本發(fā)明涉及用于緩解或減輕他汀類藥物治療的副作用的方法。特別地，本發(fā)明涉及包含LTC4介導(dǎo)的活性的抑制劑的組合物和藥劑盒，用于減輕他汀類藥物治療的至少一種不良副作用。

發(fā)明背景

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)容易受到廣泛范圍的生理學(xué)信號(hào)以及毒性劑的應(yīng)激，通常導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的ER客戶蛋白(client proteins)的積聚。ER應(yīng)激已與多種疾病有關(guān)，在這些疾病中它導(dǎo)致細(xì)胞死亡。位于ER膜的三個(gè)ER應(yīng)激傳感器蛋白，IRE1α、PERK和ATF6，介導(dǎo)一個(gè)進(jìn)化上保守排列的信號(hào)傳導(dǎo)通路，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。最初UPR的目的是通過降低ER中錯(cuò)誤折疊蛋白的過載應(yīng)對(duì)應(yīng)激。在過大的應(yīng)激下，所述UPR傳感器觸發(fā)細(xì)胞死亡。鑒定了幾種應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡機(jī)制，但是ER中錯(cuò)誤折疊蛋白積聚的毒性基礎(chǔ)和涉及的機(jī)制尚未完全理解。

在應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡中的一個(gè)關(guān)鍵角色是C/EBP-同源蛋白CHOP (DDIT3、GADD153)，其被所有三個(gè)ER應(yīng)激傳感器誘導(dǎo)。CHOP被表明通過下調(diào)Bcl2蛋白并將Bax轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體以觸發(fā)細(xì)胞凋亡。應(yīng)激觸發(fā)的TRAF2-ASK1-JNK通路也通過抑制Bcl2蛋白和激活Bim、BAX和BAC觸發(fā)細(xì)胞凋亡。然而，在某些細(xì)胞類型和應(yīng)激條件下，盡管缺乏Bcl-2抑制和ASK-1或Bax/Bak激活，但細(xì)胞死亡發(fā)生，表明另外的死亡-觸發(fā)途徑的存在。CHOP也通過氧化應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞死亡，因此，引發(fā)細(xì)胞凋亡和非細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡兩種機(jī)制。

使用秀麗線蟲(C. elegans)的研究證實(shí)ERO1，其在ER中生成H₂O₂作為蛋白質(zhì)二硫鍵形成的副產(chǎn)物，是在ER應(yīng)激下的ROS生產(chǎn)者。然而，在小鼠細(xì)胞中就不是這種情況，因?yàn)樵诰幋a所有ER巰基氧化酶ERO1α、ERO1β和PRDX4的基因中合并的喪失功能的突變導(dǎo)致增加而不是減少H₂O₂的生產(chǎn)。因此，ER應(yīng)激觸發(fā)氧化應(yīng)激的機(jī)制仍不清楚。為鑒定一種替代機(jī)制，研究了其它的ER氧化還原酶機(jī)制例如結(jié)構(gòu)上相關(guān)的酶微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1 (MGST1)和MGST2。MGST1作為一種促生存因子被廣泛研究，通過直接解毒和通過下游保護(hù)以避免氧化應(yīng)激而賦予對(duì)細(xì)胞毒性藥物的抗性。相反，MGST2在氧化應(yīng)激和ER應(yīng)激中的作用尚未進(jìn)行廣泛的研究。

MGST2是一種白三烯C4合酶(LTC4S)的同工酶。MGST2主要表達(dá)于肥大細(xì)胞和一些其它的骨髓細(xì)胞中。免疫學(xué)提示這樣的Fc受體激活通過易位到核膜和細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)、5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)和LTC4S的共定位，啟動(dòng)在肥大細(xì)胞中的LTC4生物合成。cPLA2從磷脂釋放花生四烯酸，5-LO和FLAP將其氧化為L(zhǎng)TA₄，并且LTC4S綴合LTA₄與谷胱甘肽，以形成LTC4。然后LTC4通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP1輸出到細(xì)胞外環(huán)境。細(xì)胞表面酶將LTC4進(jìn)一步代謝為更穩(wěn)定的形式LTD₄ (CAS號(hào)73836-78-9)和LTE₄ (CAS號(hào)75715-89-8)。所有三種白三烯結(jié)合于兩種G-蛋白偶聯(lián)受體：CysLTR1和CysLTR2。分泌的LTC4及其代謝物觸發(fā)平滑肌細(xì)胞的收縮，從而引起在肺部的支氣管收縮和血管收縮，表現(xiàn)為過敏和哮喘的典型的癥狀。因此，幾種LTC4受體拮抗劑(孟魯司特(CAS號(hào)158966-92-8；環(huán)戊基3-{2-甲氧基-4-[(鄰-甲苯磺酰基)氨基甲?；鵠芐基}-1-甲基-1H -吲哚-5-基氨基甲酸酯)、普侖司特(CAS號(hào)103177-37-3；N -[4-氧代-2-(1H -四唑-5-基)-4H -苯并吡喃-7-基]-4-(4-苯基丁氧基)苯甲酰胺)、扎魯司特(CAS號(hào)107753-78-6; 環(huán)戊基3-{2-甲氧基-4-[(鄰-甲苯磺酰基)氨基甲?；鵠芐基}-1-甲基-1H -吲哚-5-基氨基甲酸酯)，和西魯司特(CAS號(hào)128312-51-6；3-({3-[(E)-2-(4-環(huán)丁基-1,3-噻唑-2-基)乙烯基]苯基}氨基甲?；?-2,2-二乙基丙酸))被開發(fā)并被批準(zhǔn)為治療哮喘癥狀的藥物。

盡管LTC4S主要是在肥大細(xì)胞中表達(dá)并且在過敏和哮喘的情況下已被廣泛研究，其同工酶MGST2是廣泛表達(dá)的，但其生理學(xué)作用尚未被廣泛研究。

他汀類藥物(Statins)是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶，HMGCR，UniProt P04035)，膽固醇生物合成的限速酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其用作高膽固醇血癥的主要療法并預(yù)防心血管疾病。他汀類藥物對(duì)控制膽固醇的治療作用，包括降低動(dòng)脈粥樣硬化的主要結(jié)果，已被很好地確立。為降低高膽固醇水平，或?yàn)榉乐鼓懝檀妓皆谖ｋU(xiǎn)患者中的增加，患者用一系列的他汀類藥物治療，其包括阿托伐他汀(CAS號(hào)134523-00-5)、辛伐他汀(CAS號(hào)79902-63-9)、普伐他汀(CAS號(hào)81093-37-0)、洛伐他汀(CAS號(hào)75330-75-5)和氟伐他汀(CAS號(hào)93957-54-1)。西立伐他汀(CAS號(hào)145599-86-6)在二十世紀(jì)90年代后期投放市場(chǎng)，但由于致死性橫紋肌溶解(其中受損的骨骼肌組織分解的一種病癥)的報(bào)告，已在2001年主動(dòng)退出全球市場(chǎng)。

此外，他汀類藥物具有與內(nèi)皮功能、胰島素敏感性和炎癥/免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的許多多效性的膽固醇-非依賴性作用。也已報(bào)道他汀類藥物在治療癡呆癥和各種癌癥，例如前列腺、皮膚、肺、結(jié)腸、膀胱、子宮和腎癌中具有潛在效用。

然而，有許多與他汀類藥物治療有關(guān)的潛在的嚴(yán)重副作用，包括肌病，其嚴(yán)重性范圍可從肌炎至肌肉損耗(橫紋肌溶解)。其它不太嚴(yán)重的不良反應(yīng)已被報(bào)道，包括頭痛、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱、背痛、腹部絞痛、睡眠障礙、鼻炎、鼻竇炎、咳嗽反射的刺激、頭暈和疲勞。對(duì)這類藥物報(bào)道的禁忌癥中，最常見的兩種是疲勞和/或肌肉疼痛(常常稱為"肌痛")。在用他汀類藥物治療期間的不良副作用的風(fēng)險(xiǎn)隨著同時(shí)給予某些其它的藥物，例如環(huán)孢菌素、纖維酸衍生物(如吉非貝齊)、煙酸或抗真菌藥物而增加。

事實(shí)上，估計(jì)5-10%的患者由于范圍從輕微到中度肌痛(以肌肉無(wú)力、疲勞和疼痛為特征)，再到威脅生命的橫紋肌溶解(其被定義為一種大塊的和急性肌肉纖維的破壞，導(dǎo)致肌纖維內(nèi)容物的釋放)的肌病癥狀而停止他汀類藥物的使用。當(dāng)他汀類藥物與其它的藥物或與鍛煉結(jié)合時(shí)，肌炎(肌肉炎癥)和肌病癥狀的報(bào)告以不同類型的他汀類藥物，隨著他汀類藥物劑量而增加。

已提出各種假設(shè)來(lái)解釋他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌肉損傷。他汀類藥物的作用可以是通過減少膽固醇合成的間接作用或是對(duì)不同的肌肉細(xì)胞靶的直接作用。他汀類藥物肌病的機(jī)理基礎(chǔ)可能是多因素的且部分歸因于他汀類藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。然而，他汀類藥物如何促進(jìn)細(xì)胞凋亡是相當(dāng)模糊的。在完整的細(xì)胞中，他汀類藥物被發(fā)現(xiàn)觸發(fā)鈣水平的升高，Bax (一種促凋亡蛋白)向線粒體的易位，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，并釋放細(xì)胞色素C，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

除了細(xì)胞凋亡外，幾個(gè)體外和體內(nèi)研究證實(shí)，他汀類藥物觸發(fā)氧化應(yīng)激和壞死。最重要的是，幾種他汀類藥物誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激，其特征是誘導(dǎo)蛋白CHOP (CCAAT/-增強(qiáng)子-結(jié)合蛋白同源蛋白)，其也通過氧化應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞死亡，引發(fā)細(xì)胞凋亡和非細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡兩種機(jī)制。他汀類藥物的急性應(yīng)用也已顯示觸發(fā)大量的鈣經(jīng)由蘭諾定(ryanodine)受體，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)釋放。從ER釋放鈣是ER應(yīng)激的特征，ER應(yīng)激觸發(fā)氧化應(yīng)激?？傊?，他汀類藥物-觸發(fā)的肌病至少部分涉及ER應(yīng)激觸發(fā)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

白三烯是一個(gè)在白細(xì)胞中產(chǎn)生的類花生酸炎性介質(zhì)的家族，其通過花生四烯酸經(jīng)酶花生四烯酸5-脂氧合酶(5-脂氧合酶，5-LOX，5-LO，UniProt P 09917)的氧化而生成。顧名思義，白三烯是在白細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)的，但此后已在其它的免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。白三烯使用脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)以傳遞信息到產(chǎn)生它們的細(xì)胞(自分泌信號(hào)傳導(dǎo))，或者鄰近的細(xì)胞(旁分泌信號(hào)傳導(dǎo))，以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。白三烯產(chǎn)生通常伴有組胺和前列腺素的產(chǎn)生，其也用作炎性介質(zhì)。它們(特別是，白三烯D4)的作用之一是在細(xì)支氣管內(nèi)層的平滑肌中觸發(fā)收縮；它們的過度生產(chǎn)是哮喘和過敏性鼻炎中的炎癥的主要原因。白三烯拮抗劑被用來(lái)通過抑制白三烯的生產(chǎn)或活性，治療這些疾病。

白三烯大致被分為三種類型。LTC4 (CAS號(hào)72025-60-6)、LTD4、LTE4 (CAS號(hào)75715-89-8)和LTF4 (CAS號(hào)83851-42-7)由于在它們的結(jié)構(gòu)中存在氨基酸半胱氨酸，通常被稱為“半胱氨酰白三烯”。半胱氨酰白三烯組成過敏性反應(yīng)的慢反應(yīng)物質(zhì)(SRS-A)。LTF4，像LTD4，是LTC4的代謝物，但是不像缺乏谷胱甘肽的谷氨酸殘基的LTD4，LTF4缺乏谷胱甘肽的甘氨酸殘基。LTB₄通過酶LTA₄水解酶從LTA₄經(jīng)體內(nèi)合成。它的主要功能是募集中性粒細(xì)胞到組織損傷的區(qū)域，雖然它也有助于促進(jìn)由各種免疫細(xì)胞生產(chǎn)的炎性細(xì)胞因子。阻斷LTB₄的行動(dòng)的藥物已顯示一些減慢嗜中性粒細(xì)胞-介導(dǎo)的疾病的進(jìn)展的效果。也有人推測(cè)存在LTG₄，一種LTE₄的代謝物，其中半胱氨酰部分已被氧化為α-酮酸(即半胱氨酸已被丙酮酸替代)。

白三烯的受體在藥理學(xué)上分為三種類型，即BLT受體、CysLT1受體(UniProt Q9Y271)，和CysLT2受體(UniProt Q9NS75)。BLT受體特異性地識(shí)別LTB4。CysLT1受體和CysLT2受體二者都識(shí)別肽白三烯，即白三烯C4 (LTC4)、白三烯D4 (LTD4)，和白三烯E4 (LTE4)。

Thompson等(“他汀類藥物-相關(guān)肌病(Statin-associated myopathy)”, JAMA, 2003, Vol. 289(13):1681-90)進(jìn)行了文獻(xiàn)綜述，以提供他汀類藥物-相關(guān)肌病的臨床總結(jié)和討論可能的介導(dǎo)機(jī)制。文獻(xiàn)綜述發(fā)現(xiàn)，在他汀類藥物臨床試驗(yàn)期間，肌肉問題的報(bào)告是罕見的，西立伐他汀是最常見涉及的他汀類藥物。所述綜述進(jìn)一步指出，他汀類藥物如何損害骨骼肌是不清楚的。

因此，對(duì)預(yù)防或改善與他汀類藥物治療相關(guān)的主要副作用的組合物和方法存在未滿足的需求。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明提供用于治療一種或多種他汀類藥物治療的嚴(yán)重不良副作用的藥用組合物、方法和藥劑盒。特別地，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含有效量的白三烯C₄ (LTC4)-介導(dǎo)的活性的至少一種抑制劑，用于減輕他汀類藥物治療的一種或多種不良副作用。

本發(fā)明部分基于意外的和令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即LTC4受體拮抗劑，特別是半胱氨酰白三烯受體2的拮抗劑，能夠減輕HMGCoA (羥基-3-甲基戊二酰輔酶A)還原酶抑制劑(稱為他汀類藥物)的不良副作用，同時(shí)維持其所需的效果。本發(fā)明還部分地基于意外的和令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即半胱氨酰白三烯受體2 (CysLTR2)的拮抗劑能夠減輕他汀類藥物在肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的不良副作用。在某些非-肌細(xì)胞性細(xì)胞系中，半胱氨酰白三烯受體1 (CysLTR1)的拮抗劑也減少他汀類藥物的毒性。然而，鑒于在以下實(shí)施例部分中證實(shí)的BAY-u9773 (一種CysLTR1和CysLTR2的雙特異性拮抗劑)的效果，不希望受任何理論或機(jī)制的束縛，CysLTR1的拮抗劑還可以用來(lái)保護(hù)多種類型的細(xì)胞(包括肌細(xì)胞)，避免他汀類藥物的不良作用。

本發(fā)明公開一種以前未認(rèn)識(shí)的、由ER應(yīng)激-觸發(fā)劑激活的通用信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其在啟動(dòng)細(xì)胞死亡中起著重要的作用?；谛掳l(fā)現(xiàn)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，本發(fā)明提供用于減輕他汀類藥物-觸發(fā)的ER應(yīng)激的方法，因而治療他汀類藥物治療的一種或多種不良副作用。

他汀類藥物觸發(fā)壞死，其導(dǎo)致核蛋白HMGB1的釋放。HMGB1的釋放募集諸如巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的免疫細(xì)胞，其觸發(fā)局部炎癥和進(jìn)一步的組織損傷。不與任何理論或機(jī)制關(guān)聯(lián)，LTC4抑制劑將弱化由他汀類藥物誘導(dǎo)的初始?jí)乃馈Ｒ虼?，LTC4抑制劑不用作炎癥，特別是肌肉炎癥的抑制劑，而是作為例如通過壞死的細(xì)胞死亡的抑制劑。因此須理解LTC4抑制劑防止炎癥的形成而不是治療炎癥。本發(fā)明首次提議，使用LTC4抑制劑作為肌肉損傷或肌肉炎癥的預(yù)防劑或治療劑。

根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一種他汀類藥物，和至少一種選自CysLTR2的拮抗劑，和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的藥用組合物。

在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物選自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀，和辛伐他汀，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，所述藥物是CysLTR2的拮抗劑。根據(jù)一些實(shí)施方案，CysLTR2拮抗劑選自：BAY-cysLT2 (CAS號(hào)712313-33-2)、BAY-u9773 (CAS號(hào)154978-38-8)、HAMI3379 (CAS號(hào)712313-35-4)，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，CysLTR2的拮抗劑抑制CysLTR2的活性和半胱氨酰白三烯受體1 (CysLTR1)的活性。在某些實(shí)施方案中，所述藥物是LTC4生物合成的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑是齊留通。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是阿曲留通(CAS號(hào)154355-76-7)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)LAP的抑制劑MK-886 (CAS號(hào)118414-82-7)。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物包含他汀類藥物，CysLTR2的拮抗劑，和LTC4生物合成的抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

根據(jù)某些實(shí)施方案，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，肌病選自肌炎和橫紋肌溶解。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

本發(fā)明在另一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予受試者至少一種他汀類藥物和至少一種選自CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

根據(jù)某些實(shí)施方案，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，肌病選自肌炎和橫紋肌溶解。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

本發(fā)明在另一個(gè)方面還提供一種藥劑盒，其包含含有至少一種他汀類藥物的藥用組合物，和含有至少一種選自CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的藥用組合物。

在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物選自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀，和辛伐他汀，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，所述藥物是CysLTR2的拮抗劑。根據(jù)一些實(shí)施方案，CysLTR2拮抗劑選自：BAY-cysLT2 (CAS號(hào)712313-33-2)、BAY-u9773 (CAS號(hào)154978-38-8)、HAMI3379 (CAS號(hào)712313-35-4)，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，CysLTR2的拮抗劑抑制CysLTR2的活性和半胱氨酰白三烯受體1 (CysLTR1)的活性。在某些實(shí)施方案中，所述藥物是LTC4生物合成的抑制劑。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑是齊留通。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是阿曲留通(CAS號(hào)154355-76-7)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)LAP的抑制劑是MK-886 (CAS號(hào)118414-82-7)。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒包含含有他汀類藥物的藥用組合物，包含CysLTR2的拮抗劑的藥用組合物，和包含LTC4生物合成的抑制劑的藥用組合物。

在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒還包含給予他汀類藥物和所述藥物至受試者的用藥說明書，所述受試者接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。在某些實(shí)施方案中，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，肌病選自肌炎和橫紋肌溶解。在某些實(shí)施方案中，應(yīng)用包括在給予他汀類藥物至受試者之前、期間和/或之后給予所述藥物。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

本發(fā)明在一方面還提供一種藥用組合物，其包含用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的半胱氨酰白三烯受體2 (CysLTR2)的至少一種拮抗劑，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的LTC4生物合成的至少一種抑制劑，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用，和其中LTC4生物合成的至少一種抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。

根據(jù)某些實(shí)施方案，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，肌病選自肌炎和橫紋肌溶解。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物選自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀(CAS號(hào)147511-69-1)、普伐他汀、羅蘇伐他汀(CAS號(hào)287714-41-4)，和辛伐他汀，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，CysLTR2的拮抗劑抑制CysLTR2的活性和半胱氨酰白三烯受體1 (CysLTR1)的活性。根據(jù)一些實(shí)施方案，CysLTR2拮抗劑選自：BAY-cysLT2 (CAS號(hào)712313-33-2)、BAY-u9773 (CAS號(hào)154978-38-8)、HAMI3379 (CAS號(hào)712313-35-4)，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，描述的藥用組合物包含他汀類藥物、CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑，所述抑制劑抑制選自MGST2、cPLA2、5-LO和FLAP的酶的活性。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是齊留通。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是阿曲留通。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)LAP的抑制劑MK-886。

在某些實(shí)施方案中，上述藥用組合物包含CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑，所述抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。

根據(jù)一些實(shí)施方案，以上描述的藥用組合物還包含有效量的他汀類藥物，其選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)另外的實(shí)施方案，他汀類藥物使用的劑量在類似于當(dāng)單獨(dú)給予用于它們的批準(zhǔn)的適應(yīng)癥時(shí)批準(zhǔn)的藥物的劑量的范圍內(nèi)。

本發(fā)明在另一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予CysLTR2的至少一種拮抗劑至受試者的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

本發(fā)明在又一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予受試者LTC4生物合成的至少一種抑制劑的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用，和其中LTC4生物合成的抑制劑抑制選自MGST2、cPLA2、5-LO和FLAP的酶的活性。

在某些實(shí)施方案中，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。

在以上描述的方法的某些實(shí)施方案中，白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑在用他汀類藥物治療之前，與用他汀類藥物治療同時(shí)，或與用他汀類藥物治療一起給予用他汀類藥物治療的受試者。在以上描述的方法的某些實(shí)施方案中，白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑在用他汀類藥物治療之后給予用他汀類藥物治療的受試者。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療他汀類藥物治療的一種或多種副作用的方法，其包括給予經(jīng)受他汀類藥物治療的受試者有效量的白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑。根據(jù)一些實(shí)施方案，白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑可單獨(dú)或與有效量的他汀類藥物聯(lián)合給予。

給予受試者的任何合適的途徑可用于本發(fā)明的組合物。優(yōu)選的給藥方式將取決于要治療的具體適應(yīng)癥并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。

根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥用組合物可作為一種用于口服給予的丸劑提供。

構(gòu)成治療的組分的組合可同時(shí)地(作為分開的劑型或作為一種單一的組合物)，順序地，或者經(jīng)合適的時(shí)間間隔分開給予。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。當(dāng)組分作為分開的劑型，即不作為合并的組合物給予時(shí)，各組分可以相同的形式或不同的形式，如口服、經(jīng)鼻、胃腸外或經(jīng)皮給予。當(dāng)化合物同時(shí)、順序或分開給予時(shí)，組分可作為分開的劑型提供。

當(dāng)組分作為分開的劑型，即不作為緊密的組合物給予時(shí)，各組分可以相同的形式或不同的形式，如口服、經(jīng)鼻、胃腸外、直腸、陰道或經(jīng)皮給予。當(dāng)化合物同時(shí)、順序或分開給予時(shí)，組分可作為分開的劑型提供。任選地，組合的組分可以藥劑盒形式提供，其中藥劑盒優(yōu)選地以適合于分開給予各組分的隔室形式存在。

或者，當(dāng)組合的組分同時(shí)給予時(shí)，它們可作為含有兩種或更多種組分的單一的組合物提供或可以藥劑盒形式提供，其中藥劑盒被分割成用于同時(shí)給予各組分的隔室。

當(dāng)白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑的藥用組合物和治療性他汀類藥物作為分開的劑型給予時(shí)，各自可用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體配制在一起，以形成組合物。當(dāng)治療的組分作為單一組合物給予時(shí)，組合物也可任選地包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。

藥用組合物的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這樣的組合物可含有任何合適的載體例如，稀釋劑或賦形劑，其在與組合物中的其它成分相容且對(duì)受試者無(wú)害的意義上說是藥學(xué)上可接受的。

合適的載體包括所有常規(guī)溶劑、油、分散媒介、填充劑、固體載體、包衣料、抗真菌劑和抗菌劑、皮膚滲透劑(合適時(shí))、表面活性劑、等滲劑和吸收劑等。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物也可包括其它的補(bǔ)充生理活性劑。

本發(fā)明的化合物和/或藥用組合物可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法給予。例如，以非限制的方式，它可以經(jīng)局部、胃腸外、口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下，或通過其它的合適的方式給予。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和/或組合物可適合配制為口服給予(雖然在適宜的情況下，其它形式也可考慮)并可以選自以下的離散的單位形式配制：離散的單位例如膠囊、袋裝粉末劑、顆粒劑和片劑。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物和/或組合物可以選自粉末劑、顆粒劑、溶液劑、水性或非-水性液體中的混懸劑、油劑、糊劑、水包油液體乳劑和油包水液體乳劑的形式配制。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥用組合物被配制為用于口服給予的含有他汀類藥物和白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑二者的單一丸劑。

片劑可任選地與一種或多種輔助成分一起經(jīng)壓制或模塑成型制得。壓制片劑可通過在合適的機(jī)器中壓制呈自由流動(dòng)形式例如粉末或顆粒，任選地與粘合劑(如惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合的活性成分來(lái)制備。模塑成型片劑可通過在合適的機(jī)器中模壓用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混合物制得。片劑可任選地被包衣或刻痕并可使用例如，不同比例的羥丙基甲基纖維素配制，以提供其中活性成分的緩慢或控制釋放，以提供所需的釋放特性。片劑可任選地用腸溶衣提供，以提供在并非胃的腸道部分釋放。化合物也可以硬或軟明膠膠囊的形式存在。應(yīng)該理解，除了上文特別提及的活性成分，考慮到所提及組合物的類型，本發(fā)明的組合物還可包含本領(lǐng)域常規(guī)的其它試劑或添加劑，例如，適合于口服給予的那些可包括這樣的其它試劑如粘合劑、甜味劑、增稠劑、矯味劑、崩解劑、包衣料、防腐劑、潤(rùn)滑劑和/或時(shí)間延遲劑。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜和糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、膨潤(rùn)土、藻酸或瓊脂。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)一些實(shí)施方案，使用與本發(fā)明的藥用組合物的聯(lián)合療法將提供與所述他汀類藥物在作為單一療法給予時(shí)類似的膽固醇降低作用，同時(shí)減輕其副作用。

根據(jù)一些實(shí)施方案，以上描述的藥用組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)將從以下的描述和附圖而變得清楚。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡機(jī)制的原理性描述。

圖2A-2B.ER應(yīng)激調(diào)節(jié)MGST2和5-LO的表達(dá)。(2A) 用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH上皮細(xì)胞和人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞后，微粒體谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(MGST2)和裂解的胱天蛋白酶3 (Casp. 3)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)，如通過免疫印跡法所測(cè)定的。(2B) 在用布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH上皮細(xì)胞和用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理小鼠B16細(xì)胞后，5-脂氧合酶(5-LO)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)，如通過免疫印跡法所測(cè)定的。

圖3. 用布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH細(xì)胞，和用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理小鼠B16細(xì)胞后，CysLTR1和CysLTR2表達(dá)的動(dòng)力學(xué)，如通過免疫印跡法所測(cè)定的。

圖4A-4E.ER應(yīng)激觸發(fā)ROS積聚由MGST2-衍生的LTC4介導(dǎo)。(4A)小鼠B16細(xì)胞用對(duì)照siRNA或MGST2 siRNA轉(zhuǎn)染，然后用衣霉素處理并用超氧化物陰離子指示劑二氫乙啶(dihydroethidium) (DHE)染色。如通過ImageJ程序確定的表示相對(duì)DHE熒光強(qiáng)度的定量。N=3, ***p< 0.001。(4B)小鼠B16細(xì)胞用對(duì)照siRNA或MGST2 siRNA轉(zhuǎn)染，然后用衣霉素處理并用超氧化物陰離子指示劑二氫乙啶(DHE)染色。如通過qRT-PCR在重復(fù)樣本上測(cè)定的小鼠MGST2 mRNA的沉默效率被示出。N=3, ***p< 0.001。(4C) 人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞用布雷菲爾德菌素A (0.33 μg/ml, 24小時(shí))，伴有或沒有MRP1抑制劑reversan (20 μM)或LTC4拮抗劑普侖司特、BAY-cysLT2或BAY-u9773處理。然后用ROS指示劑DCFH-DA對(duì)細(xì)胞染色。提供相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度的定量分析。所有抑制劑(除了reversan)顯著抑制ROS積聚。N=3, * p< 0.05。(4D) 在用對(duì)照pcDNA4載體或者pcMGST2-FLAG轉(zhuǎn)染后，用抗FLAG標(biāo)簽進(jìn)行HEK 293T細(xì)胞提取物的免疫印跡。(4E) HEK 293T細(xì)胞經(jīng)模擬-轉(zhuǎn)染(對(duì)照)，用pcDNA4轉(zhuǎn)染或者用pcMGST2-FLAG轉(zhuǎn)染，然后用DHE染色。提供相對(duì)DHE熒光強(qiáng)度的定量分析，N=4, **p < 0.01。

圖5.ER應(yīng)激觸發(fā)的ROS積聚由LTC4介導(dǎo)。小鼠B16細(xì)胞用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))，伴有或沒有BAY-u9773 (1 μM)或孟魯司特(5 μM)處理。24小時(shí)后，細(xì)胞用DCF-DA (10 μM, 40 min)染色。提供了相對(duì)DCF熒光強(qiáng)度的定量分析。DCF的平均強(qiáng)度被歸一化為使用Photoshop的直方圖功能的細(xì)胞核染色。數(shù)據(jù)為測(cè)量三個(gè)視場(chǎng)的平均±SD。(**p < 0.01)。

圖6A-6C.ER應(yīng)激觸發(fā)的NADPH氧化酶4 (NOX4)表達(dá)，朝向核的易位和DNA氧化通過MGST2-LTC4途徑介導(dǎo)。(6A) 在BAY-u9773、MK571或孟魯司特的存在或不存在下，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH細(xì)胞。NOX4水平通過免疫印跡評(píng)估。(6B) 在孟魯司特、BAY-u9773或BAY-cysLT2的存在或不存在下，用媒介(對(duì)照)或衣霉素(0.5 μg/ml, 24小時(shí))處理小鼠B16細(xì)胞。NOX4水平通過免疫印跡評(píng)估。(6C) 在普侖司特或BAY-u9773的存在或不存在下，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (48小時(shí))處理人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞，然后用抗8-OHdG免疫染色。8-OHdG熒光強(qiáng)度的定量分析被示出。N= 3 *p <0.05, ****p <0.001。

圖7A-7G.MGST2-LTC4途徑介導(dǎo)ER應(yīng)激-觸發(fā)的細(xì)胞死亡。(7A)小鼠B16細(xì)胞用對(duì)照siRNA (siControl)或MGST2-特異性siRNA (siMGST2)轉(zhuǎn)染，用媒介或衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí)) (Tm)處理，然后用結(jié)晶紫染色。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=3 ***p< 0.0001。(7B)小鼠B16細(xì)胞用對(duì)照siRNA (siControl)或MGST2-特異性siRNA (siMGST2)轉(zhuǎn)染，用媒介或衣霉素(Tm)處理，然后用結(jié)晶紫染色。如通過qRT-PCR在重復(fù)樣本上測(cè)定的小鼠MGST2 mRNA的沉默效率被示出。N=3, ***p<0.001。(7C) HEK 293T細(xì)胞被模擬轉(zhuǎn)染，用pcDNA4或用pcMGST2-FLAG轉(zhuǎn)染，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理，然后用結(jié)晶紫染色。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=3 ****p< 0.0001。(7D) 在BAY-u9773 (80 nM)的存在或不存在下，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (BfA, 1.33 μg/ml, 48小時(shí))處理人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞。然后用結(jié)晶紫染色各板。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=4 ***p< 0.0001。(7E) 人WISH細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或者衣霉素(1 μg/ml, 48小時(shí))在BAY-u9773 (80 nM)的存在或不存在下處理，然后用中性紅染色。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=4 ***p< 0.0001。(7F) 人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或MG262 (0.05 μM)在齊留通(10 μM, 24小時(shí))的存在或不存在下處理。然后用結(jié)晶紫染色各板。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=4, ***p< 0.001。(7G) 人WISH細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))在普侖司特(10 μM)的存在或不存在下處理。然后用結(jié)晶紫染色各板。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=3, ***p< 0.001。

圖8A-8C. MGST2-LTC4途徑的抑制劑減少ER應(yīng)激-觸發(fā)的細(xì)胞死亡。(8A) 人WISH細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 48小時(shí))在BAY-cysLT2的存在或不存在下處理。然后用結(jié)晶紫染色各板。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=4, ***p< 0.001。(8B)小鼠B16細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí)) (Tm)、毒胡蘿卜素(50 nM, 24小時(shí)) (Tg)或布雷菲爾德菌素A (BfA 1.3 μM, 24小時(shí))在MK571的存在或不存在下處理24 h。用結(jié)晶紫染色各板。細(xì)胞的相對(duì)成活力被示出。N=4, ***p< 0.001。(8C) 釋放至用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (1.3 μg/ml, 24小時(shí))在MK571的存在或不存在下處理的B16細(xì)胞的培養(yǎng)基的壞死標(biāo)記物HMGB1的免疫印跡。麗春紅(Ponceau)染色用作加載對(duì)照。

圖9A-9G.MGST2缺乏減弱ER應(yīng)激觸發(fā)的體內(nèi)死亡。(9A) 通過來(lái)自WT和純合MGST2-缺乏(KO) 129svEvBrd小鼠的尾端的DNA的PCR獲得的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。雜合ES細(xì)胞(ES)和陰性PCR對(duì)照的DNA也示出。(9B) WT和第2代MGST2-缺乏小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理。然后用結(jié)晶紫染色各板。如通過中性紅染色所測(cè)定的，用媒介(對(duì)照)或衣霉素處理的WT和第2代MGST2-缺乏小鼠胚胎的相對(duì)成活力被示出。(9C) 如通過在WT和在MGST2缺乏MEFs中的裂解的胱天蛋白酶3 (Casp. 3)的免疫印跡所測(cè)定的布雷菲爾德菌素A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(9D) WT和第2代MGST2-缺乏小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或衣霉素(2 μg/ml, 24小時(shí))或布雷菲爾德菌素A (0.25 μg/ml, 24小時(shí))處理，然后用DCFH-DA染色。DCF熒光強(qiáng)度的定量分析被示出。N=3 *** p < 0.001。(9E) 衣霉素(1 mg/kg)在時(shí)間=0經(jīng)ip給予WT和MGST2-缺乏小鼠(5/組)一次。切除腎并用蘇木精-曙紅染色切片。對(duì)腎近端小管的損害的定量分析被示出。使用Photoshop的套索工具(lasso tool)選擇含有近端小管的整個(gè)腎面積的圖像并使用ImageJ程序?qū)张萦?jì)數(shù)。N=5, ***p < 0.03。(9F) 在時(shí)間=0經(jīng)ip給予衣霉素(2.5 mg/kg)一次的WT和MGST2-缺乏小鼠(20/組)的存活。對(duì)顯示出嚴(yán)重發(fā)病率的小鼠實(shí)施安樂死以減少痛苦。(9G) 在時(shí)間=0經(jīng)ip給予衣霉素(2.5 mg/kg)一次的和或者給予媒介(對(duì)照)或者普侖司特(1 mg/kg/天，3天)的WT小鼠(4/組)的存活。對(duì)顯示出嚴(yán)重發(fā)病率的小鼠實(shí)施安樂死以減少痛苦。

圖10. 普侖司特減少辛伐他汀觸發(fā)的細(xì)胞死亡。用指定濃度的辛伐他汀在普侖司特(10 μM, 48小時(shí))的存在(虛線)或不存在(連續(xù)線)下處理的人WISH細(xì)胞的存活。然后用結(jié)晶紫染色各板并確定細(xì)胞的相對(duì)成活力。

圖11A-11B. BAY-cysLT2和BAY-u9773而不是普侖司特減少辛伐他汀-觸發(fā)的分化的C2C12小鼠肌細(xì)胞的細(xì)胞死亡。(11A) 在小鼠C2C12細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，在媒介、普侖司特(10 μM)、BAY-cysLT2 (10 μM)、BAY-u9773 (1 μM)或甲羥戊酸(71.4 μM)的存在下，用10 uM 辛伐他汀處理5天的存活。然后用結(jié)晶紫染色各板并測(cè)定相對(duì)細(xì)胞成活力。(11B) 染色強(qiáng)度的定量被示出。

圖12A-12B. 齊留通而不是孟魯司特減少辛伐他汀-觸發(fā)的分化的C2C12小鼠肌細(xì)胞的死亡。(12A) 使C2C12無(wú)限增殖化小鼠成肌細(xì)胞(15,000細(xì)胞/100 ul DMEM)接種24，然后分化3天(由補(bǔ)充有1xITS培養(yǎng)基的無(wú)血清培養(yǎng)基啟動(dòng))，然后用20 μg/ml辛伐他汀(伴有或沒有孟魯司特(2 μM)、齊留通(10 μM)或甲羥戊酸(71.4 μM))處理。4天后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并在光鏡下拍照。(12B) 染色強(qiáng)度的定量被示出。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供用于治療他汀類藥物治療的一種或多種不良副作用的方法、藥用組合物和藥劑盒。特別地，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含有效量的用于減輕他汀類藥物治療的一種或多種不良副作用的白三烯介導(dǎo)的活性的至少一種抑制劑。

本發(fā)明的發(fā)明人已揭示先前未識(shí)別的、由ER應(yīng)激-觸發(fā)劑激活的通用信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其在啟動(dòng)細(xì)胞死亡中起著重要的作用?；谛掳l(fā)現(xiàn)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，本發(fā)明提供減輕他汀類藥物-觸發(fā)的ER應(yīng)激的方法，因而治療他汀類藥物治療的一種或多種不良副作用。

為有利于理解本發(fā)明，許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)在下文定義。要理解這些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)是為了描述的目的并不是限制目的，以致本說明書的術(shù)語(yǔ)或措辭是由熟練技術(shù)人員根據(jù)本文提出的教導(dǎo)和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)來(lái)解釋。

本發(fā)明首次揭示先前未識(shí)別的、由ER應(yīng)激-觸發(fā)他汀類藥物激活的通用信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其在接受他汀類藥物的患者中啟動(dòng)細(xì)胞死亡方面起著重要的作用。本發(fā)明提供通過抑制所述信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，減少他汀類藥物-觸發(fā)的ER應(yīng)激的方法。此外，本發(fā)明公開由ER應(yīng)激-觸發(fā)劑，以及由他汀類藥物激活的、作為一種先前未識(shí)別的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的MGST2-LTC4。

本發(fā)明部分基于以下意外的發(fā)現(xiàn)：(a) 由特異性試劑例如衣霉素、毒胡蘿卜素和布雷菲爾德菌素A引發(fā)的ER應(yīng)激，至少部分通過白三烯C₄ (LTC4)的生成觸發(fā)細(xì)胞死亡；(b) 這種LTC4通過酶MGST2生成，并且ER應(yīng)激通過其共易位(co-translocation)至核被膜且其與cPLA2、5LO和FLAP共定位在一起激活MGST2；(c) ER應(yīng)激也觸發(fā)兩個(gè)LTC4受體(CysLT1和cysLT2)的易位至核被膜，并且它們與LTC4的合成機(jī)器共定位，從而能使LTC4的胞內(nèi)分泌行動(dòng)局部化；(d) LTC4結(jié)合于其內(nèi)在化的受體激活NADPH氧化酶4，導(dǎo)致ROS積聚，并且由于ER應(yīng)激，LTC4是氧化應(yīng)激的主要觸發(fā)劑；和(e) 由ER應(yīng)激-激活的MGST2-LTC4途徑介導(dǎo)的ROS積聚導(dǎo)致DNA損傷以及隨后的細(xì)胞死亡(圖1)。在對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)(通常稱為“未折疊蛋白反應(yīng)” (UPR))中，LTC4生物合成機(jī)器及其受體易位和在核被膜共定位。結(jié)果NOX4被激活，生成ROS，其造成氧化性DNA損傷和隨后的細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明公開了一種由ER應(yīng)激激活的主要的死亡-觸發(fā)途徑。

本發(fā)明還公開了LTC4受體拮抗劑例如孟魯司特和普侖司特減少他汀類藥物例如辛伐他汀以及阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀(CAS號(hào)73573-88-3)、匹伐他汀、普伐他汀和羅蘇伐他汀的毒性。本發(fā)明還公開了LTC4受體拮抗劑保護(hù)野生型小鼠避免ER應(yīng)激觸發(fā)的發(fā)病。幾種LTC4受體拮抗劑(孟魯司特、普侖司特等)被開發(fā)并被批準(zhǔn)為治療哮喘綜合征的藥物。所有批準(zhǔn)為藥物的LTC4受體拮抗劑是CysLT1受體的選擇性抑制劑。選擇性抑制劑也被開發(fā)用于CysLT2，第二種LTC4受體，但到目前為止，它們還沒有經(jīng)受臨床的開發(fā)。早先的研究證實(shí)CysLTR1和CysLTR2，兩種LTC4受體，在不同類型的組織中并非同等表達(dá)的。因此，本發(fā)明也提供用于緩解他汀類藥物的一些主要不良副作用的Cys LT2受體拮抗劑以及cysLT1和CysLT2受體拮抗劑的組合。本發(fā)明也公開非-選擇性LTC4受體拮抗劑在緩解他汀類藥物的一些不良副作用中的用途。本發(fā)明還提供用于緩解他汀類藥物的一些不良副作用的白三烯生物合成的抑制劑。

根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一種他汀類藥物，和至少一種選自CysLTR2的拮抗劑，和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的藥用組合物。

本發(fā)明在另一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予受試者至少一種他汀類藥物和至少一種選自CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

本發(fā)明在另一個(gè)方面還提供一種藥劑盒，其包含含有至少一種他汀類藥物的藥用組合物，和包含至少一種選自CysLTR2的拮抗劑和LTC4生物合成的抑制劑的藥物的藥用組合物。

本發(fā)明在一個(gè)方面還提供一種藥用組合物，其包含用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的半胱氨酰白三烯受體2 (CysLTR2)的至少一種拮抗劑，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種藥用組合物，其包含用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的LTC4生物合成的至少一種抑制劑，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用，和其中LTC4生物合成的至少一種抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。

本發(fā)明在另一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予CysLTR2的至少一種拮抗劑至受試者的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

本發(fā)明在又一個(gè)方面提供一種預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用的方法，其包括給予受試者LTC4生物合成的至少一種抑制劑的步驟，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用，和其中LTC4生物合成的抑制劑抑制選自MGST2、cPLA2、5-LO和FLAP的酶的活性。

膽固醇治療領(lǐng)域是日益增長(zhǎng)和不斷變化的，因?yàn)閺V泛的研究和資源致力于克服這種病癥。因此，正如上面所闡述的，任何類型的影響人體膽固醇水平的分子均被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的“他汀類藥物”。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“他汀類藥物”指用來(lái)通過抑制酶HMG-CoA還原酶降低人的膽固醇水平的任何藥劑、分子或藥物。一般來(lái)說，減少或消除酶HMG-CoA還原酶的酶活性的任何分子均被本發(fā)明認(rèn)為是“他汀類藥物”。特別是，減弱從3-羥基-3-甲基-戊二酰-CoA (HMG-CoA)轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的HMG-CoA還原酶的任何分子均被本發(fā)明認(rèn)為是“他汀類藥物”。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥用組合物”指包含至少一種生物活性劑，和至少一種藥學(xué)上可接受的載體的任何組合物。生物活性分子的非-限制性實(shí)例是白三烯受體的拮抗劑，例如受體CysLTR1和CysLTR2的拮抗劑，和LTC4生物合成的抑制劑，例如酶MGST2、cPLA2、5-LO和FLAP的抑制劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥劑”指具有生物學(xué)活性的任何分子。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"意指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或媒介，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封囊物質(zhì)，涉及攜帶或轉(zhuǎn)運(yùn)受試者體內(nèi)的本發(fā)明的化合物或攜帶或轉(zhuǎn)運(yùn)本發(fā)明的化合物至受試者，以致它能執(zhí)行其預(yù)定的功能。載體在與制劑中的其它成分相容且對(duì)患者無(wú)害的意義上說必須是"可接受的"。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“白三烯C4 (LTC4)受體的拮抗劑”、“CysLTR1的拮抗劑”、“CysLTR1拮抗劑”、“CysLTR2的拮抗劑”，和“CysLTR2拮抗劑”指能夠阻斷、抑制、減輕或干擾所指定的白三烯C4受體的活性或功能的任何藥劑。這些術(shù)語(yǔ)還指能夠阻斷、抑制、減輕或干擾白三烯C4受體的表達(dá)的任何藥劑。白三烯C4受體拮抗劑的非-限制性實(shí)例是孟魯司特、扎魯司特和普侖司特。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑”指白三烯受體拮抗劑、白三烯生物合成抑制劑或其組合。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，白三烯受體拮抗劑和白三烯生物合成抑制劑二者都能夠抑制白三烯介導(dǎo)的活性，因此可作為替代或相互組合使用。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“LTC4介導(dǎo)的活性的抑制劑”指LTC4受體拮抗劑、LTC4生物合成抑制劑或其組合。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“白三烯”指選自以下的白三烯：LTC4、LTD4、LTE4及其任何組合。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"受體拮抗劑"指一種受體的配體，其在結(jié)合于受體時(shí)發(fā)揮對(duì)該受體活性的完全或部分抑制作用，例如，LTC4受體拮抗劑引起LTC4受體的抑制作用。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"受體的配體"指特異性地結(jié)合受體并從而引起受體的激活或者抑制作用的化合物。如本文所用的，“白三烯受體拮抗劑”是能夠特異性地結(jié)合于白三烯受體，和能夠完全或部分地抑制即滅活所述受體的任何化合物。因此白三烯受體拮抗劑是一種通過白三烯受體的結(jié)合和滅活而發(fā)揮其主要作用的化合物。術(shù)語(yǔ)"LTC4受體拮抗劑"、"白三烯受體拮抗劑"、"CysLT1受體拮抗劑"，和"CysLT2受體拮抗劑"在此意欲覆蓋任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物，或水合物，其在給予接受者時(shí)能夠提供(直接地或間接地)如本文描述的拮抗劑。鹽的制備可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。根據(jù)一些實(shí)施方案，白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑選自：白三烯C₄(LTC4)介導(dǎo)的活性的抑制劑、白三烯D₄ (LTD₄)介導(dǎo)的活性的抑制劑、白三烯E₄ (LTE₄)介導(dǎo)的活性的抑制劑，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”一般指在接受他汀類藥物的受試者中消除或延緩與他汀類藥物治療有關(guān)的急性和/或慢性不良副作用的最初發(fā)生。預(yù)防可以是完全的，例如，完全沒有對(duì)組織或細(xì)胞的損傷。預(yù)防也可以是部分的，以致由他汀類藥物誘導(dǎo)的對(duì)組織或細(xì)胞的損傷小于在沒有LTC4受體拮抗劑和/或LTC4生物合成抑制劑的作用時(shí)將出現(xiàn)的損傷。

術(shù)語(yǔ)“減輕”一般指在接受他汀類藥物的受試者中減輕與他汀類藥物治療有關(guān)的急性和/或慢性不良副作用的總體嚴(yán)重性和/或加速與他汀類藥物治療有關(guān)的急性和/或慢性不良副作用的消散。

如本文可互換使用的術(shù)語(yǔ)"治療"和"緩解損傷"包括減少、緩解，或改善與他汀類藥物的毒性相關(guān)的或由汀類藥物的毒性誘導(dǎo)的至少一種癥狀。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療"也包括預(yù)防性(如防止)、姑息性和治愈性治療。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肌病”指任何一種已知的肌肉疾病，其中肌肉纖維由于許多原因中的任何一種而不起作用，導(dǎo)致肌肉無(wú)力。肌肉抽搐、僵硬和痙攣也可能與肌病相關(guān)。肌肉疾病按性質(zhì)可分類為神經(jīng)肌肉的或肌肉骨骼的。一些病癥，例如肌炎，可被考慮同時(shí)為神經(jīng)肌肉的和肌肉骨骼的。肌病是遺傳的或后天獲得的。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“肌病”指藥物-誘導(dǎo)的肌病，例如在國(guó)際疾病分類(International Classification of Diseases) (ICD)-10-CM診斷代碼G72.0中列出的。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肌炎”一般指肌肉的炎癥。受試者血液中肌酸激酶(一種壞死的標(biāo)記物)的升高通常是肌炎的指示，因?yàn)榧⊙淄鳛榧?xì)胞壞死的結(jié)果發(fā)生。肌炎的類型包括，但不限于骨化性肌炎、特發(fā)性炎性肌病、皮肌炎、青少年皮肌炎、多發(fā)性肌炎，包涵體肌炎，和膿性肌炎。在某些實(shí)施方案中，肌炎選自骨化性肌炎和特發(fā)性炎性肌病。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“橫紋肌溶解”指其中損傷的骨骼肌肉組織迅速分解的一種病癥。損傷的肌肉細(xì)胞的分解產(chǎn)物被釋放進(jìn)入血流中，這些中的一些，例如蛋白肌紅蛋白，對(duì)腎臟有害并可能導(dǎo)致腎衰竭。癥狀的嚴(yán)重性(可包括肌肉疼痛、嘔吐、意識(shí)錯(cuò)亂)取決于肌肉損傷的程度和腎衰竭是否發(fā)展。診斷通常是進(jìn)行血液檢驗(yàn)和尿分析。

術(shù)語(yǔ)“受試者”或“有需要的受試者”在此可互換使用并指經(jīng)受他汀類藥物治療并罹患所述不良他汀類藥物治療副作用的受試者。根據(jù)一些實(shí)施方案，受試者是人。在一些實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物。

在某些實(shí)施方案中，受試者患有高水平的血液低密度脂蛋白(LDL)膽固醇。在某些實(shí)施方案中，受試者患有高膽固醇血癥。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“高膽固醇血癥”、“血膽甾醇過多”和“血脂障礙”指在血液中存在高水平的膽固醇。高膽固醇血癥是"高脂血癥" (血液中的脂質(zhì)水平升高)和"高脂蛋白血癥" (血液中的脂蛋白水平升高)的一種形式。

在某些實(shí)施方案中，接受他汀類藥物治療的受試者正接受高劑量的他汀類藥物。在某些實(shí)施方案中，短語(yǔ)“接受高劑量的他汀類藥物”意思是接受每日至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80，或至少80 mg的他汀類藥物。

術(shù)語(yǔ)“包含”、"含有"、"有"、“包括”、"含"、"包納"、“具有”意指"包括但不限于"。術(shù)語(yǔ)“由…組成”意指“包括且限于”。如本文所用的，單數(shù)形式"一"、"一個(gè)"和"該" 包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另外清楚地指明。例如，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)化合物"或"至少一個(gè)化合物"可包括多個(gè)化合物，包括其混合物。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抑制受體的活性”指能夠預(yù)防、阻斷或減少受體的信號(hào)-轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)或生物學(xué)活性的任何藥劑。例如，半胱氨酰白三烯激活CysLTR1和CysLTR2、G蛋白-偶聯(lián)受體，以在非-造血細(xì)胞中啟動(dòng)包括MGST2的激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“白三烯生物合成抑制劑”指選自以下的抑制劑：微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)抑制劑、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)抑制劑、5-脂氧合酶(5-LO)抑制劑、5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)抑制劑及其組合。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“LTC4生物合成的抑制劑”指能夠預(yù)防、阻斷或減少LTC4的合成的任何藥劑。如在背景部分所詳細(xì)描述的，cPLA2從磷脂釋放花生四烯酸，5-LO和FLAP將其氧化為反應(yīng)性中間體LTA₄和LTC4S綴合LTA₄與谷胱甘肽，以形成LTC4。這些酶的任何一種的任何抑制劑被考慮為L(zhǎng)TC4生物合成的抑制劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抑制酶的活性”指能夠預(yù)防、阻斷或減少酶的活性的任何藥劑。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指藥物以單一或多個(gè)劑量給予受試者時(shí)，在提供治療益處給受試者和/或在預(yù)防由他汀類藥物造成的不良副作用中是有效的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療益處是抑制或改善這樣的不良副作用的癥狀。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"也指他汀類藥物和/或白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑以單一或多個(gè)劑量給予受試者時(shí)，在提供給有需要的受試者治療益處，例如膽固醇降低作用，同時(shí)減輕不良他汀類藥物治療副作用中是有效的量。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"給予"指使哺乳動(dòng)物細(xì)胞與本發(fā)明的化合物或組合物接觸。用來(lái)實(shí)施本發(fā)明以療效性治療由他汀類藥物引起的病癥或歸因于他汀類藥物的病癥的組合物的有效量根據(jù)他汀類藥物，他汀類藥物治療的方案，給予方式，患者的年齡、體重和一般健康而變化。最終，主治醫(yī)師將決定適宜的量和劑量方案。這樣的量被稱為有效量。

術(shù)語(yǔ)“有效量”和“有效的量”在此可互換使用，指包含他汀類藥物和/或白三烯介導(dǎo)的活性的抑制劑的組合物在單一或多個(gè)劑量給予時(shí)有效減輕不良他汀類藥物治療副作用的量和/或劑量。例如，以非-限制性方式，為用本發(fā)明的組合物治療他汀類藥物治療的副作用，他汀類藥物的有效量是所述他汀類藥物當(dāng)作為一種單一療法給予時(shí)導(dǎo)致可測(cè)量的或可檢測(cè)的膽固醇降低作用的量。根據(jù)一些實(shí)施方案，白三烯受體拮抗劑的有效量是導(dǎo)致可測(cè)量的或可檢測(cè)的減輕、阻斷、抑制或預(yù)防他汀類藥物治療的不良作用的量。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)"方法"指完成給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和程序，包括，但不限于，化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的，或者由化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)人員從已知的方式、方法、技術(shù)和程序容易地開發(fā)的那些方式、方法、技術(shù)和程序。

如本文所用的短語(yǔ)“預(yù)防或減輕”和“減輕或預(yù)防"意指受試者的細(xì)胞、組織或器官中的病癥或疾病通過在病癥或疾病，或其癥狀出現(xiàn)之前、期間或之后給予藥劑被預(yù)防或嚴(yán)重性減輕。因此，在一些實(shí)施方案中，短語(yǔ)“預(yù)防或減輕”和“減輕或預(yù)防"意指“預(yù)防”。在一些實(shí)施方案中，短語(yǔ)“預(yù)防或減輕”和“減輕或預(yù)防"意指“減輕”。

在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物選自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀和辛伐他汀。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)一些實(shí)施方案，CysLTR2拮抗劑選自：BAY-cysLT2 (CAS號(hào)712313-33-2)、BAY-u9773 (CAS號(hào)154978-38-8)、HAMI3379 (CAS號(hào)712313-35-4)，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，CysLTR2的拮抗劑是雙特異性的并且還抑制CysLTR1的活性。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物包含LTC4受體拮抗劑的混合物或多個(gè)LTC4受體拮抗劑，包含CysLTR1的拮抗劑和CysLTR2的拮抗劑。

除了干擾或阻斷LTC4及其受體CysLTR1和CysLTR2之間的相互作用，LTC4的生物學(xué)活性可通過消除受試者體內(nèi)的LTC4生物合成而減至最小。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物包含CysLTR2的拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物包含LTC4生物合成的抑制劑，其抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制MGST2的活性。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制cPLA2的活性。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制5-LO的活性。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是齊留通。在某些實(shí)施方案中，5-LO的抑制劑是阿曲留通。在某些實(shí)施方案中，LTC4生物合成的抑制劑抑制FLAP的活性。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)LAP的抑制劑是MK-886。

在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物包含他汀類藥物、CysLTR2的拮抗劑，和LTC4生物合成的抑制劑，所述抑制劑抑制選自微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶2 (MGST2)、細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2 (cPLA2)、5-脂氧合酶(5-LO)，和5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)的酶的活性。

在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥用組合物被用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。

根據(jù)某些實(shí)施方案，不良副作用是他汀類藥物-誘導(dǎo)的肌病。在某些實(shí)施方案中，肌病選自肌炎和橫紋肌溶解。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，受試者正接受至少每日20 mg的阿托伐他汀或每日40-80 mg的阿托伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受每日0.8 mg的西立伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受每日超過80 mg的氟伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受每日超過80 mg的洛伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受至少每日4 mg的匹伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受每日超過40 mg的普伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受至少每日10 mg的羅蘇伐他汀或每日20-40 mg的羅蘇伐他汀。在某些實(shí)施方案中，受試者正接受至少每日40 mg的辛伐他汀或每日80 mg的辛伐他汀。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

患有高水平的膽固醇的患者往往用他汀類藥物，或他汀類藥物的組合治療。因?yàn)檫@些他汀類藥物是全身給予的，它們往往部分地通過與肌肉細(xì)胞相互作用而造成不良副作用。在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物治療高水平的膽固醇。在某些實(shí)施方案中，他汀類藥物誘導(dǎo)不良副作用。

在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒包含含有他汀類藥物的藥用組合物，包含CysLTR2的拮抗劑的藥用組合物，和包含LTC4生物合成的抑制劑的藥用組合物。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒還包含給予他汀類藥物和所述藥劑至受試者的用藥說明書，所述受試者接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。在某些實(shí)施方案中，以上描述的藥劑盒用于預(yù)防或減輕由他汀類藥物在受試者的肌肉組織中誘導(dǎo)的不良副作用，其中受試者正接受他汀類藥物治療和經(jīng)歷或有風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷由他汀類藥物誘導(dǎo)的不良副作用。在某些實(shí)施方案中，應(yīng)用包括在給予他汀類藥物至受試者之前、期間和/或之后給予所述藥劑。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥用組合物還包含有效量的選自以下的他汀類藥物：阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀，及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)一些實(shí)施方案，使用通過本發(fā)明的藥用組合物的組合療法將提供與他汀類藥物在作為單一療法給予時(shí)類似的或更好的膽固醇降低作用，同時(shí)減輕其副作用。

根據(jù)另外的實(shí)施方案，對(duì)他汀類藥物使用的劑量在類似于當(dāng)分開給藥用于它們被批準(zhǔn)的適應(yīng)癥時(shí)被批準(zhǔn)的藥物的劑量的范圍內(nèi)。

他汀類藥物治療是一類膽固醇治療。為防止或減輕由他汀類藥物造成的不良副作用，例如肌病，必須理解以上描述的藥用組合物(包含LTC4受體的拮抗劑，LTC4生物合成的抑制劑，或其任何組合)，可在用他汀類藥物治療之前，與用他汀類藥物治療同時(shí)，與用他汀類藥物治療一起，用他汀類藥物治療之后，和以其任何組合，給予用他汀類藥物治療的受試者。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，受試者先前未用他汀類藥物治療。在其它的某些實(shí)施方案中，受試者先前已用功能類似于他汀類藥物的他汀類藥物治療。在某些實(shí)施方案中，受試者先前已用他汀類藥物治療。在某些這樣的實(shí)施方案中，受試者先前已用他汀類藥物治療，并且已知獲得由他汀類藥物造成的不良副作用。

給予受試者的任何合適的途徑可用于本發(fā)明的組合物。優(yōu)選的給藥方式將取決于要治療的具體適應(yīng)癥并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。

根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥用組合物可作為一種丸劑、片劑或膠囊提供用于口服給予。

根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的藥用組合物可作為一種粉末劑、溶液劑或混懸劑提供，用于靜脈內(nèi)給予。

在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的藥用組合物被配制用于他汀類藥物的延遲釋放。關(guān)于本文公開的制劑的術(shù)語(yǔ)"延遲釋放"意指所述制劑并不立即釋放活性成分至環(huán)境(如血液、胃、腸、結(jié)腸)中，而是在預(yù)定量的時(shí)間內(nèi)釋放活性成分。因此，相對(duì)恒定或可以預(yù)見的變化量的活性劑可以在指定的時(shí)間段內(nèi)遞送。措辭例如"延長(zhǎng)作用"、"重復(fù)作用"、"持續(xù)釋放"、"緩慢釋放"和"控制釋放"也已被用來(lái)描述這樣的制劑或劑型。延緩釋放可因此被描述為一種與常規(guī)即釋劑型比較，允許至少減少給藥頻率一半的劑型或制劑。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"活性成分"意指他汀類藥物、CysLTR2的拮抗劑和/或LTC4生物合成的抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的藥用組合物包含10、20、30、40、50、60、70或80 mg他汀類藥物。

構(gòu)成治療的組分的組合可同時(shí)地(作為離散的劑型或作為單一組合物)、順序地，或者經(jīng)一個(gè)合適的時(shí)間間隔分開給予。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。當(dāng)組分作為分開的劑型，即不作為合并的組合物給予時(shí)，各組分可以相同的形式或不同的形式，如口服、經(jīng)鼻、胃腸外，或經(jīng)皮給予。當(dāng)化合物同時(shí)、順序或分開給予時(shí)，各組分可作為分開的劑型提供。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀的他汀類藥物或任何其它的膽固醇生物合成抑制劑，與選自批準(zhǔn)的藥物例如齊留通和實(shí)驗(yàn)藥物例如BAY-cysLT2、MK-886、阿曲留通等的LTC4活性抑制劑一起的組合療法。組合療法的劑量將在與批準(zhǔn)的藥物在分開給予時(shí)的劑量類似的范圍內(nèi)。組合療法可通過任何批準(zhǔn)的給予形式給予并優(yōu)選作為口服給予的含有他汀類藥物和MGST2-LTC4途徑的抑制劑二者的單一丸劑提供。

在一個(gè)方面，LTC4抑制劑是能夠抑制選自以下的多肽的表達(dá)的RNA干擾劑：LTC4、MGST2、cPLA2、5-LO、FLAP、CysLTR2及其任何組合。每一種可能性表示本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案。

根據(jù)本發(fā)明，“RNA干擾劑”或"RNAi藥物"是經(jīng)基因改造為能夠在靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄雙鏈RNA的雙鏈RNA或者DNA構(gòu)建體，所述雙鏈RNA包含與選自以下的多肽的核苷酸序列至少70%互補(bǔ)的RNA鏈：LTC4、MGST2、cPLA2、5-LO、FLAP、CysLTR2或其同源物或片段或部分。

根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供與選自LTC4、MGST2、cPLA2、5-LO、FLAP、CysLTR2或其同源物或片段的多肽的核苷酸序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸序列，其中反義寡核苷酸序列能夠與所述多肽或其同源物或片段特異性地雜交，從而抑制LTC4的表達(dá)。

貫穿本申請(qǐng)，本發(fā)明的各種實(shí)施方案可以一定的范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)該理解，在范圍格式內(nèi)的描述僅僅是為了方便和簡(jiǎn)潔，而不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的硬性限制。因此，一個(gè)范圍的描述應(yīng)視為已特別地公開所有可能的子范圍以及在該范圍內(nèi)的各個(gè)數(shù)值。例如，范圍例如從1-6的描述應(yīng)視為已特別地公開子范圍例如從1-3、從1-4、從1-5、從2-4、從2-6、從3-6等，以及在該范圍內(nèi)各個(gè)數(shù)值。例如，1、2、3、4、5和6。這適用于無(wú)論怎樣的范圍寬度。

要理解某些本發(fā)明的某些特征，為了簡(jiǎn)潔起見，其在獨(dú)立的實(shí)施方案的文中描述，也可在單一實(shí)施方案中組合提供。相反，本發(fā)明的各個(gè)特征，為了簡(jiǎn)潔起見，其在單一實(shí)施方案的文中描述，也可分開或以任何合適的亞組合或在合適時(shí)以任何其它描述的本發(fā)明實(shí)施方案提供。在各個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的某些特征不被視為那些實(shí)施方案的必要特征，除非實(shí)施方案在沒有這些要素時(shí)是不起作用的。

如上所述的和如在下文權(quán)利要求部分要求的本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案和方面在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。

特定實(shí)施方案的前文描述將充分揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，以至于對(duì)于各種應(yīng)用，其它實(shí)施方案可通過運(yùn)用現(xiàn)有的知識(shí)容易地修改和/或改編所述特定實(shí)施方案而無(wú)需過度的實(shí)驗(yàn)且不背離通用概念，并且因此，這樣的改編和修改應(yīng)當(dāng)和意欲在本公開的實(shí)施方案的等價(jià)物的意義和范圍內(nèi)來(lái)理解。要理解本文所用的措辭或術(shù)語(yǔ)是為了描述而不是限制的目的。執(zhí)行各種公開的功能的方法、材料和步驟可采取多個(gè)可供選擇的形式而不脫離本發(fā)明。

提出以下實(shí)施例，以更全面地說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。然而，它們決不應(yīng)視為限制本發(fā)明的廣泛范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地設(shè)計(jì)本文公開的原理的許多變化和修改，而不背離本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1 - ER應(yīng)激調(diào)節(jié)MGST2和5-LO的表達(dá)

為確定ER應(yīng)激對(duì)人WISH上皮細(xì)胞和人未分化的HaCaT角質(zhì)細(xì)胞中的MGST2水平的影響，在用衣霉素，一種蛋白糖基化抑制劑(1 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH上皮細(xì)胞和人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞后，微粒體谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(MGST2)和裂解的胱天蛋白酶3 (Casp. 3)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)通過免疫印跡測(cè)定。在圖2A中所示的結(jié)果證實(shí)用衣霉素處理這些細(xì)胞導(dǎo)致ER應(yīng)激，推測(cè)是由于蛋白的錯(cuò)誤折疊所致。值得注意的是，在兩種細(xì)胞類型中，MGST2在早期(未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的保護(hù)期)被下調(diào)，并在晚期(死亡促進(jìn)期)上調(diào)，伴有裂解的胱天蛋白酶3的升高。為評(píng)估MGST2及其產(chǎn)物L(fēng)TC4在ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡中的作用，進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)用于測(cè)定在用布雷菲爾德菌素A，一種蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基氏體的抑制劑(0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH上皮細(xì)胞，和用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理小鼠B16細(xì)胞后5-脂氧合酶(5-LO)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。在圖2B中所示的結(jié)果證實(shí)5-LO，白三烯生物合成的限速酶也在對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)中表現(xiàn)出倒鐘形的表達(dá)模式。因此，LTC4生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵組分受ER應(yīng)激的嚴(yán)格調(diào)節(jié)。它們?cè)谠缙?UPR的促生存期)衰減，并在晚期(死亡促進(jìn)期)上調(diào)。

實(shí)施例2 - ER應(yīng)激觸發(fā)MGST2和5-LO的核易位

為評(píng)價(jià)ER應(yīng)激對(duì)MGST2、cPLA2、5-LO和FLAP的細(xì)胞易位的影響，對(duì)未處理的和用布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理的WISH上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。結(jié)果顯示在對(duì)照人WISH細(xì)胞中，MGST2既存在于ER中，又存在于細(xì)胞核中(數(shù)據(jù)未示出)，并且5-LO既存在于胞質(zhì)中，又存在于細(xì)胞核中(數(shù)據(jù)未示出)。盡管它們?cè)趯?duì)照細(xì)胞中的共同的核位置，5-LO沒有與MGST2共同定位于人WISH上皮細(xì)胞或者HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞中(數(shù)據(jù)未示出)。用布雷菲爾德菌素A，一種阻斷蛋白從ER通往高爾基氏體的毒素，觸發(fā)ER應(yīng)激，導(dǎo)致MGST2和5-LO二者向核的移動(dòng)，如通過用核被膜標(biāo)記物核纖層蛋白(lamin)和核標(biāo)記物Hoechst 33258染色所確定的(數(shù)據(jù)未示出)。此外，ER應(yīng)激觸發(fā)MGST2和5-LO在WISH和HaCaT兩種細(xì)胞中的共同定位(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例3 - ER應(yīng)激觸發(fā)LTC4的整個(gè)生物合成機(jī)器的核易位

肥大細(xì)胞中的Fc受體的激活通過觸發(fā)其整個(gè)生物合成機(jī)器向核被膜的易位啟動(dòng)LTC4的生產(chǎn)。因此，為了檢查ER應(yīng)激對(duì)用于LTC4的生物合成所需的兩種其它的酶的細(xì)胞定位的影響，在用布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理后的WISH細(xì)胞中，5-LO激活蛋白(FLAP)和5-LO的易位和共同定位，通過免疫染色測(cè)定。結(jié)果顯示在對(duì)照細(xì)胞中，F(xiàn)LAP被定位于核和ER中，而cPLA2主要在胞質(zhì)中。盡管它們?cè)趯?duì)照細(xì)胞中的重疊定位，5-LO不與FLAP或cPLA2共同定位(數(shù)據(jù)未示出)。用布雷菲爾德菌素A觸發(fā)ER應(yīng)激造成向核的易位和5-LO與FLAP和cPLA2的共同定位(數(shù)據(jù)未示出)。因此，ER應(yīng)激觸發(fā)向核的易位和一組能夠生成LTC4的酶的共同定位。這種ER應(yīng)激觸發(fā)的易位事件與肥大細(xì)胞的Fc受體激活時(shí)見到的類似，除了其由ER應(yīng)激誘導(dǎo)而不是免疫學(xué)提示并且其涉及MGST2而非LTC4S外。

實(shí)施例4 - ER應(yīng)激觸發(fā)LTC4的基于MGST2的生物合成

為進(jìn)一步評(píng)估基于MGST2的機(jī)器的ER應(yīng)激觸發(fā)的易位是否導(dǎo)致LTC4的生產(chǎn)，進(jìn)行EDC-固定的細(xì)胞的免疫染色，以確定ER應(yīng)激的3種誘導(dǎo)劑(它們通過不同的機(jī)制起作用)對(duì)LTC4生物合成的影響。衣霉素抑制蛋白糖基化，毒胡蘿卜素觸發(fā)鈣離子從ER釋放到胞質(zhì)中，而布雷菲爾德菌素A阻斷蛋白從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基氏體。結(jié)果證實(shí)由這些毒素誘導(dǎo)的ER應(yīng)激造成LTC4的廣泛的生物合成。總而言之，這些結(jié)果提示ER應(yīng)激通過MGST2、5-LO、FLAP和cPLA2的表達(dá)、核易位和共同定位，觸發(fā)MGST2-介導(dǎo)的LTC4生物合成。

實(shí)施例5 - ER應(yīng)激調(diào)節(jié)LTC4受體的表達(dá)和向核的易位

在肥大細(xì)胞中，LTC4被分泌并通過結(jié)合于其兩個(gè)胞質(zhì)膜受體，CysLTR1和CysLTR2對(duì)鄰近的細(xì)胞起作用。然而，先前證實(shí)外源性加入LTC4和LTD4觸發(fā)它們的受體向核被膜的易位(Nielsen, C.K., et al. Cancer Res, 2005. 65(3): p. 732-42)。在用布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理人WISH細(xì)胞，和用衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理小鼠B16細(xì)胞后，通過使用免疫印跡進(jìn)行CysLTR1和CysLTR2表達(dá)的動(dòng)力學(xué)分析。令人吃驚地，如可從圖3中所示結(jié)果見到的，在人WISH上皮細(xì)胞和小鼠B16細(xì)胞中，CysLTR1和CysLTR2在早期(UPR的保護(hù)期)下調(diào)和恢復(fù)，并在UPR的晚期死亡促進(jìn)期進(jìn)一步誘導(dǎo)。

此外，結(jié)果證實(shí)意外的和令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即ER應(yīng)激也觸發(fā)CysLTR1和CysLTR2向核被膜的易位和它們與5-LO的共同-定位。因此，在ER應(yīng)激后，LTC4生物合成機(jī)器和LTC4受體二者共同定位于相同的細(xì)胞隔室，從而促進(jìn)MGST2-生成的LTC4的胞內(nèi)分泌行動(dòng)。

實(shí)施例6 - ER應(yīng)激觸發(fā)LTC4的基于MGST2的生物合成

ER應(yīng)激和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，因?yàn)镋R應(yīng)激觸發(fā)氧化應(yīng)激以及反之亦然。因此，用于測(cè)定MGST2及其產(chǎn)物L(fēng)TC4是否參與ER應(yīng)激觸發(fā)的ROS積聚的試驗(yàn)被進(jìn)行。如先前所報(bào)告的，由衣霉素觸發(fā)的ER應(yīng)激導(dǎo)致ROS的積聚，如通過用超氧化物陰離子指示劑二氫乙啶(DHE)染色所檢測(cè)的。在MGST2用特異性siRNA有效沉默后(圖4B)，ER應(yīng)激觸發(fā)的ROS積聚的水平顯著減少，達(dá)到對(duì)照細(xì)胞的水平(圖4A)。MGST2通過使其不僅偶合于LTA₄，而且也偶合于其它的底物而消耗GSH。為發(fā)現(xiàn)MGST2是否通過耗盡GSH或通過LTC4的生物合成觸發(fā)ROS積聚，使用幾種LTC4受體拮抗劑以及LTC4生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑。由于白三烯介導(dǎo)哮喘的癥狀，白三烯生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和活性的許多不同的抑制劑是可利用的。Reversan抑制LTC4從細(xì)胞輸出。孟魯司特和普侖司特是選擇性CysLTR1受體拮抗劑，BAY-cysLT2是選擇性CysLTR2拮抗劑和BAY-u9773是CysLTR1和CysLTR2二者的雙重抑制劑。由布雷菲爾德菌素A觸發(fā)ER應(yīng)激生成ROS，如通過指示劑二氯-二氫-熒光素二乙酸酯(DCFH-DA, 圖4C, 5)所測(cè)量的。結(jié)果令人驚訝和出乎意料地顯示，經(jīng)測(cè)試的所有CysLTR1和CysLTR2拮抗劑顯著地抑制ER應(yīng)激觸發(fā)的ROS積聚(圖4C, 5)。

與LTC4拮抗劑對(duì)比，MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑reversan (20 μM)在對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)中對(duì)ROS積聚具有一種小的，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義的抑制作用(圖4C)，表明LTC4活性主要在胞內(nèi)分泌。這一重要發(fā)現(xiàn)與先前兩個(gè)LTC4受體易位至核的發(fā)現(xiàn)一致，進(jìn)一步支持ER應(yīng)激觸發(fā)的LTC4行動(dòng)主要是胞內(nèi)分泌的主張。MGST2在ROS積聚中的作用通過其在HEK 293T細(xì)胞中的過度表達(dá)被進(jìn)一步確立(圖4D)，這導(dǎo)致在細(xì)胞ROS中的顯著升高(圖4E)?？傊?，這些結(jié)果表明，MGST2-生成的LTC4是ER應(yīng)激觸發(fā)的氧化應(yīng)激的主要指示物。

實(shí)施例7 - MGST2-LTC4途徑激活核NADPH氧化酶4 (NOX4)和隨后的DNA損傷

最近的研究已鑒定作為最重要的細(xì)胞ROS生產(chǎn)酶的NADH/NADPH氧化酶(NOX)，且ER應(yīng)激被發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)NOX4同工型觸發(fā)氧化應(yīng)激。CysLTR1和CysLTR2屬于的G-蛋白偶聯(lián)受體的幾種配體通過受體-介導(dǎo)的NOX的激活引起氧化應(yīng)激。人WISH細(xì)胞和小鼠B16細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))在BAY-u9773、MK571或孟魯司特的存在或不存在下處理，NOX4水平通過免疫印跡評(píng)估。顯著地，LTC4受體拮抗劑大大地抑制在ER應(yīng)激時(shí)NOX4的表達(dá)(圖6A, 6B)。此外，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (0.66 μg/ml, 24小時(shí))處理WISH細(xì)胞，固定和免疫染色揭示ER應(yīng)激觸發(fā)的NOX4朝向核的易位。因此，NOX4 (在ER應(yīng)激下的主要的ROS生產(chǎn)者)的表達(dá)和激活是LTC4-依賴的。

對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)中的核ROS的積聚將導(dǎo)致氧化DNA損傷。為測(cè)試MGST2-LTC4途徑是否涉及ER應(yīng)激觸發(fā)DNA損傷，測(cè)定氧化DNA衍生物8-羥基-2’脫氧鳥苷(8-OHdG)的形成。用布雷菲爾德菌素A處理HaCaT細(xì)胞導(dǎo)致8-OHdG出現(xiàn)在核中，如通過免疫染色所測(cè)定的(圖6C)。用普侖司特抑制LTC4結(jié)合于CysLTR1顯著地減少核8-OHdG的形成，使用 BAY-u9773抑制LTC4結(jié)合于CysLTR1和CysLTR2二者在減輕DNA損傷中甚至更有效(圖6C)。總之，ER應(yīng)激觸發(fā)的DNA損傷在很大程度上通過MGST2-LTC4途徑介導(dǎo)。

實(shí)施例8 - MGST2-LTC4途徑介導(dǎo)ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡

雖然適度水平的ROS促進(jìn)細(xì)胞增殖，但稱為“毒性閾值”的水平以上的濃度觸發(fā)細(xì)胞死亡。如果LTC4升高ROS在該閾值之上，則它可以是ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡機(jī)器的一部分，如在由缺氧/再灌注所致心肌細(xì)胞死亡的情況下報(bào)告的。此外，NOX2的誘導(dǎo)被鑒定為導(dǎo)致ER應(yīng)激-觸發(fā)的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。為確定MGST2-LTC4途徑是否介導(dǎo)ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡，小鼠B16細(xì)胞用對(duì)照siRNA (siControl)或MGST2-特異性siRNA (siMGST2)轉(zhuǎn)染，用媒介或衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí)) (Tm)處理，然后用結(jié)晶紫染色。結(jié)果證實(shí)有效敲減MGST2顯著地減少ER應(yīng)激觸發(fā)的B16黑素瘤細(xì)胞的死亡(圖7A, 7B)。在一逆向研究中，MGST2在HEK 293T細(xì)胞中的過度表達(dá)顯著地增加細(xì)胞死亡(圖7C)。最終結(jié)論是，MGST2參與ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡。

接著，進(jìn)行了另一個(gè)檢查MGST2產(chǎn)物L(fēng)TC4在人HaCaT前-角質(zhì)細(xì)胞的ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞中的作用的試驗(yàn)。在BAY-u9773 (80 nM)的存在或不存在下，用媒介(對(duì)照)或布雷菲爾德菌素A (BfA, 1.33 μg/ml, 48小時(shí))處理HaCaT細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色。

結(jié)果顯示用雙重CysLTR1和CysLTR2拮抗劑，BAY-u9773預(yù)處理人HaCaT角質(zhì)細(xì)胞，減少由布雷菲爾德菌素A引起的ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡(圖7D)。BAY-u9773也顯著地減少衣霉素-誘導(dǎo)的人WISH細(xì)胞死亡，如通過中性紅分析所測(cè)定的(圖7E)。由于錯(cuò)誤折疊蛋白在ER中的積聚，蛋白酶體抑制劑觸發(fā)ER應(yīng)激和隨后的細(xì)胞死亡。先前已發(fā)現(xiàn)5-脂氧合酶抑制劑齊留通在脊柱損傷和腦缺血后減少細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示齊留通(10 μM)顯著地保護(hù)HaCaT角化細(xì)胞避免由蛋白酶體抑制劑MG262 (50 nM, 24小時(shí), 圖7F)觸發(fā)的死亡。兩種LTC4受體CysLTR1和CysLTR2在肥大細(xì)胞和在人腸上皮細(xì)胞中二聚化。因此可能這些受體之一的選擇性抑制作用將足以減輕LTC4活性。確實(shí)，普侖司特(10 μM)，一種選擇性CysLTR1拮抗劑，顯著地減少布雷菲爾德菌素A-觸發(fā)的人WISH細(xì)胞的死亡(圖7G)。類似地，BAY-cysLT2 (5 μM)，一種選擇性CysLTR2拮抗劑，同樣保護(hù)這些細(xì)胞以避開布雷菲爾德菌素A (圖8A)。

在其作為MRP1抑制劑的活性上面，MK571是有效的選擇性CysLTR1拮抗劑。用MK571 (10 μM)預(yù)處理鼠B16黑素瘤細(xì)胞顯著地減少由衣霉素、毒胡蘿卜素和布雷菲爾德菌素A觸發(fā)的細(xì)胞死亡(圖8B)。這種保護(hù)作用與減輕細(xì)胞壞死相關(guān)，如通過減少HMGB1向培養(yǎng)基中的分泌所證實(shí)(圖8C)。

總之，本文提供的結(jié)果鑒定了一種先前未識(shí)別的ER應(yīng)激觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其介導(dǎo)ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡。

實(shí)施例9 - MGST2缺乏減少體內(nèi)ER應(yīng)激觸發(fā)的死亡

純合子MGST2缺乏小鼠從129svEvBrd小鼠品系ES細(xì)胞基因誘捕文庫(kù)建立。從Mgst2敲除小鼠和它們的WT和雜合同窩出生小鼠的尾尖獲得的DNA樣本的PCR證實(shí)Mgst2的靶向等位基因是無(wú)效突變(圖9A)。MGST2-缺乏小鼠正常飼養(yǎng)并且看起來(lái)與它們的野生型同窩出生小鼠無(wú)法區(qū)別，在體重和食物攝取方面沒有明顯的差別。WT和第2代MGST2-缺乏小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞用媒介(對(duì)照)或衣霉素(1 μg/ml, 24小時(shí))處理。然后用結(jié)晶紫染色各板。結(jié)果顯示第2代MGST2-缺乏的鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFS)對(duì)由衣霉素引起的ER應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞死亡，比WT MEFS具有顯著更大的抗性(圖9B)。與WT MEFs比較，用DCFH-DA染色顯示在對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)中幾乎完全缺乏ROS積聚(圖9C)。

為評(píng)價(jià)MGST2在體內(nèi)ER應(yīng)激的作用，采用急性腎損傷的小鼠模型。在0天用衣霉素(1 mg/kg體重)經(jīng)ip注射給WT和MGST2-缺乏小鼠。在第4天收集的蘇木精-曙紅染色的WT腎切片的組織學(xué)檢查揭示對(duì)WT小鼠近端小管的預(yù)期的損傷，而MGST2-缺乏小鼠的組織學(xué)照片是明顯輕微的，如由空泡的數(shù)量測(cè)定的(圖9D, 9E)。為進(jìn)一步研究MGST2-LTC4途徑在ER應(yīng)激觸發(fā)的發(fā)病率中的作用，更高劑量的衣霉素被注射到小鼠中。MGST2缺乏小鼠對(duì)2.5 mg/kg的單一衣霉素劑量具有比WT小鼠顯著更大的抗性(圖9F)。而且，給予普侖司特伴隨2.5 mg/kg衣霉素與單獨(dú)的衣霉素比較大大地減少WT小鼠的發(fā)病率和死亡率(圖9G)。

實(shí)施例10 - 普侖司特保護(hù)人WISH細(xì)胞避免辛伐他汀-觸發(fā)的細(xì)胞死亡

為研究MGST2-LTC4途徑在他汀類藥物-觸發(fā)的細(xì)胞死亡中的作用，在普侖司特(10 μM)或者媒介的存在下，用各種濃度的辛伐他汀或媒介在96孔板中處理人WISH上皮細(xì)胞48 h。結(jié)果顯示普侖司特減少由寬范圍(0.5-4 μg/ml)的辛伐他汀濃度觸發(fā)的細(xì)胞死亡(圖10)。

實(shí)施例11 – BAY-cysLT2和BAY-u9773保護(hù)小鼠C2C12肌細(xì)胞避免辛伐他汀-觸發(fā)的細(xì)胞死亡

為研究MGST2-LTC4途徑在他汀類藥物-觸發(fā)的細(xì)胞死亡中的作用，在媒介、BAY-cysLT2 (10 μM)或者BAY-u9773 (1 μM)或者甲羥戊酸納的存在下，用10 uM辛伐他汀或媒介在96孔板中處理分化的小鼠C2C12肌細(xì)胞5天。結(jié)果顯示 BAY-cysLT以及BAY-u9773減少由辛伐他汀觸發(fā)的細(xì)胞死亡。對(duì)比之下，CysLTR1拮抗劑普侖司特不能保護(hù)這些細(xì)胞免遭辛伐他汀的毒性作用(圖11A, 11B)。

實(shí)施例12 – 齊留通保護(hù)小鼠C2C12肌細(xì)胞避免辛伐他汀-觸發(fā)的細(xì)胞死亡

為研究MGST2-LTC4途徑在他汀類藥物-觸發(fā)的細(xì)胞死亡中的作用，在媒介、齊留通(10 μM)或甲羥戊酸納的存在下，用20 uM辛伐他汀或媒介在96孔板中處理分化的小鼠C2C12肌細(xì)胞4天。結(jié)果顯示齊留通減少由辛伐他汀觸發(fā)的細(xì)胞死亡。作為對(duì)比，CysLTR1拮抗劑孟魯司特不能保護(hù)這些細(xì)胞避免辛伐他汀的毒性作用(圖12A, 12B)。

實(shí)施例13 - 齊留通在減輕他汀類藥物治療副作用中的作用

齊留通對(duì)經(jīng)歷他汀類藥物治療(用于治療高膽固醇血癥)和已報(bào)道患有不同程度的肌肉疼痛和疲勞的患者的作用被測(cè)試。

患者在-1、0、+1、+2和+4周接觸或者參與臨床。在第一周(WK(-l))的臨床中，患者的他汀類藥物的詳情被記錄且注明每日劑量。也使用McGill疼痛問卷表(McGill Pain Questionnaire) (Melzack, R., 1975 "The McGill Pain Questionnaire: Major Properties and Scoring Methods". Pain 1:277-299，其公開內(nèi)容通過引用以其全文包括在本文中)，疼痛評(píng)分指數(shù)(Pain Rating Index) (PRI)和現(xiàn)時(shí)疼痛強(qiáng)度(Present Pain Intensity) (PPI)量表對(duì)患者的疼痛評(píng)分。在PRI指數(shù)中，其包含兩個(gè)分?jǐn)?shù)，較高的評(píng)分表示疼痛的水平增加。在PPI指數(shù)中，現(xiàn)時(shí)疼痛給出0-5的分?jǐn)?shù)，其中0表示無(wú)疼痛和5表示極度疼痛。在WK(-1)也對(duì)患者的疲勞使用疲勞沖擊量表(Fatigue Impact Scale)進(jìn)行評(píng)分(Fisk, J.D. et al, 1994, "Measuring the functional impact of fatigue: Initial Validation of the Fatigue Impact Scale"，Clinical Infectious Disease, 18 (Suppl l):S79-83，其公開內(nèi)容通過引用以其全文包括在本文中)。

在WK(0)和WK(+4)從患者采集血樣以測(cè)定肌酸激酶濃度(CK) (單位/L) (作為肌肉創(chuàng)傷的血液測(cè)量)和HDL-膽固醇或LDL-膽固醇各自的基線水平和甘油三酯水平。要注意到血肌酸激酶濃度的正常范圍是0-200單位/L。

在WK(0)開始并在整個(gè)研究中繼續(xù)，患者被要求服用2400 mg齊留通的每日總劑量，每日口服給予4次(600 mg片)或每日兩次1200 mg緩釋片劑。

為測(cè)試齊留通對(duì)患者的作用，確定PRI、PPI和FIS評(píng)分的問卷表在+1、+2和+4周后進(jìn)行。在+1和+2周時(shí)，患者通過電話聯(lián)系并被要求郵寄他們的自我評(píng)估問卷表到診所。

特定實(shí)施方案的前文描述將充分揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，以至于對(duì)于各種應(yīng)用，其它實(shí)施方案可通過運(yùn)用現(xiàn)有的知識(shí)容易地修改和/或改編所述特定實(shí)施方案而無(wú)需過度的實(shí)驗(yàn)且不背離通用概念，并且因此，這樣的改編和修改應(yīng)當(dāng)和意欲在本公開實(shí)施方案的等價(jià)物的意義和范圍內(nèi)來(lái)理解。要理解本文所用的措辭或術(shù)語(yǔ)是為了描述而不是限制的目的。執(zhí)行各種公開的功能的方法、材料和步驟可采取多個(gè)可供選擇的形式，而不脫離本發(fā)明。