本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其制藥用途。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(HBV)隸屬于嗜肝DNA病毒科，病毒顆粒由核衣殼和包膜組成，包膜主要由三種抗原組成，它們?cè)贖BV感染的檢測(cè)中發(fā)揮核心作用。核衣殼包含乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、DNA聚合酶-逆轉(zhuǎn)錄酶和病毒基因組。HBV基因組為3.2kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA，與我們所知的所有哺乳類動(dòng)物的DNA病毒不同，嗜肝DNA病毒依靠一種RNA中間體逆轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行復(fù)制?；贖BV這種獨(dú)特的復(fù)制周期，使用核苷酸/核苷類似物的抗病毒治療策略主要針對(duì)HBV RNA逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

直到現(xiàn)在，乙肝病毒進(jìn)入細(xì)胞的精確機(jī)制尚未被闡明。內(nèi)吞作用和病毒包膜與質(zhì)膜直接融合都被認(rèn)為是潛在途徑。有包膜的病毒粒子結(jié)合到宿主細(xì)胞的preS1受體，包含松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)的核衣殼被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。在細(xì)胞核里，rcDNA被修復(fù)形成cccDNA。該cccDNA作為模板被轉(zhuǎn)錄成次基因組RNA(sgRNA)和前基因組RNA(pgRNA)。在核衣殼里，pgRNA被反轉(zhuǎn)錄成反義鏈DNA。RcDNA則來(lái)自以反義鏈DNA為模板合成的正義鏈DNA。核衣殼被再次轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核擴(kuò)增cccDNA，或者被包膜包裹然后通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放出細(xì)胞。作為HBV生命周期的復(fù)制中間體，cccDNA對(duì)HBV持續(xù)性感染有重要作用。因此抗乙肝病毒藥物的藥物靶標(biāo)和免疫調(diào)節(jié)策略都是針對(duì)HBV不同生命周期的。

病人血清里面出現(xiàn)HBV DNA是病毒復(fù)制活躍的最好提示。HBsAg抗體的產(chǎn)生是由于包膜抗原暴露和獲得保護(hù)性免疫。HBcAg抗體在所有曾經(jīng)感染過(guò)HBV的病人中都可以檢測(cè)得到。然而，與HBsAg抗體不同，這種抗體不是保護(hù)性的，它有助于我們區(qū)分急性感染和慢性感染，如果病人血清里出現(xiàn)anti-HBc IgM抗體，則顯示此病人為急性感染。HBeAg抗體是在抗原被清除和病毒不再?gòu)?fù)制或者減弱復(fù)制的情況下出現(xiàn)

乙肝病毒感染宿主肝細(xì)胞，宿主則成為乙肝病毒攜帶者；乙肝病毒長(zhǎng)期處于復(fù)制的活動(dòng)狀態(tài)，宿主則可能慢慢演變成慢性乙型肝炎(CHB)患者。慢性乙型肝炎的肝損傷是宿主對(duì)HBV免疫反應(yīng)的結(jié)果；HLA-class I限制的，細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的HBV抗原反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死。因此，慢性乙型肝炎是一個(gè)HBV、病人肝細(xì)胞和免疫系統(tǒng)三 者相互作用的動(dòng)態(tài)情形。基于這種相互作用，慢性乙型肝炎的自然過(guò)程可以被劃分為不同變化階段，然而不是所有病人都會(huì)經(jīng)歷其所有階段。第一個(gè)階段為“免疫耐受期”，表現(xiàn)為：HBeAg陽(yáng)性、高病毒載量、正常丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)量和接近正常的肝組織結(jié)構(gòu)。成人慢性HBV感染通常只經(jīng)歷一個(gè)較短的免疫耐受期。相反，圍產(chǎn)期或者幼年早期慢性HBV感染則要經(jīng)歷較長(zhǎng)的免疫耐受期。第二個(gè)階段免疫清除期通常在青春期或者成人期發(fā)生，這個(gè)階段特征表現(xiàn)為：HBeAg陽(yáng)性、HBV高水平和ALT高表達(dá)，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)肝代償性失調(diào)。這些癥狀可能會(huì)加快一些HBeAg陽(yáng)性階段的病人肝纖維化或者肝硬化的進(jìn)程，但是也可能導(dǎo)致大多數(shù)病人血清HBV DNA水平的降低，甚至最終HBV DNA被清除和HBeAg血清轉(zhuǎn)化為anti-HBe抗體。隨著HBeAg血清轉(zhuǎn)化，大多數(shù)病人進(jìn)入第三個(gè)階段—“潛伏期”，該階段的特點(diǎn)為：持續(xù)正常的ALT表達(dá)、低HBV DNA載量、沒(méi)有或者很少炎癥壞死組織。

目前用于治療慢性乙型肝炎的藥物有以下6種，包括：干擾素(IFN，兩種形式：IFN和PEG-IFN)和5種核苷酸/核苷類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋)。乙型肝炎治療的目標(biāo)是持續(xù)抑制HBV復(fù)制，防止肝硬化和肝癌發(fā)生。治療有效的標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)血清HBV DNA水平降低、HBeAg消失、HBsAg消失、ALT水平正常和組織切片檢查肝臟的炎癥反應(yīng)降低等指標(biāo)來(lái)判斷。針對(duì)HBV感染的病人的抗病毒治療的理想目標(biāo)則是將HBV完全清除，包括HBsAg減少、anti-HBs血清轉(zhuǎn)化和被感染肝細(xì)胞中cccDNA被完全清除。然而，將cccDNA從被感染肝細(xì)胞核中完全清除是目前抗病毒藥物所不能達(dá)到的，于是臨床治療HBV感染并不能將病毒從肝細(xì)胞中完全清除，主要通過(guò)宿主免疫系統(tǒng)控制病毒的復(fù)制。

親環(huán)孢素(Cyclophilins，Cyps)因其為環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)的細(xì)胞內(nèi)高親和性配體而命名。親環(huán)素是人類細(xì)胞中表達(dá)的肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶的三大家族成員之一，在動(dòng)植物中廣泛表達(dá)及分布，結(jié)構(gòu)上具有高度保守性。環(huán)孢菌素A是一種免疫抑制劑，臨床上用于治療器官移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)及自身免疫系統(tǒng)疾病，所以親環(huán)素被認(rèn)為參與了免疫制劑過(guò)程。親環(huán)素還具有其他許多重要的生物學(xué)功能，如輔助蛋白折疊、介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡、參與HIV-1病毒蛋白組裝等。其中兩種功能研究得最為透徹，一是親環(huán)素具有肽酰脯氨酸順/反異構(gòu)酶(PPIase)活性，能夠催化蛋白質(zhì)特別是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，同時(shí)起著分子伴侶的作用；而是與CsA結(jié)合形成CyP-CsA復(fù)合體，在人體中通過(guò)鈣調(diào)磷酸酶(CaN)抑制免疫反應(yīng)。CyP-CsA復(fù)合物與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合可抑制其活性，使T細(xì)胞核因子(NF-ATc)不能被去磷酸化，阻斷了T細(xì)胞核因子從胞漿到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中斷，T細(xì)胞活化所必需的一些細(xì)胞因子表達(dá)受阻，從而抑制T細(xì)胞增殖。

多項(xiàng)研究已證實(shí)，CypA疏水區(qū)的PPI酶活性在參與HCV RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)過(guò)程中 起到了至關(guān)重要的作用，該區(qū)域的堿基突變可破壞HCV復(fù)制。最近研究證實(shí)HCV NS5A是CypA的主要配體，CypA對(duì)NS5A中脯氨酸肽鍵的異構(gòu)化在HCV復(fù)制過(guò)程中起到重要作用，而親環(huán)素抑制劑可通過(guò)破壞CypA-NS5A的相互作用達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。

目前，人工合成的無(wú)免疫抑制作用的CsA衍生物如Debio-025(Alisporivir)，NIM-811和SCY-635在結(jié)構(gòu)上保留了CsA的基本結(jié)構(gòu)，僅在3和4位點(diǎn)與CsA不同，卻能在低濃度時(shí)抑制PPI酶的水解活性，表現(xiàn)出明顯強(qiáng)于CsA的抗HCV效應(yīng)，同時(shí)對(duì)堿性磷酸酶幾乎無(wú)親和活性，避免了類似CsA的免疫抑制效應(yīng)。而且親環(huán)素抑制劑的耐藥發(fā)生率非常低，尤其是聯(lián)合用藥時(shí)，針對(duì)病毒酶抑制劑的耐藥發(fā)生率也明顯減少。

SCY-635是一個(gè)無(wú)免疫抑制作用的CsA類似物，在體外試驗(yàn)中已被證實(shí)能抑制CypA的PPI酶活性，與PEG-IFN和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能協(xié)同并增強(qiáng)其抗病毒效應(yīng)。在人體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SCY-635能上調(diào)體內(nèi)IFN應(yīng)答。服用SCY-635的患者隨著SCY-635血藥濃度逐漸增高，血漿IFN-a、IFN-λ1、IFNλ3和2’5’-寡腺苷酸合成酶-1的濃度也隨之增高。類似結(jié)果也出現(xiàn)在復(fù)制子細(xì)胞模型試驗(yàn)中，SCY-635被證實(shí)能刺激I型和III型IFN及IFN效應(yīng)基因(ISG)的分泌。因此，親環(huán)素抑制劑除直接干擾HCV復(fù)制過(guò)程外，還可能通過(guò)一系列激活宿主天然抗HCV免疫的方法發(fā)揮其抗病毒的作用。

由于親環(huán)素抑制劑表現(xiàn)出良好的抗病毒效應(yīng)，其在臨床應(yīng)用上被廣泛研究。Debio-025首先在一組HIV/HCV共感染者身上進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)。由于初步結(jié)果比較理想，積極展開了評(píng)估Debio-025聯(lián)合PEG-IFNa-2a治療的療效及安全性的II期臨床試驗(yàn)。NIM811的I期和II期研究同時(shí)在HCV基因型1型的PEG-IFN/RBV經(jīng)治復(fù)發(fā)者中進(jìn)行。同時(shí)，SCY-635單藥治療的I期試驗(yàn)也在20例HCV感染者中展開。目前SCY-635的II期研究正在進(jìn)行中，主要目的在于評(píng)估SCY-635聯(lián)合PEG-IFN/RBV的三聯(lián)治療對(duì)基因型1型初治患者的療效和安全性。除了上述藥物外，目前正在研發(fā)中的親環(huán)素抑制劑還包括Sangamide和EP-CyP546。親環(huán)素抑制劑因抗病毒作用強(qiáng)，耐藥屏障高，病毒性突破率低，不良反應(yīng)少，可口服吸收等優(yōu)勢(shì)而具備良好的臨床應(yīng)用前景。

體外試驗(yàn)證明環(huán)孢菌素A對(duì)乙型肝炎病毒蛋白合成和DNA復(fù)制均具有抑制作用，CsA可通過(guò)降低PyK2Y402的磷酸化水平抑制HBV復(fù)制。而環(huán)孢菌素A衍生物—親環(huán)素抑制劑Alisporivir能夠抑制HBV復(fù)制和降低乙肝病毒表面抗原HBsAg分泌，其對(duì)乙型肝炎病毒的抑制效果還要優(yōu)于環(huán)孢菌素A。目前關(guān)于親環(huán)素抑制劑的臨床抗病毒研究主要集中在丙型肝炎病毒和艾滋病毒方面，親環(huán)素抑制劑對(duì)乙型肝炎病毒是否同樣具有良好的抑制效果還缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。關(guān)于親環(huán)素抑制劑SCY-635或其組合藥物對(duì)乙型肝炎病毒的作用目前尚沒(méi)有任何相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明首次探究SCY-635組合藥物對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響，為開發(fā)成為治療乙型肝炎創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有較好的創(chuàng)新性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種有效治療或預(yù)防乙型肝炎的藥物組合物。

根據(jù)本發(fā)明的特別發(fā)現(xiàn)，提供了以下的實(shí)施方案：

本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療乙型肝炎的一種藥物組合物及方法。因此，本發(fā)明所述藥物組合物也可用于制備預(yù)防/治療乙型肝炎病毒引起的疾病的藥物和藥劑。在具體方面，此類藥物和藥劑包括治療有效劑量的親環(huán)孢素抑制劑和抗病毒藥物，以及藥學(xué)上可接受的載體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的藥物組合物包括第一組分和第二組分，其中，第一組分為選自式I所示結(jié)構(gòu)的親環(huán)孢素抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，第二組分為選自抗病毒藥物、其可藥用鹽和其溶劑合物中的至少一種。

其中，

A為式IIa或式IIb所示的殘基：

B為乙基、1-羥基乙基、異丙基或正丙基；

R1為：

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)R³取代；

含有二至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烯基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

含有二至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈炔基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

含有三至六個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其任選地被選自鹵素、羥基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；或

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基羰基；

R2為異丁基或2-羥基異丁基；

X為-S(O)_n-、硫或氧；

R³分別獨(dú)立地選自選自鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基、-NR⁴R⁵和-NR⁶(CH₂)_mNR⁴R⁵；

R⁴和R⁵分別獨(dú)立地為：

氫；

含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的基團(tuán)R⁷取代；

包括二至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基；

含有三至六個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其任選地被含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基取代；

取代的苯基，其任選地被選自鹵素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一個(gè)至五個(gè)不同的集團(tuán)取代；

飽和或不飽和雜環(huán)，其含有五個(gè)或六個(gè)環(huán)原子和選自氮、硫和氧的一至三個(gè)相同或不同的雜原子；

或者R⁴和R⁵與它們所連接的氮原子一起形成含有四至六個(gè)環(huán)原子的飽和或不飽和雜環(huán)，所述雜環(huán)可以任選地含有另一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子，所述雜環(huán)可以任選地

被選自烷基、苯基和芐基的一至四個(gè)相同或不同的基團(tuán)取代；

R⁶為氫或含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；

R⁷分別獨(dú)立地選自鹵素、羥基、羧基、烷氧基羰基和-NR⁸R⁹；

R⁸和R⁹分別獨(dú)立地為氫或含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基；

n為1或2；

m為2、3或4；

鹵素為氟、氯、溴或碘。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述所述親環(huán)孢素抑制劑中A為具有式IIa所示的殘基，B為乙基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述所述親環(huán)孢素抑制劑中R1為2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-單烷基氨基乙基、2-單烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-單環(huán)烷基氨基乙基、2-單環(huán)烷基氨基丙基、2-二環(huán)烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基為包含一至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈，環(huán)烷基包含三至六個(gè)碳原子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑中X為氧或硫。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述所述親環(huán)孢素抑制劑中X為硫時(shí)，R1選自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述所述親環(huán)孢素抑制劑的藥學(xué)上可接受的鹽為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、鹽酸鹽、甲磺酸鹽或丙酸鹽。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述親環(huán)孢素抑制劑為下列之一結(jié)構(gòu)或?yàn)橄铝兄唤Y(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物：

3-甲氧基環(huán)孢菌素；

3-(2-氨基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(異丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2-乙基丁氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2，2-二甲基丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(2-羥基乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-(3-羥基丙氧基)環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-甲基-N-異丙基氨基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]環(huán)孢菌素；

3-[2-(N-嗎啉)乙氧基)環(huán)孢菌素；

3-乙氧基環(huán)孢菌素；

3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-乙硫基環(huán)孢菌素；

3-丙烯基硫代環(huán)孢菌素；

3-[(2-甲氧基)乙基硫基]環(huán)孢菌素；

3-(甲基硫基)4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(甲氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(異丙氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-(乙氧基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素；

3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二組分為恩替卡韋或替諾福韋，或這兩者藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒感染引起的疾病。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病為選自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纖維化、肝硬性、肝癌中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物其給藥方式采用皮下或肌肉注射的方式，或以混合物形式給藥，或分別口服加注射的形式給藥，或給予不同時(shí)間的先后次序形式給藥。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物組合物的用藥劑量為1-1000mg/天，優(yōu)選為50-500mg/天，最優(yōu)選為100mg/天。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，乙肝感染模型小鼠給藥劑量為10mg/kg Bid，如果小鼠和人的生物利用度差別不大換算成人的給藥劑量為10mgx60x2/12＝100mg/天。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)，親環(huán)孢素抑制劑與抗病毒藥物具有協(xié)同效應(yīng)，特別是環(huán)孢菌素衍生物SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋組合用藥有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預(yù)期該組合藥物可以作為降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎的組合藥物繼續(xù)開發(fā)。目前尚無(wú)有關(guān)SCY-635的組合藥物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道，因此環(huán)孢菌素衍生物SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋組合用藥對(duì)于HBsAg和HBV DNA強(qiáng)效抑制均具有明確的創(chuàng)新性。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明 顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，SCY-635對(duì)SCY-635、恩替卡韋、替諾福韋分別單獨(dú)用藥與組合用藥對(duì)HBsAg表達(dá)水平和HBV DNA拷貝數(shù)的影響的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備3-甲氧基環(huán)孢菌素

將3-(巰基苯并噻唑-2-基硫)環(huán)孢菌素(0.4g，0.28mmol)和樟腦磺酸(0.7g，3mmol)的干燥四氫呋喃和干燥甲醇溶液在50℃加熱2h。將混合物冷卻至室溫，添加飽和碳酸氫鈉、醚和水。分離層，用二乙醚萃取水相。用無(wú)水硫酸鎂干燥合并的有機(jī)萃取物，過(guò)濾。在硅膠上重復(fù)進(jìn)行層析，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物洗脫，獲得120mg的3-甲氧基環(huán)孢菌素。

實(shí)施例2制備3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素

在氮?dú)庀聺饪s液體氨(30mL)。添加酰胺鈉(1.0g)，然后添加4-(γ-羥基甲基亮氨酸)-環(huán)孢菌素(1.22g，1.0mmol)的叔丁基甲醚(20mL)溶液。將混合物在-35℃攪拌90分鐘。添加2-甲氧基乙基二硫化物(5.9g)，在-35℃繼續(xù)再攪拌2小時(shí)。添加固體氯化銨(1.5g)，將混合物在-33℃攪拌10分鐘。在恢復(fù)至室溫后，用叔丁基甲醚稀釋混合物，用水、鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥。在除去溶劑后，使用硅膠柱層析法純化殘余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脫，獲得500mg 3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

實(shí)施例3制備3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素

在惰性氣氛中，在低溫下，向二異丙基氨基鋰(LDA)的干燥四氫呋喃溶液中滴加4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素(1.22g,1.0mmol)的干燥四氫呋喃溶液。將混合物在-35℃持續(xù)攪拌90分鐘。添加2-(N,N-二甲基氨基)乙基二硫化物(4.6g)，在-35℃繼續(xù)再攪拌2小時(shí)。添加 固體氯化銨(1.5g)，將混合物在-33℃攪拌10分鐘。在恢復(fù)至室溫后，用叔丁基甲醚稀釋混合物，用水、鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥。在除去溶劑后，使用硅膠柱層析法純化殘余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脫，獲得260mg 3-[(R)-2-(N,N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素。

實(shí)施例4制備3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素的鹽

將3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素溶于10ml乙醚中，添加相應(yīng)的酸，在25℃攪拌2小時(shí)，過(guò)濾收集沉淀物，用冷醚洗滌，真空干燥。由此分別制得3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羥基甲基亮氨酸)環(huán)孢菌素的磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、鹽酸鹽、甲磺酸鹽、丙酸鹽。

實(shí)施例5SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋聯(lián)合用藥與分別單獨(dú)用藥對(duì)HBsAg水平和HBV DNA拷貝數(shù)的影響

1.實(shí)驗(yàn)材料

HepG和Huh7肝癌細(xì)胞：由武漢大學(xué)保藏中心提供(HepG2保藏中心編號(hào)為GDC024，Huh7保藏中心編號(hào)為GDC134)；

胎牛血清：購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；

DMEM培養(yǎng)基：購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；

Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑：購(gòu)買于美國(guó)Life公司；

HBsAg檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上?？迫A生物工程股份有限公司；

乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒：購(gòu)買于上海科華生物工程股份有限公司；

恩替卡韋：購(gòu)買于大連美侖生物技術(shù)有限公司；

富馬酸替諾福韋酯：購(gòu)買于大連美侖生物技術(shù)有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)條件

HepG2、Huh7細(xì)胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5％CO2，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)。

3.實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：不加細(xì)胞和藥物，只加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液；

陰性對(duì)照組：加細(xì)胞不加藥物，加等量二甲亞砜(DMSO)，加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基；

單獨(dú)給藥組：加細(xì)胞和不同濃度的SCY-635、恩替卡韋或替諾福韋，用二甲亞砜(DMSO)配制，SCY-635的終濃度分別為0.5μmol/L和2μmol/L，恩替卡韋終濃度為0.5μmol/L和2μmol/L，替諾福韋終濃度為50μmol/L和200μmol/L，分別加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。

聯(lián)合給藥組：加細(xì)胞和不同濃度的SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋的組合藥，組合如下：

0.5μmol/L SCY-635+0.01μmol/L恩替卡韋；2μmol/L SCY-635+0.01μmol/L恩替卡韋；0.5μmol/L SCY-635+0.1μmol/L恩替卡韋；2μmol/L SCY-635+0.1μmol/L恩替卡韋；0.5μmol/L SCY-635+50μmol/L替諾福韋；2μmol/L SCY-635+50μmol/L替諾福韋；2μmol/L SCY-635+200μmol/L替諾福韋；2μmol/L SCY-635+200μmol/L替諾福韋，每組分別加等體積含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。

4.實(shí)驗(yàn)方法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞以4×10⁵個(gè)/孔的密度接種于24孔板，每孔0.5ml，置于5％CO2，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)6小時(shí)，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入0.8μg HBV全基因組質(zhì)粒(pBlue-HBV1.3)，轉(zhuǎn)染過(guò)程如下：將0.8μg質(zhì)粒與2μl Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑加入100μl Opti－MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，混勻，靜置20min，將混合液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中。培養(yǎng)12小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，然后按上述實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)液或藥物溶液分別加入相應(yīng)孔中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在5％CO2，37℃，飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心5分鐘，取上清液檢測(cè)HBsAg水平。同時(shí)收集細(xì)胞提取HBV DNA(復(fù)制中間體閉合環(huán)狀DNA，cccDNA)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1：

圖1顯示了SCY-635、恩替卡韋、替諾福韋分別單獨(dú)用藥與組合用藥對(duì)HBsAg表達(dá)水平和HBV DNA拷貝數(shù)的影響：

結(jié)果表明：我們測(cè)試了親環(huán)孢素抑制劑SCY-635聯(lián)合恩替卡韋(enticavir)或替諾福韋(tenofovir)對(duì)轉(zhuǎn)染HBV全基因組的Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分泌的乙肝表面抗原(HBsAg)及對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2μmol/L濃度的環(huán)孢菌素抑制劑SCY-635聯(lián)合0.1μmol/L濃度的恩替卡韋或2μmol/L濃度的環(huán)孢菌素抑制劑SCY-635聯(lián)合200μmol/L的替諾福韋比分別單獨(dú)用藥時(shí)更能顯著降低HBV全基因組轉(zhuǎn)基因人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7細(xì)胞的血清HBV DNA拷貝數(shù)以及乙肝表面抗原(HBsAg)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：2μmol/L濃度的SCY-635、0.1μmol/L濃度的恩替卡韋和200μmol/L的替諾福韋對(duì)HBsAg 的抑制率分別為30％、25％和61％，而2μmol/L SCY-635與0.1μmol/L恩替卡韋或2μmol/L SCY-635與200μmol/L替諾福韋聯(lián)合給藥對(duì)HBsAg的抑制率則分別為43％和77％?？梢娐?lián)合給藥比單獨(dú)給藥對(duì)HBsAg的抑制效率還要高10％以上。2μmol/L濃度的SCY-635、0.1μmol/L濃度的恩替卡韋和200μmol/L的替諾福韋對(duì)HBV DNA拷貝數(shù)的抑制率分別為42％、39％和80％，而2μmol/L SCY-635與0.1μmol/L恩替卡韋或2μmol/L SCY-635與200μmol/L替諾福韋聯(lián)合給藥對(duì)HBV DNA的抑制率則分別為55％和90％。同樣可見聯(lián)合給藥比單獨(dú)給藥對(duì)HBV DNA的抑制效率也要高出至少10％。

由此可見，環(huán)孢菌素衍生物SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋組合用藥有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預(yù)期該組合藥物可以作為降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎的組合藥物繼續(xù)開發(fā)。目前尚無(wú)有關(guān)SCY-635的組合藥物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報(bào)道，因此環(huán)孢菌素衍生物SCY-635與恩替卡韋或替諾福韋組合用藥對(duì)于HBsAg和HBV DNA強(qiáng)效抑制均具有明確的創(chuàng)新性。

在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。