本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種低免疫原性組織工程皮膚構(gòu)建方法，具體地說，涉及一種利用胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞制備低免疫原性組織工程皮膚的方法。

背景技術(shù)：

皮膚移植，是指將自體健康部位皮膚、異體皮膚或者異種皮膚通過外科手術(shù)的方法移植至受損部位，從而快速有效地封閉受損創(chuàng)面，使患者避免減少脫水感染等的發(fā)生。目前臨床上皮膚移植的主要方法有三種即自體皮膚移植、異種或同種異體皮膚移植以及人工合成皮膚代用品的移植。自體皮膚移植具有不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于燒燙傷患者尤其是大面積燒燙傷患者來說，其來源往往絕對(duì)不足，且術(shù)后供皮部位可能存在不能自行愈合、感染或瘢痕形成風(fēng)險(xiǎn)，因此其應(yīng)用受到一定的限制；異種或同種異體皮膚移植具有數(shù)量充足、來源相對(duì)廣泛等優(yōu)勢，但皮膚移植后都會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，移植皮膚都會(huì)很快被排異掉，因此起到覆蓋創(chuàng)面的時(shí)間相對(duì)較短，滿足不了燒燙傷患者整個(gè)治療恢復(fù)的時(shí)間窗，因此此皮膚移植同樣受到一定程度的限制；人工合成皮膚材料具有已商品化購買容易、不會(huì)發(fā)生免疫排斥等的優(yōu)勢也受到人們的關(guān)注，但其價(jià)格高昂，一般普通經(jīng)濟(jì)條件的家庭難以支付如此高額的醫(yī)療費(fèi)用，應(yīng)用同樣受到一定的限制。鑒于以上三種移植方法的比較，降低異體或異種移植皮膚的免疫原性、延長移植皮膚的存活時(shí)間可能是比較行之有效的方法，但如何降低移植物的免疫原性是目前挽救大面積、重度燒燙傷患者生命亟待解決的問題。

組織工程皮膚構(gòu)建的三要素為種子細(xì)胞、支架材料和組織構(gòu)建。

組織工程表皮的種子細(xì)胞來源皮膚表皮結(jié)構(gòu)基底層的表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞等，表皮干細(xì)胞在一定的微環(huán)境下可被誘導(dǎo)向角化細(xì)胞分化。其中，表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖和分化潛能，是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)、重建的關(guān)鍵源泉，且在體外培養(yǎng)時(shí)更容易保持表皮細(xì)胞表型。

支架材料是種子細(xì)胞黏附、生長、遷移、增殖和分化的載體，是組織工程皮膚的“真皮”部分。人工合成類支架材料降解速率和微結(jié)構(gòu)容易在合成過程控制，因此容易大規(guī)模生產(chǎn)，但其最大缺點(diǎn)是缺乏細(xì)胞識(shí)別信號(hào)，不利于細(xì)胞黏附及特異基因激活。天然生物類材料來源的的組織工程產(chǎn)品支架具有良好的相容性和適宜的降解速度，但其缺點(diǎn)是力學(xué)能力差。目前多采用膠原、氨基多糖等，該類材料具有良好的力學(xué)性能、低免疫原性及天然膠原三維支架結(jié)構(gòu)，是一種理想的組織工程支架材料。

組織構(gòu)建是組織工程的關(guān)鍵技術(shù)，在一定的微環(huán)境下，將培養(yǎng)的種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合進(jìn)行組織構(gòu)建是組織工程表皮產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。體外構(gòu)建的組織工程皮膚產(chǎn)品在功能上要接近生理皮膚，表皮細(xì)胞必須具有含角化的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，才能保證皮膚移植后具有抗感染、抗摩擦、保濕等防護(hù)功能。表皮細(xì)胞以單純的浸沒式培養(yǎng)只能形成多層結(jié)構(gòu)，不能正常角化。而采用氣-液分離培養(yǎng)的方式進(jìn)行體外培養(yǎng)，類同于模擬人體在體條件，能夠有效構(gòu)建組織工程皮膚。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制異體移植器官免疫排斥，降低移植物抗宿主疾病等的作用，這使其在器官移植領(lǐng)域越來越多的受到人們的關(guān)注。胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞家族成員之一，研究表明，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是免疫原性最低的干細(xì)胞之一，其除了具有低免疫原性以及抑制器官移植免疫排斥等間充質(zhì)干細(xì)胞共性外，還具有來源豐富，分離純化簡單不存在倫理道德問題且不會(huì)對(duì)供體造成損害的優(yōu)勢而備受關(guān)注。Pieternella S等已證實(shí)，可從人胎盤組織的絨毛膜和基蛻膜中分離得到胎兒側(cè)來源胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(fetal Placental Mesenchymal Stem Cells,fPMSC)和母體側(cè)來源胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(maternal Placental Mesenchymal Stem Cells,mPMSC)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有異體來源表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚模型在移植耐受過程中發(fā)生免疫排斥缺點(diǎn)，提供一種低免疫原性組織工程皮膚構(gòu)建方法，該方法采用人類胎兒來源的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以牛I型膠原3D基質(zhì)作為支架，使用氣液界面分離法復(fù)合構(gòu)建一種有活性的低免疫原性的全層組織工程皮膚。

其具體技術(shù)方案為：

一種低免疫原性組織工程皮膚構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟1、胎兒來源的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取新鮮胎盤組織，剪取部分胎兒側(cè)胎盤組織，利用PBS漂洗胎盤組織3～5遍直至清洗液無色為止，利用眼科剪徹底剪碎組織，PBS重復(fù)洗液3遍，A型膠原酶和DNaseⅠ酶，37℃水浴消化，消化2小時(shí)，洗滌離心接種于10cm無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，第二天小心換液，以后每隔兩天換液一次，此細(xì)胞即為P₀代，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞達(dá)70％～80％融合密度時(shí)，利用Tryple消化后按1：3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至P₃代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞；

步驟2、表皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復(fù)沖洗，置DispaseⅡ中浸泡過夜，冷消化分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細(xì)胞，過濾并接種于I型牛膠原包被的培養(yǎng)皿中，通過專用選擇培養(yǎng)基篩選表皮干細(xì)胞；

步驟3、復(fù)合胎兒來源的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的I型牛膠原3D支架制備

膠原配置：5-8mL 1.5mg/mL I型牛膠原溶液，0.4mL-1.2mL 10×DMEM，0.2mL-0.6mL NaHCO3，0.6mL-1.2mL 200mM Hepes，PH值在7.3-7.7，配制在低溫下進(jìn)行。將培養(yǎng)好的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，消化后，以6×10⁶密度重懸于1mL的matrigel中，并與配好的膠原充分混合，配制好后接種到24mm的transwell表面，1.0mL每孔，37℃條件下凝固30min，待膠原成固體后，緩慢添加含MMPs抑制劑marimastat 5nM的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中過夜；

步驟4、接種表皮干細(xì)胞

次日，吸棄培養(yǎng)板中平衡溶液待用，獲取培養(yǎng)至70％～80％融和狀態(tài)的P2代角質(zhì)形成細(xì)胞，以Transwell培養(yǎng)小室作為氣液分離支架，支架上，接種1×10⁶細(xì)胞數(shù)量于24mm的嵌套培養(yǎng)皿的上室中，更換含MMPs抑制劑marimastat 3nM-6nM的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，上室中添加培養(yǎng)基Cnt-07,CELLnTEC 2ml，下室中添加培養(yǎng)基Cnt-07,CELLnTEC 3ml繼續(xù)培養(yǎng)16h待細(xì)胞100％匯合成片；

步驟5、氣液分離培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚

更換添加MMPs抑制劑marimastat 3nM-6nM，角質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基Cnt-3D,CELLnTEC繼續(xù)培養(yǎng)2天，接種后第5天，將24mm的嵌套培養(yǎng)皿上室中液體吸出，保持細(xì)胞表面干燥，下室添加角質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基Cnt-3D,CELLnTEC 0.6mL-1.2mL，液面不高于表皮細(xì)胞層，每天換液，至12天角化表皮結(jié)構(gòu)形成，即完成組織工程皮膚的制備過程。

進(jìn)一步，步驟1中的培養(yǎng)基添加Cnt-07,CELLnTEC。

進(jìn)一步，所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞源自健康孕婦生產(chǎn)娩出胎盤的胎兒側(cè)絨毛膜層。

進(jìn)一步，分化培養(yǎng)基中添加MMPs抑制劑有效減少了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞造成的膠原支架和人工表皮產(chǎn)品的收縮。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，利用I型牛膠原和matrigel構(gòu)成3D支架，結(jié)合CELLnTEC培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠維持表皮干細(xì)胞的增殖和分化，使用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，解決了單純異體表皮細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)強(qiáng)烈的缺點(diǎn)，有效增加了異體人工表皮產(chǎn)品移植過程中的免疫耐受及存活時(shí)間。本發(fā)明利用通過分化培養(yǎng)基中添加3nM-6nM的MMPs抑制劑，有效減少了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞造成的膠原支架和人工表皮產(chǎn)品的收縮。

附圖說明

圖1是間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記鑒定,其中，A：間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞檢測前細(xì)胞狀態(tài)；B：間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測表面分子CD90/CD73/CD105表達(dá)；

圖2是表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定,其中，A,B：CK19表達(dá)鑒定，A:自然光下細(xì)胞生長狀態(tài)；B:細(xì)胞免疫熒光CK19蛋白檢測；C,D：P63表達(dá)鑒定，A:自然光下細(xì)胞生長狀態(tài)；B:細(xì)胞免疫熒光P63蛋白檢測；

圖3是組織工程皮膚的鑒定,其中，A：組織工程皮膚3D培養(yǎng)圖；B：組織工程皮膚HE染色；C：組織工程皮膚AKH1免疫組化染色鑒定；D：組織工程皮膚P63免疫組化染色鑒定；E：組織工程皮膚CK10免疫組化染色鑒定；F：組織工程皮膚E-Cadherin免疫組化染色鑒定；

圖4是組織工程皮膚的移植,其中，A：PBS對(duì)照組；B：人工表皮移植組(epidermis)；C：間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮細(xì)胞聯(lián)合移植組(fPMSC+epidermis)；

圖5是組織工程皮膚移植后的愈合,其中，A：對(duì)照愈合組；B：人工表皮移植后愈合組(epidermis)；C：間充質(zhì)干細(xì)胞和人工表皮聯(lián)合移植后愈合組(fPMSC+epidermis)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體附圖和實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

本發(fā)明利用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，采用其作為種子細(xì)胞，無血清系統(tǒng)培養(yǎng)，解決了依賴自體皮膚分離表皮干細(xì)胞來源有限的缺點(diǎn)。支架材料是組織工程的第二要素，本發(fā)明采用同種膠原和matrigel(比例8:1)作為支架材料，既具備了良好的皮膚支撐結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞提供良好的支架環(huán)境；又具備了良好的生物相容性、極低免疫原性和較好的力學(xué)強(qiáng)度，有效促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附與增殖。組織構(gòu)建是組織工程的關(guān)鍵技術(shù)，本發(fā)明采用氣-液分離的方法，模擬人體在體條件，可有效構(gòu)建組織工程皮膚。

實(shí)施例1胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞培養(yǎng)及分化各階段培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)方法與結(jié)果

方法：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)取新鮮胎盤組織(一般取分娩后24小時(shí)內(nèi)胎盤組織，若不能及時(shí)分離培養(yǎng)暫時(shí)置于4℃冰箱，實(shí)驗(yàn)證明存放時(shí)間越短培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)越佳)置于事先30分鐘紫外線消毒后的超凈工作臺(tái)上，利用剪刀分別小心剪取部分胎兒側(cè)胎盤組織(剪取時(shí)注意盡量避開大血管，剪取大小約為2.0cm×1.0cm×0.5cm)分別置于兩個(gè)無菌一次性培養(yǎng)皿中，利用PBS(添加1％Anti-Anti)漂洗胎盤組織3～5遍直至清洗液無色為止(目的是清洗掉組織中的血液成分，以免影響提取細(xì)胞質(zhì)量)，將清洗后的胎盤組織分別置于新的無菌一次性培養(yǎng)皿中，利用眼科剪徹底剪碎組織，收集剪碎后的組織分別移至干凈無菌的一次性50mL離心管中，加入40mL左右PBS顛倒混勻10次左右(進(jìn)一步洗去組織塊中的血液成分)，1500rpm快速離心10秒后使組織塊沉淀，小心棄去洗液，再次加入適量的PBS重復(fù)上述操作，離心后同樣棄去洗液，向兩離心管分別加入30mL左右的DMEM并加入A型膠原酶和DNaseⅠ酶，封口膜封閉后將上述離心管移至37℃水浴鍋中水浴消化，消化時(shí)間為2小時(shí)，期間每隔10分鐘左右顛倒混勻3～5次使組織塊與消化酶充分接觸保證其完全消化，待消化完畢后將離心管置于離心機(jī)中按1500rpm的轉(zhuǎn)速快速離心10秒，離心后將上清液移至另一干凈無菌50mL離心管中，剩余沉淀加入適量PBS洗滌后同樣按1500rpm離心10秒，將所得洗滌液也移至上述無菌離心管，最后將上述所得上清按1500rpm離心10分鐘后棄去上清，利用PBS重懸沉淀物，先后用100μm、40μm細(xì)胞篩過濾沉淀，收集過濾后所得細(xì)胞懸液，1500rpm離心10分鐘后棄去上清，利用完全培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS+1％Anti-Anti)重懸沉淀后將細(xì)胞懸液分別接種于10cm無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)，第二天小心換液，以后每隔兩天換液一次，此細(xì)胞即為P₀代，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞達(dá)70％～80％融合密度時(shí)，利用Tryple消化后按1：3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至P₃代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

表皮干細(xì)胞培養(yǎng)取環(huán)狀切除術(shù)后小兒包皮(家屬知情同意)，將組織先后在碘伏與75％的乙醇中消毒，并在含1％抗生素的PBS中進(jìn)行漂洗；剔除皮下脂肪層、血管、結(jié)締組織，剪成1cm×1cm小塊，置于3.3mg/ml dispaseⅡ中4℃消化14hr，機(jī)械分開表皮與真皮層。將表皮置于離心管中，加入0.25％胰酶5ml，在37℃孵箱中消化15min。加DMEM+10％FBS終止消化，1500r/min×5min，棄上清，加入無血清角化培養(yǎng)基，在斡旋器上瞬時(shí)震蕩6次。70μm無菌濾網(wǎng)過濾，吸取單細(xì)胞懸液，3×10⁶接種在已包被0.1％I型牛膠原的培養(yǎng)皿中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長成70％～80％融和狀態(tài)時(shí)，用Tryple消化細(xì)胞5min，PBS稀釋消化液終止消化，吹打混懸，離心收集細(xì)胞，加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至I型膠原包被好的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至P2代，每兩天換液，用作構(gòu)建復(fù)合皮的種子細(xì)胞和進(jìn)行細(xì)胞鑒定(K19及p63免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定)。

結(jié)果：

采用Stemcell公司的MesenCultTM-XF Medium無血清培養(yǎng)基能夠很好的實(shí)現(xiàn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和純化。接種后24小時(shí)換液，將細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，呈散在分布、形態(tài)不規(guī)則。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，一周左右時(shí)已形成較多克隆樣區(qū)域。fPMSC細(xì)胞呈短梭形或多邊形，魚鱗狀，呈簇樣生長(圖1)。待細(xì)胞達(dá)70％～80％融合密度時(shí)傳代，傳代后細(xì)胞呈渦旋狀生長。

采用CELLnTEC公司的角化細(xì)胞選擇培養(yǎng)基能夠很好的實(shí)現(xiàn)人包皮角化細(xì)胞的增殖和純化。在原代3×10⁶接種密度條件下，6-7天角化細(xì)胞能夠生長至80％匯合，傳代后，以1×10⁶密度接種，5天角化細(xì)胞能夠生長至80％匯合，細(xì)胞傳至2-3代增殖能力和純度最佳，適合用于構(gòu)建組織工程皮膚。此方法分離純化的細(xì)胞具有角化細(xì)胞特征：呈鋪路石樣集落生長，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，表達(dá)角化細(xì)胞標(biāo)志角蛋白19和核蛋白p63，陽性細(xì)胞比例占90％以上(圖2)。

實(shí)施例2胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合表皮干細(xì)胞組織工程皮膚構(gòu)建及氣液界面培養(yǎng)角質(zhì)化層形成的方法與結(jié)果

方法：準(zhǔn)備接種前1天，制備3D牛膠原支架。膠原配置(10ml)：7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液，1mL 10×DMEM，0.5mL NaHCO₃，1mL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低溫下進(jìn)行，配制好后37℃條件下凝固30min。待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中過夜，平衡PH。次日，吸棄培養(yǎng)板中平衡溶液待用。獲取培養(yǎng)至70％～80％融和狀態(tài)的P2代角質(zhì)形成細(xì)胞，接種8×10⁵細(xì)胞數(shù)量于24mm的嵌套培養(yǎng)皿的上室中，上室中添加培養(yǎng)基(Cnt-07,CELLnTEC)2ml，下室中添加培養(yǎng)基(Cnt-07,CELLnTEC)3ml繼續(xù)培養(yǎng)2天待細(xì)胞100％匯合成片，更換角質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cnt-3D,CELLnTEC)繼續(xù)培養(yǎng)2天。第5天，將24mm的嵌套培養(yǎng)皿上室中液體吸出，保持細(xì)胞表面干燥，下室添加角質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基(Cnt-3D,CELLnTEC)0.6mL-1.2mL，液面不高于表皮細(xì)胞層，每天換液，至12天角化表皮結(jié)構(gòu)形成。

結(jié)果：按上述方法能夠獲得直徑大于6cm的組織工程表皮，組織學(xué)結(jié)果證明其具有完整的基底細(xì)胞層、角質(zhì)層以及3-5層的顆粒細(xì)胞和棘細(xì)胞層。免疫組化染色顯示基底層細(xì)胞表達(dá)P63蛋白，顆粒細(xì)胞和棘細(xì)胞層表達(dá)角蛋白10，角質(zhì)層表達(dá)AKH1。以上結(jié)果均證明我們獲得了具有完整組織結(jié)構(gòu)的組織工程表皮(圖3)。

實(shí)施例3利用小鼠皮膚移植免疫排斥模型驗(yàn)證低免疫原性人工皮膚的功能

方法：手術(shù)操作前手術(shù)區(qū)域紫外消毒車消毒30分鐘，手術(shù)器械經(jīng)高壓滅菌60℃烘箱過夜烘干后備用。取C57BL/6小鼠，利用4％水合氯醛按1mL/100g劑量腹腔注射麻醉小鼠，待其昏迷后，在其背部略靠近左前肢處剪取直徑約12mm的圓形全層皮膚缺損，分為手術(shù)對(duì)照組、人工表皮移植組、fPMSC復(fù)合人工皮膚組，進(jìn)行人工皮膚移植，真皮面向下覆蓋在缺損處，確保皮膚對(duì)位良好并避免接觸部位有氣泡殘留，利用事先準(zhǔn)備好的凡士林紗布小心覆蓋創(chuàng)口后，創(chuàng)可貼小心包扎固定，確保移植皮膚無移位，將術(shù)后小鼠置于37℃電熱板上待其復(fù)蘇。術(shù)后從第3天開始每天拆包觀察移植皮膚排斥情況并拍照記錄，從手術(shù)之日起至移植皮膚50％的面積出現(xiàn)變硬、翹起、發(fā)黑、壞死的時(shí)間記為移植皮膚的存活時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組小鼠移植皮膚的存活時(shí)間。

結(jié)果：移植皮膚存活情況統(tǒng)計(jì)

術(shù)后觀察，小鼠精神狀態(tài)佳，活動(dòng)飲食良好，移植后24小時(shí)，各組小鼠均有不同程度的出汗現(xiàn)象，懼寒，各組小鼠均無死亡。移植術(shù)后第3天，人工表皮組移植皮膚出現(xiàn)部分發(fā)黑壞死現(xiàn)象，壞死面積約25％，第5天時(shí)，人工表皮組大部分小鼠移植皮膚發(fā)黑壞死面積已超過50％；fPMSC組移植皮膚狀態(tài)良好，皮膚紅潤柔軟，血供良好；第10天，人工表皮組移植皮膚出現(xiàn)較重程度的翹起、發(fā)黑或者壞死，且面積超過50％，fPMSC組小鼠移植皮膚狀態(tài)基本良好，無發(fā)黑、翹起、壞死或者發(fā)黑、翹起、壞死面積不足50％(圖4)。與人工表皮組比較：fPMSC組小鼠移植皮膚的存活時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HE染色法觀察移植部位皮膚炎性細(xì)胞浸潤情況。

移植術(shù)后第7天，各組取移植部位皮膚進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示：人工表皮組移植部位皮膚炎性細(xì)胞浸潤最多，炎性細(xì)胞破壞移植皮膚導(dǎo)致移植皮膚發(fā)黑和壞死，fPMSC組移植組炎性細(xì)胞浸潤最少，移植部位散在分布極少量炎性細(xì)胞，移植皮膚破壞程度最輕(圖5)。

本發(fā)明構(gòu)建所得的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結(jié)構(gòu)，組織形態(tài)學(xué)顯示該組織工程皮膚具有表皮的多層結(jié)構(gòu)，表皮層中具有多層不同分化程度的細(xì)胞，達(dá)到了組織工程皮膚的形態(tài)學(xué)要求。并且通過小鼠異體移植模型驗(yàn)證確定其具有延長異體移植物存活時(shí)間和抑制免疫細(xì)胞浸潤的作用。

本發(fā)明通過支架材料中加入胎兒側(cè)來源胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)揮免疫抑制作用，有效減少了異體來源表皮干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚移植中的免疫排斥。本發(fā)明采用的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是免疫原性最低的干細(xì)胞之一，其除了具有低免疫原性以及抑制器官移植免疫排斥等間充質(zhì)干細(xì)胞共性外，還具有來源豐富，分離純化簡單不存在倫理道德問題且不會(huì)對(duì)供體造成損害的優(yōu)點(diǎn)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。