本發(fā)明涉及用于癌癥的給藥系統(tǒng)，更具體地說，涉及一種硫酸長春新堿脂質體及制備方法和應用。

背景技術：

硫酸長春新堿(vincristinesulfate，vcr)是夾竹桃科植物長春花生物堿類的細胞周期特異性抗腫瘤藥物，抗腫瘤作用靶點是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止于中期。和其它長春花生物堿類一樣，vcr對于許多淋巴組織的惡性腫瘤，包括侵襲性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病，有著很好的治療效果。臨床主要應用于急性白血病、惡性淋巴瘤、神經(jīng)母細胞瘤、慢性淋巴細胞白血病等疾病的治療。雖然vcr抗腫瘤效果好，但vcr制劑體內代謝迅速、半衰期短、神經(jīng)毒性大、胃腸道反應和骨髓抑制作用嚴重，vcr在臨床上的應用受到限制。因此，迫切需要研發(fā)新型靶向藥物制劑，降低vcr的毒副作用、提高白血病的治療效果。

脂質體(liposome)，由磷脂或其他類脂化合物形成的具有雙分子層結構的封閉囊泡，是一種性質穩(wěn)定、在血液循環(huán)中具有長效半衰期的非病毒載體。將抗腫瘤藥物包封在脂質體中，不僅可以保護藥物在進入病灶部位前免受機體酶的分解，延長藥物循環(huán)時間，增加藥物在病灶部位的濃度和作用時間，提高療效，降低毒性；而且和其它傳遞系統(tǒng)相比，脂質體能夠提供優(yōu)越的生物相溶性、生物可降解性、低毒性、尺寸可控性及表面功能可修飾性。

雖然硫酸長春新堿的脂質體制劑傳遞藥物的高效性，降低了硫酸長春新堿的毒副作用，增強了癌癥的治療效果。但是以傳統(tǒng)的卵磷脂、膽固醇制備的常規(guī)脂質體在體內多被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)(reticuloendothelialsystem，res)吞噬，在血液循環(huán)中駐留時間較短，并且其物理化學穩(wěn)定性差，儲存和應用過程中容 易發(fā)生融合聚集，包封藥物容易泄漏，難以抵抗體內的化學和生物的降解，因而也不適于制備尺寸較小的納米顆粒。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題在于，針對常規(guī)磷脂制備的硫酸長春新堿脂質體穩(wěn)定性不高的缺陷，提供一種使用鞘磷脂制備的硫酸長春新堿脂質體及制備方法和應用。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：構造一種硫酸長春新堿脂質體，由硫酸長春新堿以及使用鞘磷脂制備的納米脂質體組成，其中所述硫酸長春新堿包裹在所述納米脂質體中。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體中，所述使用鞘磷脂制備的納米脂質體包括鞘磷脂、磷脂穩(wěn)定劑和膽固醇類成分；其中，所述磷脂穩(wěn)定劑選自二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一種或多種。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體中，所述硫酸長春新堿脂質體的粒徑為100-120nm。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體中，所述硫酸長春新堿脂質體還包括通過化學鍵連接在所述納米脂質體上用于特異識別腫瘤細胞的核酸適配體；所述核酸適配體為sgc8、a10、s2.2、as1411或tls11a。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體中，優(yōu)選地，所述核酸適配體為sgc8，使用鞘磷脂制備的納米脂質體包括以下成分：鞘磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、膽固醇和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物。

本發(fā)明還提供了一種硫酸長春新堿脂質體的制備方法，該制備方法包括：

s1、將鞘磷脂、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在有機溶劑中制備空白脂質體；

s2、使用步驟s1的空白脂質體制備包裹硫酸長春新堿的脂質體；

s3、將核酸適配體連接至包裹硫酸長春新堿的脂質體上，制備硫酸長春 新堿脂質體。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體的制備方法中，所述步驟s1具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉速為100-200rpm/min旋轉并抽真空形成干燥的脂質薄膜，去除有機溶劑；所述脂質薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質體。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質體的制備方法中，所述步驟s1中將鞘磷脂、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能性磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在有機溶劑中制備空白脂質體；且所述方法還包括：s3、在步驟s2制備的硫酸長春新堿脂質體的溶液中按照核酸適配體sgc8和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10加入核酸適配體sgc8，氮氣保護環(huán)境下室溫反應，并透析洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體sgc8，得到連接核酸適配體sgc8的硫酸長春新堿脂質體。

本發(fā)明還提供了一種治療和/或預防腫瘤藥物，該治療和/或預防腫瘤藥物的活性成分為如前所述的硫酸長春新堿脂質體。

本發(fā)明還提供了如前所述的硫酸長春新堿脂質體在治療和/或預防腫瘤中的應用。

實施本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體及制備方法和應用，具有以下有益效果：本發(fā)明使用鞘磷脂來制備納米脂質體，并包裹硫酸長春新堿得到硫酸長春新堿脂質體，其中鞘磷脂含有較多的酰胺鍵能夠更好地抵抗化學和生物的降解，保護脂質體結構的穩(wěn)定，提高腫瘤細胞的藥物富集量，從而提高抗腫瘤效果。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：

圖1為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體的制備方法圖；

圖2為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體的結構示意圖；

圖3a-c分別為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體各個階段顆 粒的透射電鏡圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體各個階段顆粒的粒徑分布圖；

圖5為cem細胞與sgc8/vcr-lipo和vcr-lipo的結合實驗圖；

圖6為荷瘤小鼠在不同的存活率時距接種腫瘤的時間圖；

圖7為不同處理的荷瘤balb/c裸鼠的腫瘤大小圖；

圖8為硫酸長春新堿脂質體的體內靶向作用圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

本發(fā)明提供了一種硫酸長春新堿脂質體，由硫酸長春新堿以及使用鞘磷脂制備的納米脂質體組成，其中硫酸長春新堿包裹在納米脂質體中。本發(fā)明中主要用鞘磷脂制備納米脂質體，其成分包括鞘磷脂、磷脂穩(wěn)定劑和膽固醇類成分。其中鞘磷脂作為一種磷脂，與膽固醇類成分一起共同構成脂質體的基礎物質。該膽固醇類成分選自膽固醇及其衍生物、膽甾烷、膽酸和膽汁酸中的一種或多種。膽固醇類成分具有調節(jié)膜流動性的作用，因此被稱為脂質體的“流動性緩沖劑”。磷脂主要由一個磷酸基團和一個季銨鹽基團組成的親水性基團，以及由兩個較長的烴基組成的親脂性基團。使用的磷脂類可以是天然磷脂，也可以是合成磷脂。天然磷脂主要以卵磷脂，又名磷脂酰膽堿(pc)為主，主要來源于蛋黃磷脂和大豆磷脂，顯中性。合成磷脂主要有二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)等，這些均屬氫化磷脂類。本發(fā)明中選用鞘磷脂(sphingomyelin)來替代常規(guī)的磷脂，這是因為鞘磷脂含有較多的酰胺鍵連接的脂肪鏈，能更好地抵抗化學和生物的降解，保護脂質體結構的穩(wěn)定。

前述磷脂穩(wěn)定劑也稱為mpeg化磷脂或mpeg磷脂，其加入可使由鞘磷脂和膽固醇類成分構成的普通脂質體成為空間穩(wěn)運脂質體、隱形脂質體或長循環(huán)脂質體。該磷脂穩(wěn)定劑選自二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 (dspe-peg)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dmpe-peg)和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(pe-peg)中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種治療和/或預防腫瘤藥物，該治療和/或預防腫瘤藥物的活性成分為本發(fā)明中所述的硫酸長春新堿脂質體。本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體在治療和/或預防腫瘤中具有應用價值。

本發(fā)明還特別針對鞘磷脂提供了適用的硫酸長春新堿脂質體的制備步驟和參數(shù)，這是因為不同磷脂的化學結構和親水性等有所不同，并且包裹的藥物性能不同，導致現(xiàn)有技術中其它磷脂制備包裹抗腫瘤藥物的步驟和參數(shù)并不完全適用于本發(fā)明。請參閱圖1，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體的制備方法，可以制備出如前所述的硫酸長春新堿脂質體。如圖所示，該制備方法包括：

首先，在步驟s1中，將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在有機溶劑中制備空白脂質體。優(yōu)選地，該步驟s1具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉速為100-200rpm/min旋轉并抽真空形成干燥的脂質薄膜，去除有機溶劑；所述脂質薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質體，即使用鞘磷脂制備的納米脂質體。更優(yōu)選地，鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑的摩爾比為55：40：5。

隨后，在步驟s2中，使用步驟s1的空白脂質體制備包裹硫酸長春新堿的脂質體。優(yōu)選地，該步驟s2具體為：將硫酸長春新堿和所述空白脂質體按照質量比1:9-11溶解，并調節(jié)水相ph為中性，放置在50-65℃水浴5-10分鐘，制得包裹硫酸長春新堿的脂質體的溶液。進一步通過冷凍干燥等方式可以得到本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體。

本發(fā)明通過大量實驗證明，采用本發(fā)明方法，并使用鞘磷脂制備的納米脂質體構建的硫酸長春新堿脂質體，與使用常規(guī)磷脂制備的硫酸長春新堿脂質體相比，其性能更為穩(wěn)定，到達腫瘤局部的藥物濃度更高，且能夠有效延長荷瘤小鼠的生存時間。

請參閱圖2，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體的結構示意圖。該硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo，是由空白脂質體(lipo)和硫酸長春新堿(vcr)構成；該空白脂質體為使用鞘磷脂制備的納米脂質體，即peg長循環(huán)脂質體。圖2中標號1代表磷脂(lipid)即鞘磷脂，標號2代表膽固醇(cholesterol)，標號3代表dspe-peg2000。如圖所示，使用鞘磷脂制備的空白脂質體與硫酸長春新堿(vcr)反應后，對vcr進行包裹。

該vcr-lipo的具體制備方法如下：

s1、peg長循環(huán)脂質體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)和dspe-peg2000dspe-peg2000-mal按摩爾比50-60：35-45：4-6加入園底燒瓶中，在50-70℃下用旋轉蒸發(fā)儀，以轉速為100-200rpm/min旋轉并打開真空泵抽真空10-20min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機溶劑。

將瓶底的脂質薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進行水化，50-60℃水浴超聲20-30min后，在液氮、50-60℃水浴反復凍融4-6次。將產(chǎn)物裝入脂質體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各15-25次，最后過50nm的聚碳酸酯膜15-25次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質體質量比1:9-11，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應空白脂質體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調節(jié)外水相ph為7.0-7.2，放置50-65℃水浴5-10分鐘，即制備硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo。

在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體還可進一步包括通過化學鍵連接在納米脂質體上用于特異識別腫瘤細胞的核酸適配體。這些核酸適配體為sgc8、a10、s2.2、as1411或tls11a。其中核酸適配體sgc8可以靶向識別白血病ccrf-cem腫瘤細胞，核酸適配體a10可以靶向識別前列腺腫癌細胞；核酸適配體s2.2和核酸適配體as1411可以靶向識別乳腺癌細 胞；核酸適配體tls11a可以靶向識別肝癌細胞。

本發(fā)明還相應提供了上述連接核酸適配體時的硫酸長春新堿脂質體的制備方法，其在步驟s1制備空白脂質體的過程中需要加入一定量的功能化磷脂，具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能化磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉速為100-200rpm/min旋轉并抽真空形成干燥的脂質薄膜，去除有機溶劑；所述脂質薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質體，即使用鞘磷脂制備的納米脂質體。更優(yōu)選地，鞘磷脂成分、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能化磷脂的摩爾比為55：40：4.7：0.3。本發(fā)明所述功能化磷脂也稱為功能化peg磷脂，其peg一端與鞘磷脂連接，另一端被馬來酰亞胺基、竣基等修飾，除了使脂質體具有空間穩(wěn)定、隱形或長循環(huán)的特點外，功能化peg磷脂所修飾的馬來酰亞胺基、竣基等可與核酸適配體靶頭連接使脂質體具有主動靶向性。該功能性磷脂選自二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物(dspe-peg-mal)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基交聯(lián)物(dspe-peg-cooh)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-n-琥珀酰亞胺(dspe-peg-nhs)和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基交聯(lián)物(dspe-peg-nh2)中的一種或多種，根據(jù)所需連接的核酸適配體確定。

并且，上述連接核酸適配體時的硫酸長春新堿脂質體的制備方法還包括步驟s3，將核酸適配體連接至硫酸長春新堿脂質體上。優(yōu)選地，該步驟具體為在步驟s2硫酸長春新堿脂質體的溶液中按照核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10加入核酸適配體，氮氣保護環(huán)境下室溫反應，并洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體，得到硫酸長春新堿脂質體。本發(fā)明中特別針對鞘磷脂制備的納米脂質體，研究了核酸適配體的優(yōu)化連接量，這是本發(fā)明的另一個獨特之處。這是因為在與脂質體結合時，過少的核酸適配體會影響納米載藥系統(tǒng)的靶向性，過多的適配體會影響納米載藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此本發(fā)明對核酸適配體的投入量進行優(yōu)化，結果顯示核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10范圍內，所形成的脂質體更加符合后續(xù)實驗要求的靶 向藥物傳遞系統(tǒng)。

本發(fā)明中以核酸適配體sgc8、硫酸長春新堿以及鞘磷脂制備的納米脂質體構成的硫酸長春新堿脂質體最為穩(wěn)定，在體內的循環(huán)時間長。該硫酸長春新堿脂質體為靶向急性t淋巴細胞白血病的硫酸長春新堿脂質體系統(tǒng)，其名稱縮寫為sgc8/vcr-lipo。其中使用鞘磷脂制備的納米脂質體采用以下成分構成：鞘磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、膽固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物(dspe-peg-mal)。在其制備方法中，在步驟s1中將前述鞘磷脂、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能性磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在有機溶劑中制備空白脂質體；在步驟s3中：按照核酸適配體sgc8和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10在硫酸長春新堿脂質體的溶液中加入核酸適配體sgc8，氮氣保護環(huán)境下室溫反應，并透析洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體sgc8，得到連接核酸適配體sgc8的硫酸長春新堿脂質體。本發(fā)明還針對核酸適配體sgc8等獲取了優(yōu)化的連接量，其中核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比優(yōu)選為1：9。

實施例1

該實施例1制備硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比55：40：5加入園底燒瓶中，在60℃下用旋轉蒸發(fā)儀，以轉速為200rpm/min旋轉并打開真空泵抽真空10min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機溶劑。

其中sm為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為860061p；膽固醇為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為700100p；dspe-peg2000為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880128p。

將瓶底的脂質薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進行水化，50℃水浴超聲20min后，在液氮、60℃水浴反復凍融5次。將產(chǎn)物裝入脂質體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次，最后過50nm的聚 碳酸酯膜21次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質體質量比1:10，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和5mg空白脂質體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調節(jié)外水相ph為7.0，放置60℃水浴10分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為130501。

實施例2

該實施例2制備硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比50：45：4加入園底燒瓶中，在70℃下用旋轉蒸發(fā)儀，以轉速為100rpm/min旋轉并打開真空泵抽真空20min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機溶劑。

其中原料sm、膽固醇和dspe-peg2000選用的產(chǎn)品與實施例1中相同。

將瓶底的脂質薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進行水化，60℃水浴超聲30min后，在液氮、50℃水浴反復凍融6次。將產(chǎn)物裝入脂質體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各25次，最后過50nm的聚碳酸酯膜15次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質體質量比1:9，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應空白脂質體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調節(jié)外水相ph為7.2，放置65℃水浴5分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿使用的產(chǎn)品與實施例1中相同。

實施例3

該實施例3制備硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比60：35：4：6加入園底燒瓶中，在50℃下用旋轉蒸發(fā)儀，以轉速為200rpm/min旋轉并打開真空泵抽真空15min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機溶劑。

其中原料sm、膽固醇和dspe-peg2000選用的產(chǎn)品與實施例1中相同。

將瓶底的脂質薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進行水化，55℃水浴超聲25min后，在液氮、55℃水浴反復凍融4次。將產(chǎn)物裝入脂質體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各15次，最后過50nm的聚碳酸酯膜25次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質體質量比1:11，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應空白脂質體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調節(jié)外水相ph為7.0，放置50℃水浴8分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿使用的產(chǎn)品與實施例1中相同。

實施例4

該實施例4制備硫酸長春新堿脂質體sgc8/vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、dspe-peg2000和dspe-peg2000-mal按摩爾比55：40：4.7：0.3加入園底燒瓶中，在60℃下用旋轉蒸發(fā)儀，以轉速為200rpm/min旋轉并打開真空泵抽真空10min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機溶劑。

其中sm為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為860061p；膽固醇為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為700100p；dspe-peg2000為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880128p；dspe-peg2000-mal為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880126p。

將瓶底的脂質薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進行水化， 50℃水浴超聲20min后，在液氮、60℃水浴反復凍融5次。將產(chǎn)物裝入脂質體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次，最后過50nm的聚碳酸酯膜21次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質體質量比1:10，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和5mg空白脂質體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調節(jié)外水相ph為7.0，放置60℃水浴10分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為130501。

s3、連接核酸適配體sgc8，制備sgc8/vcr-lipo；

根據(jù)核酸適配體和mal-peg2000-dspe的摩爾比為1：9范圍內，取適量vcr-lipo，加入適量核酸適配體sgc8，在氮氣保護環(huán)境下室溫反應24小時。該核酸適配體sgc8為上海生物工程公司合成，sgc8的核苷酸序列為5’-atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttag(t)10-sh-3’。再加入2mm的β-半胱胺除去未反應的mal基團。用超濾離心管對sgc8/vcr-lipo進行超濾離心后，10000rpm離心10min后，加入1ml去離子水，10000rpm離心10min，洗去游離的硫酸長春新堿、β-半胱胺和核酸適配體sgc8，得到硫酸長春新堿脂質體sgc8/vcr-lipo。

實施例5

該實施例5制備硫酸長春新堿脂質體a10/vcr-lipo。該實施例5與實施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為a10即可。

實施例6

該實施例6制備硫酸長春新堿脂質體s2.2/vcr-lipo。該實施例6與實施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為s2.2即可。

實施例7

該實施例7制備硫酸長春新堿脂質體as1411/vcr-lipo。該實施例7與實施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為as1411即可。

實施例8

該實施例8制備硫酸長春新堿脂質體tls11a/vcr-lipo。該實施例8與實施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為tls11a即可。

本發(fā)明對上述各個實施例制備的硫酸長春新堿脂質體進行了載藥量、包封率、粒徑及對腫瘤細胞的靶向作用及治療作用的實驗，結果表明本發(fā)明中最終制得的硫酸長春新堿脂質體的粒徑為100-120nm。這些硫酸長春新堿脂質體具有良好的穩(wěn)定性，在體內不易被化學和生物降解，能夠很好地靶向至目標部位，且對靶向的腫瘤細胞具有很好的治療效果，尤其采用實施例1和4制備的產(chǎn)品效果最佳。下面以實施例1和4制備的硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo為例對本發(fā)明的實驗效果進行說明。

1、硫酸長春新堿藥物的包封率、載藥量計算

分別取0.3mlvcr-lipo和sgc8/vcr-lipo樣本加入超濾離心管，10000rpm離心10min后，加入1ml去離子水，10000rpm離心10min，洗去游離的vcr。

取超濾離心管濾上液，放入5ml容量瓶，加入250μl10％聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，室溫放置20min，加入二次去離子水(millq)定容至5ml。吸取20μl，在上述色譜條件下注入液相色譜儀中，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算包入脂質體的藥物含量。按照以下公式計算脂質體的載藥量和包封率：

dlc(％)＝[脂質體中藥物量/(脂質體中藥物+載體總量)]×100％；

包封率dle(％)＝(脂質體中包封的藥物/脂質體中藥物總量)×100％。

實驗測得本發(fā)明實施例1制得的sgc8/vcr-lipo的載藥量為14.16％，包封率為90.63％。vcr-lipo的載藥量為13.23％，包封率為91.07％。

2、粒徑檢測

請參閱圖3a-c，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體各個階 段顆粒的透射電鏡圖。該實驗中使用的透射電鏡為型號為h-7650的日立透射掃描電子顯微鏡，加速電壓為80kv，放大倍率為200000x。圖3a為空白脂質體lipo，圖3b為包裹硫酸長春新堿的納米脂質體vcr-lipo，圖3c為連接核酸適配體的硫酸長春新堿脂質體sgc8/vcr-lipo。請結合參閱圖4，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例的硫酸長春新堿脂質體各個階段顆粒的粒徑分布圖。其中，a為空白脂質體lipo；b為vcr-lipo；c為sgc8/vcr-lipo。結果顯示，每種納米粒子的粒徑分布均呈現(xiàn)正態(tài)分布，空白脂質體lipo的粒徑在90nm左右；vcr-lipo的粒徑在100nm左右；sgc8/vcr-lipo的粒徑在110nm左右。

3、硫酸長春新堿脂質體對腫瘤細胞的靶向作用

將實施例1和4的磷脂雙分子層中標記細胞膜紅色熒光探針(dii)熒光染料,在核酸適配體sgc8上標記異硫氰酸熒光素(fitc)熒光。分別得到fitc和dii同時標記的sgc8/vcr-lipo，以及dii標記的空白脂質體lipo。

在15ml離心管中加入3×10⁶cem細胞，每管分別加入dii標記的lipo、sgc8/vcr-lipo(核酸適配體的終濃度控制在200nm)，37℃孵育20-30min。離心收集細胞并用pbs洗3次。用多聚甲醛(4％)固定30min后用pbs洗3次。細胞用1mg/mldapi染核5分鐘，用pbs洗3次并離心收集細胞。在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度并拍照。

請參閱圖5，為cem細胞與sgc8/vcr-lipo和vcr-lipo的結合實驗圖。其中dapi為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，用于染細胞核，呈藍色熒光；dii用于標記脂質體，呈紅色熒光；fitc用于標記核酸適配體sgc8，呈綠色熒光；merge表示帶有熒光的納米材料與不同細胞結合合并的熒光。圖5中a為sgc8/vcr-lipo與cem細胞孵育后的熒光圖；b為vcr-lipo與cem細胞孵育后的熒光圖；c為con/vcr-lipo與cem細胞孵育后的熒光圖；con代表對照適配體，其與核酸適配體sgc8具有相同堿基數(shù)的dna序列，但是與靶細胞不結合。

4、硫酸長春新堿脂質體對腫瘤的治療作用

分別將vcr、vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo用pbs溶解或懸浮，得到vcr濃度均為1.0ng/μl的vcr注射液、vcr-lipo注射液和sgc8/vcr-lipo注射液。

取4-6周齡的近交系雌性裸鼠(balb/cnudemice)，每只于左前肢腋窩皮下接種1×10⁷個ccrf-cem(人急性淋巴細胞白血病t淋巴細胞)。該近交系雌性裸鼠(balb/cnudemice)為上海邦耀生物技術有限公司產(chǎn)品。ccrf-cem腫瘤細胞為由湖南大學譚蔚泓教授饋贈。取一批30只荷瘤裸鼠，隨機分成五組，其中一組每只荷瘤balb/c裸鼠的尾靜脈中注射200μlsgc8/vcr-lipo進行治療，將第一次注射記為治療第0天，分別在治療第3天、治療第6天和治療第9天均注射200μl上述sgc8/vcr-lipo注射液，共處理6只荷瘤balb/c裸鼠。

按照上述方法，分別將sgc8/vcr-lipo注射液替換為pbs、vcr注射液、vcr-lipo注射液和sgc8-lipo注射液，其他步驟均不變，分別得到pbs治療的荷瘤小鼠、vcr治療的荷瘤小鼠、vcr-lipo治療的荷瘤小鼠、sgc8-lipo治療的荷瘤小鼠。從治療第1天開始記錄每組荷瘤balb/c裸鼠的存活時間，統(tǒng)計存活率參見圖6和表格1。表格1為荷瘤小鼠在不同的存活率時距接種腫瘤的時間(天)。

表格1

結果顯示，vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo能明顯延長荷瘤balb/c裸鼠的生存時間。vcr-lipo在治療的荷瘤balb/c裸鼠存活率為50％時距第1次治療的時間分別為pbs、sgc8/lipo和vcr的治療的荷瘤小鼠存活率為50％時距第1次治療的時間的1.78倍、1.64倍和1.08倍。在sgc8/vcr-lipo治療的荷瘤balb/c裸鼠存活率為50％時距第1次治療的時間分別為pbs、sgc8/lipo、vcr、vcr-lipo的治療的荷瘤小鼠存活率為50％時距第1次治療的時間的2.18倍、2.0倍、1.32倍和1.22倍。

圖7為不同處理的荷瘤balb/c裸鼠的腫瘤大小。圖7中為開始治療后的第十天，處死老鼠，取出腫瘤的拍攝照片之后的樣品圖，每組取5個樣品，通過游標卡尺測量其腫瘤體積。圖8為硫酸長春新堿脂質體的體內靶向作用圖，分別在0.5h、2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h分別對處理后的荷瘤balb/c裸鼠進行活體成像拍攝，腫瘤區(qū)域為右上肢背部。實驗證明，vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強度明顯高于dir組。并且，本發(fā)明的sgc8修飾的硫酸長春新堿脂質體sgc8/vcr-lipo對腫瘤有靶向作用：熒光標記的sgc8/vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強度明顯高于熒光標記的vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強度。

上述實驗結果表明，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo具有很好的抗腫瘤效果，可明顯抑制腫瘤生長，延長荷瘤balb/c裸鼠的生存時間。

綜上所述，本發(fā)明制備的硫酸長春新堿脂質體具有以下特點：

(1)本發(fā)明在制備脂質體過程中，選擇了含有較多的酰胺鍵連接脂肪鏈的鞘磷脂，與其它常用的磷脂相比，其能更好地抵抗化學和生物的降解，保護脂質體結構的穩(wěn)定；實驗結果表明，即使制備的硫酸長春新堿脂質體粒徑為100nm左右時也能維持到達靶向部位的藥物濃度；

(2)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體可選擇是否連接核酸適配體，并且當連接時對核酸適配體例如sgc8的連接濃度的優(yōu)化，不僅保證了脂質體傳遞系統(tǒng)的穩(wěn)定，而且最大程度增加了該系統(tǒng)的靶向性；

(3)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體的制備方法簡單，可大規(guī)模制備；

(4)本發(fā)明在制備納米脂質體時加入了peg2000，使得納米藥物傳遞系統(tǒng)在體內的循環(huán)時間長；

(5)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體可以實現(xiàn)對腫瘤的靶向，提高腫瘤細胞的藥物富集量，從而提高抗腫瘤效果。實驗證明，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質體能抑制腫瘤的生長，并能延長荷瘤動物的存活時間，可用來治療腫瘤。

本發(fā)明是根據(jù)特定實施例進行描述的，但本領域的技術人員應明白在不脫離本發(fā)明范圍時，可進行各種變化和等同替換。此外，為適應本發(fā)明技術的特 定場合或材料，可對本發(fā)明進行諸多修改而不脫離其保護范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開的特定實施例，而包括所有落入到權利要求保護范圍的實施例。