專利名稱：一種含有汗腺的組織工程皮膚模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)皮膚模型的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種更接近人類皮膚 結(jié)構(gòu)的含有汗腺的組織工程皮膚及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
皮膚作為覆蓋和保護(hù)體表的重要組織器官，容易受到外傷、燒傷、炎癥、潰瘍、腫瘤 術(shù)后及先天疾病等因素的損害。組織工程皮膚的出現(xiàn)為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域研究提供了一種新 的治療途徑，目前，已經(jīng)有多種皮膚產(chǎn)品問世，并用于臨床治療，取得了一定療效。然而，組 織工程皮膚距離真正理想的永久性皮膚替代物尚存有一定差距。尤其是目前的技術(shù)方法并 不能在組織工程皮膚中構(gòu)建出皮膚的附屬器結(jié)構(gòu)，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。而這些結(jié)構(gòu)在 皮膚創(chuàng)傷修復(fù)和重建過程中又起著至關(guān)重要的作用。因此，如何建立含有皮膚附屬器的更 接近天然皮膚的三維模型是亟待解決的問題之一。尤其是汗腺組織，具有分泌汗液、排泄廢 物、調(diào)節(jié)體溫和皮膚動態(tài)平衡的作用，汗腺的缺失會導(dǎo)致大量汗液不能排出體外，滯留在肌 肉內(nèi)刺激疤痕結(jié)締組織增生，嚴(yán)重影響皮膚損傷的愈合質(zhì)量。2001年2月6日伍津津等人申請的專利(申請?zhí)?1107099. 4)以及2002年9月 2日金巖等人申請的專利(申請?zhí)?2139398. 2)都涉及組織工程皮膚的制備，以上發(fā)明包 括各種溶液配制、膠原凝膠制備以及細(xì)胞三維培養(yǎng)。所構(gòu)建的組織工程皮膚在結(jié)構(gòu)上與人 體皮膚類似，既具有表皮層和真皮層，但由于缺乏皮膚附件而不能達(dá)到真正的皮膚重建，因 此尚未擁有正常皮膚的全部生物學(xué)功能。而且以上發(fā)明均未說明制備組織工程皮膚時的各 種細(xì)胞比例，不能明確在組織工程皮膚模型中細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用等。 細(xì)胞外基質(zhì)成分作為功能活性區(qū)域，與細(xì)胞的分化緊密關(guān)聯(lián)并調(diào)控細(xì)胞的分化方向；同時， 細(xì)胞的生長增殖等亦依賴于微環(huán)境的改建。然而以往的發(fā)明并未涉及細(xì)胞外基質(zhì)的作用和 微環(huán)境對細(xì)胞的影響。我們早在2000年開始進(jìn)行汗腺再生的實驗研究，建立了汗腺細(xì)胞的 分離培養(yǎng)和鑒定體系，證明了汗腺再生在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中起到重要的作用。因此，構(gòu)建 一種含有汗腺的組織工程皮膚替代物，可推動具有皮膚附屬器的全功能組織工程皮膚的發(fā) 展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是針對現(xiàn)有組織工程皮膚的不足，提供一種更接近天然皮膚的 含有汗腺的組織工程皮膚。本發(fā)明的目的之二是提供上述皮膚模型的制備方法。包括以下 步驟a)作為細(xì)胞微載體和生長因子釋放載體的微球制備，采用具有良好的生物相 容性并含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的明膠作為構(gòu)建載體的主要天然基質(zhì)，制備完成后復(fù)合 EGF (0. 25-0. 5 μ g EGF/g 微球)；b)分離并培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)方法鑒定，抗_CEA、CK8、CK18、CK19抗體 染色陽性；
c)將所述微球載體和培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合共培養(yǎng)。優(yōu)選地，進(jìn)行接種微球的汗腺細(xì)胞的密度為5X103-lX104/cm2。所述的共培養(yǎng)為 5-7 天。d)將經(jīng)共培養(yǎng)得到的汗腺細(xì)胞微載體復(fù)合體與膠原凝膠混合，并與通過分離培養(yǎng) 得到的皮膚表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞按照三維構(gòu)建的方式進(jìn)行培養(yǎng)；優(yōu)選地，汗腺細(xì)胞微載體復(fù)合體與表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞按照三維構(gòu)建的方式進(jìn) 行培養(yǎng)的時間為15-20天。e)對所構(gòu)建的組織工程皮膚作形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)行HE染色，觀察所構(gòu)建的皮膚結(jié)構(gòu) 以及汗腺形成情況；用免疫組織化學(xué)法檢測所構(gòu)建的組織工程皮膚中汗腺標(biāo)志物的表達(dá)。


圖1為三維培養(yǎng)的復(fù)合汗腺組織工程皮膚模型的HE染色照片。圖2為所構(gòu)建皮 膚模型的免疫組化染色照片，其中抗-CEA (a)、CK8 (b)、CK18 (c)、CK19 (d)抗體染色陽性。
具體實施例方式以下本發(fā)明以具體實施例的方式具體闡述發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是， 以下的實施例是為了闡述發(fā)明，而非限定本發(fā)明的發(fā)明的范圍。實施例實施例1作為細(xì)胞微載體和生長因子釋放載體的微球制備微型載體構(gòu)建采用含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的明膠作為構(gòu)建載體的主要天然基 質(zhì)，明膠微載體具有很好的細(xì)胞親和性，能與多種細(xì)胞自然配位結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長同 時承載細(xì)胞外基質(zhì)成分。制備方法如下取0. aiil span-80，用30ml液體石蠟充分?jǐn)嚢杈?勻后倒入三口燒瓶中，于50°C高速攪拌。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的明膠水溶液真空抽氣泡， 取4. 5mL緩慢滴加入到三口瓶中，調(diào)節(jié)攪拌速度至450r/min，攪拌lOmin，溶液變得渾濁， 形成乳狀液后在保持?jǐn)嚢杷俣炔蛔儣l件下迅速改為冰浴，使體系溫度低于5°C，繼續(xù)攪拌 15min，緩慢滴加25%的戊二醛0. 1ml，在450r/min下繼續(xù)攪拌濁。加入12ml丙酮，攪拌 :3min后靜置，待溶液分層后，可以看到制備出的淡黃色微球沉淀在最下層，倒掉溶液后將微 球泡在IOml丙酮溶液中，于5°C固化Mh。取出微球后用lmol/L的氨基乙酸浸泡30min，除 掉未反應(yīng)的戊二醛。用丙酮、異丙醇、二次水反復(fù)洗滌，有機溶劑揮發(fā)后得到淡黃色粉末狀 明膠微粒載體。將的EGF溶液(0. 25 μ g/ μ 1)滴加在凍干明膠微球上(0. 25-0. 5 μ g EGF/ g微球)，在室溫下保持30min以使EGF完全融入微球。滅菌封存。實施例2汗腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定取約0. 3cmX2.0cm的全層正常皮膚，置于含有青霉素(100U/ml)和鏈霉素 (100yg/ml)的人平衡鹽溶液中反復(fù)漂洗，去除皮下脂肪，在60mm培養(yǎng)皿中將皮膚剪成 Imm3左右的小塊，加入含有II型膠原酶Omg/ml)、胎牛血清(5% )、青霉素(100U/ml)和鏈 霉素(lOOyg/ml)的DMEM液:3ml，置37°C、5% C02、飽和濕度孵箱中過夜。次日在清潔的、 紫外線消毒的50X倒置相差顯微鏡下挑取汗腺組織，置37°C、5% CO2、飽和濕度條件下培 養(yǎng)。汗腺培養(yǎng)液以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，補加胎牛血清(5% )、重組人表皮生長因子(IOng/ ml)、三碘甲狀腺原氨酸Qng/ ml)、半琥珀酰氫化可的松(0. 4 μ g/ml)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(lml/100ml)(以上試劑均購于Gibco)及青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100 μ g/ ml)。待人汗腺細(xì)胞貼壁后，補加約2ml汗腺培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2 3d換液一次。待 細(xì)胞達(dá)80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，給予爬片檢測。按前述的細(xì)胞固定及免疫細(xì) 胞化學(xué)法行CK19和癌胚抗原(CEA)檢測。實施例3微球載體與汗腺細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合共培養(yǎng)取滅菌封存的微球載體用DMEM浸泡24h后，平鋪于12孔板中，加入含10%胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)液，將原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞以5X IO3-IX IOVcm2密度接種于微粒載體置 37°C,5% CO2孵箱中復(fù)合培養(yǎng)5-7天。實施例4含有汗腺的三維皮膚模型構(gòu)建取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，將真皮成纖維細(xì)胞以IX 107/ml的密度與提取自小牛皮 的I型膠原3ml混合(膠原濃度8mg/ml，混合前加入含10%胎牛血清的DMEM，充分混勻，調(diào) 節(jié)PH到7. 4)，同時將表皮細(xì)胞和汗腺細(xì)胞載體復(fù)合物(與真皮成纖維細(xì)胞按1 2比例密 度)以注射方式導(dǎo)入膠原凝膠，37°C孵育凝固后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)3天；在其表面以2 X IO6/ ml密度接種表皮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3天，將復(fù)合細(xì)胞的膠原凝膠移至氣液面進(jìn)行器官培養(yǎng)1 2周即獲得復(fù)合汗腺的組織工程皮膚。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建組織工程皮膚模型的方法，其特征在于所述的方法是以組織工程化方法和 微載體技術(shù)為手段，在體外將皮膚表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞以及生物支架材料復(fù)合 構(gòu)建出具有汗腺結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚模型的方法，包括以下步驟a)作為細(xì)胞微載體和生長因子釋放載體的微球制備；b)分離并培養(yǎng)汗腺細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)方法鑒定出抗_CEA、CK8、CK18、CK 19抗體 染色陽性的細(xì)胞；c)將所述微球載體和培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合共培養(yǎng)；d)將經(jīng)共培養(yǎng)得到的汗腺細(xì)胞微載體復(fù)合體與膠原凝膠混合，并與通過分離培養(yǎng)得到 的皮膚表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞按照三維構(gòu)建的方式進(jìn)行培養(yǎng)；e)對所構(gòu)建的組織工程皮膚作形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)行HE染色，觀察所構(gòu)建的皮膚結(jié)構(gòu)以及 汗腺的形成情況；用免疫組織化學(xué)法檢測所構(gòu)建的組織工程皮膚中汗腺標(biāo)志物的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的微球載體的制備方法是由機體可接 受的生物可降解材料制備而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述地方法，其特征在于所述的生物可降解材料包括明膠、膠原、透 明質(zhì)酸、殼聚糖、藻酸鹽、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的任一種或幾種的結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的微球載體粒徑為100-500μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的微球所復(fù)合的生長因子包括表皮細(xì) 胞生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(酸性aFGF ；堿性bFGF)、血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生 長因子(PD-ECGF/PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TFG-β)以及細(xì)胞因 子和細(xì)胞外間質(zhì)來源的信號等的任一種或幾種的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的細(xì)胞為自體/同種異體來源的成體 細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺細(xì)胞在微球載體上的接種密度 為 5 X IO3-I X 104/cm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于所述的皮膚汗腺細(xì)胞表皮細(xì) 胞成纖維細(xì)胞的比例為1 1 2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺細(xì)胞與微球載體的復(fù)合培養(yǎng)時 間為5-7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺細(xì)胞微載體復(fù)合體與表皮細(xì) 胞及成纖維細(xì)胞按照三維構(gòu)建的方式進(jìn)行培養(yǎng)的時間為15-20天。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)組織工程皮膚研究領(lǐng)域。具體說來，本發(fā)明涉及一種運用組織工程化方法在體外建立含有表皮層、真皮層以及汗腺結(jié)構(gòu)的三維皮膚模型的方法。
文檔編號A61L27/40GK102091352SQ200910253998
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者付小兵, 盛志勇, 黃沙 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院