一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，先將狗蟻草用95%乙醇浸泡后，進行回流提取，保持微沸2h，過濾，得第一次提取液，藥材冷卻后，再加12倍量95%乙醇，保持微沸1.5小時，得第二次濾液。藥材稍稍冷卻，加入12倍量95%乙醇，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，先制得95%乙醇浸膏；干燥后用水溶解，然后依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，經(jīng)濃縮、揮發(fā)溶劑和真空干燥后得到狗蟻草的乙酸乙酯提取物。
【專利說明】一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥液提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法 以及狗蟻草乙酸乙酯提取物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 狗蟻草為豆科植物鏈莢豆（Alysicarpus vaginalis(L. )DC.)的全草，另Ij稱山上 豆、山地豆、假花生、大葉青、廖藍豆、單葉草等。原產(chǎn)于南亞、東非。廣布于東半球熱帶地 區(qū)。喜熱帶潮濕干旱氣候。稍耐旱、耐酸，不耐漬。在砂壤土上生長良好，但易感染線蟲病， 故通常種于粘土上。狗蟻草具有諸多藥用功效，全草：甘、苦，平；活血通絡(luò)，清熱化濕，駁骨 消腫；用于跌打損傷，半身不遂，股骨酸痛，肝炎；蛇咬傷，骨折，外傷出血，瘡瘍潰爛久不收 口?！吨腥A本草》傣藥卷中記載按如下附方可以清火解毒，利膽退黃，主治"攏牛"，即小便熱 澀疼痛等癥：狗蟻草30g，野蘆谷根20g。煎湯內(nèi)服（景洪市名傣醫(yī)康郎侖驗方）；治"攏案 答勒"：狗蟻草30g，射干20g。煎湯內(nèi)服（景洪市傣醫(yī)波的應(yīng)驗方）。
[0003] 但目前對于狗蟻草有效成分的提取還少有人做詳細研宄，全株全草用藥的居多， 大大限制了其應(yīng)用，發(fā)明人經(jīng)過多年研宄，發(fā)現(xiàn)狗蟻草通過合適的溶劑提取即可制得其主 要有效成分的提取物，為其進一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，旨在解決目前狗蟻 草提取方法空白，還停留在全株全草用藥階段的問題，為進一步開發(fā)其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于研宄了狗蟻草乙酸乙酯提取物對小鼠慢性肝損傷的保護作 用以及人體慢性肝炎的初步試驗。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將狗蟻草洗凈、在18-25°c室溫下通風(fēng)干燥、剪碎并稱重，置于開口反應(yīng)器中。
[0009] (2)在開口反應(yīng)器中加入3-5倍95%乙醇（v/v)浸泡12-24h，再加入95%乙醇 (v/v)至藥材10-15倍量，進行回流提取。
[0010] (3)保持微沸2h，過濾，得第一次提取液；藥材冷卻后，第二次加10-15倍量95% 乙醇（v/v)，保持微沸1. 5小時，得第二次濾液；藥材冷卻后，第三次加入10-15倍量95%乙 醇（v/v)，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到相對密 度為1.25-1. 28的乙醇浸膏。
[0011] (4)將乙醇浸膏置于水浴鍋上，加熱至80-85°C，揮發(fā)，真空干燥，直至浸膏重量不 再減輕，得到相對密度為1. 30-1. 32的浸膏，稱重。
[0012] (5)加入5-10倍純水將乙醇浸膏全部溶解，再加入2-3倍量石油醚進行萃取，輕輕 震搖，靜置，直至出現(xiàn)清晰的分層界面，吸取上層石油醚溶液，重復(fù)石油醚萃取過程2-5次， 直至石油醚層顏色為淡黃色且不再變淡。
[0013] (6)按步驟（5)方法，用乙酸乙酯對浸膏進行萃取，將乙酸乙酯萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀進行濃縮，得到相對密度為1.22-1. 24的狗蟻草乙酸乙酯浸膏，將乙酸乙酯浸膏置 于水浴鍋上，加熱至80-85?，揮發(fā)溶劑并轉(zhuǎn)移入真空干燥箱繼續(xù)干燥，得到相對密度為 1. 28-1. 30的狗蟻草乙酸乙酯提取物。
[0014] 本發(fā)明的狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法具有以下顯著進步和優(yōu)點：
[0015] 1、本發(fā)明的狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，整個過程操作簡單，使用設(shè)備、儀 器常規(guī)，不涉及特殊高溫高壓條件，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同時，該技術(shù)在狗蟻草提取物制備 領(lǐng)域處于領(lǐng)先，尚無其它研宄單位或個人對其進行研宄，填補了該方面技術(shù)的空白。為進一 步開發(fā)狗蟻草的藥用價值奠定了夯實的基礎(chǔ)。
[0016] 2、本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)狗蟻草乙酸乙酯提取物能夠治療慢性肝炎，經(jīng)過小鼠試驗以后， 志愿者服用狗蟻草乙酸乙酯提取物有較好的療效。

【具體實施方式】
[0017] 為進一步理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明：
[0018] 實施例一狗蟻草乙酸乙酯提取物制備方法（一）
[0019] I. 1實驗材料
[0020] I. I. 1實驗藥材
[0021] 狗蟻草由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室韋松基教授鑒定為豆科植物狗蟻草 Alysicarpus vaginalis (L.) DC.的全草。
[0022] I. L 2實驗試劑
[0023] 石油醚：分析純成都市科龍化工試劑廠批號：20130820
[0024] 乙酸乙酯：分析純成都市科龍化工試劑廠批號：20130504
[0025] I. L 3實驗儀器
[0026] 電熱套PTHW型鞏義市矛華儀器有限責(zé)任公司
[0027] 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀G3型Heidolph
[0028] 真空干燥箱XMT0-8222上海精宏實驗設(shè)備有限公司
[0029] 恒溫水浴鍋HH-S8金壇市醫(yī)療儀器廠
[0030] 1.2實驗方法
[0031] 狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0032] (1)將狗蟻草洗凈、在18°C室溫下通風(fēng)干燥、剪碎并稱重，置于開口反應(yīng)器中。
[0033] (2)在開口反應(yīng)器中加入3倍95 %乙醇（v/v)浸泡12h，再加入95 %乙醇（v/v) 至藥材10倍量，進行回流提取。
[0034] (3)保持微沸2h，過濾，得第一次提取液；藥材冷卻后，第二次加10倍量95%乙醇 (v/v)，保持微沸1. 5小時，得第二次濾液；藥材冷卻后，第三次加入10倍量95%乙醇（v/ v)，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到相對密度為 1.25的乙醇浸膏。
[0035] (4)將乙醇浸膏置于水浴鍋上，加熱至80°C，揮發(fā)，真空干燥，直至浸膏重量不再 減輕，得到相對密度為1. 30的浸膏，稱重。
[0036] (5)加入5倍純水將乙醇浸膏全部溶解，再加入2倍量石油醚進行萃取，輕輕震搖， 靜置，直至出現(xiàn)清晰的分層界面，吸取上層石油醚溶液，重復(fù)石油醚萃取過程2次，直至石 油醚層顏色為淡黃色且不再變淡。
[0037] (6)按步驟（5)方法，用乙酸乙酯對浸膏進行萃取，將乙酸乙酯萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀進行濃縮，得到相對密度為1. 22的狗蟻草乙酸乙酯浸膏，將乙酸乙酯浸膏置于水浴鍋 上，加熱至80°C，揮發(fā)溶劑并轉(zhuǎn)移入真空干燥箱繼續(xù)干燥，得到相對密度為1. 28的狗蟻草 乙酸乙酯提取物。
[0038] 實施例二狗蟻草乙酸乙酯提取物制備方法（二）
[0039] 狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0040] (1)將狗蟻草洗凈、在22°C室溫下通風(fēng)干燥、剪碎并稱重，置于開口反應(yīng)器中。
[0041] (2)在開口反應(yīng)器中加入4倍95 %乙醇（v/v)浸泡20h，再加入95 %乙醇（v/v) 至藥材12倍量，進行回流提取。
[0042] (3)保持微沸2h，過濾，得第一次提取液；藥材冷卻后，第二次加12倍量95%乙醇 (v/v)，保持微沸1. 5小時，得第二次濾液；藥材冷卻后，第三次加入12倍量95%乙醇（v/ v)，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到相對密度為 1.27的乙醇浸膏。
[0043] (4)將乙醇浸膏置于水浴鍋上，加熱至83°C，揮發(fā)，真空干燥，直至浸膏重量不再 減輕，得到相對密度為1. 31的浸膏，稱重。
[0044] (5)加入6倍純水將乙醇浸膏全部溶解，再加入2倍量石油醚進行萃取，輕輕震搖， 靜置，直至出現(xiàn)清晰的分層界面，吸取上層石油醚溶液，重復(fù)石油醚萃取過程4次，直至石 油醚層顏色為淡黃色且不再變淡。
[0045] (6)按步驟（5)方法，用乙酸乙酯對浸膏進行萃取，將乙酸乙酯萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀進行濃縮，得到相對密度為1. 23的狗蟻草乙酸乙酯浸膏，將乙酸乙酯浸膏置于水浴鍋 上，加熱至84°C，揮發(fā)溶劑并轉(zhuǎn)移入真空干燥箱繼續(xù)干燥，得到相對密度為1. 28的狗蟻草 乙酸乙酯提取物。
[0046] 實施例三狗蟻草乙酸乙酯提取物制備方法（三）
[0047] 狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0048] (1)將狗蟻草洗凈、在25°C室溫下通風(fēng)干燥、剪碎并稱重，置于開口反應(yīng)器中。
[0049] (2)在開口反應(yīng)器中加入5倍95 %乙醇（v/v)浸泡24h，再加入95 %乙醇（v/v) 至藥材15倍量，進行回流提取。
[0050] (3)保持微沸2h，過濾，得第一次提取液；藥材冷卻后，第二次加15倍量95%乙醇 (v/v)，保持微沸1. 5小時，得第二次濾液；藥材冷卻后，第三次加入15倍量95%乙醇（v/ v)，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到相對密度為 1.28的乙醇浸膏。
[0051] (4)將乙醇浸膏置于水浴鍋上，加熱至85°C，揮發(fā)，真空干燥，直至浸膏重量不再 減輕，得到相對密度為1. 32的浸膏，稱重。
[0052] (5)加入10倍純水將乙醇浸膏全部溶解，再加入3倍量石油醚進行萃取，輕輕震 搖，靜置，直至出現(xiàn)清晰的分層界面，吸取上層石油醚溶液，重復(fù)石油醚萃取過程5次，直至 石油醚層顏色為淡黃色且不再變淡。
[0053] (6)按步驟（5)方法，用乙酸乙酯對浸膏進行萃取，將乙酸乙酯萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀進行濃縮，得到相對密度為I. 24的狗蟻草乙酸乙酯浸膏，將乙酸乙酯浸膏置于水浴鍋 上，加熱至85°C，揮發(fā)溶劑并轉(zhuǎn)移入真空干燥箱繼續(xù)干燥，得到相對密度為1. 30的狗蟻草 乙酸乙酯提取物。
[0054] 實施例四狗蟻草乙酸乙酯提取物對0：14造成的大鼠慢性肝損傷的保護作用試 驗。
[0055] 原因：慢性肝炎是我國的常見病和多發(fā)病，又是導(dǎo)致肝硬化的基礎(chǔ)疾病，探索其治 療新方法有重要意義，本發(fā)明人實驗發(fā)現(xiàn)，用狗蟻草乙酸乙酯提取物有保肝、抗炎以及抗肝 纖維化。本實驗旨在觀察其對CCl 4造成的大鼠慢性肝損傷的保護作用，并初步探討其作用 機理。
[0056] I. 1實驗材料
[0057] I. I. 1實驗動物
[0058] 昆明種小鼠126只，雌雄各半，體重20±2g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提 供，合格證號，桂醫(yī)動字第11004號
[0059] I. I. 1實驗試劑
[0060] 秋水仙堿：250mg北京索萊寶科技有限公司，Cat. No :C8190
[0061] 四氯化碳（CCL4):分析純500ml/瓶廣東西隴化工廠產(chǎn)品，批號：20111130 ;
[0062] 花生油：500ml/ 瓶 50S 壓榨一級批號：2013/10/0503144
[0063] 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)測試盒：南京建成試劑有限公司，批號：20140303
[0064] 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)測試盒：南京建成試劑有限公司，批號：20140303
[0065] 甲醛溶液：分析純成都市科龍化工試劑廠批號2013112201
[0066] Mouse Col I Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E20528R Lot. #:20140502B
[0067] Mouse Col I Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E20528R Lot. #:20140502B
[0068] Mouse Col III Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E92514R Lot. #:20140502B
[0069] Mouse Col IV Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E20222R Lot. #:20140502B
[0070] Mouse TGF-Bl Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E20217R Lot. #:20140502B
[0071] Mouse PDGF Elisa Kit R&D 公司 Cat. #:CK-E93225R Lot. #:20140502B
[0072] I. I. 3實驗儀器
[0073] 水浴鍋 國華電器有限公司型號：HH-2 酶標(biāo)儀 美國BIO-TEK 微量加樣器 法國GILSON 離心機 萬分之一克電子天平 德國賽多利斯型號：BP211D 超純水儀 法國默克密理博型號：明澈-D 24 UV 紫外分光光度計
[0074] I. L 4藥液配置
[0075] 狗蟻草高劑量藥液：給藥量為40g/kg，所用浸膏濃度為0. 01012g/mL ;取0. 3036g 浸膏加超純水溶解，定容至30mL
[0076] 狗蟻草中劑量藥液：給藥量為20g/kg，所用浸膏濃度為0. 00506g/mL ;取0. 1518g 浸膏加超純水溶解，定容至30mL
[0077] 狗蟻草低劑量藥液：給藥量為10g/kg，所用浸膏濃度為0. 00253g/mL ;取0. 0759g 浸膏加超純水溶解，定容至30mL
[0078] 秋水仙堿溶液：取秋水仙堿0. 3mg，加超純水溶解，定容至30ml
[0079] 1.2實驗方法
[0080] 取昆明種小鼠90只，雌雄各半，體重20±2.0g，隨機分組，分別為空白組、模型組、 秋水仙堿組（0. 2g/kg)、狗蟻草乙酸乙酯提取物高劑量組（相當(dāng)40g/kg生藥）、中劑量組 (相當(dāng)20g/kg生藥）、低劑量組（相當(dāng)10g/kg生藥），共6組，模型組20只，其余每組14 只。除正常組外，其余每組皮下注射25% CCl4花生油溶液背部，2ml/kg，3天/1次，造模1 周后正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃，0. 2ml/10g，1次/d，連 續(xù)6W。于第7W末時取小鼠肝組織作HE和Masson病理切片檢查是否形成肝纖維化，若病理 切片檢查結(jié)果顯示肝纖維化已經(jīng)形成。于第8W末時，禁食12h，自由飲水，末次給藥Ih后摘 眼球取血，分離血清，取出小鼠肝臟，部份置液氮中凍存，部份用10 %甲醛固定。按試劑盒說 明書測定血清中ALT、AST和肝臟組織中Col I、Col III、Col IV、TGF-B1、PDGF含量及病理 檢查。
[0081] 1.3實驗結(jié)果
[0082] 1. 3. 1實驗動物死亡率
[0083] 如表3所示，狗蟻草乙酸乙酯提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組均可降低慢性 肝損傷小鼠的死亡率，其中狗蟻草乙酸乙酯提取物高劑量組效果最好。
[0084] 表3狗蟻草乙酸乙酯提取物對0：14所致慢性肝損傷小鼠死亡率的影響
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 一種狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 將狗蟻草洗凈、干燥、剪碎并稱重，置于開口反應(yīng)器中； (2) 在開口反應(yīng)器中加入3-5倍95%乙醇（v/v)浸泡12-24h，再加入95%乙醇（v/v)至 藥材10-15倍量，進行回流提??； (3) 保持微沸2h，過濾，得第一次提取液；藥材冷卻后，第二次加10-15倍量95%乙醇 (v/v)，保持微沸1. 5小時，得第二次濾液；藥材冷卻后，第三次加入10-15倍量95%乙醇（v/ v)，保持微沸1小時，得第三次濾液，合并3次提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到相對密度為 1. 25-1. 28的乙醇浸膏； (4) 將乙醇浸膏置于水浴鍋上，加熱，揮發(fā)，真空干燥，直至浸膏重量不再減輕，得到相 對密度為1. 30-1. 32的浸膏，稱重； (5) 加入5-10倍純水將乙醇浸膏全部溶解，再加入2-3倍量石油醚進行萃取，輕輕震 搖，靜置，直至出現(xiàn)清晰的分層界面，吸取上層石油醚溶液，重復(fù)石油醚萃取過程，直至石油 醚層顏色為淡黃色且不再變淡； (6) 按步驟（5)方法，用乙酸乙酯對浸膏進行萃取，將乙酸乙酯萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進 行濃縮，得到相對密度為1. 22-1. 24的狗蟻草乙酸乙酯浸膏，將乙酸乙酯浸膏置于水浴鍋 上揮發(fā)溶劑并轉(zhuǎn)移入真空干燥箱繼續(xù)干燥，得到相對密度為1. 28-1. 30的狗蟻草乙酸乙酯 提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟 (1)中干燥為在18_25°C室溫下通風(fēng)干燥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟 (5)中重復(fù)石油醚萃取過程為2-5次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的狗蟻草乙酸乙酯提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟 (3)和（6)中水浴鍋溫度為80-85°C。
5. 權(quán)利要求1所述的狗蟻草乙酸乙酯提取物在制備治療慢性肝炎方面藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/48GK104435077SQ201410667241
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】鄭作文, 唐云麗, 黃麗貞 申請人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)