘤發(fā)生小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)(圖5B：h圖)。在接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體和1-MT的小鼠中，在注射TC-1腫瘤細(xì)胞后約35天時(shí)，兩只小鼠顯示出腫瘤體積的完全減小。與其他組小鼠，包括接受癌癥疫苗和抗OX40(藍(lán)色)或癌癥疫苗和1-MT(綠色)的小鼠相比，接受癌癥疫苗、抗OX40激動(dòng)劑抗體(1mg/kg)(紅色)和MT-1的小鼠具有增加的存活期(圖5C)。在注射TC-1腫瘤細(xì)胞后達(dá)約55天時(shí)，在這些小鼠中觀察到達(dá)約80％的存活率。相比之下，在注射TC-1腫瘤細(xì)胞后達(dá)約55天，約20％的接受癌癥疫苗和抗OX40激動(dòng)劑抗體的小鼠是存活的，這與先前結(jié)果一致(參見(jiàn)，例如圖1B)。腫瘤生長(zhǎng)的抑制和小鼠的存活期是相關(guān)的(圖5D)。因此，將1-MT添加至使用癌癥疫苗和抗OX40的治療使得治療的治療潛力顯著顯增加(例如60％對(duì)比20％完全消退)。在此呈現(xiàn)的結(jié)果證明使用OX40激動(dòng)劑和IDO抑制劑與癌癥疫苗的組合具有增加癌癥疫苗的效力的潛力。

使用下面的材料和方法進(jìn)行了上文描述的結(jié)果。

從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jackson Laboratory)(緬因州巴爾港(Bar Harbor,Maine))獲得小鼠(C57BL6；雌性，6-8周齡)并且將其保持在無(wú)病原體的條件下。

從ATCC(弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas,VA))獲得TC-1細(xì)胞，這些TC-1細(xì)胞是通過(guò)人乳頭瘤病毒株16(HPV16)早期蛋白6和7(E6和E7)和激活的ras癌基因共轉(zhuǎn)染至原代C57BL/6小鼠肺上皮細(xì)胞而獲得的。在37℃下在5％CO₂下將TC-1細(xì)胞生長(zhǎng)在補(bǔ)充有10％FBS、青霉素和鏈霉素(各自100U/ml)以及L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640中。

疫苗由與PADRE 13聚體T輔助表位(aKChaVAAWTLKAAa)混合的來(lái)自E7抗原(E7_49–57，9聚體肽(RAHYNIVTF))的CTL表位(兩者均來(lái)自切爾泰克生物科學(xué)公司(Celtek Bioscience)(田納西州納什維爾(Nashville,TN)))和QuilA佐劑(丹麥的邦泰公司(Brenntag,Denmark))組成。抗OX40抗體(克隆OX86)由美國(guó)醫(yī)學(xué)免疫公司(Medimmune)提供。1-甲基-D-色氨酸(1-MT)從西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密蘇里州圣路易斯(St.Louis,MO))獲得。

在腫瘤生長(zhǎng)和存活期的分析是終點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)中，在第0天向小鼠(n＝5/組)植入70,000個(gè)TC-1細(xì)胞。在腫瘤植入后第4天或第10天注射抗OX40抗體(1mg/kg，腹膜內(nèi))。在第10天，當(dāng)所有小鼠具有約3–4mm直徑的腫瘤時(shí)，向來(lái)自適當(dāng)組的動(dòng)物皮下注射疫苗(E7-100μg/小鼠、PADRE-20μg/小鼠、QuilA-10μg/小鼠)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，還在腫瘤植入后第10天開(kāi)始向來(lái)自適當(dāng)組的小鼠供應(yīng)于飲用水(2mg/ml)中的1-MT。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每周一次地用疫苗治療小鼠；每周兩次地給予抗OX40抗體。使用數(shù)顯卡尺每3–4天測(cè)量腫瘤并且使用公式V＝(W²×L)/2計(jì)算腫瘤體積，其中V是體積，L是長(zhǎng)度(較長(zhǎng)的直徑)，并且W是寬度(較短的直徑)。在這些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)小鼠變得垂死、腫瘤潰爛或腫瘤體積達(dá)到1.5cm³時(shí)，將小鼠殺死。

其他實(shí)施例

從前述說(shuō)明中，將顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)在此所述的發(fā)明作出變更和修改以使其適應(yīng)于各種用途和狀況。這樣的實(shí)施例也在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在在此的變量的任何定義中對(duì)要素清單的敘述包括將該變量定義為任何單個(gè)要素或所列要素的組合(或次組合)。在此的實(shí)施例的敘述包括作為任何單個(gè)實(shí)施例或與任何其他實(shí)施例或其部分結(jié)合的實(shí)施例。

本說(shuō)明書(shū)中提及的全部專利和出版物通過(guò)引用以相同的程度結(jié)合在此，如同每份單獨(dú)的專利和出版物具體地且個(gè)別地指出通過(guò)引用結(jié)合。