本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種骨修復材料及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

生物活性玻璃是孔徑介于2-50nm的一類多孔材料，主要含有硅、鈣和磷，它具有極高的比表面積、規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)、狹窄的孔徑分布、孔徑大小連續(xù)可調(diào)等特點。這些特點使得它在大分子的吸附、分離中具有廣泛的應用。該材料具有良好的生物活性，可使新骨生成與材料降解速度相匹配，溶出的離子可以激活成骨基因的表達，可促進成骨細胞形成、增殖、分化及細胞外基質(zhì)礦化，發(fā)揮骨誘導作用。具有良好的生物相容性、生物可降解性，可促進無機鹽的沉積、成骨細胞粘附，與骨組織結(jié)合緊密，發(fā)揮骨傳導的作用。生物活性玻璃以其優(yōu)異的骨誘導性和骨傳導性，引起了生物醫(yī)用材料界的高度關(guān)注。

然而，現(xiàn)有的生物活性玻璃由于其本身的性質(zhì)，對生物大分子的吸附作用受限。即使該材料吸附了生物大分子，生物大分子也不能從材料中緩慢釋放出來，產(chǎn)生瀑釋現(xiàn)象，因而不能滿足人們對骨修復速率與效果的需求。這一問題制約了生物活性玻璃在對骨形成過程促進方面的運用?，F(xiàn)有的骨修復材料雖然具有一定的骨傳導性，能夠提供不同水平的結(jié)構(gòu)支持，已在臨床上應用于大塊骨缺損的修復。但是生物活性玻璃的骨誘導性不足，導致細胞響應時間長、成骨方向分化能力差，呈現(xiàn)出骨再生和骨重建速度慢等問題。

表皮生長因子(EGF)是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。表皮生長因子在骨中能夠促進生成大量的成骨細胞而抑制破骨細胞的生長。然而，EGF會在骨中很快被代謝過程消耗殆盡，無法完成骨修復。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種骨修復材料及其制備方法和應用，該發(fā)明解決了現(xiàn)有生物活性玻璃對生物大分子吸附釋放能力較差，骨誘導性不足，導致細胞響應時間長、成骨方向分化能力差，呈現(xiàn)出骨再生和骨重建速度慢；表皮生長因子在骨修復過程中代謝速度過快而無法完成骨修復過程的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種骨修復材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將結(jié)構(gòu)導向劑的酸性溶液與擴孔劑溶液混合后加入由硅源、鈣源和磷源混合而成的原料混合物中，在40～50℃下攪拌均勻，即至形成具有玻璃網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的混合物后，調(diào)整所述混合物的pH值至堿性后在90～110℃下靜置沉淀，洗滌所得沉淀物至其pH為7-7.4后，在550-600℃下烘燒所得沉淀物6-10小時得到生物活性玻璃；

(2)將所述生物活性玻璃與3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合14-20小時后，在80-150℃下烘燒20-30小時，氯仿洗滌后烘干，得到氨基修飾的生物活性玻璃；

(3)向所述氨基修飾的生物活性玻璃中加入質(zhì)量濃度為10-30ng/mL的表皮生長因子溶液后孵育4-6小時，除去上清，在37-50℃下烘烤12-20小時后，得到所述骨修復材料；

所述結(jié)構(gòu)導向劑為PEO₂₀-PPO₇₀-PEO₂₀；

所述硅源、所述鈣源和所述磷源按物質(zhì)的量比為2.2-3.7:0.8-1.4:1混合。

本發(fā)明提供的制備方法以PEO₂₀-PPO₇₀-PEO₂₀為結(jié)構(gòu)導向劑，能使所得骨修復材料的微觀結(jié)構(gòu)與真骨相似，從而有利于成骨細胞在其中生長。該材料的分解過程還能為成骨細胞的生長提供鈣、磷元素，從而促進骨骼的生長。

所用硅源、鈣源和磷源按此比例混合，能合理的為骨骼再生過程提供所需元素，并提供所需支撐，增強材料的生物相容性，易于表面鈣沉積的形成，所用硅源、鈣源和磷源可以為現(xiàn)有骨修復材料中常用的無機物。

在堿性條件下形成沉淀的過程中，無機物前驅(qū)體和結(jié)構(gòu)導向劑能形成有機無機復合聚集體，并通過在該溫度下的烘燒使所形成的有機無機復合聚集體所具有的結(jié)構(gòu)有利于促進細胞在成骨方向分化，并除去結(jié)構(gòu)導向劑使所得骨修復材料適于人體使用。

此處的孵育是指在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育，從而使得氨基修飾的生物活性玻璃中所存在的孔洞結(jié)構(gòu)能對表皮生長因子進行全面吸附。

由于在骨修復過程中涉及到的多種生物大分子特別是蛋白多肽分子都具有羥基，因此對生物活性玻璃進行氨基化修飾，有助于其與蛋白多肽分子通過氫鍵的相互作用從而對蛋白多肽分子進行吸附及緩慢釋放。通過后續(xù)實驗表明：本發(fā)明制備的骨修復材料不僅可對負載的表皮生長因子進行緩釋，而且可作為表皮生長因子的載體，促進骨的生成過程。

進一步地，結(jié)構(gòu)導向劑的酸性溶液的濃度為0.016～0.025g/mL，pH值為1-2。

進一步地，擴孔劑為1，3，5-均三甲苯。

進一步地，擴孔劑溶液的濃度為0.2-0.3mol/L。

進一步地，硅源為正硅酸乙酯；所述鈣源為硝酸鈣或氯化鈣；所述磷源為磷酸三乙酯。

進一步地，表皮生長因子為質(zhì)量濃度為10-30ng/mL的溶液；所述氨基修飾的生物活性玻璃與所述表皮生長因子的質(zhì)量比為1*10⁵～0.3*10⁵。

本發(fā)明的另一方面提供了一種按上述方法制備得的骨修復材料。

進一步地，骨修復材料的平均孔徑為4～40nm，比表面積為253.4m²/g～490.3m²/g，組成中具有氨基。所得骨修復材料中存在高度有序的六方結(jié)構(gòu)的孔道結(jié)構(gòu)，從而提高了其中表皮生長因子的吸附量。

本發(fā)明的另一面提供了一種按上述方法制備得的骨修復材料在制備骨缺損修復材料中的應用。

具體的，本發(fā)明提供的骨修改材料的制備方法包括以下步驟：

1)將4-6g結(jié)構(gòu)導向劑溶解在水中，采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為1-2，加入6-10g擴孔劑，攪拌3-6小時直至均勻，再加入6-10毫升的正硅酸乙酯，2.75-4.55g的硝酸鈣或氯化鈣作為鈣源，2.5g磷酸三乙酯。在45℃攪拌20-24小時后，采用濃氨水調(diào)整pH至9-11，在90-110℃靜置56-80小時得到沉淀，將所得沉淀采用去離子水洗滌數(shù)次至pH7-7.4，550-600℃進行烘燒6-10小時，得到生物活性玻璃材料；

(2)將所述生物活性玻璃與3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合14-20小時，在80-150℃下烘燒20-30小時，氯仿洗滌后烘干，得到氨基修飾的生物活性玻璃；

(3)將所述氨基修飾的生物活性玻璃與表皮生長因子在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4-6小時進行吸附后，除去上清，37-50℃烘烤12-20小時后，得到所述骨修復材料。

本發(fā)明的技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的骨修復材料制備方法，所得骨修復材料能發(fā)揮對表皮生長因子的緩釋作用，從而促進細胞在成骨方向分化，促進骨再生和骨重建的快速進行，達到長效快速的促進骨修復過程。

本發(fā)明提供的骨修復材料，具有高效吸附并能緩慢釋放表皮生長因子的特性，從而使得該骨修復材料不僅具有生物活性玻璃的骨傳導性，還具有表皮生長因子對骨分化誘導的骨誘導性。因此，該骨修復材料具有促進骨組織再生和誘導分化的雙重功能，對細胞具有長效地促進其增殖、成骨方向分化和礦化的作用，能有效的提升骨缺損的修復效果和速度。在骨缺損修復、微整形上具有廣泛的應用前景。

具體請參考根據(jù)本發(fā)明的骨修復材料及其制備方法和應用提出的各種實施例的如下描述，將使得本發(fā)明的上述和其他方面顯而易見。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃的典型氮氣吸附脫附曲線圖；

圖2為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃的廣角度XRD衍射圖；

圖3為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃的小角度XRD衍射圖；

圖4為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃的紅外光譜圖；

圖5為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃的XPS譜圖；

圖6為本發(fā)明實施例1制得的氨基修飾的生物活性玻璃的N1s分峰擬合圖；

圖7為本發(fā)明實施例1制得的骨修復材料對表皮生長因子的緩釋結(jié)果示意圖；

圖8為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃在體外SBF溶液中對鈣沉積速度影響圖；

圖9為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃在體外SBF溶液中對鈣沉積10天后的形貌的掃描電鏡圖，其中a)為放大10，000倍時；b)為放大20，000倍時；

圖10為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃及骨修復材料對成骨細胞(MC3T3-E1)粘附影響圖；

圖11為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃及骨修復材料對MC3T3-E1的增殖影響圖；

圖12為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃及骨修復材料對MC3T3-E1的分化影響圖；

圖13為本發(fā)明實施例1制得的生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃及骨修復材料對MC3T3-E1的礦化影響圖。

具體實施方式

構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。

實施例

以下實施例中所用物料和儀器均為市售。

實施例1

通過模板誘導和自組裝相結(jié)合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。將4.5g結(jié)構(gòu)導向劑非離子型嵌段共聚物PEO₂₀-PPO₇₀-PEO₂₀(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為1，加入6.5g擴孔劑1，3，5-均三甲苯(TMB)，攪拌3小時直至均勻，再加入7毫升正硅酸乙酯(TEOS)，3.65g Ca(NO₃)₂·4H₂O鈣源，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在40℃攪拌24小時后，采用濃氨水調(diào)整pH至10，110℃靜置50小時得到沉淀。將所得沉淀采用去離子水洗滌數(shù)次至pH為7，550℃進行烘燒10小時，得到生物活性玻璃材料。將生物活性玻璃材料與3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式為C₉H₂₃NO₃Si，)，混勻20小時，在120℃烘燒30小時，氯仿洗滌后烘干，得到氨基修飾的生物活性玻璃材料(MBG-NH₂)。將氨基修飾的生物活性玻璃材料與表皮生長因子(20ng/mL)在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育6小時進行吸附后，除去上清，37℃烘烤20小時，得到氨基修飾的生物活性玻璃協(xié)同表皮生長因子的材料(MBG-NH₂/EGF)。

實施例1 中氨基修飾的生物活性玻璃的表征測量及結(jié)果

生物活性玻璃的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)通過Brnauer-Emmett-Teller法和Barret-Joyer-Halenda法來確定。圖1為生物活性玻璃的氮氣吸附脫附IV曲線圖，由圖1可見，在0.8-1.0范圍的p/p_o區(qū)域，生物活性玻璃的吸附體積具有明顯的變化，說明該生物活性玻璃的孔徑在介孔范圍，數(shù)據(jù)表明其平均孔徑為6.4nm。圖1中吸附和脫附曲線沒有重合，說明生物活性玻璃具有介孔材料的性質(zhì)，為后續(xù)所得骨修復材料具有對大分子物質(zhì)的緩釋能力提供基礎(chǔ)。

生物活性玻璃及氨基修飾的生物活性玻璃的晶體組成通過X-射線衍射(Bruker D8，德國)進行測定，采用壓片法制片，Cu/Ka靶，廣角角度15°-90°，小角角度0.8°-4°進行測試。廣角角度的X-射線衍射所得結(jié)果如圖2所示，在2θ＝15-35°存在一個衍射峰，說明本發(fā)明提供方法制備得到的骨修復材料是以無定型狀態(tài)存在。小角度X-射線衍射結(jié)果如圖3所示，在2θ＝15-35°下存在(100,110及200)的衍射峰，顯示其中的生物活性玻璃存在高度有序的六方結(jié)構(gòu)孔道結(jié)構(gòu)。

生物活性玻璃及氨基修飾的生物活性玻璃的表面基團通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR，Nicolet Avatar 360system)獲得，測試采用KBr壓片的方法，測試波長的范圍為：400-4000cm^-1。結(jié)果如圖4所示，骨修復材料在1550cm^-1存在一個C-NH₂的氨基峰，但是MBG不存在該峰，說明其中的生物活性玻璃已經(jīng)成功修飾了氨基，即為：氨基修飾的生物活性玻璃。

氨基修飾的生物活性玻璃的組成成分由X-射線光電子能譜分析(XPS，Thermo Escalab 250，美國)獲得，采用由Al K輻射的1486.6eV的能量進行測試。結(jié)構(gòu)如圖5所示，生物活性玻璃及氨基修飾的生物活性玻璃中N1s，Si2p，Si2s，Ca2p，Ca2s及C1s的原子組成進行了分析，氨基修飾的生物活性玻璃在399.8和402.5eV處具有N1s的兩個峰。由圖6的分峰擬合圖可知，結(jié)合能在399.8eV的為N-H鍵，結(jié)合能在402.5eV為N-C鍵。因此，從另外一方面說明骨修復材料中的生物活性玻璃已形成氨基修飾。

骨修復材料對表皮生長因子的緩釋過程在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)中進行測試。圖7顯示，在2天時，骨修復材料對表皮生長因子的釋放量已達到總負載量的35％，而在9天時，其釋放量僅達到總負載量的70％，骨修復材料對表皮生長因子具有良好的緩釋功能。

生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃在模擬人體體液的液體(SBF)(142.0mM Na⁺，5.0mM K⁺，1.5mM Mg²⁺，2.5mM Ca²⁺，103.0mM Cl^-，27.0mM HCO₃^-，1.0mM HPO₄^2-，0.5mM SO₄^2-)中測試對鈣沉積速度的影響，鈣沉積實驗在37℃培養(yǎng)箱中進行，在相應的時間點通過顯微鏡觀察鈣沉積的速度。結(jié)果顯示(圖8)，在4小時和1天后，在生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃表面均出現(xiàn)了顆粒沉積，而在10天后，在氨基修飾的生物活性玻璃表面的顆粒沉積比在生物活性玻璃表面的多，表明氨基修飾的生物活性玻璃可以促進類骨沉積的生成。在鈣沉積10天后，采用去離子水洗滌鈣沉積，然后在掃描電子顯微鏡(SEM；JSM-6700F，日本)下觀察表面形貌。測試前先將鈣沉積充分干燥并用導電膠粘結(jié)于樣品銅臺上，然后對樣品表面進行噴金處理后進行觀察。如圖9顯示，生物活性玻璃和氨基修飾的生物活性玻璃表面均被球形的類骨樣沉積所覆蓋，而在氨基修飾的生物活性玻璃上類骨樣沉積明顯多于生物活性玻璃。在不同的放大倍數(shù)下(圖9中a和b)，可以更清晰的看出沉積形態(tài)的不同。氨基修飾的生物活性玻璃上的沉積形態(tài)與骨中的鈣化沉積更相似。

生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃、骨修復材料對MC3T3-E1細胞的粘附能力通過免疫熒光進行測定。細胞分別在三種材料中進行孵育6小時，采用甲醇:丙酮(1:1)室溫固定30分鐘后，通過10％馬血清4℃封閉過夜，anti-Actin的抗體以1:100的比例進行稀釋后對細胞4℃孵育過夜后，F(xiàn)ITC標記的二抗以1:100的比例進行稀釋對細胞室溫孵育2小時，碘化丙啶(PI)染細胞核5分鐘后在具有藍光和綠光激發(fā)波的顯微鏡(Leica，德國)下觀察細胞的粘附。結(jié)果如圖10顯示，骨修復材料對細胞的粘附性最好，氨基修飾的生物活性玻璃其次，生物活性玻璃最次，說明氨基修飾的生物活性玻璃對成骨細胞的附著及伸展具有正向調(diào)節(jié)作用，氨基修飾的生物活性玻璃協(xié)同表皮生長因子后促進了成骨細胞的粘附。

生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃、骨修復材料對MC3T3-E1細胞的增殖能力通過Cell Counting Kit-8(CCK-8)進行測定。在對應測試時間前4小時，將CCK-8以10％的比例加入到細胞培養(yǎng)液中。測試時，在酶標儀的450nm的波長下讀取吸光度值。如圖11所示，在第5天時，氨基修飾的生物活性玻璃、骨修復材料促進細胞活性的效果相同。不同天數(shù)的對細胞活性的研究表明，骨修復材料促進成骨細胞MC3T3-E1的增殖。

生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃、骨修復材料對MC3T3-E1細胞的分化能力通過檢測堿性磷酸酶(ALP)的活性進行測定。細胞分為兩組，一組采用對硝基酚磷酸(pNPP)工作溶液(8mM pNPP，0.1％Triton X-100，2mM MgCl₂，0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖液(pH 10.3))，在37℃孵育30分鐘后，通過酶標儀測定405nm的吸光度，另外一組采用基于二喹啉甲酸(BCA)法測定細胞內(nèi)蛋白濃度作為內(nèi)參，在37℃孵育30分鐘后，通過酶標儀測定550nm的吸光度。采用公式計算細胞的堿性磷酸酶活性，堿性磷酸酶活性＝A405/A550。結(jié)果顯示(圖12)，MC3T3-E1細胞培養(yǎng)在骨修復材料上，其堿性磷酸酶的活性最高，氨基修飾的生物活性玻璃其次，生物活性玻璃最低。因此，骨修復材料對成骨細胞MC3T3-E1的分化作用最強，氨基修飾的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最低。

生物活性玻璃、氨基修飾的生物活性玻璃、骨修復材料對MC3T3-E1細胞的分化能力通過檢測礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量進行測定。將MC3T3-E1細胞培養(yǎng)在不同的材料上，3天后換為礦化培養(yǎng)基(含10mMβ-甘油磷酸鈉，50μg/mL維生素C，10％FBS的αMEM培養(yǎng)液)，在細胞培養(yǎng)的第14天對礦化結(jié)節(jié)進行檢測。通過75％的乙醇將細胞室溫固定10分鐘，然后采用茜素紅工作液(pH4.2，40mM)37℃染色10分鐘，去離子水沖洗，干燥后在顯微鏡下拍照。結(jié)果顯示(圖13)，MC3T3-E1細胞培養(yǎng)在骨修復材料上，其礦化結(jié)節(jié)量最多，氨基修飾的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最少。因此，骨修復材料對成骨細胞MC3T3-E1的礦化作用最強，氨基修飾的生物活性玻璃次之，生物活性玻璃最低。

實施例2

通過模板誘導和自組裝相結(jié)合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。將6g結(jié)構(gòu)導向劑非離子型嵌段共聚物PEO₂₀-PPO₇₀-PEO₂₀(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為1，加入10g擴孔劑1，3，5-均三甲苯(TMB)，在40℃下攪拌6小時直至均勻，再加入10毫升正硅酸乙酯(TEOS)，4.55g Ca(NO₃)₂·4H₂O，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在45℃攪拌24小時后，采用濃氨水調(diào)整pH至11，90℃靜置56小時得到沉淀。將所得沉淀采用去離子水洗滌數(shù)次至pH為7.4，550℃進行烘燒10小時，得到生物活性玻璃材料。將生物活性玻璃材料與3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式為C₉H₂₃NO₃Si，)，混勻14小時，在150℃烘燒20小時，氯仿洗滌后烘干，得到氨基修飾的生物活性玻璃材料(MBG-NH₂)。將氨基修飾的生物活性玻璃材料與表皮生長因子(30ng/mL)在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4小時進行吸附后，除去上清，37℃烘烤12小時，得到氨基修飾的生物活性玻璃協(xié)同表皮生長因子的材料(MBG-NH₂/EGF)。

實施例3

通過模板誘導和自組裝相結(jié)合的方法合成生物活性玻璃(MBG)。將4g結(jié)構(gòu)導向劑非離子型嵌段共聚物PEO₂₀-PPO₇₀-PEO₂₀(P123)溶解在240毫升水中，采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值為2，加入6g擴孔劑1，3，5-均三甲苯(TMB)，攪拌3小時直至均勻，再加入6毫升正硅酸乙酯(TEOS)，2.75g氯化鈣，2.5g磷酸三乙酯(TEP)，在50℃攪拌20小時后，采用濃氨水調(diào)整pH至9，110℃靜置80小時得到沉淀。將所得沉淀采用去離子水洗滌數(shù)次至pH為7，600℃進行烘燒6小時，得到生物活性玻璃材料。將生物活性玻璃材料與3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，分子式為C₉H₂₃NO₃Si，)，混勻20小時，在80℃烘燒30小時，氯仿洗滌后烘干，得到氨基修飾的生物活性玻璃材料(MBG-NH₂)。將氨基修飾的生物活性玻璃材料與表皮生長因子(10ng/mL)在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育6小時進行吸附后，除去上清，37℃烘烤20小時，得到氨基修飾的生物活性玻璃協(xié)同表皮生長因子的材料(MBG-NH₂/EGF)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的范圍不限制于以上討論的示例，有可能對其進行若干改變和修改，而不脫離所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍。盡管己經(jīng)在附圖和說明書中詳細圖示和描述了本發(fā)明，但這樣的說明和描述僅是說明或示意性的，而非限制性的。本發(fā)明并不限于所公開的實施例。

通過對附圖，說明書和權(quán)利要求書的研究，在實施本發(fā)明時本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解和實現(xiàn)所公開的實施例的變形。在權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”不排除其他步驟或元素，而不定冠詞“一個”或“一種”不排除多個。在彼此不同的從屬權(quán)利要求中引用的某些措施的事實不意味著這些措施的組合不能被有利地使用。權(quán)利要求書中的任何參考標記不構(gòu)成對本發(fā)明的范圍的限制。