本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及親環(huán)孢素抑制劑的用途。

背景技術(shù)：

乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染引起的傳染病，全球大約有3億人感染乙肝病毒，其中中國(guó)有1億人。急性乙型肝炎病毒感染后常常轉(zhuǎn)化為慢性感染，甚至轉(zhuǎn)化為肝硬化、肝功能障礙和肝癌等。全世界由慢性乙型肝炎引發(fā)的肝癌占了肝癌總發(fā)病率的60％-80％，慢性乙型肝炎已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。

HBV隸屬于嗜肝病毒科，其基因組為3.2kb不完全閉合雙鏈環(huán)狀DNA。完整病毒顆粒由核衣殼和包膜組成。核衣殼主要由病毒的核心抗原蛋白包裹著DNA和病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶及末端蛋白組成，包膜的主要成分跟宿主的細(xì)胞膜相同。乙肝病毒主要通過母嬰傳播、性傳播、血液傳播。

HBV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制過程可被簡(jiǎn)單的分為三個(gè)時(shí)期：(1)病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞，將包含有核衣殼的RC-DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)里，RC-DNA隨后被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，形成cccDNA。(2)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄出不同的基因組及亞基因組RNAs，其中pgRNA被選擇性作為新的模板并合成核衣殼蛋白及病毒DNA聚合酶。(3)合成的病毒基因組與病毒蛋白組合包裝形成子代病毒顆粒，進(jìn)入高爾基體形成包膜，最后通過出芽釋放到細(xì)胞外，進(jìn)行下一輪感染及復(fù)制。

HBV在宿主中的生命周期主要表現(xiàn)為四個(gè)階段。第一個(gè)階段是免疫耐受期。在健康的成年人中，這個(gè)潛伏期通常為二到四個(gè)星期，而在新生兒中，潛伏期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年。第二個(gè)階段，機(jī)體的免疫反應(yīng)開始或提高，刺激產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和炎癥因子。處于此階段的感染者血清中HBV DNA下降，但分泌HBeAg。HBV感染的急性患者，此階段通常持續(xù)4周期左右，但對(duì)慢性感染者來說，第二階段持續(xù)的時(shí)間很長(zhǎng)，可能導(dǎo)致肝硬化及并發(fā)癥。當(dāng)宿主的免疫能力被觸發(fā)后，有能力大大減少或者消除被感染的細(xì)胞，病毒的復(fù)制減弱至消失，這意味著第三階段的開始。第三階段，感染已消除，機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)至正常水平，然而，HBsAg仍呈陽(yáng)性，可能的原因是S基因整合到宿主的基因組中了。第四階段稱為免疫階段。此階段大多數(shù)感染者的生理特征為乙肝表面抗原抗體呈陽(yáng)性而乙肝表面抗原呈陰性。在這個(gè)階段，檢測(cè)不到HBV DNA的存在。很多因素影響著這四個(gè)階段的進(jìn) 程，如宿主的遺傳易感性、其它病毒的存在、HBV突變體的出現(xiàn)、性別、免疫抑制劑的治療等等。

目前，對(duì)乙肝患者的用藥主要分為保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化和調(diào)節(jié)免疫等幾個(gè)大類，取得較大進(jìn)展的還是在抗病毒藥物治療研究方面。目前對(duì)于病毒性乙肝的治療方案只能達(dá)到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，并不能直接破壞病毒體，甚至清除病毒。用于治療慢性肝炎的藥物有兩類：一類是通過直接干擾HBV復(fù)制，一類是調(diào)節(jié)HBV特異性的免疫反應(yīng)。前者主要為核苷酸或核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等，通過直接抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性來抑制病毒復(fù)制。后者主要是干擾素及聚乙二醇干擾素-2a，它們具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。但是干擾素治療易發(fā)生較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，導(dǎo)致很多病人不能耐受而退出治療；核苷類似物治療易出現(xiàn)病毒變異及耐藥，且停藥后常發(fā)生反彈。而近年來一系列作用于HBV病毒復(fù)制周期的新型抗病毒藥物不斷涌現(xiàn)，其中，靶向宿主因素的親環(huán)孢素(CyP)抑制劑也正受到越來越多的重視。

親環(huán)孢素A(CyPA)最初是作為環(huán)孢菌素A(CsA)的蛋白受體被發(fā)現(xiàn)的，環(huán)孢菌素A是一種免疫抑制劑，可用于抗真菌、抗寄生蟲、抗炎癥以及抗HIV活性。已經(jīng)報(bào)道環(huán)孢菌素A和其某些衍生物具有抗HCV活性。近年研究顯示環(huán)孢菌素A抑制鈉-牛黃膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并阻斷NTCP與HBV衣殼蛋白體外結(jié)合，從而阻礙HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞。環(huán)孢菌素A相關(guān)復(fù)合物(SCYX618806、Alisporivir等)具有比環(huán)孢菌素A更強(qiáng)的抗HBV潛力。但是環(huán)孢菌素治療會(huì)引起嚴(yán)重的腎毒性，表現(xiàn)為劇烈的腎血管收縮，以致發(fā)展成不可逆的腎結(jié)構(gòu)和功能損傷。因此急需要治療或預(yù)防病毒性肝炎的有效方法和組合物藥物。

環(huán)孢菌素治療引起的并發(fā)癥問題隨后得到了解決，因?yàn)槿藗凅@訝的發(fā)現(xiàn)某些3-取代的環(huán)孢菌素衍生物具有抗HCV活性，并且具有出乎意料的良好毒理學(xué)性質(zhì)。目前研究表明親環(huán)孢素的免疫缺乏類似物，如NIM811、SCY-635和Alisporivir有希望替代親環(huán)孢素作為抗丙肝化學(xué)療法藥物。

如今，我們已知用干擾素單一藥物治療或與利巴韋林(病毒唑)(Ribavirin)，聯(lián)合治療能夠有效根除HCV，但仍具有較大局限性，因此研究者們多方面開展抗HCV藥物的研究來代替干擾素或與干擾素同時(shí)使用。其中取得較大突破的要數(shù)對(duì)環(huán)孢菌素衍生物SCY-635的抗病毒研究。環(huán)孢菌素衍生物SCY-635誘導(dǎo)丙肝患者的體內(nèi)免疫反應(yīng)，促進(jìn)宿主細(xì)胞產(chǎn)生I/II/III型干擾素，其與干擾素聯(lián)合使用具有更加優(yōu)良的抗HCV效果。

然而，至今HBV感染引起的乙型肝炎仍是非常難以治愈的，目前對(duì)于乙型肝炎的治療方案只能達(dá)到抑制HBV復(fù)制和繼發(fā)感染，并不能完全清除乙肝病毒，這是乙型肝炎相對(duì)于丙型肝炎治療的難點(diǎn)。SCY-635在丙肝病毒相關(guān)疾病中發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)功能讓我們有理由 推測(cè)該藥物不僅適用于抗RNA病毒，對(duì)DNA病毒可能也同樣具有抑制作用。而且到目前為止，還沒有關(guān)于環(huán)孢菌素衍生物SCY-635抑制乙肝病毒感染的相關(guān)報(bào)道。但是我們也要清楚能夠治療丙型肝炎病毒相關(guān)疾病的藥物并不一定也能夠治療乙型肝炎病毒相關(guān)疾病。盡管具有廣譜抗病毒作用的干擾素，既能夠抗丙肝病毒，也能夠抗乙肝病毒，但治療兩種病毒相關(guān)疾病的其他藥物卻有不同的作用機(jī)制及不同的療效。大多數(shù)抗乙肝病毒的核苷類藥物在體內(nèi)需要先轉(zhuǎn)化為三磷酸形式才能發(fā)揮抗乙肝病毒作用，這些核苷類藥物可抑制病毒DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，并與脫氧胞嘧啶核苷競(jìng)爭(zhēng)性滲入病毒的DNA鏈，終止DNA鏈的延長(zhǎng)和合成，使病毒的復(fù)制受到抑制而發(fā)揮抗DNA病毒作用。三磷酸形式的拉米夫定可插入正在合成的乙肝病毒DNA鏈中，阻斷HBV DNA的合成；阿德福韋則是通過作為DNA鏈的終止物抑制HBV DNA聚合。而核苷類藥物對(duì)丙肝病毒是無效的，長(zhǎng)效干擾素與廣譜抗病毒藥物利巴韋林聯(lián)合使用才有可能將丙肝病毒有效清除。利巴韋林的抗丙肝病毒機(jī)制是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)激酶磷酸化后抑制RNA多聚酶活性，并且抑制丙肝病毒復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用的5’端帽狀結(jié)構(gòu)的形成，磷酸化后的利巴韋林又可成為肌苷單磷酸(IAmp)脫氧酶的抑制劑，阻斷鳥苷酸的合成，從而抑制丙肝病毒復(fù)制，發(fā)揮抗丙肝病毒作用。然而利巴韋林抗乙肝病毒的療效卻是較弱的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及核苷類藥物對(duì)乙肝病毒的抑制效果，因此利巴韋林逐漸從乙肝病毒治療市場(chǎng)撤出。新的直接抗丙肝病毒的藥物則是直接靶向HCV非結(jié)構(gòu)蛋白，特異性抑制NS3/4A蛋白酶、NS5A蛋白和NS5B RNA多聚酶。NS3/4A抑制劑Simeprevir和NS5B抑制劑Sofosbuvir已于近期獲批上市。鑒于抗丙肝病毒的藥物與抗乙肝病毒的藥物并不是通用的，我們研究SCY-635對(duì)治療乙型肝炎病毒相關(guān)疾病的療效仍然是非常有意義和價(jià)值的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種有效治療或預(yù)防乙型肝炎的藥物。

根據(jù)本發(fā)明的特別發(fā)現(xiàn)，提供了以下的實(shí)施方案：

本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒感染引起的疾病的藥物及方法。因此，本 發(fā)明所述化合物也可用于制備治療乙型肝炎病毒感染引起的疾病的藥物和藥劑。在具體方面，此類藥物和藥劑包括治療有效劑量的親環(huán)孢素抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，具有式I所示結(jié)構(gòu)的親環(huán)孢素抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防乙型肝炎病毒感染引起的疾?。?/p>

其中，

A為式IIa或式IIb所示的殘基：

B為乙基、1-羥基乙基、異丙基或正丙基；

R1為：

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)R³取代；

含有二至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烯基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

含有二至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈炔基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

含有三至六個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；或

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基羰基；

R2表示異丁基或2-羥基異丁基；

X為硫、-S(O)_n-或氧；

R³選自鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基、-NR⁴R⁵和-NR⁶(CH₂)_mNR⁴R⁵；

R⁴和R⁵分別獨(dú)立地為：

氫；

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)R⁷取代；

包括二至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基；

含有三至六個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其任選地被含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代；

取代的苯基，其任選地被選自鹵素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一至五個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

飽和或不飽和雜環(huán)，其含有五個(gè)或六個(gè)環(huán)原子和選自氮、硫和氧的一至三個(gè)相同或不同的雜原子；

或者R⁴和R⁵與它們所連接的氮原子一起形成含有四至六個(gè)環(huán)原子的飽和或不飽和雜環(huán)，該環(huán)可以任選地含有另一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子，該環(huán)可以任選地被選自烷基、苯基和芐基的一至四個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

R⁶表示氫或含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；

R⁷為選自鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基和-NR⁸R⁹的至少之一；

R⁸和R⁹分別獨(dú)立地為氫或含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；

n為1或2；

m為2、3或4；

鹵素為氟、氯、溴或碘。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑中A為具有式IIa所示的殘基，B為乙基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑中R1為2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-單烷基氨基乙基、2-單烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-單環(huán)烷基氨基乙基、2-單環(huán)烷基氨基丙基、2-二環(huán)烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基為包含一至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈，環(huán)烷基包含三至六個(gè)碳原子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑中X為氧或硫；根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑中X為硫時(shí)，R1選自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥學(xué)上可接受的鹽為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、鹽酸鹽、甲磺酸鹽或丙酸鹽。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑為下列之一結(jié)構(gòu)或下列之一的藥學(xué)上可接受的鹽：

3-甲氧基環(huán)孢菌素；

3-(2-氨基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(異丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2-乙基丁氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2，2-二甲基丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2-羥基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(3-羥基丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-甲基-N-異丙基氨基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-嗎啉)乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-乙氧基環(huán)孢菌素；

3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-乙硫基環(huán)孢菌素；

3-丙烯基硫代環(huán)孢菌素；

3-[(2-甲氧基)乙基硫基]環(huán)孢菌素；

3-(甲基硫基)4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(甲氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(異丙氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(乙氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病為選自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纖維化、肝硬性、肝癌中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑是口服或胃腸外途徑用藥的。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述用藥的劑量為1-1000mg/天，優(yōu)選為50-500mg/天，最優(yōu)選為100mg/天。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，乙肝感染模型小鼠給藥劑量為10mg/kg Bid，如 果小鼠和人的生物利用度差別不大換算成人的給藥劑量為10mgx60×2/12＝100mg/天。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素(SCY-635)、或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物在制備預(yù)防和/或治療慢性乙型肝炎病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響的圖譜；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，SCY-635對(duì)HBV DNA拷貝數(shù)的影響的圖譜；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例5，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響的圖譜；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例5，SCY-635對(duì)HBV DNA拷貝數(shù)的影響的圖譜；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例5，SCY-635對(duì)HBsAb表達(dá)的影響的圖譜；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例6，SCY-635對(duì)PBMC細(xì)胞分泌IFN-a的影響的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1 制備3-甲氧基環(huán)孢菌素

將3-(巰基苯并噻唑-2-基硫)環(huán)孢菌素(0.4g，0.28mmol)和樟腦磺酸(0.7g，3mmol)的干燥四氫呋喃和干燥甲醇溶液在50℃加熱2h。將混合物冷卻至室溫，添加飽和碳酸氫鈉、醚和水。分離層，用二乙醚萃取水相。用無水硫酸鎂干燥合并的有機(jī)萃取物，過濾。在硅膠上重復(fù)進(jìn)行層析，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物洗脫，獲得120mg的3-甲氧基環(huán)孢菌素。

實(shí)施例2 制備3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素

在氮?dú)庀聺饪s液體氨(30mL)。添加酰胺鈉(1.0g)，然后添加4-(γ-羥基甲基亮氨酸)-環(huán)孢菌素(1.22g，1.0mmol)的叔丁基甲醚(20mL)溶液。將混合物在-35℃攪拌90分鐘。添加2-甲氧基乙基二硫化物(5.9g)，在-35℃繼續(xù)再攪拌2小時(shí)。添加固體氯化銨(1.5g)，將混合物在 -33℃攪拌10分鐘。在恢復(fù)至室溫后，用叔丁基甲醚稀釋混合物，用水、鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥。在除去溶劑后，使用硅膠柱層析法純化殘余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脫，獲得500mg 3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

實(shí)施例3 制備3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素

在惰性氣氛中，在低溫下，向二異丙基氨基鋰(LDA)的干燥四氫呋喃溶液中滴加4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素(1.22g,1.0mmol)的干燥四氫呋喃溶液。將混合物在-35℃持續(xù)攪拌90分鐘。添加2-(N,N-二甲基氨基)乙基二硫化物(4.6g)，在-35℃繼續(xù)再攪拌2小時(shí)。添加固體氯化銨(1.5g)，將混合物在-33℃攪拌10分鐘。在恢復(fù)至室溫后，用叔丁基甲醚稀釋混合物，用水、鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥。在除去溶劑后，使用硅膠柱層析法純化殘余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脫，獲得260mg 3-[(R)-2-(N,N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

實(shí)施例4 制備3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素的鹽

將3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素溶于10ml乙醚中，添加相應(yīng)的酸，在25℃攪拌2小時(shí)，過濾收集沉淀物，用冷醚洗滌，真空干燥。由此分別制得3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素的磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、鹽酸鹽、甲磺酸鹽、丙酸鹽。

實(shí)施例5 SCY-635對(duì)對(duì)乙肝病毒HBsAg、HBeAg水平和HBV DNA拷貝數(shù)的影響

1.實(shí)驗(yàn)材料

HepG和Huh7肝癌細(xì)胞：由武漢大學(xué)保藏中心提供(HepG2保藏中心編號(hào)為GDC024，Huh7保藏中心編號(hào)為GDC134)；

胎牛血清：購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；

DMEM培養(yǎng)基：購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；

Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑：購(gòu)買于美國(guó)Life公司；

HBsAg/HBeAg檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上海科華生物工程股份有限公司；

乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上海科華生物 工程股份有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)條件

HepG2、Huh7細(xì)胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5％CO₂，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)。

3.實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：不加細(xì)胞和藥物，只加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液；

陰性對(duì)照組：加細(xì)胞不加藥物，加等量二甲亞砜(DMSO)，加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基；

SCY-635不同濃度組(簡(jiǎn)稱藥物組)：加細(xì)胞和不同濃度的SCY-635溶液，SCY-635用二甲亞砜(DMSO)配制，SCY-635的終濃度分別為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。

4.實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞或Huh7細(xì)胞以4×10⁵個(gè)/孔的密度接種于24孔板，每孔0.5ml，置于5％CO₂，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)6小時(shí)，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.8μg HBV全基因組質(zhì)粒(pBlue-HBV1.3)，轉(zhuǎn)染過程如下：將0.8μg質(zhì)粒與2μL Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑加入100μL Opti－MEM無血清培養(yǎng)基，混勻，靜置20min，將混合液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中。培養(yǎng)12小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，然后按上述實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)液或藥物溶液分別加入相應(yīng)孔中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在5％CO₂，37℃，飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心5分鐘，取上清液檢測(cè)HBsAg和HBeAg水平。同時(shí)收集細(xì)胞提取HBV DNA(復(fù)制中間體閉合環(huán)狀DNA，cccDNA)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的HBsAg和HBeAg，酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm)測(cè)定OD值。抑制百分率(5)＝【(陰性對(duì)照組OD值-藥物組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)】×100％。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1-圖2：

其中，圖1顯示了SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響：結(jié)果表明：如表1數(shù)據(jù)所示，SCY-635可以抑制瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV基因組質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg，并且具有劑量依賴性。特別是SCY-635高劑量組對(duì)HBsAg/HBeAg的抑制效果非常明顯，抑制率高達(dá)58％。提示SCY-635對(duì)乙型肝炎病毒具有一定的抑制作用，對(duì)治療乙肝病毒相關(guān)疾病具有一定潛力。

在Huh7細(xì)胞中，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響如表1所示：

表1 SCY-635在Huh7細(xì)胞中對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響

在HepG2細(xì)胞中，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響如表2所示：

表2 SCY-635在HepG2細(xì)胞中對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響

圖2顯示了SCY-635對(duì)HBV DNA拷貝數(shù)的影響，結(jié)果表明：如表2數(shù)據(jù)所示，SCY-635對(duì)乙肝病毒DNA的復(fù)制具有比較強(qiáng)的抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，尤其是在較高劑量(2μmol/L)時(shí)對(duì)HBV DNA復(fù)制活性的抑制率高達(dá)80-90％。提示SCY-635對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制具有較好的抑制作用。

在Huh7細(xì)胞中，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響如表3所示：

表3 SCY-635在Huh7細(xì)胞中對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響

在HepG2細(xì)胞中，SCY-635對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響如表4所示：

表4 SCY-635在HepG2細(xì)胞中對(duì)HBsAg、HBeAg表達(dá)的影響

實(shí)施例6 小鼠模型中SCY-635對(duì)HBV DNA及HBeAg/HBsAg/HBsAb表達(dá)的影響

1.實(shí)驗(yàn)材料

BALB/C小鼠：SPF級(jí)，雌性，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；

HBsAg/HBeAg檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上海科華生物工程股份有限公司；

乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上?？迫A生物工程股份有限公司；

HBsAb檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上?？迫A生物工程股份有限公司；

拉米夫定(3TC)：購(gòu)買于葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立

高壓尾靜脈注射慢病毒載體構(gòu)建的HBV1.3倍體全基因組質(zhì)粒(paav-HBV1.3)，感染BALB/c小鼠。模型小鼠按0.08×體重(g)/ml注射paav-HBV1.3質(zhì)粒，5s內(nèi)完成尾靜脈注射，質(zhì)粒配置濃度為6.5μg/ml(PBS稀釋)。小鼠注射質(zhì)粒后可持續(xù)檢測(cè)到乙肝病毒HBeAg、HBsAg和HBV DNA的表達(dá)。灌胃給藥，尾靜脈取血檢測(cè)小鼠血液中HBsAg，HBeAg，及病毒核酸的量評(píng)價(jià)藥物對(duì)乙肝病毒感染小鼠的治療作用。

3.實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：沒有表達(dá)HBV全基因組的BALB/C小鼠；

陰性對(duì)照組：表達(dá)HBV全基因組的BALB/C小鼠，口服相同劑量的生理鹽水；

陽(yáng)性對(duì)照組：表達(dá)HBV全基因組的BALB/C小鼠，口服3mg/kg或1mg/kg的拉米夫定；

SCY-635不同濃度組(簡(jiǎn)稱藥物組)：表達(dá)HBV全基因組的BALB/C小鼠，口服不同濃度(10mg/kg和3.3mg/kg)的SCY-635；

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖3-圖4。

其中，圖3顯示了SCY-635隨著濃度和作用時(shí)間的增加對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制作 用增強(qiáng)，尤其是對(duì)HBsAg的抑制效果較為明顯。陽(yáng)性對(duì)照拉米夫定給藥15天期間，小鼠血液中HBsAg表達(dá)量持續(xù)降低。高濃度SCY-635給藥2-6天期間，小鼠血液中HBsAg表達(dá)量迅速降低，之后7-15天HBsAg仍然保持在一個(gè)較低的表達(dá)水平。SCY-635對(duì)小鼠血液中HBsAg表達(dá)量的抑制效果似乎還略好于拉米夫定。

圖4表明SCY-635隨著濃度和作用時(shí)間的增加有利于降低HBV DNA拷貝數(shù)。小鼠給藥前6天，血液中HBV DNA表達(dá)量在持續(xù)增加主要是受轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)的影響，給藥2-6天期間開始表現(xiàn)出藥物組對(duì)HBV DNA的抑制效果。給藥2-15天，陽(yáng)性對(duì)照拉米夫定持續(xù)高效地抑制了HBV DNA水平，高濃度SCY-635也比低濃度SCY-635的抑制HBV DNA能力強(qiáng)一些。SCY-635抑制HBV DNA的能力雖沒有拉米夫定那么強(qiáng)，但相對(duì)于對(duì)照組能看出SCY-635也具有明顯的抑制HBV DNA的作用。

圖5表明口服SCY-635后有利于HBsAb血清轉(zhuǎn)化。小鼠給藥處理15天，停止給藥后3天檢測(cè)HBsAb表達(dá)水平。HBsAb是宿主對(duì)乙肝病毒免疫調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的保護(hù)性抗體，HBsAb的表達(dá)量反應(yīng)了宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的調(diào)控作用。通過高壓靜脈注射HBV基因組慢病毒載體質(zhì)粒使小鼠感染HBV，然后再給藥處理15天，檢測(cè)到陽(yáng)性對(duì)照拉米夫定組和SCY-635高濃度組HBsAb的表達(dá)量均有所升高，但因此方法感染病毒時(shí)間有限，故所檢測(cè)到的HBsAb的表達(dá)值均偏低。該結(jié)果提示SCY-635可能調(diào)控宿主免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制乙肝病毒的效果。

實(shí)施例7 SCY-635調(diào)節(jié)乙型肝炎病人PBMC細(xì)胞分泌IFN-a

1.實(shí)驗(yàn)材料

乙肝病人血液：來源于武漢市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；

淋巴細(xì)胞分離液：購(gòu)買于北京碧云天生物技術(shù)有限公司；

RPMI-1640培養(yǎng)基：購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；

人IFN-a檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

2.分離PBMC細(xì)胞

將新鮮病人血液用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基等體積稀釋，再沿管壁緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，輕輕混勻，室溫2000rpm離心15分鐘。離心后從管底至液面分四層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、分層液層、單個(gè)核細(xì)胞層、血漿層。小心吸取霧狀單個(gè)核細(xì)胞層至新的離心管中，加入3倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，每次2000rpm離心10分鐘，最后獲得單個(gè)核淋巴細(xì)胞。將獲得的PBMC細(xì)胞平均鋪在12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中。

3.實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：不加細(xì)胞和藥物，只加等體積含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液；

陰性對(duì)照組：加細(xì)胞不加藥物，加等量二甲亞砜(DMSO)，加等體積含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液；

SCY-635不同濃度組(簡(jiǎn)稱藥物組)：加細(xì)胞和不同濃度的SCY-635溶液，SCY-635用二甲亞砜(DMSO)配制，SCY-635的終濃度分別為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L，加等體積含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖6。

圖6表明SCY-635對(duì)乙肝病人PBMC細(xì)胞分泌的IFN-a量的影響。結(jié)果表明不同劑量的SCY-635(0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L)刺激乙肝病人PBMC細(xì)胞分泌IFN-a的量為分別為1.55pg/ml、10.85pg/ml和32.5pg/ml，提示SCY-635能夠再次激活乙肝病人的免疫反應(yīng)，而且隨著SCY-635濃度增加而免疫效果增強(qiáng)。

參照SCY-635實(shí)施其鹽型和溶劑合物的活性檢測(cè)。顯示本發(fā)明的親環(huán)孢素抑制劑的鹽或溶劑合物也可治療和/或預(yù)防乙型肝炎病毒感染引起的疾病。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。