本發(fā)明屬于鹿血漿酶解肽活性提取物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鹿血漿酶解肽在制備以及在抗衰老、抗腫瘤保健品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

梅花鹿是一種具有悠久應(yīng)用歷史的珍貴動(dòng)物。我國是世界上最早將梅花鹿產(chǎn)品應(yīng)用于醫(yī)療的國家，距今大約已有二千多年的歷史。梅花鹿產(chǎn)品作為一種純天然，綠色保健食品，可以藥食兩用，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高，老少皆宜的滋補(bǔ)品。近代，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明了鹿血確實(shí)具有養(yǎng)容顏，治療貧血，調(diào)節(jié)免疫，延緩衰老，改善記憶，抗疲勞，改善性功能等多項(xiàng)治療保健作用。

鹿血，為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的膛血或茸血,其性熱,味甘咸,歸肝、腎二經(jīng)；具有養(yǎng)血益精、行血祛瘀、消腫療傷等作用。鹿血在中醫(yī)臨床上有重要地位,而且在俄羅斯、韓國、日本和東南亞民間醫(yī)學(xué)中也亦廣泛流傳。新鮮鹿血含水量為80％～81％，并含有多種氨基酸、酶類、脂類、游離脂肪酸類、固醇類、磷脂類、激素類、維生素類、嘌呤類和多糖類，具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗輻射、助強(qiáng)壯、美容、補(bǔ)血、補(bǔ)腎益精、增強(qiáng)免疫力等多種保健功能。當(dāng)今由于科學(xué)技術(shù)的發(fā)達(dá)，通過先進(jìn)工藝更是將鹿血的生產(chǎn)及應(yīng)用發(fā)揮的淋漓盡致。如鹿血紅花酒、東海鹿血酒、鹿血發(fā)酵酒、中華鹿血酒等酒劑制品。鹿血美膚膠囊、中國梅花鹿生鮮血粉膠囊等膠囊制劑。藥膳食品中如鹿血蛋羹、鹿血豆腐、鹿血粥等。但是目前市場(chǎng)上的鹿血制品多為酒劑，不能滿足兒童及青少年的需求，并且對(duì)酒精過敏者有局限性，而膠囊制劑不便于吞咽，鹿血藥膳如果處理不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生鹿血的血腥味，且鹿血的有效成分不易吸收，因此有一定的局限性。并且制備工藝簡(jiǎn)單粗糙，寶貴的鹿血資源得不到充分的利用。

鹿血經(jīng)抗凝處理后，利用離心分離技術(shù)得到的液體，占全血總量的55％左右即為鹿血漿，可作為民間傳統(tǒng)的滋補(bǔ)佳品，具有重要保健功能。但因其粘度大，蛋白分子量高等特點(diǎn)不利于人體的吸收和利用。經(jīng)研究表明，利用蛋白酶將鹿血漿進(jìn)行酶解后，所得酶解液同樣具有與鹿血漿類似的保健功能，且黏度降低，流動(dòng)性及溶解性增強(qiáng)，可為后期生產(chǎn)加工提供便利，且酶解可將大分子的蛋白質(zhì)變成小分子的肽，肽具有多種生物學(xué)功能如修復(fù)細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞生長、提高消化系統(tǒng)功能、清除體內(nèi)自由基防止血栓的形成、改善內(nèi)分泌等并且更利于人體的吸收。

自由基代謝的失衡與機(jī)體許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，如癌癥、阿爾茨海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、側(cè)索硬化癥、糖尿病等。正常機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中。正常機(jī)體條件下產(chǎn)生的自由基主要是由于各種細(xì)胞器正常運(yùn)作過程中產(chǎn)生的，比如說線粒體在產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)時(shí)，呼吸鏈產(chǎn)生的電子氧化產(chǎn)生超氧陰離子可以被利用并發(fā)揮生理作用，體外自由基主要是生活環(huán)境中的應(yīng)激刺激機(jī)體產(chǎn)生的，如紫外線、高溫、電離輻射、大氣污染等，一些藥物如類固醇激素等的攝入在體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生自由基。當(dāng)這些因素使自由基生成過多或和體內(nèi)各類抗氧化物質(zhì)減少，則體內(nèi)自由基將不斷積聚，從而引起機(jī)體的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致過氧化損傷增多。氧化應(yīng)激使機(jī)體處于易損狀態(tài)，過量的自由基會(huì)引起廣泛的損傷效應(yīng)自；由基過多引起的氧化應(yīng)激也會(huì)對(duì)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)損傷，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生、蛋白質(zhì)損傷和熱休克反應(yīng)、損傷、信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變、刺激轉(zhuǎn)錄因子活化等，而這些損傷將最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,對(duì)機(jī)體造成損傷。

目前對(duì)于抗氧化肽的研究已有較多的報(bào)道，沈浥等人通過對(duì)乳清蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化性能的乳清蛋白酶解肽(WHPs)；席守民等人發(fā)現(xiàn)蝸牛多肽混合物具有抗過氧化氫誘導(dǎo)神經(jīng)母瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)損傷的作用；趙江等人也發(fā)現(xiàn)山楂提取物具有對(duì)秀麗隱桿線蟲急性氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。抗氧化肽具有清除自由基、清除供氫/供電子、螯合金屬離子、淬滅單線態(tài)氧、分解過氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化功效，易消化吸收，無毒副作用，生物利用率高，營養(yǎng)和加工特性良好。

食品中營養(yǎng)成分的氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生過氧化物。過氧化物影響食品的營養(yǎng)價(jià)值，嚴(yán)重還可導(dǎo)致疾病發(fā)生，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產(chǎn)生一直是生化營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前廣泛使用的抗氧化劑如BHA、BHT等，多為化學(xué)合成物，雖抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺有蓄積性致癌作用。因此人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑，目前很多的天然提取抗氧化產(chǎn)物多為有機(jī)溶劑提取或者萃取技術(shù)，成本高且工藝復(fù)雜。抗腫瘤藥物的制備也同樣以化學(xué)合成法或半化學(xué)合成法為主，主要是通過化學(xué)反應(yīng)對(duì)藥物進(jìn)行合成，如目前應(yīng)用較廣泛的紫杉醇，利用組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇進(jìn)展很快,但無法達(dá)到商業(yè)要求,所以目前只是擴(kuò)大藥源的潛在方法。因此找到一種成本低，高效快速，操作簡(jiǎn)單，原料豐富，安全且副作用小的方法制備利于人體吸收的可以作為保健品服用的抗氧化抗腫瘤產(chǎn)品成為了一個(gè)值得關(guān)注的焦點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中制備抗衰老抗腫瘤藥物或保健品的不足，本發(fā)明提供一種鹿血漿酶解肽在在制備抗衰老抗腫瘤藥物或保健品的應(yīng)用。

本發(fā)明主要對(duì)鹿血漿的酶解肽進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其可以降低過氧化氫(H₂O₂)損傷條件下的活性氧含量，降低對(duì)細(xì)胞的損傷程度，使細(xì)胞維持正常的生長形態(tài)；同時(shí)酶解肽可以延長秀麗隱桿線蟲的生命周期，提高線蟲的抗逆性；酶解肽還具有抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；促進(jìn)小鼠原代胚胎細(xì)胞生長并延長細(xì)胞存活周期等特性?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的在于提供鹿血漿酶解肽在制備抗氧化及抗腫瘤的藥物或保健品中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種新的抗衰老預(yù)防癌癥發(fā)生的手段。

本發(fā)明應(yīng)用了食用酶的酶解特性通過控制不同的酶解溫度、氫離子濃度指數(shù)(pH)、時(shí)間等條件、通過H₂O₂刺激構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型、利用噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量、細(xì)胞凋亡情況、以秀麗隱桿線蟲為動(dòng)物模型，檢測(cè)其抗氧化抗衰老性能、以小鼠原代胚胎細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞為模型，檢測(cè)酶解肽的促增長性能等生物技術(shù)手段。闡述鹿血肽具有抗衰老、抗腫瘤的生物學(xué)活性。

具體的，成本低的雙酶聯(lián)合酶解法制備鹿血漿酶解肽，利用酶解的手段對(duì)體系中的大分子量蛋白進(jìn)行水解制備小分子肽的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，我們采用可食用且應(yīng)用范圍廣泛的食品級(jí)酶：堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶形成不同的酶解組合得到不同的酶解產(chǎn)物，首先通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及小分子專用聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分析酶解后大分子量蛋白的酶解情況及不同分子量蛋白的分布。發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶(trypsin，T)、木瓜蛋白酶單酶解(papain，P)與風(fēng)味蛋白酶(flavourzyme，F(xiàn))、堿性蛋白酶(alkaline proteinase，A)單酶解相比效果更優(yōu)，并且胰木雙酶解(TP)組合效果也好于風(fēng)堿雙酶解(FA)組合選定L02、SH-SY5Y兩種細(xì)胞系，以體積比為10％的不同酶解成分作用于兩種細(xì)胞，MTT檢測(cè)對(duì)兩種細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無明顯作用，對(duì)L02有較明顯的促增殖作用，其中TP組促增殖作用最為明顯。在抗氧化實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)TP組能夠顯著降低胞內(nèi)ROS含量恢復(fù)至與對(duì)照組水平基本保持一致。進(jìn)一步選用不同濃度的TP組產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)，200μg/ml檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量及鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化確定TP組產(chǎn)物的最佳作用濃度，發(fā)現(xiàn)較損傷組相比ROS含量有所降低至與對(duì)照組相近的水平通過細(xì)胞形態(tài)觀察也可以較好的維持細(xì)胞形態(tài)因此認(rèn)為200μg/ml為最佳細(xì)胞保護(hù)濃度。說明酶解產(chǎn)物可以在一定程度上保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受過量的ROS的損傷并維持一定的細(xì)胞形態(tài)。TP組作用于乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231，通過MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)作用 濃度為20％，作用時(shí)間為24h時(shí)便可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并且隨著濃度的增加，抑制程度也不斷增加。隨后流式檢測(cè)TP作用于MDAMB231細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡程度，發(fā)現(xiàn)隨著作用濃度的增加，TP產(chǎn)物具有逐漸促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)，當(dāng)體積比濃度達(dá)到25％時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率增加了22.33％，說明酶解產(chǎn)物具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，并且有一部分是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑來發(fā)生的。同樣，以相同的濃度作用于小鼠原代胚胎細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行比較觀察酶解產(chǎn)物對(duì)不同類型細(xì)胞生命活動(dòng)的影響。分別作用24h、48h及10d后通過鏡檢細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞增殖數(shù)量，發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，酶解產(chǎn)物明顯促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。在10d時(shí)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)體積比2.5％濃度作用實(shí)驗(yàn)組組明顯增加了原代胚胎細(xì)胞的存活狀況，并且促進(jìn)了細(xì)胞的增殖與分裂，而對(duì)照組很多已經(jīng)不再具備完整的細(xì)胞形態(tài)。這說明了TP酶解產(chǎn)物具有促進(jìn)原代胚胎細(xì)胞增殖延長細(xì)胞存活周期的作用。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)TP酶解產(chǎn)物抗氧化抗衰老作用，用含有0.6mg/ml TP酶解產(chǎn)物的大腸桿菌OP50(Escherichia coli,E.coli)喂食秀麗隱桿線蟲，對(duì)照組只喂食OP50，分別對(duì)線蟲壽命實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)卵率，抗熱激能力進(jìn)行檢測(cè)，TP酶解產(chǎn)物喂食秀麗隱桿線蟲，對(duì)其壽命無明顯的影響，但顯著增加了線蟲的產(chǎn)卵率，在35℃熱激條件下，TP組顯著延長了線蟲壽命，說明TP酶解產(chǎn)物喂食線蟲后，表現(xiàn)出了其抗衰老，增強(qiáng)線蟲抗逆性的特點(diǎn)。

因此，可以利用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶解得手段對(duì)鹿血漿進(jìn)行了聯(lián)合酶解得到鹿血肽，其具有抗衰老養(yǎng)生之道，抗腫瘤等生物活性，可將鹿血肽應(yīng)用于腫瘤、阿爾茨海默癥等的預(yù)防及治療中，即用于制備抗衰老抗腫瘤的藥物或保健品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

本發(fā)明中用到的酶解法生產(chǎn)活性肽具有產(chǎn)品安全性高，基本無副作用，生產(chǎn)條件溫和，不產(chǎn)生消旋，水解易控制，成本低等優(yōu)點(diǎn)，為現(xiàn)在生產(chǎn)活性肽最為推廣的生產(chǎn)方法。本發(fā)明得到的活性肽不僅具有肽普遍具有的抗氧化活性，同時(shí)兼有抗腫瘤的活性，與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比，不僅合成手段綠色健康，可食用酶來源廣泛，同時(shí)毒副作用小，減弱了目前市面上化療藥物所引起的白血球下降、免疫力減弱、精神恍惚、視力模糊等毒副作用。

附圖說明

圖1：不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖；

其中，條帶Marker：14-100bp；條帶T：胰蛋白酶單酶解組；條帶P：木瓜蛋白酶單酶解組；條帶TP：胰蛋白酶木瓜蛋白酶聯(lián)合酶解組；條帶A：堿性蛋 白酶單酶解組；條帶F：風(fēng)味蛋白酶單酶解組；條帶AF：堿性蛋白酶風(fēng)味蛋白酶聯(lián)合酶解組。N：未經(jīng)過酶解的鹿血漿原液(以下均為縮寫)

圖2：不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE分析圖

圖3：不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞(SH-SY5Y、L02)存活率的影響圖。

圖4：SH-SY5Y細(xì)胞過氧化氫氧化損傷模型的建立。

圖5：不同蛋白酶酶解產(chǎn)物ROS清除能力的檢測(cè)圖(a)及定量圖(b)

圖6：檢測(cè)不同濃度的TP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的ROS清除能力圖(a)及細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)不同濃度的TP對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用圖(b)；

圖7：TP對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDAMB231增殖抑制作用圖；

圖8：TP誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDAMB231凋亡的檢測(cè)圖(a)及定量圖(b)

圖9：不同濃度TP促進(jìn)小鼠原代胚胎細(xì)胞生長不同時(shí)間點(diǎn)的拍照觀察檢測(cè)圖，其中(a)24h，TP體積比為2.5％、5％、10％、15％、20％(b)48h，TP體積比為2.5％、5％、10％、15％、20％(c)10d，TP體積比為2.5％

圖10：TP對(duì)線蟲生命周期的影響圖；

圖11：TP對(duì)線蟲產(chǎn)卵率的影響圖；

圖12：TP對(duì)線蟲抗熱激能力的影響圖(a)和統(tǒng)計(jì)圖(b)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：鹿血漿酶解肽的制備

選取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶分別進(jìn)行單酶解和不同的雙酶解組合制備具有不同活性成分的酶解組分。具體步驟如下：取20ml鹿血漿原液，檢測(cè)其蛋白質(zhì)濃度并計(jì)算所含的蛋白質(zhì)總量。充分混勻后90℃預(yù)處理5min。

組A：胰蛋白酶(反應(yīng)溫度37℃)、木瓜蛋白酶(反應(yīng)溫度55℃)

胰蛋白酶單酶解：降溫至37℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min,調(diào)pH至中性后加胰蛋白酶,酶底物比為4％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在7±0.05之間,水解90min后，沸水浴滅酶10min,迅速冷卻，調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀，上清液即為胰酶單酶解產(chǎn)物，4℃冷藏備用。

木瓜蛋白酶單酶解：降溫至55℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min,調(diào)pH至中性后加入木瓜蛋白酶，酶底物比2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在 7士0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀,上清液即為木瓜蛋白酶單酶解產(chǎn)物，4℃冷藏備用。

雙酶解：降溫至37℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min，調(diào)pH至中性后加胰蛋白酶,酶底物比為4％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在7±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀。上清液轉(zhuǎn)入預(yù)先調(diào)至55℃的酶反應(yīng)器保溫,調(diào)pH至中性后重新檢測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)濃度，加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在7±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀,上清液4℃冷藏備用。

組B：風(fēng)味蛋白酶(反應(yīng)溫度55℃)、堿性蛋白酶(反應(yīng)溫度60℃)

風(fēng)味蛋白酶單酶解：降溫至55℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min,調(diào)pH至中性后加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在7±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀,上清液即為風(fēng)味蛋白酶單酶解產(chǎn)物，4℃冷藏備用。

堿性蛋白酶單酶解：降溫至60℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min,調(diào)pH至中性后加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在8±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀,上清液即為堿性蛋白酶單酶解產(chǎn)物，4℃冷藏備用。

雙酶解：降溫至55℃并在酶反應(yīng)器中保溫10min,調(diào)pH至中性后加風(fēng)味蛋白酶底物比為2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在7±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀。上清液轉(zhuǎn)入預(yù)先調(diào)至60℃的酶反應(yīng)器保溫,調(diào)pH至中性后重新檢測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)濃度，將pH調(diào)節(jié)至8±0.05加入堿性蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解過程中不斷調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值在8±0.05之間,水解90min后,沸水浴滅酶10min,迅速冷卻,調(diào)至中性,8000rpm冷凍離心30min后棄去沉淀,上清液4℃冷藏備用。

實(shí)施例2：SDS-PAGE檢測(cè)不同酶解產(chǎn)物蛋白分子量的分布

包括以下步驟：

配制SDS-PAGE電泳緩沖液(最好不要過夜，現(xiàn)用現(xiàn)配)，灌滿里側(cè)電泳槽，外側(cè)電泳槽的緩沖液可以重復(fù)利用2-3次。取相同蛋白含量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃金屬浴10min，12000rpm離心5min，取上清液及5μL蛋白質(zhì)預(yù)染Marker進(jìn)行電泳，電壓設(shè)定80V進(jìn)行濃縮膠，使蛋白樣品遷移到濃縮膠與分離膠的界限并濃縮成一條細(xì)線；將電壓設(shè)定為120V，待溴酚藍(lán)遷 移到凝膠底部，停止電泳；取出蛋白凝膠后考馬斯亮藍(lán)R-250染色1h，棄去染色液，脫色液脫色兩小時(shí)左右至蛋白膠背景透亮，條帶清晰，拍照分析。

表1：SDS-PAGE配方：

如圖1和圖2中所示，從圖中可以看出，與未經(jīng)過任何酶解的鹿血漿原液(N)相比，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單酶解能夠充分分解白蛋白等大蛋白,與堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶單酶解相比效果更優(yōu)，并且胰木雙酶解組效果也好于風(fēng)堿雙酶解組合，主要表現(xiàn)在大分子蛋白(主要為55kD處的白蛋白)降解更徹底以及14kD以下多肽聚集更明顯。

實(shí)施例3：不同酶解產(chǎn)物對(duì)兩種細(xì)胞的增殖影響

L02細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞系)、SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系)采用含有體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。稱取MTT 0.25g溶于500ml PBS配成濃度為5mg/ml的使用液，過濾除菌分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。分別取對(duì)數(shù)生長期的兩種細(xì)胞，1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)基200μL，37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h。棄去原培養(yǎng)基，以體積比為10％的不同酶解成分作用于兩種細(xì)胞，同時(shí)以相同體積比的磷酸緩沖液作用于細(xì)胞作為空白對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入20μL 5mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)溶液至終濃度為0.5mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后小心吸棄上清，加入150μl二甲亞砜溶解生成的沉淀物，振蕩5min后，在492nm下通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。取各平行孔吸光度值的平均值，依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample為加入不同的酶解產(chǎn)物后的吸光度值，A_control為以加入相同體積比的磷酸緩沖液細(xì)胞培養(yǎng)液正常培養(yǎng)細(xì)胞后的吸光度值，A_blank為無培養(yǎng)細(xì)胞僅加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液后的吸光度值。

從圖3可以看出，當(dāng)以體積比為10％的不同酶解成分作用于兩種細(xì)胞，MTT檢測(cè)對(duì)兩種細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無明顯作用，對(duì)L02有較明顯的促增殖作用，其中TP組促增殖作用最為明顯。

實(shí)施例4：鹿血肽抗氧化功能的探究

(1)H₂O₂對(duì)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建

取生長對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞,消化后接種,以2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后,棄去原培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基并在培養(yǎng)基中加入H₂O₂,終濃度分別為50、100、200、300、400、500、600、700、800μmol/L。細(xì)胞分別在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后,吸出上清液,以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,選取致死率接近50％的濃度作為氧化損傷模型建立的濃度。

(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同酶解產(chǎn)物的抗氧化功能

取生長對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞,消化后接種6孔板,細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔,每孔培養(yǎng)基2ml，培養(yǎng)24h后分組如下：

①正常組：正常細(xì)胞

②模型組：細(xì)胞+H₂O₂(H₂O₂濃度為最佳損傷濃度：500μmol/L)

③樣品保護(hù)組：A：細(xì)胞+胰蛋白酶單酶解+H₂O₂；B：細(xì)胞+木瓜蛋白酶單酶解+H₂O₂；C：細(xì)胞+堿性蛋白酶單酶解+H₂O₂；D：細(xì)胞+胰木雙酶解+H₂O₂細(xì)胞培養(yǎng)24后，樣品保護(hù)組提前加入200μg/ml的各組樣品預(yù)孵2h，取出去除上清后再在培養(yǎng)基中加入H₂O₂使其終濃度為最佳損傷濃度500μmol/L刺激細(xì)胞12h。根據(jù)活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)的使用說明書進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)：使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化貼壁細(xì)胞，2000g離心5min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。裝載檢測(cè)ROS的探針DCFH-DA：按照體積比1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋探針DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為10⁶～2×10⁸/ml，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。每隔3-5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。

從圖4中可以看出，當(dāng)H₂O₂濃度為500μM，作用時(shí)間為12h時(shí)，細(xì)胞死亡率可以達(dá)到50％，可以以此作為半數(shù)致死濃度，氧化損傷建立成功。圖5的(a)為流式檢測(cè)ROS含量的結(jié)果，圖(b)為圖(a)的數(shù)值量化可以看出，從(a)和(b)中 同時(shí)可以看出當(dāng)以200μg/ml濃度的不同酶解產(chǎn)物作用于SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶單酶解產(chǎn)物組與H₂O₂組相比均可以降低10％-12％的ROS含量，但ROS水平仍然高于對(duì)照組，胰蛋白酶木瓜蛋白酶聯(lián)合酶解組與H₂O₂組相比ROS水平可以降低到達(dá)30％，基本與對(duì)照組持平。說明聯(lián)合酶解組清除ROS的能力更強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用更好。

(3)流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞形態(tài)觀察檢測(cè)不同濃度胰木聯(lián)合酶解組產(chǎn)物的抗氧化

功能。

取生長對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞,消化后接種于兩個(gè)6孔板中,細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔,培養(yǎng)24h后分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和熒光顯微鏡拍照觀察分組如下：

①正常組：正常細(xì)胞

②模型組：細(xì)胞+H₂O₂(H₂O₂濃度為最佳損傷濃度：500μmol/L)

③樣品保護(hù)組：A：細(xì)胞+50μg/ml樣品+H₂O₂；B：細(xì)胞+100μg/ml樣品+H₂O₂；C：細(xì)胞+200μg/ml樣品+H₂O₂；D：細(xì)胞+1000μg/ml樣品+H₂O₂

細(xì)胞培養(yǎng)24后，樣品保護(hù)組提前加入不同濃度的胰木聯(lián)合酶解產(chǎn)物預(yù)孵2h，取出去除上清后再在培養(yǎng)基中加入H₂O₂使其終濃度為最佳損傷濃度500μmol/L刺激細(xì)胞12h。收集細(xì)胞后裝載探針檢測(cè)ROS。樣品的制備與檢測(cè)方法與實(shí)施例4(2)中的第③步相同。同時(shí)使用熒光顯微鏡對(duì)另一個(gè)6孔板進(jìn)行觀察及拍照記錄。

圖6中(a)圖為流式檢測(cè)不同濃度TP對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響，可以看出，200μg/ml濃度較損傷組相比ROS含量有所降低至與對(duì)照組相近的水平，而50μg/ml和100μg/ml組雖然也降低了ROS含量，但與對(duì)照組相比，降低程度過大，ROS含量過高與過低均不利于細(xì)胞的生存及生長。圖(b)為熒光顯微鏡拍攝觀察細(xì)胞形態(tài)，通過細(xì)胞形態(tài)觀察也可以發(fā)現(xiàn)200μg/ml可以較好的維持細(xì)胞形態(tài)，因此認(rèn)為200μg/ml為最佳細(xì)胞保護(hù)濃度。說明酶解產(chǎn)物可以在一定程度上保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受過量的ROS的損傷并維持一定的細(xì)胞形態(tài)。

實(shí)施例5：胰木聯(lián)合酶解產(chǎn)物抗腫瘤作用的研究

(1)MTT檢測(cè)酶解產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率

以1×10⁴細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDAMB231細(xì)胞接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)基200μL，預(yù)培養(yǎng)24h。吸棄培養(yǎng)基，在1.5ml EP管中將聯(lián)合酶解產(chǎn)物與DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以一定的比例混合將其分別稀釋至體積比10％、20％、30％、40％、50％，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔200μL加入至細(xì)胞培養(yǎng)體系中，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入20μL 5mg/mL 噻唑藍(lán)(MTT)溶液至終濃度為0.5mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后小心吸棄上清，加入150μl二甲亞砜溶解生成的沉淀物，振蕩5min后，在492nm下通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。取各平行孔吸光度值的平均值，依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample為加入不同的酶解產(chǎn)物后的吸光度值，A_control為以加入相同體積比的磷酸緩沖液細(xì)胞培養(yǎng)液正常培養(yǎng)細(xì)胞后的吸光度值，A_blank為無培養(yǎng)細(xì)胞僅加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液后的吸光度值。

研究中，對(duì)胰木聯(lián)合酶解產(chǎn)物進(jìn)行不同體積比的稀釋，作用于腫瘤細(xì)胞24h后檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)體積比為10％時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖無明顯影響，當(dāng)體積比為20％時(shí)，細(xì)胞死亡比例即可以達(dá)到40％，并且隨著加入酶解肽體積比的不斷增加，細(xì)胞死亡百分比不斷升高，說明酶解肽可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。

(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)酶解產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

以2×10⁵細(xì)胞/孔的密度分別將MCF7、MDAMB231細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基2mL，預(yù)培養(yǎng)24h。吸棄培養(yǎng)基，在1.5ml EP管中將聯(lián)合酶解產(chǎn)物與DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液以一定的比例混合將其分別稀釋至體積比5％、10％、15％、20％、25％，總體積為1ml。分別將其加入細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中，并向各孔中補(bǔ)加1ml DMEM完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h。根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博公司)的使用說明書進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)：使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化貼壁細(xì)胞，2000g離心5min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次；以50μL染色體系對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，其中包括2μL Annexin V-FITC和2μL PI，混勻后于4℃避光條件下孵育30min；以Annexin V結(jié)合緩沖液將體系稀釋至400μL，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞凋亡情況。

圖8中(a)圖為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TP誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)圖，(b)圖為對(duì)(a)圖的定量，從兩個(gè)圖中同時(shí)可以看出，聯(lián)合酶解產(chǎn)物對(duì)MDAMB231細(xì)胞具有良好的凋亡誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)隨著肽濃度的增加，晚期凋亡比例高于對(duì)照組但基本保持在8％左右，早期凋亡的比例不斷增加，當(dāng)體積比為25％時(shí)，早期凋亡即可達(dá)到23.4％。

實(shí)施例6：聯(lián)合酶解產(chǎn)物TP對(duì)小鼠原代胚胎細(xì)胞增殖的影響

選取孕期8-10d的母鼠在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行解剖，在無菌條件下采取動(dòng)物的組織或器官研磨成單個(gè)細(xì)胞，采用含有體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清、1％的L-谷氨酰胺的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。以2×10⁵細(xì)胞/孔的密度將胚胎細(xì)胞接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基2mL， 預(yù)培養(yǎng)24h。吸棄培養(yǎng)基，在1.5ml EP管中將聯(lián)合酶解產(chǎn)物與DMEM-F12完全培養(yǎng)基以一定的比例混合將其分別稀釋至體積比5％、10％、15％、20％、25％，總體積為1ml。分別將其加入細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中，并向各孔中補(bǔ)加1ml DMEM-F12完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置只加入完全培養(yǎng)基的組為對(duì)照組。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，為了觀察酶解產(chǎn)物是否具有延長胚胎細(xì)胞生命周期的作用，每隔48h給對(duì)照組和加入不同濃度TP的實(shí)驗(yàn)組換一次相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔一定時(shí)間對(duì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)及拍照記錄，最后記錄培養(yǎng)了24h、48h及10d時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)。

從圖9中可以看出，培養(yǎng)24h時(shí)，在體積比為2.5％時(shí)，即能夠促進(jìn)胚胎細(xì)胞的增殖，細(xì)胞數(shù)量整體增多。在48h時(shí)，與24h相比，各組細(xì)胞數(shù)量均有增加，但對(duì)照組變化較小，與對(duì)照組相比，酶解產(chǎn)物處理的組別中細(xì)胞均明顯增多。隨著時(shí)間的延長，原代胚胎細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下不具有無限增殖的能力，因此會(huì)逐漸死亡，我們發(fā)現(xiàn)在10d時(shí)，酶解肽處理組的細(xì)胞形態(tài)要明顯優(yōu)于對(duì)照組，并且細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，說明我們給予原代胚胎細(xì)胞不同濃度的酶解產(chǎn)物處理之后，可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，延長細(xì)胞的生命周期。

實(shí)施例7：聯(lián)合酶解肽TP對(duì)秀麗隱桿線蟲生命周期影響的研究

(1)線蟲生命周期實(shí)驗(yàn)

選用雌雄同體的野生型秀麗隱桿線蟲N2，采用涂有大腸桿菌E.coli OP50的線蟲培養(yǎng)專用的板，于20℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要將線蟲進(jìn)行同期化處理，以便對(duì)相同發(fā)育階段線蟲的表型進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。采用轉(zhuǎn)移母蟲線蟲進(jìn)行同期化：一般一條產(chǎn)卵期線蟲一小時(shí)可以產(chǎn)卵8個(gè)左右。把平板置于20℃恒溫箱中孵育。為了得到同步生長的線蟲，挑取進(jìn)入產(chǎn)卵期的線蟲若干條在一個(gè)平板中，具體數(shù)量視所需要的線蟲數(shù)量而定，孵育約0.5h后，將平板中線蟲挑出，平板中的卵孵化后即處于同一發(fā)育時(shí)期。野生型在20℃以O(shè)P50為食生命周期實(shí)驗(yàn)方法如下：轉(zhuǎn)移50顆卵至兩個(gè)新鮮接種OP50的線蟲專用培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)基上，操作中避免轉(zhuǎn)入幼體和成蟲。將卵置于20℃，48h等待卵孵化發(fā)育至L4期。第0d：將線蟲轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組記為第0d，觀察線蟲并記錄生長狀況，繼續(xù)培養(yǎng)線蟲至L4期。實(shí)驗(yàn)分TP組和對(duì)照組。設(shè)置兩組樣品，第一組為聯(lián)合酶解肽組，酶解肽初始濃度為6mg/ml，將OP50與一定量酶解產(chǎn)物混勻加入培養(yǎng)基，涂布棒涂勻，酶解肽終濃度為0.6mg/ml；第二組為對(duì)照組，涂布與實(shí)驗(yàn)組相同體積的OP50。轉(zhuǎn)移12條健康L4期線蟲至新鮮接種皿，共6個(gè)皿并標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱培養(yǎng)。記錄：建立表格，記錄存活、死亡、刪除的線蟲數(shù)目。被刪除的線蟲指的是丟失、鉆到瓊脂里的、爬到皿壁上而干死 的，有一些會(huì)生殖道外翻，或者變成蟲袋。第2d：將開始產(chǎn)卵的母代線蟲轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基。第4、6、8d：兩天后，隔一天觀察并轉(zhuǎn)移線蟲，直到產(chǎn)卵期結(jié)束，期間做好數(shù)據(jù)記錄。比較并制作開普勒米耶生存曲線。

死亡判斷方法：線蟲隨著年齡的增長行動(dòng)變慢，尤其在他們生命的最后時(shí)刻幾乎是靜止的，偶爾擺動(dòng)一下頭或尾巴?，F(xiàn)在普遍被接受的判斷線蟲死亡的方法包括物理法和化學(xué)法。我們采用物理法：用挑蟲針刺激它一下，然后觀察它的反應(yīng)。刺激兩次以上均無反應(yīng)說明線蟲已經(jīng)死亡。另外，為了避免反復(fù)機(jī)械刺激對(duì)線蟲的損傷，可以把鉑絲燒紅，靠近線蟲頭部而不接觸線蟲，觀察它的反應(yīng)，活的線蟲會(huì)擺動(dòng)一下腦袋，死亡的則不會(huì)。

從圖10中可以看出，在19d之前喂食酶解肽組的線蟲平均存活率要高于對(duì)照組，19d之后，雖然存活率出現(xiàn)了低于對(duì)照組的趨勢(shì)，但最終平均存活時(shí)間對(duì)照組與喂食酶解肽的實(shí)驗(yàn)組是相同的，均為20d，說明酶解肽對(duì)線蟲生命周期無明顯影響。

(2)線蟲產(chǎn)卵率的測(cè)定

同期化秀麗隱桿線蟲，方法同(1)中所述。挑取L2期秀麗線蟲至含0.6mg/ml聯(lián)合酶解產(chǎn)物的涂有OP50溶液的90mm平皿中給藥，空白對(duì)照組為只涂有OP50的平皿。分別從酶解肽組和對(duì)照組挑取30條L4期的線蟲至相應(yīng)酶解肽和對(duì)照平板中，每板5條線蟲并編號(hào)記錄，于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。進(jìn)入產(chǎn)卵期開始產(chǎn)卵的當(dāng)天記為第一天，每天將線蟲轉(zhuǎn)至新的相應(yīng)培養(yǎng)板中，直到線蟲產(chǎn)卵期結(jié)束，約4d。將所有平板于20℃孵化，統(tǒng)計(jì)每條線蟲在4個(gè)平板中孵化線蟲總數(shù)即該線蟲產(chǎn)卵數(shù)量。

從圖11中可以看出，第一天喂食酶解產(chǎn)物的線蟲產(chǎn)卵量與對(duì)照組基本持平，第二天及第三天實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)卵量顯著高于對(duì)照組，產(chǎn)卵總數(shù)可以達(dá)到對(duì)照組的兩倍，第四天實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)卵量有所降低，可能是因?yàn)槲故沉嗣附猱a(chǎn)物促進(jìn)了線蟲的早期排卵，卵的數(shù)量是一定的，那么后期產(chǎn)卵量就會(huì)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。用0.6mg/ml的酶解產(chǎn)物處理過的線蟲產(chǎn)卵量提高了35％。

(3)耐熱實(shí)驗(yàn)

所有的實(shí)驗(yàn)工具置于35℃，新鮮接種的培養(yǎng)基在35℃預(yù)熱2-3h。將同期化線蟲挑取至含0.6mg/ml聯(lián)合酶解產(chǎn)物的涂有OP50溶液的直徑90mm平皿中，空白對(duì)照組為只涂有OP50的平皿。(約3d)，轉(zhuǎn)移線蟲至預(yù)熱好的TP組NGM培養(yǎng)基和對(duì)照組培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基放置30條線蟲，準(zhǔn)備10皿線蟲，將觀察后的培養(yǎng)皿廢棄，防止溫度漲落對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。分組放置于培養(yǎng)箱中，盡量減 少培養(yǎng)箱開門的時(shí)間。轉(zhuǎn)至35℃生化培養(yǎng)箱，此時(shí)設(shè)為0h，以后每隔4h記錄線蟲死亡數(shù)目。

從圖12中可以看出，在35℃高溫條件下，喂食酶解肽組線蟲平均存活24h左右，存活時(shí)間最長者存活44h；對(duì)照組線蟲平均存活20h左右，存活時(shí)間最長者存活40h，TP組線蟲比對(duì)照組線蟲存活時(shí)間延長高達(dá)20％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明酶解肽能顯著提高線蟲急性熱應(yīng)激能力。