專利名稱：一種生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法，特別涉及一種利用植物細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)和代謝調(diào)控技術(shù)生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法。
技術(shù)背景長春花(periwinkle)拉丁名為(CflAara"Ai^ (L) G. Don)是夾竹桃科中生物堿含量較為豐富的一屬。長春花生物堿主要有Aspicospermatan型如文多靈 (Vindoline)等、Ibogan型如長春質(zhì)堿(Catharanthine)等、Corynanthean型如阿瑪堿 (Ajmalicine)和蛇根堿(Serpentine)等和Bisindoles型如長春堿(Vinblastine)和長春新堿 (Vincristine)等。五十年代中期， 一些學(xué)者在研究長春花植物降血糖作用時分別發(fā)現(xiàn)長春花植物 的提取物還具有降低白血球的作用，1958年，加拿大Noble和Beer等共同分離了這 一活性成分，命名為Vinblastine(長春堿)并制備了其硫酸鹽。隨后美國Lilly公司證 明了長春花粗生物堿和VLB可治療急性淋巴白血病，同時證明Leurosine(洛諾生) 也具有抗癌作用，隨后又發(fā)現(xiàn)Leurosidine(長春羅賽定)和Leurocristine(長春新堿)也 有抗癌作用(CuttsJH,etal Cancer Res. 1960, 20: 1023)。后來，藥理學(xué)家證明長春堿 和長春新堿的抗癌機理是其與微管蛋白結(jié)合，阻滯微管蛋白聚合形成微管和誘導(dǎo)微 管解聚，因而使細(xì)胞停止在細(xì)胞分裂中期而死亡(Cutts JH, et al Cancer Res. 1960, 20: 1023JohnsonlS. Cancer Res. 1960, 20: 1016-1022)。這一發(fā)現(xiàn)震動世界，人們迅速開 始研究長春花抗癌活性。隨后美國Lily公司證明了長春花粗生物堿可治療急性淋巴 白血病；長春新堿(Vincristine)具有抗癌作用；并開發(fā)了長春花堿和長春新堿，應(yīng)用 于臨床。長春花堿在臨床上主要用做治療何杰金氏病以及絨毛膜癌，對乳腺癌效果 也較好，長春新堿主要用于治療兒童急性淋巴白血病和髓白血病，它們同時具有光 譜抗癌活性。藥理學(xué)家證明長春堿和長春新堿的抗癌機理是其與微管蛋白結(jié)合，阻 滯微管蛋白聚合形成微管和誘導(dǎo)微管解聚，因而使細(xì)胞停止在細(xì)胞分裂中期而死亡。至今長春堿和長春新堿仍主要從長春花植物中提取，長春花是該生物堿的唯一 來源植物。由于這兩種生物堿在植物體內(nèi)含量很低，分別為十萬分之幾和百萬分之 幾，并無法用化學(xué)合成的方法生產(chǎn)，使市場價格非常高。盡管其在臨床上有劑量依 賴的神經(jīng)毒副作用，使其應(yīng)用受到一定限制。但由于其廣泛的臨床和其它應(yīng)用及改 造潛力，藥物化學(xué)家們?nèi)栽谂υ噲D用化學(xué)方法合成它們，或進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以尋求高效低毒的類似物。生物學(xué)家也很早便開始研究用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法來生產(chǎn)這些生物堿(Jian Zhao, Wei Hua Zhu, Qiu Hu. Enhanced catharanthine production in Catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors， Enzyme and Microbial Technology. 2001, 28: 673~681; Kutney JP, Awery B, Choi LS, et al. The synthesis and biosynthesis of indole alkaloids, Tetrahedron, 1983, 39, 3781)。自60年代國外就開始研究長春花組織培養(yǎng)生產(chǎn)吲哚生物堿，從70年代末開 始，用此來生產(chǎn)長春花生物堿的研究成為生物工程領(lǐng)域的一個熱點，但至目前為止， 仍未能從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中獲得這兩種抗癌生物堿，僅可生產(chǎn)阿瑪堿、蛇根堿和長春 質(zhì)堿，也未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法，是將長春花多倍體細(xì)胞株接 種于合成培養(yǎng)基中，于20 29'C，培養(yǎng)3 7天得到富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞；所述合成培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基中添加0 5mg/L植物細(xì)胞生長素、0 5mg/L 植物細(xì)胞分裂素，30 60 g/L蔗糖、1 50pg/L乙酰輔酶A、 10 40jig/L過氧化氫、 0.1 2pmol/L苯丙三氮唑、10 150mg/L色氨酸、10 110mg/L馬錢子苷、10 50mg/L 氯化鈰得到的液體培養(yǎng)基。所述方法中，所述長春花多倍體細(xì)胞株接種于合成培養(yǎng)基的接種量為200 400g/L。所述方法中，所述合成培養(yǎng)是在80 130rpm/分轉(zhuǎn)速搖培。所述合成培養(yǎng)的溫度 優(yōu)選為25 29'C，所述合成培養(yǎng)的時間可為4-7天。所述方法中，所述長春花多倍體細(xì)胞株是將長春花愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行多倍體誘 導(dǎo)培養(yǎng)得到的。所述多倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)是將長春花愈傷組織細(xì)胞用含10-40mg/L秋水 仙堿的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)得到長春花多倍體細(xì)胞株。所述方法中，所述長春花多倍體細(xì)胞株在合成培養(yǎng)之前在20 25。C，避光條件 下擴增培養(yǎng)2 3周；所述擴增培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加0 5mg/L植物細(xì)胞分裂素，0 5mg/L植 物細(xì)胞生長素，20 60g/L蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。所述方法中，所述長春花多倍體細(xì)胞株在所述擴增培養(yǎng)之前進(jìn)行繼代培養(yǎng)3代 以上；所述繼代培養(yǎng)用培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加20-60g/L蔗糖，1.0-5mg/L植物 細(xì)胞生長素和1.0-5mg/L植物細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基；所述繼代培養(yǎng)的條件為20 25°C，避光條件。所述方法中，所述基本培養(yǎng)基為按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將其中 的CuS04.5H20和CoCl2.6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸 得到的培養(yǎng)基；所述植物細(xì)胞分裂素為6 —卞氨基嘌呤或激動素；所述植物細(xì)胞生 長素為吲哚乙酸或a—奈乙酸。所述方法中，所述擴增培養(yǎng)基的pH值為5.6 7.0;所述合成培養(yǎng)基的pH值為 5.8 7.0。所述方法中，還包括將所述富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞用溶劑萃取獲得含有 長春堿和長春新堿的粗提物，再經(jīng)過純化獲得長春堿和/或長春新堿；所述溶劑為體 積百分濃度為95%的乙醇溶液或甲醇溶液。本發(fā)明的方法合理地解決了長春花細(xì)胞生長與長春堿和長春新堿合成的相互矛 盾，可以在3周內(nèi)獲得300 500g/L新鮮細(xì)胞，并利用活細(xì)胞作為微反應(yīng)器，采取 代謝調(diào)控技術(shù)快速促進(jìn)長春堿和長春新堿的合成，可以在3 7天內(nèi)將長春堿和長春 新堿的含量提高到細(xì)胞干重的千分之一以上，超過天然植物枝葉的50倍左右。本發(fā) 明的方法用長春花細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿，可穩(wěn)定的實現(xiàn)長春堿和長春新 堿的工業(yè)化生產(chǎn)，并且其生產(chǎn)成本較低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境以及氣候的影 響，可以實現(xiàn)周年生產(chǎn)。
具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所述的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。 實施例1、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng) 1)長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養(yǎng)基中，在2000k，12-16小時照 光，25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟 2)所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快，質(zhì)地松軟， 生長量穩(wěn)定的細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸1.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA1.0mg/L， 20g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊脂，在115"C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織的繼代馴化培養(yǎng) '將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為2(TC室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng) 過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代馴化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.0mg/L的植物細(xì)胞生長 素NAA， 1.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 20g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)1I5°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板繼代馴化培養(yǎng)基。3) 長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入10mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915),做成液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在2(TC， 避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙堿的繼 代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生 長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅或銀染色 后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。4) 長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在生長培養(yǎng)基上，在2(TC，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)3周后，獲得接種量IO倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuS(V5H2O和CoC^6H2O的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加2mg/La—萘乙酸(NAA) ， 4mg/升6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和20g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.7，再添加4.5g/L瓊 脂，在115"， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。2、長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的生長旺盛的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)， 接種量為250g/L，在25t:，避光條件，80轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)7天得到富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng) 器繼續(xù)反復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuS(V5H20和CoClr6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖30g/L， B引哚乙酸(IAA)0mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 一BA) lmg/L，用酸或堿將pH值調(diào)整到7.0，在115"C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 10pg/L、過氧化氫 10嗎/L、苯丙三氮唑O.5nmol/L、色氨酸50mg/L、馬錢子苷50mg/L、氯化鈰20mg/L)， 用無菌的酸或堿將pH值調(diào)整到7.0，制成合成培養(yǎng)基。 3、長春堿和長春新堿的提取將步驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高 速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長 春新堿的含量，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.0mg/g細(xì)胞干重，長春堿和長春 新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.1 %以上。。實施例2、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿 1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng)1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的節(jié)間作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將節(jié)間切成2毫米長的莖斷接種到脫分化培養(yǎng)基中，在2000k,12-16小時照光， 25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2) 所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快，質(zhì)地松軟， 生長量穩(wěn)定的細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸2.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA2.0mg/L， 30g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊月旨， 在115'C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養(yǎng)將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為2(TC室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng) 過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.0mg/L的植物細(xì)胞生長素 NAA， 2.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 30g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)U5。C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基。3) 長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入20mg/L秋水仙堿(Sigma, C3915),做成液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在2(TC， 避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙堿的繼 代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生 長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅或銀染色 后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。4)長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在擴增培養(yǎng)基上，在25。C，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)2周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuS(V5H2O和CoC1^6H2O的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加0mg/La—萘乙酸(NAA) ， lmg/L激動 素(KT)和25g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到6.0，再添加5g/L瓊脂，在 115"， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。2、 長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為 200g/L，在26"C，避光條件，100轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)5天得 到富含長春堿或長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反 復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuS(V5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖40g/L， a—萘乙酸(NAA)0.5mg/L， 6 —卞氨基嘌 呤(6—BA) lmg/L，用酸或堿將pH值調(diào)整到6.0，在115。C， 0.1MPa壓力下消毒15 分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A5pg/L、過氧化氫 20|ig/L、苯丙三氮唑0.1pmol/L、色氨酸10mg/L、馬錢子苷10mg/L、氯化鈽10mg/L)， 用無菌的酸或堿將pH值調(diào)整到6.0，制成合成培養(yǎng)基；3、 長春堿和長春新堿的提取將步驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高 速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的甲醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長春新堿的含量，結(jié)果表明，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.1mg/g細(xì)胞干重，長 春堿和長春新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.11%以上。實施例3、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng)1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的葉片作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將葉片延葉脈切成0.5厘米見方的小塊接種到脫分化培養(yǎng)基中，在2000bc，12-16 小時照光，25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放 在步驟2)所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快， 質(zhì)地松軟，生長量穩(wěn)定的細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸3.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA3.0mg/L， 40g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊月旨， 在115X:， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養(yǎng)將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為2(TC室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng) 過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3.0mg/L的植物細(xì)胞生長素 NAA， 3.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 40g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)115°C ， O.lMPa 壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板繼代馴化培養(yǎng)基。3、長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入30mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915),做成液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在2(TC， 避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙堿的繼 代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生 長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅或銀染色 后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。4)長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在擴增培養(yǎng)基上，在22t:，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuSCV5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加lmg/L卩引哚乙酸(IAA) ， 0mg/L6 —卞氨 基嘌呤(6—BA)和30g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，再添加5g/L瓊脂， 在115X:， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。
2、 長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的生長旺盛的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)， 接種量為250g/L，在27t:，避光條件，90轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)6天得到富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng) 器繼續(xù)反復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuSCV5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖50g/L， a —萘乙酸(NAA) lmg/L，激動素(KT) lmg/L，用酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，在115"， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷 卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A5pg/L、過氧化氫30)ig/L、 苯丙三氮唑l|imol/L、色氨酸100mg/L、馬錢子苷100mg/L、氯化鈰30mg/L)，用無 菌的酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，制成合成培養(yǎng)基；
3、 長春堿和長春新堿的提取將步驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高 速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長 春新堿的含量，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.0mg/g細(xì)胞干重，長春堿和長春 新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.1%以上。實施例4、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿 1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng) 1)長春花愈傷組織的獲得將長春花的葉片作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將葉片延葉脈切成0.5厘米見方的小塊接種到脫分化培養(yǎng)基中，在2000k,12-16小時照光，25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放 在步驟2)所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快， 質(zhì)地松軟，生長量穩(wěn)定地細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸4.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA4.0mg/L， 45g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊脂， 在115'C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養(yǎng)將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為2(TC室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng) 過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加4.0mg/L的植物細(xì)胞生長素 NAA， 4.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 50g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)115°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基。3) 長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入35mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體合成培養(yǎng) 基，步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該合成培養(yǎng)基內(nèi)，在 20°C，避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙 堿的繼代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度 更快(生長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅 或銀染色后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。4) 長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在擴增培養(yǎng)基上，在24。C，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)2.5周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuS(V5H20和CoClr6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加Omg/La—萘乙酸(NAA) ， 0.5mg/L 6 — 卞氨基嘌呤(6—BA)和40g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加5g/L瓊 脂，在115'C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。2、長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的生長旺盛的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)， 接種量為300g/L，在28'C，避光條件，120轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)5天得到富含長春堿或長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng)器繼續(xù)反復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuS(V5H20和CoCV6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖40g/L，吲哚乙酸(IAA) lmg/L，激動素(KT) 2mg/L， 用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，在115°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理； 冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A40嗎/L、過氧化氫40嗎/L、苯丙三 氮唑1.5pmol/L、色氨酸150mg/L、馬錢子苷50mg/L、氯化鈰20mg/L)，用無菌的 酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，制成合成培養(yǎng)基。3、長春堿和長春新堿的提取將步驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高 速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長 春新堿的含量，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.1mg/g細(xì)胞干重，長春堿和長春 新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.11%以上。實施例5、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿 1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng)1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養(yǎng)基中，在2000bc,12-16小時照 光，25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟 2)所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快，質(zhì)地松軟， 生長量穩(wěn)定地細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊月旨， 在115'C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養(yǎng)將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為2(TC室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng)過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5.0mg/L的植物細(xì)胞生長素 NAA， 5.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)115°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基。3) 長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入40mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915),做成液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在2(TC， 避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙堿的繼 代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生 長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅或銀染色 后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。4) 長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在擴增培養(yǎng)基上，在23"，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuS04，5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加5mg/La—萘乙酸(NAA) ， 5mg/L6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，再添加5g/L瓊 脂，在115。C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。2、 長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的生長旺盛的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為350g/L，在29'C，避光條件，130轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)4天得到富含長春堿或長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng) 器繼續(xù)反復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuS(V5H20和CoCV6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖50g/L，吲哚乙酸(IAA)5mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 一BA) 3mg/L，用酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，在115"C， O.lMPa壓力下消毒15分 鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A3(Vg/L、過氧化氫 20嗎/L、苯丙三氮唑2pmol/L、色氨酸50mg/L、馬錢子苷110mg/L、氯化鈰40mg/L)， 用無菌的酸或堿將pH值調(diào)整到6.5，制成合成培養(yǎng)基。3、 長春堿和長春新堿的提取將歩驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的甲醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長 春新堿的含量，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.05mg/g細(xì)胞干重，長春堿和長春 新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.11 %以上。實施例6、利用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿 1、長春花細(xì)胞系的培養(yǎng)1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作 臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養(yǎng)基中，在20001x，12-16小時照 光，25度左右室溫下培養(yǎng)3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟 2)所述繼代馴化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次以上，同時篩選得到生長速度快，質(zhì)地松軟， 生長量穩(wěn)定地細(xì)胞系。脫分化培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，細(xì)胞分裂素 6-BA5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到5.8，再添加6.5g/L瓊脂， 在115t， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經(jīng)冷卻制成斜面脫分化培養(yǎng)基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養(yǎng)將步驟1)所述誘導(dǎo)形成的愈傷組織細(xì)胞系接種在下述繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行3次 以上的繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20。C室溫，避光條件，培養(yǎng)周期為3周。在繼代培養(yǎng) 過程中，篩選出結(jié)構(gòu)疏松以及生長速度較快的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基的配制在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5.0mg/L的植物細(xì)胞生長素 NAA， 5.0mg/L的植物細(xì)胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，經(jīng)115°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后經(jīng)冷卻制成平板馴化培養(yǎng)基。3) 長春花多倍體細(xì)胞的誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基中加入40mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915),做成液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 步驟2)獲得的結(jié)構(gòu)疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在2(TC， 避光，100rpm/分轉(zhuǎn)速的搖床上振蕩培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞后再接種在無秋水仙堿的繼 代培養(yǎng)基中，反復(fù)馴化培養(yǎng)三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細(xì)胞量/培養(yǎng)周期)的多倍體細(xì)胞系；經(jīng)細(xì)胞醋酸洋紅或銀染色 后通過顯微檢測表明，該細(xì)胞系為混合多倍體細(xì)胞系。 4)長春花多倍體細(xì)胞的擴增培養(yǎng)將步驟3)得到的長春花混合多倍體細(xì)胞系接種在擴增培養(yǎng)基上，在25'C，黑 暗條件下進(jìn)行擴增培養(yǎng)2.5周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細(xì)胞；擴增培養(yǎng)基的制備方法為在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng) 基的配方，將其中的CuSOf5H20和CoCl2*6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加 lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加3mg/La—萘乙酸(NAA) ， 2mg/L6 —卞 氨基嘌呤(6—BA)和40g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調(diào)整到6，再添加5g/L瓊脂， 在115'C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養(yǎng)基。2、 長春堿和長春新堿合成將步驟1擴增培養(yǎng)得到的生長旺盛的長春花多倍體細(xì)胞接種到合成培養(yǎng)基內(nèi)， 接種量為400g/L，在28"C，避光條件，120轉(zhuǎn)/分的搖床或大型生物反應(yīng)器中懸浮培 養(yǎng)5天得到富含長春堿或長春新堿的細(xì)胞。收獲細(xì)胞，培養(yǎng)液經(jīng)調(diào)整后可返回反應(yīng) 器繼續(xù)反復(fù)利用。合成培養(yǎng)基在改良的MS培養(yǎng)基(按照Murashige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將 其中的CuS04'5H20和CoCl2'6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞 血酸得到的培養(yǎng)基)中，添加蔗糖60g/L， a—萘乙酸(NAA)0.5mg/L， 6 —卞氨基嘌 呤(6—BA)0mg/L，用酸或堿將pH值調(diào)整到6，在115X:， O.lMPa壓力下消毒15分 鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 5pg/L、過氧化氫 30嗎/L、苯丙三氮唑l|iimol/L、色氨酸100mg/L、馬錢子苷60mg/L、氯化鈰50mg/L)， 用無菌的酸或堿將pH值調(diào)整到6，制成合成培養(yǎng)基。3、 長春堿和長春新堿的提取將步驟2合成培養(yǎng)得到的富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞置于提取灌中，經(jīng)過高 速攪拌(300轉(zhuǎn)/分)破碎，加入lml/g鮮細(xì)胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液， 在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸 乙酯，用硫酸調(diào)pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有 長春堿和長春新堿的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中長春堿和長 春新堿的含量，結(jié)果表明，長春新堿的含量達(dá)到1.03mg/g細(xì)胞干重，長春堿和長春 新堿的總質(zhì)量含量為細(xì)胞干重的0.11 %以上。
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法，是將長春花多倍體細(xì)胞株接種于合成培養(yǎng)基中，于20～29℃，培養(yǎng)3～7天得到富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞；所述合成培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基中添加0～5mg/L植物細(xì)胞生長素、0～5mg/L植物細(xì)胞分裂素，30～60g/L蔗糖、1～50μg/L乙酰輔酶A、10～40μg/L過氧化氫、0.1～2μmol/L苯丙三氮唑、10～150mg/L色氨酸、10～110mg/L馬錢子苷、10～50mg/L氯化鈰得到的液體培養(yǎng)基。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細(xì)胞株接種 于合成培養(yǎng)基的接種量為200 400g/L。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述合成培養(yǎng)是在80 130rpm/ 分轉(zhuǎn)速搖培。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細(xì) 胞株是將長春花愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細(xì)胞株在合 成培養(yǎng)之前在20 25°C，避光條件下擴增培養(yǎng)2 3周；所述擴增培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加0 5mg/L植物細(xì)胞分裂素，0 5mg/L 植物細(xì)胞生長素，20 60g/L蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細(xì)胞株在所 述擴增培養(yǎng)之前進(jìn)行繼代培養(yǎng)3代以上；所述繼代培養(yǎng)用培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添 加20-60g/L蔗糖，1. 0-5mg/L植物細(xì)胞生長素和1. 0-5mg/L植物細(xì)胞分裂素的培養(yǎng) 基；所述繼代培養(yǎng)的條件為20 25X:，避光條件。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述多倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)是將長春 花愈傷組織細(xì)胞用含10-40mg/L秋水仙堿的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)得到長春花多倍體細(xì)胞 株。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其特征在于所述基本培養(yǎng)基 為按照Mumshige&Skoog培養(yǎng)基的配方，將其中的CuS04 5H20和Co Cl2 6H20的 添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養(yǎng)基；所述植物細(xì)胞 分裂素為6 —卞氨基嘌呤或激動素；所述植物細(xì)胞生長素為U引哚乙酸或a—奈乙 酸。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述擴增培養(yǎng)基的pH值為5.6 所述合成培養(yǎng)基的pH值為5.8 7.0。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將所述富 含長春堿和長春新堿的細(xì)胞用溶劑萃取獲得含有長春堿和長春新堿的粗提物，再經(jīng) 過純化獲得長春堿和/或長春新堿；所述溶劑為體積百分濃度為95%的乙醇溶液或 甲醇溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)長春堿和/或長春新堿的方法。該方法是將長春花多倍體細(xì)胞株接種于合成培養(yǎng)基中，于20～29℃，培養(yǎng)3～7天得到富含長春堿和長春新堿的細(xì)胞；所述合成培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基中添加0～5mg/L植物細(xì)胞生長素、0～5mg/L植物細(xì)胞分裂素，30～60g/L蔗糖、1～50μg/L乙酰輔酶A、10～40μg/L過氧化氫、0.1～2μmol/L苯丙三氮唑、10～150mg/L色氨酸、10～110mg/L馬錢子苷、10～50mg/L氯化鈰得到的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法用長春花細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)長春堿和長春新堿，可穩(wěn)定的實現(xiàn)長春堿和長春新堿的工業(yè)化生產(chǎn)，并且其生產(chǎn)成本較低，培養(yǎng)周期短，不受自然環(huán)境以及氣候的影響，可以實現(xiàn)周年生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/18GK101333512SQ200810117768
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者云 劉, 郭志剛 申請人:清華大學(xué)