本發(fā)明涉及一種藥物的新用途，具體是一種肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑的新用途。
背景技術(shù)：
：急性肺損傷（ALI）是指在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等由心源性以外的直接和間接致傷因素導(dǎo)致的致肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌散性肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)水腫、肺不張，導(dǎo)致急性進(jìn)行性呼吸困難和低氧血癥，其發(fā)展至嚴(yán)重階段（氧合指數(shù)＜200）被稱為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。根據(jù)1994年歐美聯(lián)席會(huì)議提出的ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn),2005年美國(guó)ALI,ARDS發(fā)病率分別在每年79/10萬和59/10萬。病因不同,ARDS發(fā)病率也不同。嚴(yán)重感染時(shí)ALI/ARDS發(fā)病率可高達(dá)25%~50%，大量輸血可達(dá)40%，多發(fā)性創(chuàng)傷達(dá)到11%~25%。同時(shí)存在2個(gè)或3個(gè)危險(xiǎn)因素時(shí)，ALI/ARDS發(fā)病率進(jìn)一步升高。另外，危險(xiǎn)因素持續(xù)作用時(shí)間越長(zhǎng)，ALI/ARDS的發(fā)病率越高，危險(xiǎn)因素持續(xù)24、48及72h小時(shí)，ARDS患病率分別為76%,85%和93%。雖然不同研究對(duì)ALI/ARDS病死率的報(bào)道差異較大(15~72%)，總體來說目前ARDS的病死率仍較高。對(duì)1994-2006年國(guó)際上正式發(fā)表的72個(gè)ARDS臨床研究進(jìn)行薈萃分析，11426例ALI/ARDS病人的病死率為43%。我國(guó)上海市15家成人ICU2001年3月至2002年3月ARDS病死率也高達(dá)68.5%。近來，RiteshA等的薈萃分析，提示肺內(nèi)因素與肺外因素所致的ALI在病死率上無差異。目前，急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的臨床治療主要是根據(jù)其病理生理改變和臨床表現(xiàn)進(jìn)行針對(duì)性或支持性治療。主要治療原則為積極治療原發(fā)病，控制感染，改善通氣和組織供氧，防止進(jìn)一步的肺損傷和肺水腫。國(guó)內(nèi)外已試圖針對(duì)其主要發(fā)病環(huán)節(jié)，進(jìn)行藥物治療，以減輕肺和全身炎癥。1、非皮質(zhì)醇類抗炎藥物：此類藥物主要包括前列腺素代謝的脂氧合酶和環(huán)氧合酶通路抑制劑，如布洛芬等。但是，這類藥物須在早期的時(shí)候應(yīng)用，才有效果。2、糖皮質(zhì)激素：糖皮質(zhì)激素的抗炎機(jī)制主要是與GR結(jié)合形成GC-GR復(fù)合體形式與DNA的順式元件或核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、AP-1等）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，或者通過“非基因組效應(yīng)”途徑發(fā)揮抗炎作用。糖皮質(zhì)激素治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的效果理論上是可行的，但是其用藥時(shí)機(jī)、劑量、療程以及并發(fā)癥都有待進(jìn)一步的研究。3、氧自由基清除劑和抗氧化劑：此類藥物有維生素E、超氧化物歧化酶（SOD）等，但是，目前臨床上應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)不多。綜上所述，目前，亟需一種臨床有效的藥物來對(duì)急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征進(jìn)行治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑或其組合物，在治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征等肺部疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提及的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑不僅包括化學(xué)合成的廣義的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑，而且還包括從天然植物及中藥中提取、分離、純化得到的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑。本發(fā)明所述的肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑包括二肽或三肽的肽硼酸酯類抑制劑。本發(fā)明所述的肽硼酸酯類抑制劑為硼替佐米、CEP-18770等二肽或三肽的肽硼酸酯類抑制劑的一種或幾種的組合。按藥劑學(xué)方法，可以將肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑加入輔料制成臨床有效的劑型，包括注射給藥、吸入給藥等起效快、效果好的給藥方式。優(yōu)選注射給藥形式，例如注射劑、凍干粉針劑或輸液劑型；或吸入給藥形式，例如脂質(zhì)體給藥。優(yōu)選的，本發(fā)明中肽硼酸酯類抑制劑相關(guān)劑型中有效成分的質(zhì)量百分比為0.5%-99%，輔料的質(zhì)量百分比為1%-99%。其中輔料選擇為本領(lǐng)域制劑中的常規(guī)選擇。本發(fā)明所述的肺部疾病，不僅包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征，也包括具有相同病理改變的其他肺部疾病，如哮喘、慢性支氣管炎等疾病。本發(fā)明還以硼替佐米在急性肺損傷中的應(yīng)用為例，來進(jìn)一步探討肽硼酸酯類蛋白酶抑制劑在肺部疾病中的應(yīng)用的可能機(jī)理：對(duì)硼替佐米等硼酸酯類蛋白酶抑制劑在急性肺損傷中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究表明，這類抑制劑能減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低前沿性介質(zhì)的釋放，減少炎性細(xì)胞在肺組織的活化與聚集，使肺上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮受損減輕，降低血管內(nèi)皮的通透性，減少肺組織的氧化應(yīng)激損傷，顯著改善肺部氣體交換功能；此外，這類抑制劑還能抑制NF-κB的表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，顯著減輕急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征等肺部疾病的炎癥反應(yīng)，從而顯著提高急性肺損傷動(dòng)物的生存率。而上述機(jī)理的發(fā)現(xiàn)，同樣可能是硼酸酯類蛋白酶抑制劑可以對(duì)急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征等肺部疾病進(jìn)行臨床有效的治療，改善患者的病情，并提高患者的生存率的作用機(jī)理。附圖說明圖1是各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織濕/干重比的測(cè)定結(jié)果；圖2是各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)BALF蛋白含量結(jié)果；圖3是各實(shí)驗(yàn)組NF-κB的DNA結(jié)合活性的測(cè)定結(jié)果。具體實(shí)施方式下面用具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1硼替佐米對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，隨機(jī)將大鼠分成4組，分別為：假手術(shù)組（sham）30只；模型對(duì)照組（control）30只；溶媒干預(yù)組（vehicle）30只；硼替佐米干預(yù)組（bort）30只。A組：sham組，開腹后，取出盲腸，然后回納關(guān)腹。B組：control組，也稱CLP組，盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（CLP術(shù)）。C組：Vehicle組，盲腸結(jié)扎穿刺后經(jīng)腹腔注射生理鹽水。D組：Bort組，盲腸結(jié)扎穿刺后經(jīng)腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水。2、給藥方法CLP術(shù)后2h給予Bort組腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水，Vehicle組給予同樣體積的生理鹽水。3、確定取樣時(shí)間點(diǎn)給藥之后4h、8h、12h時(shí)間點(diǎn)取A、B、C、D組各8只動(dòng)物，處死，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。4.1肺水含量的測(cè)定通過計(jì)算肺組織濕/干重比值來反映肺組織含水量。取右上肺，用濾紙吸干表面的滲液和血跡稱濕重，置入80℃烘箱內(nèi)烘24h，再稱重獲得干重，計(jì)算肺組織濕重/干重來評(píng)價(jià)組織水腫。4.2、支氣管肺泡灌洗液（BALF）蛋白含量測(cè)定用BCA法測(cè)蛋白含量，先繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定565nm樣品蛋白含量。蛋白含量用mg蛋白/mlBALF表示。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：5.1肺水含量的測(cè)定結(jié)果實(shí)驗(yàn)各組各時(shí)間點(diǎn)肺水含量用肺濕干重比表示，結(jié)果如圖1所示（注：**：control組與sham組相比，p＜0.01；##：Bort干預(yù)組與Vehicle組相比，p＜0.01），各時(shí)間點(diǎn)CLP組肺濕干重比均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）；各時(shí)間點(diǎn)硼替佐米干預(yù)組肺濕干重均低于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。5.2支氣管肺泡灌洗液蛋白含量結(jié)果實(shí)驗(yàn)各組各時(shí)間點(diǎn)BALF蛋白含量結(jié)果如圖2（注：**：control組與sham組相比，p＜0.01；##：Bort干預(yù)組與Vehicle組相比，p＜0.01）所示，各時(shí)間點(diǎn)CLP組的BALF蛋白含量均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）；各時(shí)間點(diǎn)的Bort的干預(yù)組的BALF含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)論ALI時(shí)肺毛細(xì)血管通透性增高，大量蛋白質(zhì)和水分滲入肺泡和肺間質(zhì)，所以肺部炎癥反應(yīng)的病例特征主要表現(xiàn)為肺水腫和肺透明膜的形成，導(dǎo)致?lián)Q其功能障礙，引起嚴(yán)重的急性呼吸衰竭。本研究中，肺臟組織的濕重/干重比值（代表肺水含量）被作為肺水腫的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，而水腫是炎癥的典型表現(xiàn)。結(jié)果表示硼替佐米能夠顯著降低CLP組的肺水含量，表明硼替佐米能防止液體向肺泡和肺間質(zhì)的嚴(yán)重滲漏。支氣管肺泡灌洗液里的蛋白含量被作為肺-毛細(xì)血管滲透性的指標(biāo)而測(cè)定，結(jié)果顯示CLP組大鼠支氣管肺泡灌洗液的蛋白含量指標(biāo)上調(diào)，硼替佐米治療組支氣管肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量降低，說明急性肺損傷存在肺高滲透性，而硼替佐米可以降低這種滲透性。綜上所述，硼替佐米能抑制肺部的炎性反應(yīng)、減少肺組織的氧化應(yīng)激損傷，從而減輕CLP致ALI大鼠肺部微血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞損傷，改善肺部氣體交換功能，最終顯著提高大鼠的生存率。實(shí)施例2硼替佐米對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠，隨機(jī)將大鼠分成4組，分別為：假手術(shù)組（sham）30只；模型對(duì)照組（control）30只；溶媒干預(yù)組（vehicle）30只；硼替佐米干預(yù)組（bort）30只。A組：sham組，開腹后，取出盲腸，然后回納關(guān)腹。B組：control組，也稱CLP組，盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（CLP術(shù)）。C組：Vehicle組，盲腸結(jié)扎穿刺后經(jīng)腹腔注射生理鹽水。D組：Bort組，盲腸結(jié)扎穿刺后經(jīng)腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水。2、給藥方法CLP術(shù)后2h給予Bort組腹腔注射1mg/kg硼替佐米+生理鹽水，Vehicle組給予同樣體積的生理鹽水。3、確定取樣時(shí)間點(diǎn)將術(shù)后12h確定為取樣的時(shí)間點(diǎn)。4、標(biāo)本處理CLP術(shù)后12h，手術(shù)切取右肺葉于液氮中保存待測(cè)。5、肺組織細(xì)胞核中NF-κB的DNA結(jié)合活性測(cè)定5.1肺組織細(xì)胞核蛋白的制備（1）液氮保存的肺組織樣品用研缽搗碎，稱取2g，加BuffferA3ml溶解，冰浴中制成勻漿，轉(zhuǎn)移入15ml離心管；（2）2000rpm，4℃離心1min，取上清液入另一離心管，冰浴10min；（3）5000rpm，4℃離心10min，留取核蛋白沉淀物；（4）加入1mlBufferB重懸核蛋白沉淀物，冰浴2min，震蕩；（5）12000rpm，4℃離心20min，吸取上層核蛋白提取液，裝入離心管中，保存于-80℃冰箱。5.2NF-κB探針標(biāo)記（1）按以下方法一次加入各成分，經(jīng)過離心，震蕩，再離心，致使反應(yīng)液集中于離心管底部來標(biāo)記NF-κB探針。（2）NF-κB探針標(biāo)記反應(yīng)體系：1.75pmol/μ1NF-κB探針2mlT4多核苷酸激酶10×緩沖液1ml370MBq/ml[γ32P]ATP1ml5-10U/μ1T4多核苷酸激酶1ml無核酸酶水5ml（6）12000rpm4℃離心10min，倒去上清液，保留離心后的沉淀物，使用TE溶液0.1ml將沉淀物溶解。使用標(biāo)記的寡核苷酸10μl行閃爍計(jì)數(shù)（5萬-20萬cpm的探針）。標(biāo)記了的寡核苷酸-20℃保存。5.3凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（1）探針和核蛋白的結(jié)合反應(yīng)體系核蛋白液4ml5×結(jié)合緩沖液1mlNF-κB探針1ml無核酸酶水14ml（2）37℃孵育30min，加2μl10×電泳緩沖液，混勻，電泳分析；（3）7%非解離聚丙烯酰氨凝膠制備TEMED0.016ml雙蒸水13.13ml30%丙烯酰胺4.67ml5×電泳緩沖液2.01ml10%過硫酸銨0.2ml（4）將制備好的凝膠傾倒入垂直電泳槽的玻璃間，再將樣品梳子插好，等待一段時(shí)間，凝膠聚合后，輕輕將梳子從電泳槽中拔出來。之后用雙蒸水將樣品孔進(jìn)行反復(fù)沖洗，一般洗5次左右，直至樣品孔被沖洗干凈，然后用濾紙拭干樣品孔中的水分；再在樣品孔內(nèi)加入20μl結(jié)合反應(yīng)體系，在電泳槽內(nèi)加1×EMSA電泳緩沖液，然后4℃冷室電泳，電泳時(shí)間大約為2h，電壓梯度12V/cm；（5）電泳過程結(jié)束后，把凝膠放進(jìn)盛有30%冰醋酸的容器內(nèi)固定5min，然后又用雙蒸水來進(jìn)行充分的漂洗，漂洗后把凝膠的一面用濾紙覆蓋，而另一面則用保鮮膜覆蓋。濾紙-凝膠-保鮮膜的三層結(jié)構(gòu)在凝膠真空干燥儀內(nèi)干燥，共90min；（6）放射自顯影：取出制備好的凝膠，到暗室中將其放進(jìn)X光片盒內(nèi)，在保鮮膜上放置一張X光片，然后于-70℃放射自顯影，時(shí)間48-72h；（7）結(jié)果分析：在電腦內(nèi)輸入圖像用凝膠成像分析系統(tǒng)，然后使用電腦軟件做結(jié)果分析，電泳區(qū)帶結(jié)果使用積分光密度值表達(dá)。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組各組大鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性如圖3所示（注：**：CLP組與Sham組相比，p＜0.01；#：Bort干預(yù)組與CLP組相比，p＜0.05），CLP組及硼替佐米干預(yù)組肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性均顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）；硼替佐米干預(yù)能顯著降低肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。7、實(shí)驗(yàn)結(jié)論NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的關(guān)鍵點(diǎn)，它受各種刺激如生物及理化因子激活，激活后的NF-κB能誘導(dǎo)并調(diào)控多種炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)，介導(dǎo)了膿毒癥ALI/ARDS瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。實(shí)驗(yàn)表明。硼替佐米能明顯抑制NF-κB活化，最終減少促炎細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子的表達(dá)和釋放而對(duì)急性肺損傷起到有效保護(hù)作用，從而有效降低急性肺損傷大鼠的死亡率。當(dāng)前第1頁1 2 3