專利名稱：一種磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
酶是一種在許多領(lǐng)域都有重要應(yīng)用價值的生物催化劑，具有催化速率高、反應(yīng) 專一性強(qiáng)、催化條件溫和、能耗低以及不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的游離酶存在一些 缺點(diǎn)，如本身結(jié)構(gòu)易受外界環(huán)境影響，出現(xiàn)失活現(xiàn)象；使用后分離回收困難，難以 實(shí)現(xiàn)連續(xù)利用。酶的固定化技術(shù)是解決這些問題的有效措施之一。固定化酶不僅保 留了酶的催化特性，可以提高酶的貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，同時還可以實(shí)現(xiàn)酶的 回收和連續(xù)利用，從而減低了生產(chǎn)中酶制劑的投入成本，并且簡化了產(chǎn)品的后續(xù)提 純工藝。微米級的中空球形結(jié)構(gòu)，因其極高的比表面積和可容納大量客體分子的內(nèi) 部空間，在酶固定化領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。特別是磁性中空微結(jié)構(gòu)，在具備上 述優(yōu)點(diǎn)的同時，由于其本身的磁性，在外加磁場的作用下可以很容易地從反應(yīng)體系 中分離出來而得到回收利用，因此是一種潛在的優(yōu)良的酶固定化載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶及其制備方法。 本發(fā)明所提供的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的載 體。其中，所述載體是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和殼組
成，所述殼包覆于所述核的外表面，所述殼由鐵酸鹽組成，所述核為中空多聚糖微 球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中進(jìn)行 碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-24(TC之間的任一溫度。
上述磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶中的酶具體可為水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纖維素酶、過氧化物酶、脫氫酶、氧化酶或漆酶等。所述鐵酸鹽為四氧化 三鐵、鐵酸錳、鐵酸鈷或鐵酸鋅。
所述中空多聚糖微球的制備中所述酵母在液體中的濃度為10-200g/L。所述恒 溫的時間為10-24小時。所述液體可以為水，也可以是水溶液，所述水溶液的溶質(zhì) 選自如下10種化合物中的至少一種鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化鈉、氯化鉀、 醋酸鉀、乙醇、乙醛或戊二醛，所述水溶液中溶質(zhì)的終濃度可為0.01-0. lmol/L。所述酵母為球形或橢球形，酵母可以是死的，也可以是活的。當(dāng)所述液體為水溶液 時，不同的溶質(zhì)，制備出的中空多聚糖微球可以有不同的形狀，如球形或蘋果形或 壇子形，還可以是球壁完整的中空微球或球壁上有一個孔的中空微球。 所述磁性中空多聚糖微球可以按照如下方法制備
a) 向所述中空多聚糖微球懸浮液(中空多聚糖微球濃度為10 50g/L)中先后 加入鐵、鈷、錳或/和鋅的無機(jī)鹽，使其終濃度分別為0.01 0. lmol/L，再加入乙 二醇作為還原劑；
b) 將步驟a)的懸浮液在恒溫下加熱6 24h得到磁性中空多聚糖微球，所述 恒溫的溫度選自160 25(TC中的任一溫度。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的制備方法。 本發(fā)明所提供的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的制備方法，包括如下步驟
1) 在堿性條件下，將所述載體用環(huán)氧氯丙垸水溶液處理，使所述載體表面帶 有環(huán)氧基；
2) 將步驟l)得到的載體用氨水進(jìn)行處理使其表面帶有氨基；
3) 將步驟2)中得到的載體用戊二醛水溶液處理；
4) 將步驟3)得到的載體與所述酶溶液混合，使所述酶與所述載體形成固定化酶。
其中，所述環(huán)氧氯丙垸水溶液的體積百分比濃度為1-50%。所述氨水的濃度為 0. 01-2. Omol/L。所述戊二醛水溶液的體積百分比濃度為0. 1-20%。
本發(fā)明的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶蛋白負(fù)載量高、酶活性高、酶的穩(wěn) 定性和操作穩(wěn)定性強(qiáng)，且在外加磁場條件下該固定化酶易于回收。
本發(fā)明的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的制備方法中制備載體的原料來源廣 泛，載體制備、表面修飾和酶的固定化技術(shù)簡單易行，且制備出的載體具有高比表 面積、大內(nèi)部空間、豐富的表面官能團(tuán)以及良好的生物相容性等特點(diǎn)。本發(fā)明的磁 性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的方法適合于各種水解酶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶
a)稱橢球形啤酒酵母(5"acc力aro/ 7ces cerew'w'ae) 5 g，分散于100ml去離 子水中，制成酵母懸浮液，然后將酵母懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在180 'C下加熱18h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在20。C下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球， 并用對中空多聚糖微球進(jìn)行紅外表征。
掃描電鏡下中空多聚糖微球的結(jié)構(gòu)為直徑2-3微米的中空微球，紅外表征結(jié)果 表明中空多聚糖微球表面含有的-0H， -0=0等功能團(tuán)，具有良好的生物相容性。
b) 稱取a)中球形中空多聚糖微球3.0 g，分散于50ml去離子水中，加入氯 化鐵，使其濃度保持在0. 01mol/L，然后加入醋酸鈉，使其濃度保持在10g/L，最 后加入乙二醇50ml，攪拌60分鐘后，將上述液體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，反應(yīng)釜置于恒溫 箱中，在19(TC下放置12h，然后收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，最后 沉淀在2(TC下干燥24 h，即可得到固定化酶的載體。場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM) 和X射線衍射儀(XRD)檢測固定化酶的載體。
XRD結(jié)果表明四氧化三鐵成功包覆于中空多聚糖微球的外表面，場發(fā)射掃描電 鏡(FE-SEM)的結(jié)果表明四氧化三鐵顆粒均勻、致密地包覆。上述結(jié)果說明該載體 均一性很好。
c) 取步驟b)的載體O. lg，均勻分散到4mL 0. 06%的6—葡萄糖苷酶溶液中， 28。C振蕩10小時，外加磁場分離沉淀后，用醋酸緩沖液洗去沉淀上非共價結(jié)合的 酶蛋白，獲得磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶。
以水楊素為底物測定磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力，酶活力的測定方 法如下將25mg磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶和lmL經(jīng)過預(yù)熱的5g/100ml的水楊 素溶液(由pH4.8醋酸緩沖液配制)混合，振蕩條件下5(TC水浴保溫30分鐘后在 外加磁場作用下分離，向分離得的上清液中加入lmLDNS (3， 5-二硝基水楊酸)試 劑，煮沸5分鐘，冷至室溫后，在540nm下測定其吸光度。1個單位酶活(IU)指 每分鐘水解得到1微摩爾葡萄糖所需的酶量。
酶活力測定結(jié)果表明，磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力為4. 9U/g載體。
實(shí)施例2、磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶
a)稱橢球形啤酒酵母(5"acc力aro/z /ces cerew'w'ae) 5g，分散于100ml去離 子水中，制成酵母懸浮液，然后向酵母懸浮液中加入稀鹽酸，使其終濃度為O. 1 mol/L，在將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在15(TC下加熱24h，反應(yīng) 結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24 h。干 燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球。中空多聚糖微球 為直徑2-3微米的壇子狀。b) 稱取a)中壇子形中空多聚糖微球3.0 g，分散于50ral去離子水中，加入 氯化鐵，使其濃度保持在0. 01mol/L，再加入氯化錳，使其濃度保持在0. 005mol/L， 然后加入醋酸鈉，使其濃度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，攪拌60分鐘后， 將上述液體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，反應(yīng)釜置于恒溫箱中，在19(TC下放置12h，然后收 集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，最后沉淀在2(TC下干燥24 h，即可得到 固定化酶的載體。場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)和X射線衍射儀(XRD)檢測固定化 酶的載體。
XRD結(jié)果表明鐵酸錳包覆于中空多聚糖微球的外表面，場發(fā)射掃描電鏡 (FE-SEM)的結(jié)果表明鐵酸錳顆粒均勻、致密地包覆。上述結(jié)果說明該載體均一性 很好。
c) 取步驟b)的載體O. lg，均勻分散到4mL 0.06%的3—葡萄糖苷酶溶液中， 28。C振蕩IO小時，外加磁場分離后用醋酸緩沖液洗去載體上非共價結(jié)合的酶蛋白， 獲得磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶。
以水楊素為底物測定磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力，酶活力的測定方 法同實(shí)施例1。
酶活力的測定結(jié)果表明，磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力為6. 3U/g載體。
實(shí)施例3、磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶
a) 稱橢球形啤酒酵母(&cc力aro/ff/ces cerew'w'ae) 5g，分散于100ml去離 子水中，制成酵母懸浮液，然后向酵母懸浮液中加入氯化鈉，使其終濃度為O.Ol mol/L，在將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在15(TC下加熱24h，反應(yīng) 結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24 h。干 燥后，即得到中空多聚糖微球，用掃描電鏡觀察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球 為直徑2-3微米的球形。
b) 稱取a)中球形中空多聚糖微球3.0 g，分散于50ml去離子水中，加入氯 化鐵，使其濃度保持在0. 01mol/L，再加入硫酸鈷，使其濃度保持在0. 005mol/L， 然后加入醋酸鈉，使其濃度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，攪拌60分鐘后， 將上述液體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，反應(yīng)釜置于恒溫箱中，在19(TC下放置12h，然后收 集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，最后沉淀在2(TC下干燥24 h，即可得到固定化酶的載體。場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)和X射線衍射儀(XRD)檢測固定化 酶的載體。'
XRD結(jié)果表明鐵酸鈷包覆于中空多聚糖微球的外表面，場發(fā)射掃描電鏡 (FE-SEM)的結(jié)果表明鐵酸鈷顆粒均勻、致密地包覆。上述結(jié)果說明該載體均一性 很好。
c)取步驟b)的載體lg，分散于100mL 10%環(huán)氧氯丙烷的堿性溶液中，振蕩 6小時后用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；將洗后的載體用0. 25M氨水處理 9小時，處理后離心分離沉淀，再用1%戊二醛處理沉淀1小時，得到的載體用去 離子水洗凈后，取O. lg，均勻分散到4mL0.06n/Q的e—葡萄糖苷酶溶液中，28'C振 蕩10小時，外加磁場分離沉淀，用醋酸緩沖液洗去沉淀上非共價結(jié)合的酶蛋白， 獲得磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶。
以水楊素為底物測定磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力，酶活力的測定方 法同實(shí)施例1.
為了測定中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的穩(wěn)定性，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶通過磁 場分離回收后連續(xù)使用500次，取連續(xù)使用一定次數(shù)的中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶， 測定其酶活，酶活測定方法同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性測定的結(jié)果表明，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力為 10.6U/g載體，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶通過磁場分離回收的回收率為95%，連續(xù) 使用500次后酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
實(shí)施例4、磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶
a) 稱橢球形啤酒酵母(6^cc力aro/z /ces cerew'w'ae) 5g，分散于100ml去離 子水中，制成酵母懸浮液，然后向酵母懸浮液中加入戊二醛，使其終濃度為0.05 mol/L，在將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，置于恒溫箱中在24(TC下加熱10h，反應(yīng) 結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在2(TC下干燥24 h。干 燥后，即得到中空多聚糖微球。用掃描電鏡觀察生物相容性中空多聚糖微球，中空 多聚糖微球?yàn)橹睆?-5微米的蘋果形。
b) 稱取a)中蘋果形中空多聚糖微球3.0 g，分散于50ml去離子水中，加入 氯化鐵，使其濃度保持在0. 01mol/L，再加入硫酸鋅，使其濃度保持在0. 005mol/L， 然后加入醋酸鈉，使其濃度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，攪拌60分鐘后， 將上述液體轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，反應(yīng)釜置于恒溫箱中，在190。C下放置12h，然后收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，最后沉淀在2(TC下干燥24 h，即可得到 固定化酶的載體。場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)和X射線衍射儀(XRD)檢測固定化 酶的載體。
XRD結(jié)果表明鐵酸鋅包覆于中空多聚糖微球的外表面，場發(fā)射掃描電鏡 (FE-SEM)的結(jié)果表明鐵酸鋅顆粒均勻、致密地包覆。上述結(jié)果說明該載體均一性 很好。
c)取步驟b)的載體lg，分散于100mL 10%環(huán)氧氯丙烷的堿性溶液中，振蕩 6小時后用去離子水徹底洗凈殘留的環(huán)氧氯丙烷；將洗后的球形磁性中空復(fù)合微結(jié) 構(gòu)用0.25M氨水處理9小時，處理后離心分離沉淀，再用1%戊二醛處理沉淀1小 時，得到的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)用去離子水洗凈后，取0. lg，均勻分散到4mL 0. 06% 的e—葡萄糖苷酶溶液中，28'C振蕩10小時，外加磁場分離沉淀后，用醋酸緩沖 液洗去沉淀上非共價結(jié)合的酶蛋白，獲得磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶。
以水楊素為底物測定磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力，酶活力的測定方 法同實(shí)施例l。
為了測定中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的穩(wěn)定性，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶通過磁 場分離回收后連續(xù)使用500次，取連續(xù)使用一定次數(shù)的中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶， 測定其酶活，酶活測定方法同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
酶活力和酶的穩(wěn)定性測定的結(jié)果表明，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶活力為 14.2U/g載體，中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶通過磁場分離回收的回收率為95%，連續(xù) 使用500次后酶活力未出現(xiàn)明顯下降。
權(quán)利要求
1、一種固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的載體，其特征在于所述載體是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和殼組成，所述殼包覆于所述核的外表面，所述殼由鐵酸鹽組成，所述核為中空多聚糖微球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中進(jìn)行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-240℃之間的任一溫度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的固定化酶，其特征在于所述酶為水解酶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于所述鐵酸鹽為四氧化三鐵、鐵酸錳、鐵酸鈷或鐵酸鋅。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化酶，其特征在于所述酵母在液體中的濃度為 10-200g/L。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的固定化酶，其特征在于所述恒溫的時間為10-24小時。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的固定化酶，其特征在于所述液體為水或水溶液；所 述水溶液中的溶質(zhì)選自下述10種物質(zhì)中的至少一種鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯 化鈉、氯化鉀、醋酸鉀、乙醇、乙醛和戊二醛；所述水溶液中溶質(zhì)的終濃度為0. Ol-O. lmol/L。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化酶，其特征在于所述酵母為球形或橢球形； 所述酵母為死的或活的。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的固定化酶，其特征在于所述中空多聚糖微球?yàn)榍蛐?或蘋果形或壇子形；所述中空多聚糖微球?yàn)榍虮谕暾闹锌瘴⑶蚧蚯虮谏嫌幸粋€孔的中空微球。
9、 權(quán)利要求1至8中任一所述的固定化酶的制備方法，包括如下步驟1) 在堿性條件下，將所述載體用環(huán)氧氯丙垸水溶液處理，使所述載體表面帶有環(huán)氧基；2) 將步驟l)得到的載體用氨水進(jìn)行處理使其表面帶有氨基；3) 將步驟2)中得到的載體用戊二醛水溶液處理;4) 將步驟3)得到的載體與所述酶溶液混合，使所述酶與所述載體形成固定化酶。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述環(huán)氧氯丙院水溶液的體體積 百分比濃度為1-50%;所述氨水的濃度為0. 0卜2. 0mol/L;所述戊二醛水溶液的體積 百分比濃度為0. 1-20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶及其制備方法。該固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的載體，其中，所述載體是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和殼組成，所述殼包覆于所述核的外表面，所述殼由鐵酸鹽組成，所述核為中空多聚糖微球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在液體中進(jìn)行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒溫的溫度選自150-240℃之間的任一溫度。本發(fā)明還公開了該固定化酶的制備方法。本發(fā)明的磁性中空復(fù)合微結(jié)構(gòu)固定化酶的酶蛋白負(fù)載量高、酶活性高、酶的穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性強(qiáng)，且在外加磁場條件下該固定化酶易于回收。
文檔編號C12N11/00GK101643725SQ200810117760
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日
發(fā)明者倪德志, 周克斌, 森 楊, 雷 王 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)