本發(fā)明涉及醫(yī)療器械技術領域，特別涉及一種PI3K/mTOR雙重抑制劑在制備抑制血管內膜增生的藥物中的用途、載藥支架及其制備方法。

背景技術：

20世紀末期到21世紀初期分子靶向藥物的出現是抗癌藥物研究進展的里程碑式的事件，這其中PI3K抑制劑作為抗腫瘤藥物的開發(fā)一直是制藥屆的熱點。其中，LY294002和渥曼青霉素(Wortmannin)是最早出現的兩種PI3K抑制劑，它們雖顯示了一定的體內和體外抗腫瘤作用，但由于分別引起皮膚和肝臟毒性以及溶解度與穩(wěn)定性等原因，未能進入臨床試驗。

經過10多年的發(fā)展，PI3K抑制劑朝著專一性更強的方向發(fā)展，出現了一批新型的PI3K抑制劑，這些抑制劑大體可分為：PI3K亞型特異性抑制劑、泛PI3K抑制劑和PI3K/mTOR雙重抑制劑。

以血管粥樣硬化為代表的心血管疾病在全球范圍內已經成為威脅生命的重要因素。對于中度以及重度的冠心病病人，采用經皮腔內冠脈成形術(PTCA)配以冠脈支架植入術(coronary stenting)的微創(chuàng)傷介入治療創(chuàng)傷小，病人恢復快，適用范圍廣，是當前冠心病治療的熱點和較為為行之有效的治療方法之一。

1977年，全球第一例PTCA在德國施行，此后，該技術被迅速推廣，技術規(guī)范及與之相關的各種操作設備不斷改進。PTCA術雖然有創(chuàng)傷小、適應范圍廣的優(yōu)點，但術后的再狹窄率居高不下。1986年，Puel和Sigwart將第一枚冠脈金屬裸支架置入人體；之后金屬裸支架經歷了一個快速發(fā)展期。與單純的球囊擴張相比，裸金屬支架明顯降低了病變血管再狹窄率，但幾率仍高達20％以上。

2003年和2004年美國FDA分別批準Cordis公司的雷帕霉素洗脫支架(Cypher)和Boston Scientific公司的紫杉醇洗脫支架(Taxus)上市，人類進入藥物洗脫支架時代。以此為代表的藥物洗脫支架(DES)將抑制血管內膜增生或抗炎癥 抗血栓的藥物載于支架，使藥物在支架植入血管后從支架表面直接釋放到病變部位，從而預防支架內再狹窄發(fā)生，多數的臨床報道均顯示，藥物洗脫支架術后再狹窄的發(fā)生率低于10％，與裸金屬支架相比，藥物洗脫支架再狹窄率明顯降低。

雷帕霉素洗脫支架，是利用雷帕霉素對mTOR的阻斷作用，進而阻斷細胞因子和生長因子活化，從而抑制細胞的增殖和克隆擴散，阻滯細胞周期G1期的活化，抑制細胞增生，減少再狹窄。

紫杉醇洗脫支架，是利用紫杉醇與微管蛋白結合，使大量微管非正常聚合，從而改變細胞骨架的平衡狀態(tài)，產生結構的畸變，導致其失去正常的功能，造成細胞發(fā)育停止于G0/G1期和G1/M期，細胞的有絲分裂阻滯于絲狀分裂期，從而抑制細胞的分裂、增殖，減少再狹窄的發(fā)生。但相比于雷帕霉素及其衍生物，紫杉醇有更高的毒性。

藥物洗脫支架歷經10余年的發(fā)展，雖然在支架結構、藥物選擇、載藥方式等方面進行了多種改進的嘗試，但是病人的再狹窄現象始終存在，大量的臨床數據顯示，術后再狹窄率始終難以降低到5％以下。此外，隨著藥物支架在臨床上長期應用，其他方面的一些問題也日益顯現：如藥物支架晚期血栓的問題、血管內皮障礙的問題、特殊人群效果的問題等。

臨床資料顯示，目前以雷帕霉素及其衍生物為代表的藥物支架相比于裸支架并不能真正降低心肌梗死的發(fā)生率，這與其遠期血栓事件有關。與裸支架比較，隨機接受雷帕霉素藥物支架治療的患者晚期支架血栓事件發(fā)生率增加，特別是在停用氯吡格雷等藥物以后。

另外，雷帕霉素藥物支架和紫杉醇藥物支架的應用雖然大大減少了支架內再狹窄的發(fā)生，然而在其強烈抑制血管平滑肌細胞(SMC)過度增殖的同時，也不可避免抑制了支架處功能內皮層的生長，從而干擾了血管損傷處自然愈合的進程。血管內皮細胞(VEC)的損傷、修復及功能改變在再狹窄的形成過程中同樣也起到重要的作用，同時對血栓的形成有一定影響。

雷帕霉素藥物支架在臨床應用中還存在對特殊患者效果不佳的問題。特別是對于糖尿病合并心血管疾病患者，其療效相比于非糖尿病患者存在顯著差異。多項大樣本量臨床研究數據進行的多元線性回歸分析表明糖尿病是植入支架后 再狹窄的獨立風險因素。植入支架后，無論是裸金屬支架還是藥物洗脫支架，糖尿病人的再狹窄率顯著高于無糖尿病癥狀者。目前糖尿病人支架內再狹窄的機理還未完全厘清，但有一些基礎研究資料認為可能與病人胰島素抵抗有關，也有一些研究認為可能與體內瘦素(leptin)水平有關。有研究顯示，關閉瘦素接收通道可以顯著減少血管壁創(chuàng)傷后的內膜增生。Jian Shan等(Leptin-enhanced neointimal hyperplasia is reduced by mTOR and PI3K inhibitors.2008.PNAS,105:19006–19011)以高瘦素誘導糖尿病鼠模型作為研究對象觀察損傷血管的再狹窄，使用PI3K抑制劑LY294002以注射的方式干預高瘦素水平對動物的影響，結果顯示將雷帕霉素與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合使用相比于雷帕霉素單獨使用，動物血管損傷處再狹窄的程度低。研究者同時指出，以支架載藥的方式使用LY294002或其他PI3K抑制劑的有效性不得而知，但目前LY294002在臨床前研究表現出嚴重的毒性反應，未能進入臨床，采用選擇性不高的泛PI3K抑制劑與雷帕霉素合用用于支架針對糖尿病合并冠心病患者的干預存在巨大的毒性風險。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種PI3K/mTOR雙重抑制劑在制備抑制血管內膜增生的藥物中的用途、載藥支架及其制備方法，以解決患者置入藥物洗脫支架后再狹窄率仍然較高的問題。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種PI3K/mTOR雙重抑制劑的用途，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為對PI3K和mTOR都有抑制作用的藥物，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑用于制備抑制血管內膜增生的藥物。

可選的，在所述的用途中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為BKM120、ZSTK474、GDC0941、GDC0980、XL765、XL147、SF1126、BEZ235、PF04691502、GSK2126458、PKI587、BGT226、GEN477、PWT33597或DS7423中的一種或多種。

可選的，在所述的用途中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑，所述平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3K的IC50值與mTOR的IC50值的比值在預定范圍之中。

可選的，在所述的用途中，所述預定范圍為1/5～5。

可選的，在所述的用途中，所述的平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PWT33597或DGC0980。

可選的，在所述的用途中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3Kα/mTOR雙重抑制劑、或PI3Kγ/mTOR雙重抑制劑。

本發(fā)明提供一種載藥支架，所述載藥支架的支架本體上裝載有采用PI3K/mTOR雙重抑制劑制備的抑制血管內膜增生的藥物。

可選的，在所述的載藥支架中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為BKM120、ZSTK474、GDC0941、GDC0980、XL765、XL147、SF1126、BEZ235、PF04691502、GSK2126458、PKI587、BGT226、GEN477、PWT33597或DS7423中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑，所述平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3K的IC50值與mTOR的IC50值的比值在預定范圍1/5～5之中。

可選的，在所述的載藥支架中，所述的平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PWT33597或DGC0980。

可選的，在所述的載藥支架中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3Kα/mTOR雙重抑制劑或PI3Kγ/mTOR雙重抑制劑。

可選的，在所述的載藥支架中，所述支架本體上還裝載有單純PI3K抑制劑、單純mTOR抑制劑、胰島素增敏劑中的一種或多種，所述單純PI3K抑制劑僅對PI3K有抑制作用，所述單純mTOR抑制劑僅對mTOR有抑制作用。

可選的，在所述的載藥支架中，所述單純PI3K抑制劑為LY294002、渥曼青霉素、哌立福辛、艾代拉里斯、PX-866、IPI-145、BAY 80-6946、RP6503或TGR1202中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述單純mTOR抑制劑為雷帕霉素、依維莫司、他克莫司、地磷莫司、替西羅莫司或佐他莫司中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述胰島素增敏劑為曲格列酮、吡格列酮或羅格列酮中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述支架本體上還裝載有抗菌劑、抗腫瘤 藥、抗氧化劑、內皮生長因子、平滑肌細胞生長和/或遷移抑制劑、凝血酶抑制劑、抗血小板凝集劑、膠原蛋白合成抑制劑、氧化氮供體、治療抗體、非甾體抗炎藥、血管緊張素轉化酶抑制劑或自由基清除劑中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述抗腫瘤藥為甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，巰嘌呤，羥基脲，阿糖胞苷，卡鉑，順鉑，奧沙利鉑，雙環(huán)鉑，紫杉醇，柔紅霉素，多柔比星，三氧化二砷中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述抗氧化劑為維生素E、維生素C、人參皂苷、銀杏葉提取物中的一種或多種。

可選的，在所述的載藥支架中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑裝載于所述支架本體的表面、或者所述支架本體表面的凹槽或微孔中。

可選的，在所述的載藥支架中，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑通過載體裝載于所述支架本體上，所述載體為至少一種高分子涂層材料。

可選的，在所述的載藥支架中，所述高分子涂層材料為明膠或透明質酸。

本發(fā)明還提供一種載藥支架的制備方法，所述載藥支架的支架本體上裝載有采用PI3K/mTOR雙重抑制劑制備的抑制血管內膜增生的藥物，所述制備方法包括：

S1：提供支架本體；

S2：將PI3K/mTOR雙重抑制劑和溶劑混合成藥物溶液；

S3：將所述藥物溶液裝載于所述支架本體上；

S4：待所述溶劑揮發(fā)后，獲得所述載藥支架。

可選的，在所述的載藥支架的制備方法中，步驟S2中，所述溶劑為鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化物、含氮化合物或含硫化合物。

在本發(fā)明所提供的PI3K/mTOR雙重抑制劑在制備抑制血管內膜增生的藥物中的用途、載藥支架及其制備方法，將PI3K/mTOR雙重抑制劑用于制備抑制血管內膜增生的藥物，以及在支架本體上裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑，制備成用于抑制血管內膜增生的載藥支架，由于PI3K/mTOR雙重抑制劑對PI3K和mTOR都有抑制作用，因此可以發(fā)揮單一藥物的雙靶點作用，相比采用單純的mTOR 抑制劑，對于抑制血管的平滑肌的作用更強，有效地抑制血管內膜增生，使得血管再狹窄率進一步降低。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一實施例中載藥支架沿軸向展開的結構示意圖；

圖2是本發(fā)明一實施例中載藥支架的制備方法的流程圖；

圖3是本發(fā)明一實施例中藥物涂層在凹槽內的結構示意圖。

圖1-3中，支撐環(huán)-1；連接桿-2；波桿-10；凹槽-11；藥物涂層-3。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明提出的載藥支架及其制備方法作進一步詳細說明。根據下面說明和權利要求書，本發(fā)明的優(yōu)點和特征將更清楚。需說明的是，附圖均采用非常簡化的形式且均使用非精準的比例，僅用以方便、明晰地輔助說明本發(fā)明實施例的目的。

請參考圖1，其為本發(fā)明一實施例中載藥支架沿軸向展開的結構示意圖。如圖1所示，所述載藥支架包括支架本體，一個支架本體包括至少一個支撐環(huán)1及連接支撐環(huán)1的連接桿2，每個支撐環(huán)1包括波桿10以及設置于波桿10上的凹槽11。這里的凹槽11用于承載藥物，也可將其替換為微孔(微米級別的孔)。其中，所述支架本體可以選自鈦、鈷、鉭、鎳鈦合金、鎳鈦锘合金、醫(yī)用不銹鋼、醫(yī)用可降解合金材料如鋁鎂合金，也可以選用聚合物材料，這里的聚合物材料包括可降解或不可降解材料，可降解材料如PCL、PGA、PLLA、PCLA、PLGA等。

本實施例中，載藥支架可以通過高分子材料涂層載藥，或者在凹槽或微孔中裝載載體和藥物，或者直接在支架本體表面涂覆藥物制成。這里的藥物可以與支架本體以化學或物理的方式結合；藥物可以分布在支架表面，也可以置于支架內部。

其中，本實施例中選用高分子涂層材料作為藥物的載體，以實現對藥物的緩慢釋放的效果，可以通過高分子材料和藥物的比例不同使藥物釋放的曲線和周期不同，從而控制藥物的釋放時間。例如，支架上藥物和高分子材料的比例 (重量比)在5：1～1：10之間可以實現藥物在患者體內3～6個月的持續(xù)釋放。其中，高分子涂層材料可以是生物可降解聚合物，選自于聚酯、聚酸酐、聚氨基酸、聚膦腈、聚多糖等及其共聚物以及混合物，包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚己內酯、殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、聚癸酸酐、聚乙烯醇等或其混合物的一種或幾種；也可以是生物穩(wěn)定聚合物，選自于聚氨基甲酸酯、聚烯烴、聚酯、聚酰胺、聚己內酰胺、聚酰亞胺、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯醇或乙烯醇、烯烴共聚物、聚丙烯腈、聚二甲基硅氧烷、聚(乙烯-醋酸乙烯酯)、基于丙烯酸酯的聚合物或共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、氟化聚合物、纖維素酯、多孔陶瓷涂層、氟聚炭，或其混合物的一種或多種。較佳的，高分子涂層材料可以是明膠或透明質酸，以促進內皮細胞生長的功能。

本申請?zhí)峁┑妮d藥支架用于抑制血管內膜增生，主要原因在于支架本體上裝載有采用PI3K/mTOR雙重抑制劑制備的抑制血管內膜增生的藥物，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑為對PI3K和mTOR都有抑制作用的藥物，通常PI3K/mTOR雙重抑制劑應用于對腫瘤的治療，而本申請將其應用于抑制血管內膜增生中，獲得了較佳的治療效果。在支架本體上裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑的優(yōu)點體現于：由于PI3K/mTOR雙重抑制劑單一藥物對PI3K和mTOR都有抑制作用，因此可以發(fā)揮藥物的雙靶點作用性能，相比采用單純的mTOR抑制劑，對于抑制血管的平滑肌的作用更強，有效的抑制血管內膜增生，使得血管再狹窄率進一步降低。需要說明的是，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑對mTORC1和mTORC2都有抑制作用。

具體的，這里所述的PI3K/mTOR雙重抑制劑為BKM120、ZSTK474、GDC0941、GDC0980、XL765、XL147、SF1126、BEZ235、PF04691502、GSK2126458、PKI587、BGT226、GEN477、PWT33597(VDC-597)或DS7423中的一種或多種。

進一步地，PI3K/mTOR雙重抑制劑也可以是對細胞毒性更小的PI3Kα/mTOR雙重抑制劑或者PI3Kγ/mTOR雙重抑制劑。這里的PI3Kα/mTOR雙重抑制劑為GEN477、PWT33597或DGC0941中的一種或多種，以及PI3Kγ/mTOR雙重抑制劑，如XL765。PI3Kα/mTOR雙重抑制劑、PI3Kβ/mTOR雙重抑制劑和PI3Kγ/mTOR雙重抑制劑也可以被稱為特異性PI3K/mTOR雙重抑 制劑。

為了較好的體現本申請PI3K/mTOR雙重抑制劑應用在抑制血管內膜增生的藥物中能夠獲得較佳的治療效果，請參考表1，其具體記載了幾種PI3K/mTOR雙重抑制劑對于靶蛋白活性抑制測試結果。

表1

根據PI3K/mTOR雙重抑制劑的抑制選擇性將其劃分為兩類，即平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑和非平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑，所述PI3K/mTOR雙重抑制劑分為平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑和非平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑；所述平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3K的IC₅₀值與mTOR的IC₅₀值的比值在預定范圍之中，表1中的PWT33597(VDC-597)或DGC0980為平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑。所述非平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑為PI3K的IC₅₀值與mTOR的IC₅₀值的比值在預定范圍之外。以使用PI3K/mTOR雙重抑制劑進行對靶蛋白活性的抑制實驗為例，設定藥物對PI3K和mTOR的IC₅₀值分別為A和B，若A與B的比值在1/5～5(本例中的預定范圍)之間，即可認為是平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑；若A/B不在此范圍內，則認為是非平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑。經研究發(fā)現，如實驗例1中表2中的數據所示，平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑對于平滑肌細胞的抑制作用顯著，對于內皮細胞的抑制作用輕微；而在非平衡型PI3K/mTOR雙重抑制劑中，對PI3K選擇性更強的PI3K/mTOR雙重抑制劑對于血糖水平較高的病人作用更為明顯，因而針對糖尿病合并冠心病患者的效果更好。

為了本申請的載藥支架具有更佳的治療效果，在裝載PI3K/mTOR雙重抑制 劑的同時還可以裝載單純PI3K抑制劑、單純mTOR抑制劑、胰島素增敏劑中的一種或多種。其中，所述單純PI3K抑制劑僅對PI3K有抑制作用，所述單純PI3K抑制劑選自LY294002、渥曼青霉素、哌立福辛、艾代拉里斯、PX-866、IPI-145、BAY 80-6946、RP6503或TGR1202中的一種或多種；所述單純mTOR抑制劑僅對mTOR有抑制作用，具體選自雷帕霉素、依維莫司、他克莫司、地磷莫司、替西羅莫司或佐他莫司中的一種或多種；所述胰島素增敏劑選自曲格列酮、吡格列酮或羅格列酮中的一種或多種。經研究發(fā)現，如實驗例1中表2中的數據所示，單純PI3K抑制劑或單純mTOR抑制劑可以作為改變PI3K/mTOR抑制劑的靶蛋白選擇性的調節(jié)劑聯(lián)合使用。

較佳的，本申請裝載有PI3K/mTOR雙重抑制劑的載藥支架的支架本體上還裝載有抗菌劑、抗腫瘤藥、抗氧化劑、內皮生長因子、平滑肌細胞生長和/或遷移抑制劑、凝血酶抑制劑、抗血小板凝集劑、膠原蛋白合成抑制劑、氧化氮供體、治療抗體、非甾體抗炎藥、血管緊張素轉化酶抑制劑或自由基清除劑中的一種或多種。其中，所述抗菌劑可以是β內酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、喹諾酮類抗生素或磺胺類抗生素中的一種或多種；所述抗腫瘤藥物可以為甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，巰嘌呤，羥基脲，阿糖胞苷，卡鉑，順鉑，奧沙利鉑，雙環(huán)鉑，紫杉醇，柔紅霉素，多柔比星或三氧化二砷中的一種或多種；所述抗氧化劑可以是維生素E、維生素C、人參皂苷或銀杏葉提取物中的一種或多種；所述非甾體抗炎藥可以是阿司匹林、對乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、雙氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、羅非昔布或塞來昔布中的一種或多種；所述血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)可以是卡托普利、阿拉普利、依那普利、賴諾普利、培哚普利、雷米普利、喹那普利、地拉普利、西拉普利、貝那普利、螺普利、群多普利、莫昔普利、咪達普利或福辛普利中的一種或多種。

經研究發(fā)現，本發(fā)明所提供的載藥支架可以在裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑的基礎上，可以根據需要選擇裝載其它功能的藥物，具有較好的穩(wěn)定性。釋放的PI3K/mTOR雙重抑制劑發(fā)揮藥物的雙靶點作用性能，相比單純的mTOR抑制劑，對于抑制血管的平滑肌的作用更強，當其作用于病患處，有效的抑制血管內膜增生，從而使得血管再狹窄率進一步降低。相比單純的mTOR抑制劑和單純 的PI3K抑制劑聯(lián)合使用來說，避免了兩種藥物相互反應作用帶來的穩(wěn)定性下降、不良反應風險增大的問題。裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑的載藥支架的藥物釋放周期可控，可以為：1天至2年。優(yōu)選的釋放周期為15天-9個月，特別優(yōu)選：1個月-6個月。

此外，相比于采用單純的mTOR抑制劑(如雷帕霉素)的藥物支架，在支架上采用PI3K/mTOR雙重抑制劑，并未顯示增加了對血管內皮細胞的抑制作用，甚至部分PI3K/mTOR雙重抑制劑對內皮細胞的抑制作用比單純的mTOR抑制劑更弱一點，這對于減少載藥支架晚期血栓的發(fā)生率和降低血管內皮障礙有著意想不到的效果。

此外，本發(fā)明裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑的載藥支架還適合糖尿病合并心血管疾病患者，相比于雷帕霉素等單純mTOR抑制劑，其受體內病理環(huán)境變化因素的干擾更少；相比單純的mTOR抑制劑和單純的PI3K抑制劑聯(lián)合使用來說，本發(fā)明避免了兩種藥物相互反應作用帶來的穩(wěn)定性下降、不良反應風險增大乃至存在巨大毒性風險的問題。

含PI3K/mTOR雙重抑制劑的載藥支架對于抑制血管內膜增生的效能評價：

實驗例1：細胞實驗

A藥物的配制：

a)實驗前，將載有不同PI3K/mTOR雙重抑制劑的藥物支架從置于DMSO溶液中，完全溶解后并進一步稀釋形成藥物濃度為10^-2mmol/ml的溶液。

b)再將10^-2mmol/ml的藥物溶液用DMSO稀釋成濃度為10^-3,10^-4,10^-5…10^-9mmol/ml的藥物溶液。

c)將上述配制的系列濃度藥物溶液分裝后，置于-20攝氏度暫存?zhèn)溆谩?/p>

d)使用時，將保存的DMSO稀釋后的10^-2～10^-9的雷帕霉素取出恢復常溫后，用相應完全細胞培養(yǎng)基將每個濃度的藥物溶液稀釋1000倍進行細胞試驗，即最終的使用濃度分別為10^-5,10^-6,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^-11,10_-¹²mmol/mL。

B體外細胞增殖及測定

a)細胞接種濃度的選擇：選擇生長狀態(tài)良好，生長穩(wěn)定的A10細胞。消化后配制成濃度分別為1*104/ml、2*104/ml、4*104/ml、5*104/ml、10*104/ml 的細胞懸液。將上述濃度的細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，按MTT比色法進行培養(yǎng)。最后酶標儀測得570nm波長下吸光值為0.6-1.5的為要進行試驗的細胞接種液濃度。

b)配制既定的細胞濃度懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板上。

c)吸去細胞培養(yǎng)液添加最終濃度的含藥細胞培養(yǎng)液，并以無藥細胞培養(yǎng)液作為空白對照組，含1/1000濃度的DMSO細胞培養(yǎng)液作為背景對照組。細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。

d)添加MTT培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)板上的細胞培養(yǎng)液添加DMSO溶解測試吸光度

C實驗分組

實驗分別選用主動脈平滑肌細胞(HASMC)和人主動脈內皮細胞(HAEC)；每組細胞又分為13個組，每組n＝6，具體如下：

1.對照組：無藥物添加；

2.雷帕霉素組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM雷帕霉素；

3.PWT33597組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM PWT33597；

4.DGC0980組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mMDGC0980；

5.DGC0941組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM DGC0941；

6.BKM120組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM BKM120；

7.XL765組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM XL765；

8.GEN477組：培養(yǎng)基中含1nM、6μM和10mM GEN477；

9.DGC0980+雷帕霉素組：培養(yǎng)基中含1nM雷帕霉素和1nM、6μM、10mM DGC0980；

10.DGC0980+LY294002組：培養(yǎng)基中含1nM LY294002和1nM、6μM、10mM DGC0980；

11.DGC0980+羅格列酮組：培養(yǎng)基中含1nM羅格列酮和1nM、6μM、10mM DGC0980；

12.DGC0980+賴諾普利組：培養(yǎng)基中含1nM賴諾普利和1nM、6μM、10mM DGC0980；

13.XL765+維生素E+尼美舒利組：培養(yǎng)基中含1nM維生素E、1nM尼美 舒利和1nM、6μM、10mM DGC0980。

D實驗結果

各組實驗對于平滑肌細胞和內皮細胞的抑制率見表2。

表2

實驗例2：動物實驗

A研究對象：選擇巴馬小型豬，雄性，月齡1-2月，以誘導飼料配方喂養(yǎng)5個月。誘導飼料配方為：蔗糖30％，牛油15％，膽固醇3％，大豆餅17％，魚粉5％,玉米20％，小麥次粉5％，搗米糠5％。選擇出現高血糖癥、高胰島素血癥，并觀察到微蛋白尿、尿糖和腎炎等早期糖尿腎病表現的豬作為實驗對象。

B實驗分組

1、雷帕霉素支架組：動物植入含有雷帕霉素的支架

2、GEN477支架組：動物植入含有GEN477的支架

3、BKM120支架組：動物植入含有BKM120的支架

4、GEN477+雷帕霉素支架組：動物植入含有GEN477+雷帕霉素的支架

C支架植入術

術前3日開始每天喂服阿司匹林和氯吡格雷。術前麻醉動物，使其仰臥固定于手術臺，建立靜脈通路，氣管插管及呼吸機輔助呼吸。冠脈造影局部消毒后，穿刺右股動脈，經穿刺針送入導引導絲，沿導絲送入6F股動脈鞘，經鞘管給以肝素150Ukg。經鞘管送入6F右冠指引導管分別行左右冠脈造影。靶血管選擇盡量避開大的血管分支。在體外用壓力泵充盈球囊釋放支架，待支架完全貼壁并造成損傷后撤出球囊。術后復查造影。撤出導管，拔出股動脈鞘，術區(qū)局部加壓止血。豬清醒后送回隆中繼續(xù)喂養(yǎng)。

D實驗結果

支架植入后，持續(xù)飼養(yǎng)45d。45d后考察損傷部位血管內膜增生情況，測定支架植入出血管內膜(intima)和中膜厚度(media)計算其比值(I/M)ratio，結 果見表3。

表3

相應的，本實施例還提供了一種載藥支架的制備方法。下面參考圖2詳細說明本實施例所述載藥支架的制備方法。

首先，執(zhí)行步驟S1，提供支架本體；這里所述支架本體表面設置有凹槽或表面帶有微孔，以為后續(xù)裝載藥物奠定條件。

接著，執(zhí)行步驟S2，將PI3K/mTOR雙重抑制劑和溶劑混合成溶液；其中，所述溶劑為鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化物、含氮化合物或含硫化合物。

接著，執(zhí)行步驟S3，將所述溶液裝載于所述支架本體上。具體的，所述溶液裝載在所述支架本體表面的凹槽內，或將表面帶有微孔的所述支架本體浸泡在所述溶液后取出，或者將所述溶液涂覆在所述支架本體的表面。所述溶液裝載的方式為：滴注或涂覆，所述涂覆包括超聲霧化噴涂、化學氣相沉積、物理氣相淀積、離子束噴涂、浸涂、微噴或刷涂中的一種或多種。

接著，執(zhí)行步驟S4，待所述溶劑揮發(fā)后，獲得所述載藥支架。

進一步地，請結合下面幾個實施例理解載藥支架的制備方法。

實施例1：

按1:3的重量比分別稱取BKM120和聚乳酸，混合后溶于乙腈溶液制成0.9％固體含量的溶液。待溶質(即BKM120和聚乳酸)完全溶解后，用超聲霧化的方式將溶液均勻噴涂在L605鈷鉻合金金屬支架表面。室溫下待乙腈完全揮發(fā)后即制得含BKM120的載藥支架。

實施例2：

按1:1:10的重量比分別稱取XL147、雷帕霉素和SBS，混合后加入四氫呋 喃定容至固體含量百分比1％。制備含有槽結構的支架本體，然后將配得的溶液通過微噴的方法注入槽結構中。真空干燥6h，除去四氫呋喃后制得的載藥支架。

實施例3：

通過摩擦處理使不銹鋼裸支架表面形成細微紋痕，將經過微粉化處理后的GDC0980、羅格列酮、雙環(huán)鉑按照10：1：0.1的比例與裸支架置于高壓密閉設備內，開啟設備，使藥物微粒鑲嵌于裸支架的細微紋痕之中，待裸支架增重43μg/cm²，得到載藥支架。

實施例4：

取0.2g聚乳酸(PLA)，在室溫下加入到10ml乙腈配制成均勻的溶液，再加入0.05g BEZ235和0.01g紫杉醇待完全溶解，得到噴涂溶液。然后將溶液準確的噴涂至支架本體上的凹槽11內，自然干燥至重量穩(wěn)定，再經環(huán)氧乙烷滅菌后得到載藥支架。制備后的載藥支架的藥物涂層3在凹槽11內的狀態(tài)可以參考如圖3所示內容。

綜上，在本發(fā)明所提供的PI3K/mTOR雙重抑制劑在制備抑制血管內膜增生的藥物中的用途、載藥支架及其制備方法，將PI3K/mTOR雙重抑制劑用于制備抑制血管內膜增生的藥物，以及在支架本體上裝載PI3K/mTOR雙重抑制劑，制備成用于抑制血管內膜增生的載藥支架，由于PI3K/mTOR雙重抑制劑對PI3K和mTOR都有抑制作用，因此可以發(fā)揮單一藥物的雙靶點作用，相比采用單純的mTOR抑制劑，對于抑制血管的平滑肌的作用更強，有效地抑制血管內膜增生，使得血管的再狹窄率進一步降低。

上述描述僅是對本發(fā)明較佳實施例的描述，并非對本發(fā)明范圍的任何限定，本發(fā)明領域的普通技術人員根據上述揭示內容做的任何變更、修飾，均屬于權利要求書的保護范圍。